專利名稱：：一種卵泡刺激素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及卵泡刺激素(FSH)的純化方法，以及含有它的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：卵泡刺激素(Follicle-stimulatinghormone,簡稱FSH)是由垂體產(chǎn)生的激素，它由a鏈和P鏈兩個(gè)亞基組成。FSH的a亞基與黃體生成激素(leuteinizinghormone,簡稱LH)和絨毛膜促性腺素(chorionicgonadotropin,簡稱CG)的a亞基完全相同，具有92個(gè)氨基酸，分子量約為14500D,第52和78位置上的天冬酰胺是發(fā)生W-糖基化的氨基酸。FSH的P亞基由lll個(gè)氨基酸組成，分子量約為18000D，其中第7和24位置上的天冬酰胺是發(fā)生iV-糖基化的氨基酸。而LH的P亞基由121個(gè)氨基酸組成，分子量約為14800D;CG的6亞基則有145個(gè)氨基酸，分子量22000-39000D。臨床上FSH主要用于治療不育癥以及體外的輔助生殖。FSH可以從垂體或絕經(jīng)期婦女的尿液中提取出來，也可通過DNA重組技術(shù)而制備。含有FSH的第一代產(chǎn)品是尿促性素(HMG)，如Serono公司的Pergonal,它是FSH與LH比例約為1的混合物。但是，對于體內(nèi)有較多量的LH而不需加用外源性LH的患者，LH水平過高會影響卵泡的正常發(fā)育，不合時(shí)機(jī)的抑制減數(shù)分裂抑制因子會導(dǎo)致卵子的老化，從而降低受精和著床的機(jī)會。因此對這部分患者而言，更適合于使用純FSH制劑。另一方面，過多的LH容易導(dǎo)致多囊卵巢綜合癥(PolycysticOvarianSyndrome,POOS)，研究表明，LH過多對生殖功能有不利的作用，如引起月經(jīng)稀發(fā)、無排卵、不孕及流產(chǎn)。因此對POOS患者用純FSH治療比HMG更為安全，可減少卵巢過度刺激綜合癥(OvarianHyperstimulationSyndrome,OHSS)危險(xiǎn)。由于上文所述的原因，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出完全不含LH活性的FSH制劑，以滿足患者的治療所需。Serono公司推出的Metrodin是一種含有極少量LH的FSH制劑，其后的Metrodin-HP則是高純度的FSH制劑。另外，近年來市場上也開發(fā)出一種高純度的尿促性素(pHMG)，如Ferring公司的Men叩ur，它是將純化后的高純度FSH與高純度LH或者是高純度hCG(人絨毛膜促性腺激素，humanchorionicgonadotropin)按1:1的比例調(diào)配而成的產(chǎn)品，主要用于替代普通的HMG產(chǎn)品，并克服普通HMG產(chǎn)品中因大量雜蛋白而造成的對人體的過敏反應(yīng)。美國專利號3,674,865描述了從尿提取物中純化FSH的方法，該方法總共包括21個(gè)不同步驟，得到是FSH和LH的混合物，F(xiàn)SH和LH比例在3:16:1之間。其純化工藝較為復(fù)雜，且所得FSH的比例也較低。美國專利號6,162,905描述了用離子交換層析、染料層析等多步方法純化FSH的方法，但其FSH與LH的免疫效價(jià)之比最高也只有313:1，其中還是有少量的LH存在。近年來，通過免疫反應(yīng)純化目標(biāo)物的手段已漸趨成熟。免疫反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)，兩者之所以能夠進(jìn)行特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級結(jié)構(gòu)決定的?？贵w是由人或動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的一種球蛋白，一般由4條肽鏈組成，可通過鏈內(nèi)二硫鍵折疊成若干球形功能區(qū)，其中的超變區(qū)與相應(yīng)抗原的表位在空間結(jié)構(gòu)上呈專一性互補(bǔ)關(guān)系，如同鑰匙和鎖的關(guān)系，因而兩者可發(fā)生專一性的結(jié)合反應(yīng)。在專利WO98/20039中，描述了用抗FSH的單克隆抗體免疫層析法以及反相HPLC法來純化FSH,但由于其免疫層析是吸附洗脫過程，洗脫劑是pHll的1M氨水，洗脫時(shí)容易造成FSH的失活以及單克隆抗體的脫落，對產(chǎn)品存在一定的影響。為此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出一種可用于簡單、高效地純化FSH的方法，并由此獲得幾乎不含LH活性的FSH制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種簡單高效的FSH純化方法，并通過該方法獲得幾乎不含LH活性的FSH產(chǎn)品。