專利名稱：以介芬胺為原料制備環(huán)杷明的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)杷明的制備方法，具體地涉及一種以來(lái)源于藜蘆屬植物的介芬胺為原料制備環(huán)杷明的方法，以及該環(huán)杷明在治療胰腺癌、髓母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌等Hh信號(hào)通路表達(dá)的腫瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Hedgehog(Hh)信號(hào)通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，是引發(fā)果蠅幼蟲(chóng)發(fā)育的信號(hào)通路。進(jìn)一步的研究表明，Hh信號(hào)通路包括Patched(Ptc)蛋白和Smoothened(Smo)蛋白及Ci(Gli)蛋白、Cos2蛋白、Fused激酶、蛋白SuFu的復(fù)合體，目的基因。Hh蛋白是一種分泌蛋白，經(jīng)過(guò)自身的修飾獲得活性；Patched蛋白是Hh信號(hào)蛋白的受體；Smo蛋白是Hh信號(hào)的轉(zhuǎn)換器。當(dāng)Hh蛋白存在時(shí)，Ptch失去對(duì)Smo的抑制作用，Smo蛋白活化，為復(fù)合體提供磷酸，促使Ci(Gli)轉(zhuǎn)變?yōu)榇呋瘎┬问?155kDa)，進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄；相反，當(dāng)Hh蛋白缺失時(shí)，Smo受到Ptch抑制，Ci(Gli)被蛋白酶水解，其抑制劑形式(75kDa)在細(xì)胞核中阻止基因的轉(zhuǎn)錄。
Hh信號(hào)通路是眾多動(dòng)物胚胎發(fā)育及臟器、組織發(fā)育的信號(hào)通路。胚胎中Hh信號(hào)通路的缺失會(huì)引起發(fā)育缺陷或畸形。在越來(lái)越多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)異常的Hh信號(hào)通路激活，因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者逐步認(rèn)識(shí)到Hh信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。并且隨著在此領(lǐng)域研究的深入和范圍的擴(kuò)展，發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路的異常表達(dá)是引起基底細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、胰腺細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等腫瘤疾病的原因。因此，抑制Hh信號(hào)通路的異常表達(dá)是治療腫瘤的有效方法之一。
環(huán)杷明(cyclopamine)是存在于藜蘆和貝母屬植物中的一種異膽甾烷類生物堿，最初在1964年發(fā)現(xiàn)于毛葉藜蘆(Veratrum grandiflorum(Maxim.)Loes.f.)(Masamune，T.，et al.，Bull.Chem.Soc.Jpn.38(8)1374-1378(1965))。20世紀(jì)60年代到80年代對(duì)于環(huán)杷明的研究?jī)H限于其致畸作用，直到20世紀(jì)90年代中期才發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明是Hh信號(hào)通路的抑制劑，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)(Cooper，M.K.，et al.，Science 280，1603-1607(1998))。
Johns Hopkings大學(xué)的Berman研究組將髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞移植至大鼠，經(jīng)過(guò)環(huán)杷明處理，發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并且使大鼠體內(nèi)的腫瘤縮小。Hutchinson癌癥研究中心的Olson對(duì)髓母細(xì)胞瘤樣品進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明能殺滅99.9％的腫瘤細(xì)胞(Bermn，D.M.，etal.，Science 297，1559-1561(2002))。在研究環(huán)杷明對(duì)胰腺癌細(xì)胞株的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)Smo基因高表達(dá)的細(xì)胞株經(jīng)環(huán)杷明處理后與對(duì)照組相比增殖率下降75％-80％，凋亡增加2.5-3.5倍。并且用環(huán)杷明治療接種對(duì)環(huán)杷明敏感的細(xì)胞株的裸鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，治療組50％-60％的腫瘤體積縮小。表明環(huán)杷明在體內(nèi)和體外都可以通過(guò)Hh途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻斷增值(Thayer，S.p.，etal.，Nature 425，851-855(2003))。
