專利名稱：一種具有纖溶促進(jìn)作用的天然化合物的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然化合物的分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及纖溶促進(jìn)纖維的天然化合物的分離方法。
背景技術(shù)：
心肌梗塞、腦栓塞等血栓性疾病造成的死亡數(shù)量已經(jīng)超過了癌造成的死亡數(shù)量正成為死亡原因的首位。圍繞著血栓溶解既纖溶作用，在臨床上使用的藥品如組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶型纖溶酶原激活劑等會(huì)帶來出血的重大危險(xiǎn)性，只能用于重篤血栓患者，由于上述藥品的安全問題，自20世紀(jì)90年代開始，一些研究者開始探索用組織型纖溶酶原激活劑變異體、脂質(zhì)化合物用于血栓疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)，比組織型纖溶酶原激活劑分子量小的活化的血液蛋白質(zhì)C具有抗凝血作用和促進(jìn)纖溶作用；最近，血小板膜特異性糖蛋白的抑制藥物阿昔單抗作為小分子量的短肽抗凝血藥物已經(jīng)用于臨床；血液凝固因子Xa的低分子抑制化合物作為藥物正處于開發(fā)階段。但已經(jīng)用于臨床或正在試驗(yàn)階段的抗凝血藥物除了都有程度不同的出血危險(xiǎn)性以外，阿昔單抗的使用已經(jīng)帶來了像阿司匹林投與后的血小板減少的副作用。因此，在這一治療領(lǐng)域正急待著出血危險(xiǎn)性小、不損傷血液因子、活性能夠簡單調(diào)控的低分子天然化合物作為血栓治療藥物的出現(xiàn)。
在天然化合物的分離上經(jīng)常使用的方法有溶劑提取、液-液分離、層析色譜、結(jié)晶等方法，對于結(jié)構(gòu)和特性比較復(fù)雜的天然化合物常常使用兩種以上的經(jīng)典分離方法和現(xiàn)代分離方法，在糖苷類化合物的分離上經(jīng)常使用甲醇提取、常壓硅膠層析、高壓液相精制的方法，在脂類化合物的分離上，常常采用乙醇提取、有機(jī)溶劑萃取、常壓硅膠層析、大孔樹脂吸附、高壓液相精制的方法。但是在使用比較恰當(dāng)?shù)娜軇┖瓦m宜的分離方法分離特定化合物時(shí)，分離的流程和分離的方法都將簡化和縮短。常壓硅膠色譜是典型的吸附色譜(liquid-solid chromatography)，它基于溶質(zhì)和固定相固定位點(diǎn)之間的相互作用，溶劑與溶質(zhì)官能團(tuán)之間的相互作用，根據(jù)極性的大小將化合物分離，常壓硅膠色譜適用于糖苷類化合物、酯類化合物、帖類化合物等多種化合物的分離。例如周仲飛等把紫菜中的脂肪酸用汽油-乙醇混合溶劑提取出來后，用氫氧化鉀皂化脂肪酸，皂化的脂肪酸被甲酯化后，用常壓硅膠層析得到了高純度的二十碳五烯酸乙酯化合物。以常壓硅膠色譜為主來分離具有纖溶促進(jìn)作用的甘油糖脂類化合物還沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種以常壓硅膠色譜為主分離具有纖溶促進(jìn)作用的天然化合物的方法。
本發(fā)明中，該纖溶促進(jìn)化合物的分離源是馬尾藻屬的所有種，它包括微勞馬尾藻(sargassum fulvellum)，漂浮馬尾藻(Sargassum natans)，麗鈴馬尾藻(Sargassumringgoldianum)，凹頂馬尾藻(Sargassum emarginatum Tseng et Lu)，半葉馬尾藻(Sargassumhemiphyllum(Turn.)Ag.)，棒托馬尾藻(Sargassum baccularia(Mert.)Ag.)，草葉馬尾藻(Sargassum graminfolium Turn.)，賓德馬尾藻(Sargassum binderi Sond.)，長干馬尾藻(Sargassum Longicaulis Tseng et Lu)，檗葉馬尾藻(Sargassum berberifolium J.Ag.)，長托馬尾藻(Sargassum longifructum Tseng et Lu)，刺莖馬尾藻(Sargassum spinifex Ag.)