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種制備卵泡刺激素FSH的方法，所述方法包括以下步驟(A)使含有FSH的原料與抗體接觸，其中所述原料含有作為雜質(zhì)的黃體生成激素LH和/或絨毛膜促性腺素CG,并且所述抗體是特異性地與LH和/或CG結(jié)合，從而使得所述抗體與LH和/或CG形成抗原-抗體復(fù)合物；(B)將形成的抗原-抗體復(fù)合物從所述原料中去除，從而獲得純化的FSH。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體是抗LH的抗體和/或抗CG的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其變體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述人卵泡刺激素或其變體是人尿來源的卵泡刺激素或是重組的人卵泡刺激素。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的抗LH的抗體是能與LH或LHP亞基或它們的變體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，包括抗人LH或其變體的抗體，抗人LH3亞基或其變體的抗體，抗動(dòng)物L(fēng)H或其變體的抗體，抗動(dòng)物L(fēng)HP亞基或其變體的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的抗LH的抗體包括使用多克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、或DNA重組技術(shù)制備的抗LH的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的抗LH的抗體包括含有抗LH抗體的混合物、或純化過的抗LH抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的含有抗LH抗體的混合物包括含有抗LH抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水、或細(xì)胞培養(yǎng)液。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的純化過的抗LH抗體包括將含有抗LH抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水、或細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行純化后的產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的抗CG的抗體是能與CG或CGP亞基或它們的變體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，包括抗人CG或其變體的抗體，抗人CGP亞基或其變體的抗體，抗動(dòng)物CG或其變體的抗體，抗動(dòng)物CGe亞基或其變體的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的抗CG的抗體包括使用多克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、或DNA重組技術(shù)制備的抗CG的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的抗CG的抗體包括含有抗CG抗體的混合物、或純化過的抗CG抗體。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的含有抗CG抗體的混合物包括含有抗CG抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的純化過的抗CG抗體包括將含有抗CG抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行純化后的產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的純化過程包括使用免疫沉淀法和免疫層析法進(jìn)行純化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述的卵泡刺激素中，F(xiàn)SH與LH的生物效價(jià)比例不低于10(h1;優(yōu)選所述的卵泡刺激素中，F(xiàn)SH與LH的免疫效價(jià)的比例不低于1000:1;更優(yōu)選所述的卵泡刺激素中，F(xiàn)SH與LH的免疫效價(jià)的比例不低于10000:1。在本發(fā)明的第二方面中，提供一種含F(xiàn)SH的藥物組合物的制備方法，所述方法包括以下步驟-(A)使含有FSH的原料與抗體接觸，其中所述原料含有作為雜質(zhì)的黃體生成激素LH和/或絨毛膜促性腺素CG，并且所述抗體是特異性結(jié)合LH和/或CG但基本上不與FSH發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體，從而使得所述抗體與LH和/或CG形成抗原-抗體復(fù)合物；(B)將形成的抗原-抗體復(fù)合物從所述原料中去除，從而獲得純化的FSH;(C)將治療有效量的步驟(B)中制得的純化的FSH、藥學(xué)上可接受的載體、和任選的其它活性成分配制在一起，從而形成所述的藥物組合物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述純化的FSH的含量為所述藥物組合物總重量的0.001-99.9重量％;優(yōu)選0.01-99重量°/。