以上結(jié)果可以看出，環(huán)杷明只對(duì)Hh信號(hào)通路表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，表現(xiàn)出極強(qiáng)的專一性。而且早期的毒理研究表明，環(huán)杷明對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒性，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒副作用也很小。許多專家認(rèn)為這開(kāi)啟了治療腫瘤的一個(gè)極具前景的新途徑。該領(lǐng)域的權(quán)威，美國(guó)JohnsHopkings大學(xué)P.A.，Beachy稱目前的實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)杷明殺死腫瘤細(xì)胞的速度快于以往的任何藥物，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物看不出任何副作用(Beachy，P.A.，et al.，Nature，411，349-354(2001))。但是，環(huán)杷明在植物中的含量很低，僅有萬(wàn)分之一，并且化學(xué)全合成極為困難。曾有過(guò)報(bào)道用介芬胺為原料采用Wolff-Kishner法還原得到環(huán)杷明，但在該方法中采用易燃高危險(xiǎn)的肼，反應(yīng)條件要求苛刻，產(chǎn)率低，僅有20％左右(Masamune，T.，et al.，Bull.Chem.Soc.Jpn.38(8)1374-1378(1965))。后又有人采用改進(jìn)的Wolff-Kishner-黃鳴龍法還原制備環(huán)杷明，但仍存在產(chǎn)物收率低的問(wèn)題(約50％)，且有異構(gòu)體3-表環(huán)杷明存在(周劍俠，等.中國(guó)藥物化學(xué)雜志，16(5)303-305(2006))。環(huán)杷明的來(lái)源問(wèn)題成為其被開(kāi)發(fā)成藥品的一大障礙。
本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)了環(huán)杷明的前驅(qū)物--介芬胺，其在該種藜蘆中的含量較高，并且該種藜蘆的資源豐富。發(fā)明人進(jìn)行了40余次用介芬胺制備環(huán)杷明的反復(fù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了反應(yīng)條件，可以方便地高收率地制備得到環(huán)杷明，并且所需的反應(yīng)條件容易達(dá)到，適于工業(yè)生產(chǎn)。通過(guò)介芬胺制備環(huán)杷明成為一條切實(shí)可行的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種反應(yīng)快速方便、產(chǎn)率高的以介芬胺為原料制備環(huán)杷明的方法。
本發(fā)明提出的由介芬胺制備環(huán)杷明的方法，其步驟如下將介芬胺原料和水合肼、強(qiáng)堿在相轉(zhuǎn)移催化劑的催化下，在高沸點(diǎn)溶劑中反應(yīng)，介芬胺和水合肼的摩爾比為1.1∶1-3∶1，反應(yīng)溫度為160-200℃，反應(yīng)時(shí)間為2-7小時(shí)。反應(yīng)用高沸點(diǎn)溶劑的用量為每g介芬胺用0.2-0.6L溶劑。反應(yīng)結(jié)束后，加入水，并以中等極性的有機(jī)溶劑萃取，收集有機(jī)溶劑層，除去水分后濃縮，析出結(jié)晶即為環(huán)杷明。
反應(yīng)中強(qiáng)堿為氫氧化鉀或叔丁醇鉀。高沸點(diǎn)溶劑為一縮二乙二醇、二甲基亞砜、1，3-丙二醇或乙二醇。
相轉(zhuǎn)移催化劑可以用分子量為400的聚乙二醇，用量為反應(yīng)溶劑體積的2～8％(ml/ml)，優(yōu)選為5％。相轉(zhuǎn)移催化劑也可以為芐基三乙基氯化銨(TEBA)，用量為介芬胺重量的1～3％(g/g)。
反應(yīng)結(jié)束后萃取的中等極性的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一種或多種。
析出結(jié)晶后的母液中含有部分環(huán)杷明，用柱層析法進(jìn)一步純化，得到環(huán)杷明。柱層析所用的吸附劑為硅膠、氧化鋁或聚酰胺。洗脫用的溶劑為石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中的一種或多種。
從介芬胺合成環(huán)杷明的反應(yīng)過(guò)程如下 本發(fā)明中制備的環(huán)杷明的熔點(diǎn)及核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Gaffield，W.，et al.，J.Nat.Prod.49(2)286-292(1986))一致。
