專利名稱：：6,7-去氫羅列酮在制藥中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及二萜類化合物，特別是環(huán)狀二蔽類化合物的新用途。
背景技術(shù)：
：6,7-去氫羅列酮(6,7-Dehydroroyleanone)為一種紅色針狀結(jié)晶，即170171。C，溶于苯、氯仿等低極性溶劑，是存在于香茶菜屬植物狹基線紋香茶菜中的一個(gè)對映-7,20-環(huán)-貝殼杉垸型二萜化合物，其結(jié)構(gòu)式為國家知識產(chǎn)權(quán)局于2006年10月25日公開了一項(xiàng)"鼠尾草根中具有抑制血小板聚集作用的6，7-去氫羅列酮"(申請?zhí)枮?00510067148.8)的發(fā)明專利申請，該申請公開了6，7-去氫羅列酮具有抑制血小板聚集的作用。《6，7-去氫羅列酮對實(shí)驗(yàn)性心肌缺血的保護(hù)作用》一文公開了6,7-去氫羅列酮具有保護(hù)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血的藥理作用(何新，常軍民等.中國藥理學(xué)通報(bào)，2000Vol.16No.5P.596-597.)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供6，7-去氫羅列酮在制藥中的新用途。實(shí)際上，本發(fā)明的新用途是6,7-去氫羅列酮在制備抑制一氧化氮合成酶的抑制劑中的應(yīng)用。NO的生物合成是由左旋精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合成酶(nitricoxidesynthase,NOS)作用下與02結(jié)合，生成左旋瓜氨酸(L-Cit)，并釋放出NO。一般認(rèn)為在生理狀態(tài)下，L-Arg經(jīng)細(xì)胞內(nèi)原生型NOS催化生成低濃度的NO，發(fā)揮信號傳遞、維持血管張力等生理作用；在病理?xiàng)l件下則通過激活誘導(dǎo)型NOS持續(xù)產(chǎn)生大量的NO而表現(xiàn)為細(xì)胞毒作用，引發(fā)多種疾病，例如(1)敗血性或出血性休克；(2)炎癥疾病；(3)心肌梗塞損傷；(4)病毒性心肌炎。巨噬細(xì)胞iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶)為一個(gè)同型二聚體酶，由兩個(gè)相同的亞基組成，亞基二聚體化為iNOS活性所必需。亞基聚合不能自動(dòng)發(fā)生，需要BH4、L-精氨酸和血紅素共同存在才能發(fā)生，如果BH4、L-精氨酸和血紅素其中一種物質(zhì)細(xì)胞內(nèi)水平不足，將影響iNOS單體(亞基)聚合成有活性的二聚體。iNOS亞基聚合的一般過程如下合成的酶蛋白起初為單體，含有一個(gè)非功能性的氧化酶區(qū)和一個(gè)功能性的還原酶區(qū)，后者與FAD、FMN及CaM結(jié)合，然后在L-精氨酸存在的情況下，BH4、血紅素(heme)與兩個(gè)單體的氧化酶區(qū)相互作用形成一個(gè)二聚體。二聚體化才使iNOS具有催化NO合成的功能。在這個(gè)過程中，BH4是必不可缺的，而6，7-去氫羅列酮能與其競爭性地和NOS結(jié)合，使得與能與BH4結(jié)合的NOS減少，降低NOS的活性和穩(wěn)定性，從而防止體內(nèi)一氧化氮含量升高，有效防止上述幾種病變的發(fā)生，達(dá)到預(yù)防的目的；當(dāng)上述幾種病變己經(jīng)發(fā)生，6,7-去氫羅列酮亦可通過降低體內(nèi)一氧化氮水平，減緩病變的程度，達(dá)到治療的目的。因此，本發(fā)明所述的6，7-去氫羅列酮實(shí)際上是作為一種誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶抑制劑，抑制病理?xiàng)l件下誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶的活性，阻止體內(nèi)一氧化氮含量升高。