，更優(yōu)選0.02-95重量％。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述藥物組合物不含LH。在另一優(yōu)選例中，步驟(C)中的其它活性成分選自LH、和或hCG。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述藥物組合物還包含純化的LH，其中FSH與LH的生物效價(jià)比為0.01-100:1，優(yōu)選0.1-10:1，更優(yōu)選l-5:1。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物是尿促性素(HMG)或高純度尿促性素(p腹G)。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為高純度pHMG，其包含按所需比例混合的純化的FSH和高純度LH。所述純化的FSH和高純度LH的重量比為10:1-1:10，優(yōu)選5:1-1:5，更優(yōu)選1:1。此外在本發(fā)明提供的制備卵泡刺激素FSH的方法中，所述的LH和/或CG是哺乳動(dòng)物的LH和/或CG。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述哺乳動(dòng)物為人。在另一實(shí)施方式中，所述抗體選自下組.-(a)抗LHe亞基的抗體；(b)抗CGP亞基的抗體；和/或(c)它們的組合。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的抗LHe亞基或抗CGP亞基的抗體選自抗hCG單克隆抗體(例如可購自AntibodyShop的Monoclonalanti-PhcgHYB-093-05或Sigma的Monoclonalanti-PhcgC7659)、抗LH單克隆抗體(例如可購自ThermoFisher的MS-1448-PABX)。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是采用多克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)或DNA重組技術(shù)制備的。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體為包含抗LH和/或CGP亞基的抗體的混合物或經(jīng)純化的抗LH和/或CGe亞基的抗體。在另一實(shí)施方式中，所述的抗體包括單克隆抗體以及含有抗體的抗血清、動(dòng)物腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述抗體的純化是通過鹽析、層析等常規(guī)純化方法進(jìn)行的。在另一實(shí)施方式中，其中所述的純化方法為免疫沉淀法或親和層析法。在另一優(yōu)選例中，可對純化過程中分離的LH和/或CG進(jìn)行進(jìn)一步的純化和利用。在另一實(shí)施方式中，所述含有FSH的原料選自未經(jīng)任何預(yù)純化步驟的原料、經(jīng)預(yù)純化步驟去除了部分雜質(zhì)的原料、或經(jīng)預(yù)純化步驟而基本上只含LH和/或CG的原料。在另一實(shí)施方式中，所述純化的FSH的比活為不低于500IU/mg蛋白。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的純化的FSH的比活為500-15000IU/mg，優(yōu)選600-12000IU/mg蛋白，更優(yōu)選為700-10000IU/mg蛋白，最優(yōu)選為750-8000IU/mg蛋白。本發(fā)明還提供了一種抗體在從含有FSH的原料制備FSH中的用途，所述原料含有作為雜質(zhì)的LH和/或CG，所述抗體特異性結(jié)合LH和/或CG但基本上不與FSH發(fā)生交叉反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述抗體選自下組(a)抗LHP亞基的抗體；(b)抗CGP亞基的抗體；和/或(c)它們的組合。本發(fā)明的純化方法條件溫和、操作簡便、fsh得率高、純度高和效價(jià)高。圖1為hCG的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為lh的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)可通過免疫純化法，利用抗lh或cg的P亞基的抗體去除fsh中的雜質(zhì)lh和/或cg，從而在溫和條件下簡單而高效地獲得高純度、高效價(jià)的fsh純化產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，如