，冬青葉馬尾藻(Sargassum ilicifolium(Turn.)Ag.)，多囊馬尾藻(Sargassum myriocystum J.Ag.)，短葉馬尾藻(Sargassum brevifolium Grev.)，多孢馬尾藻(Sargassum polyporumMent)，匐枝馬尾藻(Sargassum ploycystum C.Ag.)，粉末馬尾藻(Sargassum incanumGrun.)，粉葉馬尾藻(Sargassum glaucescens J.Ag.)，廣東馬尾藻(Sargassum guangcangiiTseng et Lu)，革葉馬尾藻(Sargassum coriifolium J.Ag.)，海蒿子(Sargassum pallidum(Turn.)Ag.)，海南馬尾藻(Sargassum hainanense)，冠葉馬尾藻(Sargassum cristaefolium(C.Ag.)J.Ag.)，灌叢馬尾藻(Sargassum frutercens Tseng et Lu)，灌木馬尾藻(Sargassum fruticulosumTseng et La)，果囊馬尾藻(Sargassum bacciferum)，海黍子(Sargassum kjellmanianum Yendo)，郝氏馬尾藻(Sargassum herklotsii Setchell)，亨氏馬尾藻(Sargassum henslowianum Ag.)，黑葉馬尾藻(Sargassum nigrifoloides Tseng et Lu)，厚葉馬尾藻(Sargassum crassifolium J.Ag.)，灰葉馬尾藻(Sargassum cinereum J.Ag.)，莢托馬尾藻(Sargassum siliquosum J.Ag.)，角托馬尾藻(Sargassum aemulum Sonder)，嬌美馬尾藻(Sargassum amabile Yamada)，粒莖馬尾藻(Sargassum granuliferum Ag.)，裂葉馬尾藻(Sargassum siliquastrum(Turn.)Ag.)，雷州馬尾藻(Sargassum leizhouense Tseng et Lu)，列葉馬尾藻(Sargassum siliquastrum(Turn.)Ag.)，柳葉馬尾藻(Sargassum fulvellum Agardh)，鹿角馬尾藻(Sargassum cervicorneGrev.)莫氏馬尾藻(Sargassum maclurei Setchell)，硇洲馬尾藻(Sargassum naozhouense Tsenget Lu)，匍枝馬尾藻(Sargassum polycystum Ag.)，欽州馬尾藻(Sargassum qinzhouense Tsenget Lu)，軟葉馬尾藻(Sargassum tenerrimum J.Ag.)，軟枝馬尾藻(Sargassum kuetzingiiSetch)，弱枝馬尾藻(Sargassum kuetzingli Setchell)，日本馬尾藻(Sargassum nipponicumYendo)，上川馬尾藻(Sargassum shangchuanii Tseng et Lu)，少囊馬尾藻(Sargassumoligocystum Mont.)，鼠尾菜(Sargassum thunbergii(Mert.)O Kuntze)，鼠尾藻(Sargassumthunbergii O.kuntze)，斯氏馬尾藻(Sargassum swartzii(Turn.)Ag.)，松弛馬尾藻(Sargassumlaxifolium Tseng et Lu)，太平洋馬尾藻(Sargassum pacificum Bory)，瓦氏馬尾藻(Sargassumvachellianum Grev.)，彎葉馬尾藻(Sargassum subrepandum(Forsk)J.Ag.)，銅藻(Sargassumhorneri(Turn.)Ag.)，潿洲馬尾藻(Sargassum weizhouense Tseng et Lu)，陀螺馬尾藻(Sargassum turbinatifolium Tseng et Lu)，魏氏馬尾藻(Sargassum wightii Grev.)，文昌馬尾藻(Sargassum wenchangense Tseng et Lu)，無肋馬尾藻(Sargassum enerve Ag.)