因此，6,7-去氫羅列酮可用于制備預(yù)防和治療因體內(nèi)一氧化氮過量所引發(fā)的疾病的藥物，具體可以是(1)制備預(yù)防和治療敗血性或出血性休克的藥物；(2)制備預(yù)防和治療炎癥疾病的藥物；(3)制備預(yù)防和治療心肌梗塞損傷的藥物；(4)制備預(yù)防和治療病毒性心肌炎的藥物；本發(fā)明所述的預(yù)防和治療因體內(nèi)一氧化氮過量所引發(fā)的疾病的藥物是由6，7-去氫羅列酮和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料按照常規(guī)制劑的制備方法制備得到，如腸溶膠囊、軟膠囊、滴丸、分散片、顆粒劑等，其中6,7-去氫羅列酮的含量為1440mg/g。圖1是不同組別的二甲苯誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠的耳腫脹程度的直方圖。下面將通過藥效實(shí)驗(yàn)來證明本發(fā)明具有的技術(shù)效果。1、體外抑制誘導(dǎo)型一氧化氮百分率的測定(1)材料與試劑誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、四氫生物蝶呤二鹽酸鹽(純度>99%)是由CaymanChemical公司提供；一氧化氮試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；DMSO購自Sigma公司(2)實(shí)驗(yàn)方法在一氧化氮試劑盒的1號試劑中不加四氫生物喋呤(BH4)，按試劑盒方法分別在試管中加入試劑1、試劑2、試劑3、BH4、iNOS樣品、受試藥物后混勻，37。C水浴下準(zhǔn)確反應(yīng)20分鐘，加入試劑4終止反應(yīng)，再加入終止液后混勻，530nm處，lcm光程，蒸餾水調(diào)零，比色測定吸光值。測定BH4的飽和濃度按照試劑盒方法步驟加入試劑，各個(gè)試管中分別加入不同濃度的BH4，測定各管吸光值，并計(jì)算其飽和濃度。測定化合物的抑制百分率根據(jù)文獻(xiàn)，我們配制藥物濃度為BH4飽和濃度的50倍，同樣按試劑盒的方法測定吸光值，并計(jì)算出抑制百分率。抑制百分率-(標(biāo)準(zhǔn)管吸光值一測定管吸光值)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光值一空白管吸光值)X100%IC50(半數(shù)抑制濃度)的測定根據(jù)前一次試驗(yàn)BH4飽和濃度測定結(jié)果，以及藥物的抑制百分率達(dá)100%的藥物濃度，我們推薦以下幾個(gè)劑量，分別為50倍、15倍、5倍。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)試管中加入的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)和BH4的濃度都是固定的。測得各管在530nm處的吸光度，用非線性回歸方法計(jì)算出各自的半數(shù)抑制濃度(見表l)。表16,7-去氫羅列酮對iNOS的抑制效果組別劑量(ng丄")iNOS抑制率(。/。ofVmax)IC50(iig.L")1006,7-去氫羅列酮3031.960.110069.4結(jié)果如表l所示，6，7-去氫羅列酮對iNOS的半數(shù)抑制濃度為60.1pg丄"，抑制率隨6，7-去氫羅列酮?jiǎng)┝吭黾佣龃蟆?、6，7-去氫羅列酮對機(jī)體免疫功能的影響(1)小鼠溶血素實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠隨機(jī)分為對照組(生理鹽水)、陽性對照組(5-Fu),6，7-去氫羅列酮低劑量組(10mg.kg—、按成人低劑量30倍給藥)、6，7-去氫羅列酮高劑量組(20mg'kg—、按成人高劑量30倍給藥)。昆明種小鼠以20%的壓積綿羊紅細(xì)胞致敏，每鼠0.5mL，與致敏后第二天給藥，連用5d，于致敏后的第五天進(jìn)行免疫試驗(yàn)。取滅活的小鼠眼眶血清2mL，以2倍稀釋法加入每一試驗(yàn)管，每試管加入1:30綿羊紅細(xì)胞0.2mL及1:5豚鼠血清0.2mL。充分搖勻，于37。C培養(yǎng)30min，觀察其最大溶血稀釋度。結(jié)果見表2。表2溶血素試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)體內(nèi)抑制小鼠二甲苯誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)各用藥組動(dòng)物按擬定劑量連續(xù)用藥10d，第11天以棉花蘸取二甲苯，涂在小鼠一側(cè)耳廓的正反兩側(cè)制備遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型，對側(cè)耳廓作對照。