背景技術(shù)：
部分中所述，現(xiàn)有技術(shù)中采用了抗fsh的抗體結(jié)合fsh來純化fsh。但該方法在洗脫時(shí)易于造成fsh失活和抗體的脫落，從而影響了純化效果。在探索改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)方法的過程中，本發(fā)明人注意到fsh、lh和cg具有如下的特點(diǎn)它們的a亞基完全相同，而P亞基卻有各自的結(jié)構(gòu)。其中，fsh的P亞基與lh和cg的0亞基分子結(jié)構(gòu)差異較大，因此抗lh禾卩/或cg的0亞基的抗體基本上與fsh不發(fā)生交叉反應(yīng)。而lh和cg的P亞基在分子結(jié)構(gòu)上有較大的相似性，cg的P亞基只比lh的e亞基多24個(gè)氨基酸，且這24個(gè)氨基酸未參與鏈內(nèi)二硫鍵的結(jié)合，因此在空間結(jié)構(gòu)上兩者很接近(見圖1和圖2)，所以一些抗體對這兩者有一定的交叉反應(yīng)。因此，使用抗lh的抗體，或者使用對lh有交叉反應(yīng)性的抗cg抗體都可以與lh發(fā)生免疫結(jié)合，從而達(dá)到高效去除lh并同時(shí)去除可能存在的cg的目的。本發(fā)明采用的免疫純化法，正是利用了抗lh或cg的e亞基的抗體能與目標(biāo)物中的lh(或cg)發(fā)生專一性結(jié)合反應(yīng)這一特性，既保證了lh(或cg)的高效去除，又保證純化條件溫和而不破壞fsh的活性。因此，本發(fā)明采用針對雜質(zhì)lh和cg的抗體，通過形成雜質(zhì)-抗體結(jié)合物的方法去除FSH中的雜質(zhì)，達(dá)到了純化FSH的目的。同時(shí)發(fā)明人還驚喜地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的純化方法具有純化條件溫和、操作簡便、FSH得率高、純度高和效價(jià)高等優(yōu)點(diǎn)。FSH、LH禾BCG如本發(fā)明所用，術(shù)語"卵泡刺激素"和"FSH"可互換使用，指一類用于促進(jìn)精子或卵泡產(chǎn)生、促進(jìn)卵巢發(fā)育的激素或其變體，其可在天然情況下由垂體前葉分泌，可從絕經(jīng)期婦女的尿液中提取或可通過重組技術(shù)獲得的。所述FSH與天然FSH具有相同或類似的結(jié)構(gòu)與功能。本發(fā)明中所用的原料FSH可采用本領(lǐng)域常用的任何方式獲得，例如天然產(chǎn)生、通過重組技術(shù)獲得或合成，其中含有作為雜質(zhì)的LH或CG。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其變體，優(yōu)選人尿來源的卵泡刺激素或是重組的人卵泡刺激素。可用于本發(fā)明中的含有FSH且包含作為雜質(zhì)的LH和/或CG的原料可為未經(jīng)任何預(yù)純化步驟的原料、經(jīng)預(yù)純化步驟去除了部分雜質(zhì)的原料、或經(jīng)預(yù)純化步驟而基本上只含F(xiàn)SH和雜質(zhì)LH和/或CG的原料。優(yōu)選在采用本發(fā)明的方法純化FSH前，采用本領(lǐng)域常規(guī)方法對原料FSH進(jìn)行初步純化，以分離除LH或CG以外的其它雜質(zhì)。如本文所用，術(shù)語"黃體生成激素"和"LH"可互換使用，指在含有FSH的原料制備或獲取過程中摻雜于其中的與天然LH具有相同或相似結(jié)構(gòu)和功能的激素。類似地，術(shù)語"絨毛膜促性腺激素"和"CG"可互換使用，指在含有FSH的原料制備或獲取過程中摻雜于其中的與天然CG具有相同或相似結(jié)構(gòu)和功能的激素?？筁H和/或CGe亞基的抗體如本文所用，術(shù)語"抗LH和/或CGP亞基的抗體"和"抗LH和/或CG的抗體"是指可與LH和/或CG的P亞基發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，但基本上不與FSH發(fā)生免疫交叉反應(yīng)或與FSH發(fā)生免疫反應(yīng)的能力遠(yuǎn)低于其與LH和/或CG反應(yīng)的能力的抗體。此處所用術(shù)語"遠(yuǎn)低于"是指以抗原抗體的親和力或交叉反應(yīng)率來表示，所述抗體與FSH發(fā)生免疫反應(yīng)的能力為其與LH和/或CG發(fā)生免疫反應(yīng)能力的1/10以下，優(yōu)選1/100以下。本發(fā)明過程中使用的抗體優(yōu)選為哺乳動(dòng)物抗體，更優(yōu)選為抗人LH或其變體的抗體，或抗人CG或其變體的抗體。術(shù)語"變體"是指氨基酸序列與人LH或CG相比有一定差異，但仍具有與人LH或CG相同或類似結(jié)構(gòu)和/或功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所使用的抗體可以通過常規(guī)技術(shù)獲得，例如采用多克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)或重組DNA技術(shù)，或通過市售獲得。