，細(xì)葉馬尾藻(Sargassum gracile J.Ag.)，細(xì)枝馬尾藻(Sargassum tenue J.Ag.)，西沙馬尾藻(Sargassum xishaensis Tseng et Lu)，線形馬尾藻(Sargassum carpilliforme Tseng et Lu)，細(xì)囊馬尾藻(Sargassum parvivesiculosum Tseng et Lu)，狹葉馬尾藻(Sargassum angustifolium(Turn.)C.Ag.)，纖細(xì)馬尾藻(Sargassum subtilissimum Tseng et Lu)，腺隆馬尾藻(Sargassummicrocanthum(Kuetz.)Endlicher)，享氏馬尾藻(Sargassum henslowianum C.Ag.)，小鳥馬尾藻(Sargassum pusillum Tseng et Lu)，斜基馬尾藻(Sargassum assimile Harv.)，羊棲菜(Sargassum fusiforme(Harv.)Setch)，葉囊馬尾藻(Sargassum phyllocystum Tseng et Lu)，葉托馬尾藻(Sargassum carpophyllum J.Ag.)，硬葉馬尾藻(Sargassum aquifolium(Turn.)J.Ag.)，羽葉馬尾藻(Sargassum pinnatifidum Harv.)，鶯歌海馬尾藻(Sargassum yinggehaienseTseng et Lu)，原始馬尾藻(Sargassum primitivum Tseng et Lu)，展枝馬尾藻(Sargassum patensAg.)，重緣葉馬尾藻(Sargassum duplicatum J.Ag.)，錐狀馬尾藻(Sargassum panicnlatumJ.Ag.)。合計(jì)86種馬尾藻。
本發(fā)明分離的方法的具體步驟如下將干燥的馬尾藻剪碎，添加到含有三氯甲烷和甲醇的混合有機(jī)溶劑中，馬尾藻和有機(jī)溶劑的重量/體積比例為1∶3-1∶5mg/ml，三氯甲烷在混合有機(jī)溶劑中的體積含量為66％-80％，用組織搗碎機(jī)充分破碎，過濾，針對殘?jiān)貜?fù)一次上述的提取過程；再用提高了溶劑極性的該混合有機(jī)溶劑提取殘?jiān)械目扇苄晕镔|(zhì)，甲醇在混合有機(jī)溶劑中的體積含量為66-80％；把三次提取的濾液混合，經(jīng)減壓濃縮和真空干燥，從馬尾藻中得到初步提取物；向上述提取物添加三氯甲烷使之溶解，緩慢注入丙酮使活性物質(zhì)沉淀，離心之后得到被初步精制的纖溶促進(jìn)化合物；再以三氯甲烷和甲醇為移動(dòng)相用硅膠層析柱從丙酮的沉淀物中分離出活性物質(zhì)，將得到的活性溶出液濃縮、干燥，用含有1％醋酸的移動(dòng)相三氯甲烷和甲醇的混合有機(jī)溶液層析多次，得到精制的纖溶促進(jìn)化合物。
本發(fā)明方法中，用移動(dòng)相三氯甲烷和甲醇混合有機(jī)溶劑層析次數(shù)，一般為3次，其中，第一次層析，移動(dòng)相中三氯甲烷的體積含量比為75％-80％；第二次層析，移動(dòng)相中三氯甲烷的體積含量比為85％-90％；第三次層析，移動(dòng)相中三氯甲烷的體積含量比為90％-95％。最后層析的移動(dòng)相為100％的三氯甲烷。該化合物被含有1％醋酸的三氯甲烷和甲醇(HCCl3∶CH3OH＝7∶3)的移動(dòng)相在硅膠薄層層析板(Silica gel 60 F254，MERCK)上顯示出唯一的斑點(diǎn)。
該分離方法的優(yōu)點(diǎn)是1、分離所用的設(shè)施和設(shè)備比較簡單。
2、分離所用的溶劑毒副作用相對較小，并且，所用的溶劑能反復(fù)回收利用。
3、操作過程簡單，重現(xiàn)性好。
4、該方法能分離到原料中90％以上的纖溶促進(jìn)化合物，回收性好。