30分鐘后將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，然后用打孔器于同一部位各取一個(gè)耳片稱重。腫脹度-(致炎側(cè)耳片質(zhì)量一對照耳片質(zhì)量)/體重。二甲苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏免疫反應(yīng)表現(xiàn)為受藥側(cè)耳廓的明顯腫脹。臨床常用免疫抑制藥物FK506可以明顯抑制這一效應(yīng)，6,7-去氫羅列酮也表現(xiàn)出同樣的效果，使小鼠耳廓腫脹度受到明顯抑制，且隨著劑量的遞增，此效應(yīng)逐步增強(qiáng)，見圖l。3、6，7-去氫羅列酮治療出血性休克的藥效試驗(yàn)O)材料與動(dòng)物雄性新西蘭兔24只，體重2kg左右(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。家兔稱重標(biāo)記，隨機(jī)分為3組，每組8只，即生理鹽水組(A組)、羥乙基淀粉代血漿對照組(B組)、6,7-去氫羅列酮組(C組)。(2)實(shí)驗(yàn)方法以l。/。戊巴比妥鈉(0.5mlAg")作腹腔注射麻醉。全身肝素化(5tng4cg—0后測股動(dòng)脈壓，抽取股動(dòng)脈血測血?dú)夥治鲋怠Ｈ缓蠊蓜?dòng)脈開始放血，在15min左右的時(shí)間內(nèi)使動(dòng)脈壓下降到5.32kPa，并維持60min，造成出血性休克模型。再次測血?dú)夥治鲋?。此時(shí)所有動(dòng)物開始面罩吸氧，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射6,7-去氫羅列酮(20mg'kg—1)，然后加壓輸回全部失血，對照組則分別輸與失血等量的羥乙基淀粉代血漿或生理鹽水(約30min輸完)。面罩吸氧濃度30%，氧流量為2Lmin人吸氧條件下監(jiān)測2h，重復(fù)測定上述各項(xiàng)指標(biāo)。監(jiān)測完畢后，置籠喂養(yǎng)，觀察12h存活率。12h后所有動(dòng)物均取標(biāo)本，若動(dòng)物在12h內(nèi)死亡，則立即取標(biāo)本。后分別用光鏡(HE染色和甲苯胺藍(lán)染色)及電子顯微鏡對頂葉皮層行病理檢查。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以^化表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用方差分析和x"檢驗(yàn)。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在完成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ推趦?nèi)動(dòng)物無死亡。生理鹽水組12h存活率為0，全部死亡；羥乙基淀粉代血漿對照組存活率為25%,存活2只；6，7-去氫羅列酮組存活率為87.5%，存活7只。12h存活率6，7-去氫羅列酮組比羥乙基淀粉代血漿對照組高(尸<0.05)。監(jiān)測過程中6，7-去氫羅列酮組心率與羥乙基淀粉代血漿、生理鹽水對照組差異明顯，呼吸較對照組深大，次數(shù)加快，在監(jiān)測結(jié)束時(shí)血壓較對照組為高，見表IO。6，7-去氫羅列酮組的Pa02，較生理鹽水和羥乙基淀粉代血漿對照組明顯升高，PaC02明顯降低，可見生理鹽水和羥乙基淀粉代血漿對照組血?dú)庥忻黠@變酸趨勢，差異顯著(見表ll)。組織學(xué)觀察可見實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)基本正常，核仁清晰，對照組皮層神經(jīng)元呈典型細(xì)胞腫脹，核仁消失，中央型尼氏小體溶解等各種改變。實(shí)驗(yàn)組損傷神經(jīng)元數(shù)目與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(表12)。電鏡下可見羥乙基淀粉代血漿、生理鹽水對照組神經(jīng)元呈核染色質(zhì)稀疏，核膜不清，線粒體、核糖體腫脹，線粒體嵴消失，核糖體聚集，胞漿結(jié)構(gòu)紊亂或消失，6，7-去氫羅列酮組無上述典型改變。