用于本發(fā)明中的抗體可為現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中所記載的那些抗體，例如Schwarz，S的Theantigenicsurfaceofhumanchorionicgonadotropinasmappedbymurinemonoclonalantibodies(《通過鼠單克隆抗體作圖的人絨毛膜促性腺素的抗原性表面》，Endocrinology,1986，118:189-97)中所記載的那些抗體。用于本發(fā)明中的抗體也可為通過市售購得的抗LH或CG抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述抗體選自抗hCG單克隆抗體(例如可購自AntibodyShop的Monoclonalanti-PhcgHYB-093-05或Sigma的Monoclonalanti-PhcgC7659)、抗LH單克隆抗體(例如可購自ThermoFisher的MS-1448-PABX)。也可通過本領(lǐng)域已知的單克隆抗體技術(shù)獲得表達(dá)所述單克隆抗體的細(xì)胞株。可將直接使用所述抗體或可通過鹽析、層析等常規(guī)方法進(jìn)行純化后用于本發(fā)明方法中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可采用以下形式的抗體抗LH和/或CGe亞基的單克隆抗體、含有抗LH和/或CGP亞基抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水、細(xì)胞培養(yǎng)液或它們的純化產(chǎn)物。FSH的免疫純化方法在本發(fā)明中，可采用多種抗體免疫純化方法，包括例如免疫沉淀法和免疫層析法。免疫沉淀法是指待純化樣品中的抗原、抗體在均相系統(tǒng)中發(fā)生結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，然后通過離心、過濾或其它方法將抗原-抗體復(fù)合物分離，以達(dá)到純化效果。免疫層析法是近來發(fā)展出來的一種純化方法，它是將抗體固定化到層析樹脂上，然后將待純化樣品上樣至該樹脂上，使得其中的抗原被結(jié)合在固定化的抗體上，從而達(dá)到將抗原和目標(biāo)物分離的效果，或者用適當(dāng)?shù)南疵撘哼M(jìn)行洗脫收集抗原從而達(dá)到純化抗原的效果?？贵w可以通過常規(guī)的方法固定化到層析樹脂(如瓊脂糖)上，例如通過二乙烯基砜或溴化氫活化結(jié)合等方法。本發(fā)明采用了使雜質(zhì)(LH、CG)與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而將雜質(zhì)從所需產(chǎn)物(FSH)中分離出的方法，以溫和的反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)了FSH的高效純化。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述層析是用pH7.0的溫和層析液(O.lMTris-HCl，0.2MNaCl)進(jìn)行的，確保了所得FSH的高活性。經(jīng)免疫純化后的產(chǎn)物隨后可通過乙醇沉淀、真空干燥或冷凍干燥，或進(jìn)行進(jìn)一步的純化，獲得高純度的FSH產(chǎn)品以及其制劑形式。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有治療有效量的用本發(fā)明方法制備的高純度FSH，以及藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，術(shù)語"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由……構(gòu)成"、和"由……構(gòu)成"。如本文所用，術(shù)語"治療有效量"是指可對人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"或"食品學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、剌激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知白勺。在《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences'MackPub.Co.，N丄1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。所述的"藥學(xué)上可接受的載體"可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物組合物中的FSH占組合物總重量的0.00199.9wtQ/。；優(yōu)選為組合物總重量的0.0199wt。/。，較優(yōu)選為0.0295wt%，更優(yōu)選0.0590wt%。