將上述獲得的化合物添加到尿激酶前體、纖溶酶原、SUK(Spectrozyme UK)構(gòu)成的反應(yīng)體系中，以SUK的分解評(píng)價(jià)的纖溶反應(yīng)與對照相比被該天然化合物顯著促進(jìn)了，該天然化合物的這種活性作用被稱為纖溶促進(jìn)作用，所以，從馬尾藻分離出來的該天然化合物被稱為纖溶促進(jìn)化合物。精致的該纖溶促進(jìn)化合物呈微黃色粉末，能溶解于甲醇、氯仿、乙酸乙脂、正己烷，微溶于水，不溶于丙酮。通過核磁共振、氣相-質(zhì)譜、化學(xué)分析等方法將上述精制的活性化合物的分子結(jié)構(gòu)解析成1-棕櫚酰-2-亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯。約15mg纖溶促進(jìn)化合物溶于750μl二亞甲砜，從600MHz的核磁共振儀得到了該化合物一維核磁共振譜和二維核磁共振譜，一維碳譜的特征數(shù)據(jù)為13CNMR(DMSO-d6)δ62.5(C1)，69.7(C2)，64.7(C3)，98.3(C1)，71.6(C2)，72.8(C3)，74.4(C4)，68.4(C5)，54.9(C6)，172.2 and 172.4(C1’，C1”)，33.5 and33.3(C2’，C2”)，24.3(C3’，C3”)，28.3-28.9(C4’-C7’，C12’-C15’，C4”-C13”)，26.5 and 26.4(C8’，C11”)，129.5 and 129.4(C9’，C10’)，31.2(C16’，C14”)，21.9(C17’，C15”)，13.7(C18’，C16”)，一維氫譜的特征數(shù)據(jù)為1H NMR(DMSO-d6)δ4.34(1H，dd，J＝2.6，12.1)and 4.21(1H，dd，J＝2.6，12.1)(1-H2)，5.12(1H，m)(2-H)，3.87(1H，dd，J＝5.8，10.6)and 3.41(1H，dd，J＝5.5，10.6)(3-H2)，4.56(1H，d，J＝3.7)(1-H)，3.18(1H，dd，J＝4.4，9.2)(2-H)，3.36(1H，t，J＝9.2)(3-H)，2.94(1H，t，J＝9.2)(4-H)，3.78(1H，ddd，J＝5.1，5.5，9.5)(5-H)，2.88(1H，dd，J＝4.8，13.9)and 2.57(1H，dd，J＝6.2，13.9)(6-H)，2.26(4H，m)(2’-H2，2”-H2)，1.49(4H，m)(3’-H2，3”-H2)，1.2-1.3(m)(4’-H2-7’-H2，12’-H2-17’-H2，4”-H2-15”-H2)，1.97(4H，m)(8’-H2，11’-H2)，5.04(2H，t，J＝4.8)(9’-H，10’-H)，0.84(6H，t，J＝6.8)(18’-H3，16”-H3)。通過GC-MS確定該化合物的構(gòu)成脂肪酸為棕櫚酸和亞油酸，從質(zhì)譜譜圖和核磁共振譜的特征數(shù)據(jù)確定甘油的一位連接棕櫚酸、二位連接亞油酸。以溴化鉀法測得的紅外光譜的特征吸收峰為IR(NaBr)vmax(cm-1)3400(br)，2920，2852，1742，1219，1171，1035，771。該化合物溶于甲醇得到了末端吸收的紫外光譜數(shù)據(jù)。最后確定該化合物為1-棕櫚酰-2-亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯。
1-棕櫚酰-24亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)具體實(shí)施方式
一種具有纖溶促進(jìn)作用的天然化合物的分離方法作為天然化合物的分離技術(shù)，適用于以馬尾藻為原料的甘油糖脂類化合物的分離，該甘油糖脂類化合物具有纖溶促進(jìn)作用，是一種以甲醇、氯仿、丙酮、乙酸為溶劑，以常壓硅膠色譜分離該天然化合物的方法。使用有機(jī)溶劑甲醇和氯仿(三氯甲烷)提取該纖溶促進(jìn)化合物，提取出來的該纖溶促進(jìn)化合物被丙酮沉淀。利用開放式硅膠柱層析的吸附-洗脫原理分離該纖溶促進(jìn)化合物，在分離的過程中使用兩次以上的硅膠色譜分離方法。下面以微老馬尾藻、羊棲菜和海蒿子為例來敘述具體的實(shí)施方式。
1，從微勞馬尾藻中分離纖溶促進(jìn)化合物將干燥的微勞馬尾藻植株200g剪碎至0.5cm長短，添加到900ml三氯甲烷和甲醇的混合液(HCCl3∶CH3OH＝2∶1)中，用組織搗碎機(jī)充分破碎，過濾之后回收濾液，針對殘?jiān)貜?fù)一次上述的提取過程。再用提高了溶劑極性的該混合液(HCCl3∶CH3OH＝1∶2)提取殘?jiān)械目扇苄晕镔|(zhì)。把三次提取的濾液混合，經(jīng)減壓濃縮和真空干燥，從200g微勞馬尾藻中得到了提取物15g。