本發(fā)明中，所述原料介芬胺可從藜蘆植物中提取獲得，具體提取步驟如下將藥材藜蘆植物的干燥根莖粉碎后用乙醇熱提或冷浸，將提取液或冷浸液濃縮；對(duì)濃縮的粗提物經(jīng)酸化和堿沉處理，再用硅膠柱層析法，分離得到介芬胺；所用的洗脫劑是二氯甲烷和甲醇體系或石油醚和乙酸乙酯體系。
其中熱提時(shí)采用75％的乙醇，熱提2-4次，每次乙醇用量為藥材(藜蘆根莖)體積的3-5倍。冷浸用75％-95％的乙醇，優(yōu)選95％的乙醇，冷浸2-4次，每次乙醇的用量為藥材體積的4-10倍，優(yōu)選5-7倍體積。酸化處理的酸為質(zhì)量濃度為0.5％-5％的硫酸或鹽酸，優(yōu)選1％-2％的質(zhì)量濃度。堿沉處理用的堿為濃氨水或碳酸鈉的飽和液，調(diào)節(jié)酸化處理的溶液pH值為7-10，優(yōu)選8-9。
介芬胺的結(jié)構(gòu)式如下
環(huán)杷明的結(jié)構(gòu)式如下 本發(fā)明還提出含有上述環(huán)杷明及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5％-95％的活性成分。
上文所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過(guò)透皮吸收、口服、靜脈注射給藥的方式用于需要這種治療的患者。用于透皮吸收時(shí)，可將其制成乳膏、軟膏或凝膠貼片制劑；用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于靜脈注射給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是乳膏貼片、片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑和注射劑。
環(huán)杷明對(duì)有Hh信號(hào)通路表達(dá)的胰腺癌、髓母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞株的增殖表現(xiàn)出特異性抑制作用。因此，本發(fā)明制備的環(huán)杷明及上述藥物組合物可用于這些腫瘤的治療。
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。


圖1為環(huán)杷明對(duì)胰腺癌腫瘤細(xì)胞株的抑制活性。
圖2為環(huán)杷明對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的抑制活性圖3為環(huán)杷明對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的抑制活性具體實(shí)施方式
實(shí)施例1取5kg藜蘆根莖的粗粉，用95％的乙醇冷浸兩次，每次的用量為30L的乙醇。冷浸液濃縮至流浸膏狀，拌入0.5kg的硅藻土，晾至近干后裝柱，用質(zhì)量濃度2％的硫酸洗脫。洗脫下來(lái)的酸水用濃氨水調(diào)pH＝9，靜置2h后過(guò)濾，得到的40g總生物堿。拌入100g 200-300目的硅膠中，另用1kg 200-300目硅膠裝。用石油醚∶乙酸乙酯體系(5∶1-2∶1-1∶1-0∶1)洗脫，收集11-16餾分，各180mL。各餾分濃縮至60mL后于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出淡黃色針狀介芬胺，總重325mg。經(jīng)HPLC檢測(cè)含量達(dá)99.1％。
實(shí)施例2取5kg藜蘆根莖的粗粉，用75％的乙醇熱提3次，每次的用量為15L的乙醇。提取液濃縮至無(wú)醇味，剩余物用2％的硫酸酸化至pH＝1。離心，取上清液，用濃氨水調(diào)pH＝9，用氯仿萃取3次，每次2L。氯仿層濃縮至0.5L，拌入200g 200-300目的硅膠中蒸干，另用2kg200-300目硅膠裝。用二氯甲烷∶甲醇體系(20∶1-10∶1-5∶1-2∶1)洗脫，收集8-12餾分，各180mL，濃縮后上Sephadex-LH20，用甲醇洗脫，除去少量的黃酮和色素。餾分濃縮至60mL后于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出淡黃色針狀介芬胺，總重289mg。經(jīng)HPLC檢測(cè)含量達(dá)98％以上。
實(shí)施例3將50mg介芬胺溶于30mL二縮乙二醇，加入10μL水合肼，5％體積比的聚乙二醇400和0.2g的氫氧化鉀，在160℃下攪拌，2h后降溫至120℃，除去水份，再升溫至190±5℃，反應(yīng)2.5h左右。反應(yīng)液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后用無(wú)水硫酸鈉干燥。濃縮至5mL，于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出無(wú)色針狀結(jié)晶28mg，母液上硅膠柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脫，得到白色粉末6mg，共計(jì)34mg，收率70.3％。TLC展開(kāi)后噴KBiI4顯色，只有一個(gè)斑點(diǎn)。熔點(diǎn)125-128℃，1H-NMR，13C-NMR數(shù)據(jù)如表1，與文獻(xiàn)(Gaffield，W.，et al.，J.Nat.Prod.49(2)286-292(1986))基本一致。