余量為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語"單位劑型"是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次施用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑、粉針劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中FSH的含量為0.0012000mg/劑，優(yōu)選0.003-500mg/劑，更優(yōu)選0.005-50mg/劑。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，每天施用16劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用13劑；最優(yōu)選的，每天施用的劑量為1齊IJ。應(yīng)理解，所用FSH的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴(yán)重程度而變化。具體情況根據(jù)對象的個(gè)體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達(dá)到的效果)來決定，這在熟練醫(yī)師或營養(yǎng)師可以判斷的范圍內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液、水針劑)或其它合適的形狀。高純度尿促性素(pHMG)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物是尿促性素(HMG)或高純度尿促性素(pHMG),更優(yōu)選為pHMG。所述pHMG是通過將高純度LH與本發(fā)明的高純度FSH按比例進(jìn)行調(diào)配而制得的。其中，所述純化的FSH和高純度LH的重量比為10:1-1:10，優(yōu)選5:1-1:5，更優(yōu)選1:1。施用方式本發(fā)明的組合物可以通過常規(guī)途徑施用，其中包括(但并不限于)口服、肌注、皮下注射等。優(yōu)選皮下注射施用。組合物形式應(yīng)與施用方式相匹配。本發(fā)明組合物的施用量，按活性物質(zhì)計(jì)算，通常為每天約0.00001-400mg/kg體重，較佳地約0.0000610mg/kg體重，更優(yōu)選為0.0001lmg/kg體重。本發(fā)明的組合物可直接使用，也可與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物還可與有效量(如0.005-1000mg/kg體重/天)的選自下組的物質(zhì)聯(lián)合施用hCG、黃體激素釋放激素(LHRH)類似物。當(dāng)兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合給藥時(shí)，一般具有優(yōu)于兩種藥物分別單獨(dú)給藥的效果。優(yōu)選地，聯(lián)合施用的藥物或其它制劑不干擾本發(fā)明FSH有效成分的治療活性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)提供了一種可簡單而高效地去除含有FSH的原料中LH和/或CG雜質(zhì)的方法，該方法成本低、步驟簡便、條件溫和，適合于工業(yè)化生成高純度FSH;(2)本發(fā)明方法獲得的FSH得率高、純度高且活性高，適用于制備含高純度FSH的藥物組合物。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件、或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1含F(xiàn)SH的原料在本實(shí)施例中，將HMG(購自上海天偉生物制藥有限公司)用作含F(xiàn)SH的原料，其中FSH的生物效價(jià)為521IU/mg，LH的生物效價(jià)為483IU/mg。純化方法取10mL瓊脂糖4B(購自GEAmersham),用二乙烯基砜活化好后，懸浮于10mL0.5M碳酸鈉溶液中，加入10mL含有抗hCG單克隆抗體的溶液(購自AntibodyShop,HYB-093-05,lmg/mL)，使得抗體結(jié)合到活化的樹脂上，從而得到免疫樹脂。將10mL免疫樹脂抗hCG-瓊脂糖裝入層析柱，用平衡液(0.05MTris-HCl，0.2MNaCl，pH7.2)平衡。將35mgHMG(其中FSH的生物效價(jià)為521IU/mg，LH的生物效價(jià)為483IU/mg)用lOmL上述平衡液溶解，然后上樣至免疫層析柱上，上樣結(jié)束后用平衡液洗滌(2倍柱體積)，收集流出液共約20mL(直接用于免疫效價(jià)的測定中)，邊攪拌邊加入5倍體積的-l(TC無水乙醇，離心收集沉淀，用無水乙醇脫水，真空干燥得30mg干燥品(直接用于生物效價(jià)的測定中)。免疫效價(jià)的測定方法及其結(jié)果采用雙抗體夾心法(ABBOTTAXSYM，F(xiàn)SH和LH免疫測定試劑盒)，按照廠商說明書指示來測定所得樣品的免疫效價(jià)。測定結(jié)果如表1所示表1.免疫層析收集液的免疫效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>。