向上述提取物添加15ml三氯甲烷使之溶解，緩慢注入300ml丙酮使活性物質(zhì)沉淀，在3000rpm，5min的室溫條件下離心，得到被初步精制的活性物質(zhì)500mg。在該過程中，如果使用了其它溶劑如2-丁醇、乙酸乙脂、含水丙酮等都不能使活性物質(zhì)沉淀?；钚晕镔|(zhì)不能沉淀出來隨后的分離無法實(shí)施。
以三氯甲烷和甲醇為移動(dòng)相用常壓硅膠層析柱從丙酮的沉淀物中分離出活性物質(zhì)，得到的活性溶出液濃縮、干燥之后，用含有1％醋酸的移動(dòng)相三氯甲烷和甲醇的成比例混合有機(jī)溶液層析3次。3次層析，移動(dòng)相中三氯甲烷占體積百分比依次為80％、90％、95％。最后從層析柱的三氯甲烷溶出液中得到活性物質(zhì)15mg。
該活性物質(zhì)被含有1％醋酸的三氯甲烷和甲醇(HCCl3∶CH3OH＝7∶3)的移動(dòng)相在硅膠薄層層析板(Silica gel 60 F254，MERCK)上顯示出唯一的斑點(diǎn)Rf＝0.48。
分離到的纖溶化合物是1-棕櫚酰-2-亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯，分子量為756、分子式是C43H80O10，微黃色粉末，能溶解于甲醇、氯仿、乙酸乙脂、正己烷，微溶于水，不溶于丙酮。一維碳譜的特征數(shù)據(jù)為13C NMR(DMSO-d6)δ62.5(C1)，69.7(C2)，64.7(C3)，98.3(C1)，71.6(C2)，72.8(C3)，74.4(C4)，68.4(C5)，54.9(C6)，172.2 and172.4(C1’，C1”)，33.5 and 33.3(C2’，C2”)，24.3(C3’，C3”)，28.3-28.9(C4’-C7’，C12’-C15’，C4”-C13”)，26.5 and 26.4(C8’，C11”)，129.5 and 129.4(C9’，C10’)，31.2(C16’，C14”)，21.9(C17’，C15”)，13.7(C18’，C16”)，一維氫譜的特征數(shù)據(jù)為1H NMR(DMSO-d6)δ4.34(1H，dd，J＝2.6，12.1)and 4.21(1H，dd，J＝2.6，12.1)(1-H2)，5.12(1H，m)(2-H)，3.87(1H，dd，J＝5.8，10.6)and 3.41(1H，dd，J＝5.5，10.6)(3-H2)，4.56(1H，d，J＝3.7)(1-H)，3.18(1H，dd，J＝4.4，9.2)(2-H)，3.36(1H，t，J＝9.2)(3-H)，2.94(1H，t，J＝9.2)(4-H)，3.78(1H，ddd，J＝5.1，5.5，9.5)(5-H)，2.88(1H，dd，J＝4.8，13.9)and 2.57(1H，dd，J＝6.2，13.9)(6-H)，2.26(4H，m)(2’-H2，2”-H2)，1.49(4H，m)(3’-H2，3”-H2)，1.2-1.3(m)(4’-H2-7’-H2，12’-H2-17’-H2，4”-H2-15”-H2)，1.97(4H，m)(8’-H2，11’-H2)，5.04(2H，t，J＝4.8)(9’-H，10’-H)，0.84(6H，t，J＝6.8)(18’-H3，16”-H3)。通過GC-MS確定該化合物的構(gòu)成脂肪酸為棕櫚酸和亞油酸，從質(zhì)譜譜圖和核磁共振譜的特征數(shù)據(jù)確定甘油的一位連接棕櫚酸、二位連接亞油酸。以溴化鉀法測得的紅外光譜的特征吸收峰為IR(NaBr)vmax(cm-1)3400(br)，2920，2852，1742，1219，1171，1035，771。該化合物溶于甲醇得到了末端吸收的紫外光譜數(shù)據(jù)。