實(shí)施例4將50mg介芬胺溶于15mL二縮乙二醇，加入7μL水合肼，2％體積比的聚乙二醇400，在160℃下攪拌，2h后降溫至120℃，除去水份，加入0.2g的氫氧化鉀，再升溫至190±5℃，反應(yīng)4h左右。反應(yīng)液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后用無(wú)水硫酸鈉干燥。濃縮至5mL，于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出無(wú)色針狀結(jié)晶36mg，母液上硅膠柱，用梯度的二氯甲烷∶甲醇混合液洗脫，得到白色粉末5mg，共計(jì)41mg，收率82％。TLC展開(kāi)后噴KBiI4顯色，只有一個(gè)斑點(diǎn)。熔點(diǎn)125-128℃，與實(shí)施例3中的晶體混合后熔點(diǎn)不下降。ESI[M+H]412。
實(shí)施例5將50mg介芬胺溶于15mL二縮乙二醇，加入10μL水合肼，1mg的TEBA和0.3g的氫氧化鉀，在160℃下攪拌，2h后降溫至120℃，除去水份，再升溫至190±5℃，反應(yīng)2.5h左右。反應(yīng)液加入50mL水中，用100mL×2氯仿萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后用無(wú)水硫酸鈉干燥。濃縮至6mL，于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出無(wú)色針狀結(jié)晶28mg，母液上硅膠柱，用梯度的二氯甲烷∶甲醇混合液洗脫，得到白色粉末5mg，共計(jì)33mg，收率66％。TLC展開(kāi)后噴KBiI4顯色，只有一個(gè)斑點(diǎn)。熔點(diǎn)125-128℃，與實(shí)施例3中的晶體混合后熔點(diǎn)不下降。ESI[M+H]412。
實(shí)施例6將50mg介芬胺溶于25mL乙二醇，加入20μL水合肼，5％體積比的聚乙二醇400和0.2g的氫氧化鉀，在反應(yīng)瓶上加上除水裝置，在160℃，0.06MPa真空度下回流2h，恢復(fù)至常壓后升溫至195-200℃，反應(yīng)4h左右。反應(yīng)液加入40mL水中，用40mL×2二氯甲烷萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后用無(wú)水硫酸鈉干燥。濃縮至5mL，于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出無(wú)色針狀結(jié)晶33mg，母液上氧化鋁柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脫，得到白色粉末5mg，共計(jì)38mg，收率76％。TLC展開(kāi)后噴KBiI4顯色，只有一個(gè)斑點(diǎn)。熔點(diǎn)125-128℃，與實(shí)施例3中的晶體混合后熔點(diǎn)不下降。ESI[M+H]412。
實(shí)施例7將50mg介芬胺溶于15mL DMSO中，加入10μL水合肼，8％體積比的聚乙二醇400和0.1g的氫氧化鉀，在160℃下攪拌，2h后降溫至120℃，除去水份，再升溫至190±5℃，反應(yīng)4h左右。反應(yīng)液加入100mL水中，用100mL×2丙酮萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后用無(wú)水硫酸鈉干燥。濃縮至5mL，于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出無(wú)色針狀結(jié)晶26mg，母液上硅膠柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脫，得到白色粉末10mg，共計(jì)36mg，收率72％。TLC展開(kāi)后噴KBiI4顯色，只有一個(gè)斑點(diǎn)。熔點(diǎn)125-128℃，與實(shí)施例3中的晶體混合后熔點(diǎn)不下降。ESI[M+H]412。
實(shí)施例8將50mg介芬胺溶于15mL二縮乙二醇，加入10μL水合肼，5％體積比的聚乙二醇400，在160℃，0.06MPa真空度條件下回流2.5h，降溫至30℃，加入0.4g的叔丁醇鉀，反應(yīng)6h左右。反應(yīng)液加入60mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后用無(wú)水硫酸鈉干燥。濃縮至6mL，于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出無(wú)色針狀結(jié)晶29mg，母液上硅膠柱，用梯度的乙酸乙酯∶丙酮混合液洗脫，得到白色粉末8mg，共計(jì)37mg，收率74％。TLC展開(kāi)后噴KBiI4顯色，只有一個(gè)斑點(diǎn)。熔點(diǎn)125-128℃，與實(shí)施例3中的晶體混合后熔點(diǎn)不下降。ESI[M+H]412。