表2.免疫層析所得干燥品的生物效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>上述結(jié)果表明采用本發(fā)明的方法進(jìn)行純化，可去除HMG中絕大部分的LH，使得FSH的純度大大提高。實(shí)施例2.含F(xiàn)SH的原料在本實(shí)施例中，將HMG(購自上海天偉生物制藥有限公司)用作含F(xiàn)SH的原料，其中FSH的生物效價(jià)為2251IU/mg，LH的生物效價(jià)為437IU/mg，F(xiàn)SH與LH的生物效價(jià)比例為5:1。純化方法取10mL瓊脂糖4B(購自GEAmersham)，用溴化氫活化好后，懸浮于10mL0.1M碳酸氫鈉溶液(pH8.5)中，加入10mL含有抗LH單克隆抗體的溶液(購自ThermoFisher，MS-1448-PABX，lmg/mL),調(diào)pH約8.5，使得其中的抗體結(jié)合到活化的樹脂上，從而得到免疫樹脂。將10mL免疫樹脂抗LH-瓊脂糖裝入層析柱，用平衡液(0.05MTris-HCl，0.2MNaCl，pH7.2)平衡。將25mgHMG(其中FSH的生物效價(jià)為2251IU/mg，LH的生物效價(jià)為4371U/mg)用lOmL上述平衡液溶解，然后上樣至免疫層析柱上。上樣結(jié)束后用平衡液洗滌(2倍柱體積)，收集流出液共約20mL(直接用于免疫效價(jià)的測定中)，邊攪拌邊加入5倍體積的-l(TC無水乙醇，離心收集沉淀，用無水乙醇脫水，真空干燥得20mg干燥品。免疫效價(jià)的測定方法及其結(jié)果采用實(shí)施例1所用測定方法來測定所得收集液的免疫效價(jià)3所示表3.免疫層析中收集的流出液的免疫效價(jià)l定結(jié)果如表<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>上述結(jié)果表明采用本發(fā)明的方法進(jìn)行純化，可去除HMG中絕大部分的LH，使得FSH的純度大大提高。實(shí)施例3.高純度尿促性素(pHMG)的制備方法配制lOOmL0.01M磷酸二氫鈉溶液(用NaOH調(diào)整pH至約6.5)，加入4g乳糖，攪拌溶解后，用0.22ym過濾器過濾。取15mL濾過液，加入實(shí)施例2中獲得的FSH干燥品10mg，再加入5mg高純度LH(LH效價(jià)4592IU/mg，購自上海天偉生物制藥有限公司)，完全溶解后，進(jìn)行真空冷凍干燥，得570mg高純度HMG(含乳糖作為賦性劑)。測得其FSH比活為2358IU/mg蛋白，LH比活為2114IU/mg蛋白。實(shí)施例4.FSH凍干針劑的制備用于制造10000瓶FSH凍干針劑，且每瓶含75IUFSH的生產(chǎn)的典型例子如下計(jì)算出的一定量(以生物效價(jià)為單位)的FSH精品溶解于50mL注射用無熱原水中，如果需要的話，用HC1或NaOH調(diào)節(jié)pH6.5±0.2，然后用0.22ym過濾器進(jìn)行無菌過濾。將100g乳糖溶解于2L注射用無熱原水中，如果需要的話，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH6.5土0.2，用0.22um過濾器進(jìn)行無菌過濾。然后加入到上述FSH溶液中，用注射用無熱原水定容至7.5L，混勻。將上述溶液分裝入安瓿瓶中，每瓶0.75mL，進(jìn)行冷凍干燥。所得到的安瓿瓶中，每瓶含75IUFSH和10mg乳糖。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種制備卵泡刺激素FSH的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(A)使含有FSH的原料與抗體接觸，其中所述原料含有作為雜質(zhì)的黃體生成激素LH和/或絨毛膜促性腺素CG，并且所述抗體特異性地與LH和/或CG結(jié)合，從而使得所述抗體與LH和/或CG形成抗原-抗體復(fù)合物；(B)將形成的抗原-抗體復(fù)合物從所述原料中去除，從而獲得純化的FSH。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述抗體是抗LH抗體和/或抗CG抗體。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其變體。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述人卵泡刺激素或其變體是人尿來源的卵泡刺激素或是重組的人卵泡刺激素。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗LH抗體是能與LH或LHe亞基或它們的變體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，包括抗人LH或其變體的抗體，抗人LHe亞基或其變體的抗體，抗動(dòng)物L(fēng)H或其變體的抗體，抗動(dòng)物L(fēng)HP亞基或其變體的抗體。