1-棕櫚酰-2-亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)2，從羊棲菜中分離纖溶促進(jìn)化合物將干燥的羊棲菜植株200g剪碎至0.5cm長短，添加到900ml三氯甲烷和甲醇的混合液(HCCl3∶CH3OH＝2∶1)中，用組織搗碎機(jī)充分破碎，過濾之后回收濾液，針對殘?jiān)貜?fù)一次上述的提取過程。再用提高了溶劑極性的該混合液(HCCl3∶CH3OH＝1∶2.5)提取殘?jiān)械目扇苄晕镔|(zhì)。把三次提取的濾液混合，經(jīng)減壓濃縮和真空干燥，從200g羊棲菜中得到了提取物18g。如果使用單一的甲醇、氯仿、乙醇、水等溶劑，羊棲菜中的活性化合物不能被提取出來，組織的充分破碎是分離纖溶促進(jìn)化合物的前提條件。
向上述提取物添加18ml三氯甲烷使之充分溶解，緩慢注入360ml丙酮使活性物質(zhì)沉淀，在3000rpm，5min的室溫條件下離心，得到被初步精制的活性物質(zhì)385mg。在該過程中，如果使用了其它溶劑如2-丁醇、乙酸乙脂、含水丙酮等都不能使活性物質(zhì)沉淀?；钚晕镔|(zhì)不能沉淀出來隨后的分離無法實(shí)施。
以三氯甲烷和甲醇為移動(dòng)相用常壓硅膠層析柱從丙酮的沉淀物中分離出活性物質(zhì)，得到的活性溶出液濃縮、干燥之后，用含有1％醋酸的移動(dòng)相三氯甲烷和甲醇的成比例混合有機(jī)溶液層析3次。3次層析，移動(dòng)相中三氯甲烷所占的體積百分比依次為75％、85％、90％。最后從層析柱的三氯甲烷溶出液中得到活性物質(zhì)10mg。
該活性物質(zhì)被含有1％醋酸的三氯甲烷和甲醇(HCCl3∶CH3OH＝6∶4)的移動(dòng)相在硅膠薄層層析板(Silica gel 60 F254，MERCK)上顯示出唯一的斑點(diǎn)Rf＝0.70。
分離到的纖溶化合物是1-棕櫚酰-2-亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯，分子量為756、分子式是C43H80O10，微黃色粉末，能溶解于甲醇、氯仿、乙酸乙脂、正己烷，微溶于水，不溶于丙酮。一維碳譜的特征數(shù)據(jù)為13C NMR(DMSO-d6)δ62.5(C1)，69.7(C2)，64.7(C3)，98.3(C1)，71.6(C2)，72.8(C3)，74.4(C4)，68.4(C5)，54.9(C6)，1 72.2 and172.4(C1’，C1”)，33.5 and 33.3(C2’，C2”)，24.3(C3’，C3”)，28.3-28.9(C4’-C7’，C12’-C15’，C4”-C13”)，26.5 and 26.4(C8’，C11”)，129.5 and 129.4(C9’，C10’)，31.2(C16’，C14”)，21.9(C17’，C15”)，13.7(C18’，C16”)，一維氫譜的特征數(shù)據(jù)為1H NMR(DMSO-d6)δ4.34(1H，dd，J＝2.6，12.1) and 4.21(1H，dd，J＝2.6，12.1)(1-H2)，5.12(1H，m)(2-H)，3.87(1H，dd，J＝5.8，10.6) and 3.41(1H，dd，J＝5.5，10.6)(3-H2)，4.56(1H，d，J＝3.7)(1-H)，3.18(1H，dd，J＝4.4，9.2)(2-H)，3.36(1H，t，J＝9.2)(3-H)，2.94(1H，t，J＝9.2)(4-H)，3.78(1H，ddd，J＝5.1，5.5，9.5)(5-H)，2.88(1H，dd，J＝4.8，13.9)and2.57(1H，dd，J＝6.2，13.9)(6-H)，2.26(4H，m)(2’-H2，2”-H2)，1.49(4H，m)(3’-H2，3”-H2)，1.2-1.3(m)(4’-H2-7’-H2，12’-H2-17’-H2，4”-H2-15”-H2)，1.97(4H，m)(8’-H2，11’-H2)，5.04(2H，t，J＝4.8)(9’-H，10’-H)，0.84(6H，t，J＝6.8)(18’-H3，16”-H3)。通過GC-MS確定該化合物的構(gòu)成脂肪酸為棕櫚酸和亞油酸，從質(zhì)譜譜圖和核磁共振譜的特征數(shù)據(jù)確定甘油的一位連接棕櫚酸、二位連接亞油酸。以溴化鉀法測得的紅外光譜的特征吸收峰為IR(NaBr)vmax(cm-1)3400(br)，2920，2852，1742，1219，1171，1035，771。該化合物溶于甲醇得到了末端吸收的紫外光譜數(shù)據(jù)。