實(shí)施例9將50mg介芬胺溶于20mL乙醇，加入10μL水合肼，5％體積比的聚乙二醇400和0.2mL37％的鹽酸，回流12h，濃縮至5mL，冷卻析出46mg的淡黃色針狀結(jié)晶，收率89.1％。將其溶于15mL DMSO中，加入0.4g叔丁醇鉀，于30℃攪拌6h，反應(yīng)液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌后用無(wú)水硫酸鈉干燥。濃縮至5mL，于冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜，析出無(wú)色針狀結(jié)晶32mg，母液上硅膠柱，用梯度的石油醚∶氯仿混合液洗脫，得到白色粉末5mg，共計(jì)37mg，收率74％。TLC展開(kāi)后噴KBiI4顯色，只有一個(gè)斑點(diǎn)。熔點(diǎn)125-128℃，與實(shí)施例3中的晶體混合后熔點(diǎn)不下降。ESI[M+H]412。
實(shí)施例10環(huán)杷明抑制胰腺癌細(xì)胞株的增殖。
采用噻唑藍(lán)還原法(MTT法)測(cè)定環(huán)杷明對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株BXPC3，CEPAC，SW1990增殖抑制活性。
方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人癌細(xì)胞株分裝于96孔培養(yǎng)板中，0.25mL/孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)DMSO對(duì)照組，3個(gè)不同濃度環(huán)杷明組。藥物與細(xì)胞培養(yǎng)96h，第48h換液，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h后去處培養(yǎng)液，加入100μL DMSO/孔，待結(jié)晶溶解后置酶聯(lián)檢測(cè)儀，用540nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度值(A)。
結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢钥闯?，胰腺癌細(xì)胞株CEPAC和SW1990對(duì)環(huán)杷明具有明顯的量效關(guān)系。這表明環(huán)杷明在體外具有抗腫瘤作用，同時(shí)也表明胰腺癌細(xì)胞株CEPAC和SW199是有效的Hh通路轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。
實(shí)施例11環(huán)杷明抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的增殖。
采用噻唑藍(lán)還原法(MTT法)測(cè)定環(huán)杷明對(duì)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株LTEP-Sm1和NCI-H446增殖抑制活性。
方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株分裝于96孔培養(yǎng)板中，0.25mL/孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)DMSO對(duì)照組，3個(gè)不同濃度環(huán)杷明組。藥物與細(xì)胞培養(yǎng)96h，第48h換液，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h后去處培養(yǎng)液，加入100μL DMSO/孔，待結(jié)晶溶解后置酶聯(lián)檢測(cè)儀，用540nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度值(A)。
結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢钥闯?，人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株LTEP-Sm1和NCI-H446對(duì)環(huán)杷明具有明顯的量效關(guān)系。這表明環(huán)杷明在體外具有抗腫瘤作用，同時(shí)也表明人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株LTEP-Sm1和NCI-H446是有效的Hh通路轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。
實(shí)施例12環(huán)杷明抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖。
采用噻唑藍(lán)還原法(MTT法)測(cè)定環(huán)杷明對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO和HCT-8增殖抑制活性。
方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞株分裝于96孔培養(yǎng)板中，0.25mL/孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)DMSO對(duì)照組，3個(gè)不同濃度環(huán)杷明組。藥物與細(xì)胞培養(yǎng)96h，第48h換液，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h后去處培養(yǎng)液，加入100μL DMSO/孔，待結(jié)晶溶解后置酶聯(lián)檢測(cè)儀，用540nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度值(A)。