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗LH抗體包括使用多克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、或DNA重組技術(shù)制備的抗LH抗體。7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗LH抗體包括含有抗LH抗體的混合物、或純化過的抗LH抗體。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的含有抗LH抗體的混合物包括含有抗LH抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水、或細(xì)胞培養(yǎng)液。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的純化過的抗LH抗體包括將含有抗LH抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水、或細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行純化后的產(chǎn)物。10.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗CG抗體是能與CG或CGe亞基或它們的變體發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，包括抗人CG或其變體的抗體，抗人CGe亞基或其變體的抗體，抗動(dòng)物CG或其變體的抗體，抗動(dòng)物CGP亞基或其變體的抗體。11.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗CG抗體包括使用多克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、或DNA重組技術(shù)制備的抗CG抗體。12.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗CG抗體包括含有抗CG抗體的混合物、或純化過的抗CG抗體。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的含有抗CG抗體的混合物包括含有抗CG抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液。14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的純化過的抗CG抗體包括將含有抗CG抗體的動(dòng)物血清、動(dòng)物腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行純化后的產(chǎn)物。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的純化過程包括使用免疫沉淀法和免疫層析法進(jìn)行純化。16.如權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的卵泡刺激素中，F(xiàn)SH與LH的生物效價(jià)比例不低于100:1;優(yōu)選所述的卵泡刺激素中，F(xiàn)SH與LH的免疫效價(jià)的比例不低于1000:1;更優(yōu)選所述的卵泡刺激素中，F(xiàn)SH與LH的免疫效價(jià)的比例不低于10000:1。17.—種含F(xiàn)SH的藥物組合物的制備方法，所述方法包括以下步驟-(A)使含有FSH的原料與抗體接觸，其中所述原料含有作為雜質(zhì)的黃體生成激素LH和/或絨毛膜促性腺素CG，并且所述抗體是特異性結(jié)合LH和/或CG但基本上不與FSH發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體，從而使得所述抗體與LH和/或CG形成抗原-抗體復(fù)合物；(B)將形成的抗原-抗體復(fù)合物從所述原料中去除，從而獲得純化的FSH;(C)將治療有效量的步驟(B)中制得的純化的FSH、藥學(xué)上可接受的載體、和任選的其它活性成分配制在一起，從而形成所述的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明提供了一種制備卵泡刺激素FSH的方法，其包括步驟(A)使含有FSH的原料與抗體接觸，其中所述原料含有作為雜質(zhì)的黃體生成激素LH和/或絨毛膜促性腺素CG，并且所述抗體是特異性結(jié)合LH和/或CG但基本上不與FSH發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體，從而使得所述抗體與LH和/或CG形成抗原-抗體復(fù)合物；(B)將形成的抗原-抗體復(fù)合物從所述原料中去除，從而獲得純化的FSH。還提供了含有FSH的藥物組合物的制備方法。文檔編號A61P15/08GK101307103SQ200710045768公開日2008年11月19日申請日期2007年9月11日優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日發(fā)明者嚴(yán)惠敏,斌季,季曉銘,金燦煌申請人:上海天偉生物制藥有限公司