1-棕櫚酰-2-亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)3，從海蒿子分離纖溶促進(jìn)化合物將干燥的海蒿子植株200g剪碎至0.5cm長短，添加到900ml三氯甲烷和甲醇的混合液(HCCl3∶CH3OH＝3∶1)中，用組織搗碎機(jī)充分破碎，過濾之后回收濾液，針對殘?jiān)貜?fù)一次上述的提取過程。再用提高了溶劑極性的該混合液(HCCl3∶CH3OH＝1∶3)提取殘?jiān)械目扇苄晕镔|(zhì)。把三次提取的濾液混合，經(jīng)減壓濃縮和真空干燥，從200g海蒿子中得到了提取物12g。如果使用單一的甲醇、氯仿、乙醇、水等溶劑，羊棲菜中的活性化合物不能被提取出來，組織的充分破碎是分離纖溶促進(jìn)化合物的前提條件。
向上述提取物添加12ml三氯甲烷使之充分溶解，緩慢注入240ml丙酮使活性物質(zhì)沉淀，在3000rpm，5min的室溫條件下離心，得到被初步精制的活性物質(zhì)350mg。在該過程中，如果使用了其它溶劑如2-丁醇、乙酸乙脂、含水丙酮等都不能使活性物質(zhì)沉淀。活性物質(zhì)不能沉淀出來隨后的分離無法實(shí)施。
以三氯甲烷和甲醇為移動(dòng)相用常壓硅膠層析柱從丙酮的沉淀物中分離出活性物質(zhì)，得到的活性溶出液濃縮、干燥之后，用含有1％醋酸的移動(dòng)相三氯甲烷和甲醇的成比例混合有機(jī)溶液層析1次，最后從層析柱的三氯甲烷溶出液中得到活性物質(zhì)8mg。初步精致的化合物用逆相高壓液相色譜和順相都不能實(shí)現(xiàn)分離的目的，大孔樹脂也不能分離該纖溶促進(jìn)化合物，當(dāng)使用2次以上的常壓硅膠層析后，纖溶化合物被分離了。
該活性物質(zhì)被含有1％醋酸的三氯甲烷和甲醇(HCCl3∶CH3OH＝8∶2)的移動(dòng)相在硅膠薄層層析板(Silica gel 60 F254，MERCK)上顯示出唯一的斑點(diǎn)Rf＝0.30。
分離到的纖溶化合物是1-棕櫚酰-2-亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯，分子量為756、分子式是C43H80O10，微黃色粉末，能溶解于甲醇、氯仿、乙酸乙脂、正己烷，微溶于水，不溶于丙酮。一維碳譜的特征數(shù)據(jù)為13C NMR(DMSO-d6)δ62.5(C1)，69.7(C2)，64.7(C3)，98.3(C1)，71.6(C2)，72.8(C3)，74.4(C4)，68.4(C5)，54.9(C6)，172.2 and172.4(C1’，C1”)，33.5 and 33.3(C2’，C2”)，24.3(C3’，C3”)，28.3-28.9(C4’-C7’，C12’-C15’，C4”-C13”)，26.5 and 26.4(C8’，C11”)，129.5 and 129.4(C9’，C10’)，31.2(C16’，C14”)，21.9 (C17’，C15”)，13.7(C18’，C16”)，一維氫譜的特征數(shù)據(jù)為1H NMR(DMSO-d6)δ4.34(1H，dd，J＝2.6，12.1)and 4.21(1H，dd，J＝2.6，12.1)(1-H2)，5.12(1H，m)(2-H)，3.87(1H，dd，J＝5.8，10.6)and 3.41(1H，dd，J＝5.5，10.6)(3-H2)，4.56(1H，d，J＝3.7)(1-H)，3.18(1H，dd，J＝4.4，9.2)(2-H)，3.36(1H，t，J＝9.2)(3-H)，2.94(1H，t，J＝9.2)(4-H)，3.78(1H，ddd，J＝5.1，5.5，9.5)(5-H)，2.88(1H，dd，J＝4.8，13.9)and 2.57(1H，dd，J＝6.2，13.9)(6-H)，2.26(4H，m)(2’-H2，2”-H2)，1.49(4H，m)(3’-H2，3”-H2)，1.2-1.3(m)(4’-H2-7’-H2，12’-H2-17’-H2，4”-H2-15”-H2)，1.97(4H，m)(8’-H2，11’-H2)，5.04(2H，t，J＝4.8)(9’-H，10’-H)，0.84(6H，t，J＝6.8)(18’-H3，16”-H3)。通過GC-MS確定該化合物的構(gòu)成脂肪酸為棕櫚酸和亞油酸，從質(zhì)譜譜圖和核磁共振譜的特征數(shù)據(jù)確定甘油的一位連接棕櫚酸、二位連接亞油酸。以溴化鉀法測得的紅外光譜的特征吸收峰為IR(NaBr)vmax(cm-1)3400(br)，2920，2852，1742，1219，1171，1035，771。該化合物溶于甲醇得到了末端吸收的紫外光譜數(shù)據(jù)。