結(jié)果見(jiàn)圖3。可以看出，人結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO和HCT-8對(duì)環(huán)杷明具有明顯的量效關(guān)系。這表明環(huán)杷明在體外具有抗腫瘤作用，同時(shí)也表明胰腺癌細(xì)胞株LOVO和HCT-8是有效的Hh通路轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。
表1.環(huán)杷明的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)

權(quán)利要求
1.一種環(huán)杷明的制備方法，其特征是包括如下步驟由介芬胺、水合肼、強(qiáng)堿在相轉(zhuǎn)移催化劑的催化下，在高沸點(diǎn)溶劑中反應(yīng)，反應(yīng)中介芬胺和水合肼的摩爾比為1.1∶1-3∶1，反應(yīng)溫度為160-200℃，反應(yīng)時(shí)間為2-7小時(shí)，高沸點(diǎn)溶劑的用量為每g介芬胺用0.2-0.6L溶劑，反應(yīng)結(jié)束后，加入水，并以中等極性的有機(jī)溶劑萃取，收集有機(jī)溶劑層，除去水分后濃縮，析出結(jié)晶即為環(huán)杷明，其中所述強(qiáng)堿為氫氧化鉀或叔丁醇鉀，所述相轉(zhuǎn)移催化劑采用分子量為400的聚乙二醇，用量為反應(yīng)溶劑體積的2～8％，或采用芐基三乙基氯化銨，用量為介芬胺重量的1-3％；所述高沸點(diǎn)溶劑為一縮二乙二醇、二甲基亞砜、1，3-丙二醇或乙二醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)結(jié)束后萃取用的中等極性的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于對(duì)析出環(huán)杷明結(jié)晶后的固滋進(jìn)行粒層析純化，得到環(huán)杷明，其中柱層析純化所用的吸附劑為硅膠、氧化鋁或聚酰胺；洗脫用的溶劑為石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所用的介芬胺原料從藜蘆屬植物中提取獲得，具體步驟如下將藥材藜蘆植物的干燥根莖粉碎后用乙醇熱提或冷浸，將提取液或冷浸液濃縮；對(duì)濃縮的粗提物經(jīng)酸化和堿沉處理，再用硅膠柱層析法，分離得到介芬胺；所用的洗脫劑是二氯甲烷和甲醇體系或石油醚和乙酸乙酯體系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述熱提采用75％的乙醇，熱提2-4次，每次乙醇用量為藥材體積的3-5倍；冷浸用75％-95％的乙醇，冷浸2-4次，每次乙醇用量為藥材體積的4-10倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述酸化用的酸為質(zhì)量濃度0.5-5％的硫酸或鹽酸，堿沉用的堿為濃氨水或碳酸的飽和液，調(diào)節(jié)酸化處理的溶液的pH值為7-10。
7.由權(quán)利要求1或4制備的環(huán)杷明在制備治療腫瘤的藥物組合物中的應(yīng)用，其中所述腫瘤為由Hn信號(hào)通路表達(dá)的腫瘤；所述藥物組合物由所述活性成分環(huán)杷明與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體組成，其中，活性成分含量的重量比為0.1％-99.5％。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為胰腺癌，髓母細(xì)胞瘤或小細(xì)胞肺癌。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以來(lái)源于藜蘆屬植物的介芬胺(jervine)為原料制備環(huán)杷明(cyclopamine)的方法及環(huán)杷明在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。介芬胺與水合肼反應(yīng)成腙后于高沸點(diǎn)溶劑中，在氫氧化鉀、叔丁醇鉀等強(qiáng)堿作用下脫氮形成環(huán)杷明，反應(yīng)中使用聚乙二醇400、TEBA等相轉(zhuǎn)移催化劑。環(huán)杷明通過(guò)與腫瘤細(xì)胞Hh通路中的Smo蛋白直接連接，非基因毒性地引起癌細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。
文檔編號(hào)A61K31/58GK101016329SQ20071003775
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 李慧梁, 湯建, 張川, 蘇娟, 沈云亨, 柳潤(rùn)輝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)