1-棕櫚酰-2-亞油酰-α-D-葡萄糖甘油酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種具有溶纖促進(jìn)作用的天然化合物的分離方法，其特征在于具體步驟如下將干燥的馬尾藻剪碎，添加到含有三氯甲烷和甲醇的混合有機(jī)溶劑中，馬尾藻和有機(jī)溶劑的重量/體積比例為1∶3-1∶5mg/ml，三氯甲烷在混合有機(jī)溶劑中的體積含量為66％-80％，用組織搗碎機(jī)充分破碎，過濾，針對殘?jiān)貜?fù)一次上述的提取過程；再用提高了溶劑極性的該混合有機(jī)溶劑提取殘?jiān)械目扇苄晕镔|(zhì)，甲醇在混合有機(jī)溶劑中的體積含量為66-80％；把三次提取的濾液混合，經(jīng)減壓濃縮和真空干燥，從馬尾藻中得到初步提取物；向上述提取物添加三氯甲烷使之溶解，注入丙酮使活性物質(zhì)沉淀，離心之后得到被初步精制的纖溶促進(jìn)化合物；再以三氯甲烷和甲醇為移動(dòng)相用硅膠層析柱從丙酮的沉淀物中分離出活性物質(zhì)，將得到的活性溶出液濃縮、干燥，用含有1％醋酸的移動(dòng)相三氯甲烷和甲醇的混合有機(jī)溶劑層析多次，得到精制的纖溶促進(jìn)化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于用移動(dòng)相三氯甲烷和甲醇混合有機(jī)溶劑層析次數(shù)為3次，其中，第一次層析，移動(dòng)相中三氯甲烷的體積含量為75％-80％；第二次層析，移動(dòng)相中三氯甲烷的體積含量為85％-90％；第三次層析，移動(dòng)相中三氯甲烷的體積含量為90％-95％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于所述馬尾藻為下述之一種微勞馬尾藻，漂浮馬尾藻，麗鈴馬尾藻，凹頂馬尾藻，半葉馬尾藻，棒托馬尾藻，草葉馬尾藻，賓德馬尾藻，長干馬尾藻，檗葉馬尾藻，長托馬尾藻，刺莖馬尾藻，冬青葉馬尾藻，多囊馬尾藻，短葉馬尾藻，多孢馬尾藻，匐枝馬尾藻，粉末馬尾藻，粉葉馬尾藻，廣東馬尾藻，革葉馬尾藻，海蒿子，海南馬尾藻，冠葉馬尾藻，灌叢馬尾藻，灌木馬尾藻，果囊馬尾藻，海黍子，郝氏馬尾藻，亨氏馬尾藻，黑葉馬尾藻，厚葉馬尾藻，灰葉馬尾藻，莢托馬尾藻，角托馬尾藻，嬌美馬尾藻，粒莖馬尾藻，裂葉馬尾藻，雷州馬尾藻，列葉馬尾藻，柳葉馬尾藻，鹿角馬尾藻莫氏馬尾藻，硇洲馬尾藻，匍枝馬尾藻，欽州馬尾藻，軟葉馬尾藻，軟枝馬尾藻，弱枝馬尾藻，日本馬尾藻，上川馬尾藻，少囊馬尾藻，鼠尾菜，鼠尾藻，斯氏馬尾藻，松弛馬尾藻，太平洋馬尾藻，瓦氏馬尾藻，彎葉馬尾藻，銅藻，潿洲馬尾藻，陀螺馬尾藻，魏氏馬尾藻，文昌馬尾藻，無肋馬尾藻，細(xì)葉馬尾藻，細(xì)枝馬尾藻，西沙馬尾藻，線形馬尾藻，細(xì)囊馬尾藻，狹葉馬尾藻，纖細(xì)馬尾藻，腺隆馬尾藻，享氏馬尾藻，小鳥馬尾藻，斜基馬尾藻，羊棲菜，葉囊馬尾藻，葉托馬尾藻，硬葉馬尾藻，羽葉馬尾藻，鶯歌海馬尾藻，原始馬尾藻，展枝馬尾藻，重緣葉馬尾藻，錐狀馬尾藻。
全文摘要
本發(fā)明屬于天然化合物的分離技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種方便、實(shí)用的纖溶促進(jìn)化合物的分離方法。以常壓硅膠色譜為主來分離具有纖溶促進(jìn)作用的甘油糖酯類化合物還沒有報(bào)道。該發(fā)明用氯仿－甲醇混合溶劑提取、原料殘?jiān)^濾、丙酮沉淀離心、常壓硅膠柱層系等步驟，從馬尾藻中撮分離獲得具有促進(jìn)纖溶作用的天然化合物。經(jīng)核磁共振譜、質(zhì)譜和化學(xué)分析方法該化合物被解析為α－D－葡萄糖甘油二脂，分離到的α－D－葡萄糖甘油二酯的分子量是756、分子式是C
文檔編號(hào)A61K36/02GK101037458SQ200710039400
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月12日
發(fā)明者吳文惠, 包斌, 姝亞, 許劍鋒, 劉克海 申請人:上海水產(chǎn)大學(xué)