表IO休克及治療的不同時(shí)間對心率、呼吸、血壓的影響心跳(次數(shù)/min)呼吸(次數(shù)/min)血壓(kPa)B、J岡ABCABCABC放血前79±11.380±12.180±8.341±440±842±715.2±0.714.8±0.814.7±1.1放血后瞬間101±7.599±13.6102±10.462±560±759±9一——放血后60min103±10.2100±14.3101±12.129±630±932±5一一治療后120min44±8.370±10.182±8.3'11±535±750±5*3.3±1.77.7±1.810.4±1.3'同一時(shí)間點(diǎn)，C與A、B組比較'尸O.05"PO.01(表ll同)表ll休克及治療的不同時(shí)間對動(dòng)脈血?dú)獾挠绊憰r(shí)間Pa02(kPa)PaC02(kPa)pHABCABCABC放血前12.7±1.313.2±2.112.4±1.34.8±0.45.5±0.85.1±1.17.34±0.077.33±0.057.35±0.06放血后60min17.1±2.517.3±3.617.2±2.44.6±0.54.8±0.64.8±0.87.10±0.067.11±0.067.10±0.12治療后60min8.6±2.823.8±4.338.5±4.15.9±0.65.0±0.94.5±0.9'一———治療后120min5.8±1.623.9±3.139.8±3.37.9±0.25.3±0.44.6±0.4'6.13±0.227.12±0.187.34±0.08表12各組動(dòng)物頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元的觀察組別神經(jīng)元數(shù)目正常神經(jīng)元(％)受損神經(jīng)元(％)A5U±72.314.6±6.985.3±3.6B576±74.243.8±10.556.2±8.7C554±71.886.7±6.**13.3±4.5**C與A、B組比較？<0.05"尸O.Ol4、6,7-去氫羅列酮治療炎癥疾病的的藥效試驗(yàn)；(1)材料與動(dòng)物醋酸地塞米松(天津藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號061042);伊文思蘭(進(jìn)7口分裝，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。昆明種小鼠體重1822g;SD大鼠體重180220g，均雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響小鼠80只，雌雄各半，；空白對照組(生理鹽水20ml'kg'1)、陽性對照組(地塞米松5mg'kg")，6,7-去氫羅列酮低、高劑量組(即IO、20mg.kg—4。末次給藥lh后，各組于尾靜脈注射0.5%伊文思蘭0.1mL/10g(體重)，并立即腹腔注射0.6%的冰醋酸0.1ml/10g后頸椎脫臼處死。腹腔注射5ml生理鹽水，輕柔，再剪開一小口，用吸管吸出洗液(如有出血?jiǎng)t棄去不用)。再以3000rpm離心15min，取上清液于722分光光度計(jì)590nm波長測吸光度。結(jié)果如表13所示，6,7-去氫羅列酮低、高劑量組給藥都有減輕小鼠毛細(xì)血管通透性的作用(P值都小于O.05)，且作用程度比較相似。表136，7-去氫羅列酮對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響(x")組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量(mg'kg1)A值(x±s)抑制率(％)空白對照組1620mL-kg10.098±0.023地塞米松170.054土0.018'456,7-去氫羅列酮17100.046±0.017*536，7-去氫羅列酮18200.049±0.014*49與對照組比較*尸<0.05，林iM).Ol(表14、15皆同)。(3)對大鼠棉球植入所致的肉芽腫的影響取180220g,SD大鼠40只，雌雄各半。手術(shù)前一天將大鼠按體重、性別隨機(jī)分為4組，分別給相應(yīng)的藥物(分組和劑量同上)。第二次給藥后乙醚麻醉，在大鼠兩側(cè)腋窩下剪開約lcm的小口，將兩個(gè)滅菌棉球(每個(gè)棉球重50ilmg。高壓滅菌，各加入氯芐青霉素2mg'mL—1，5(TC烘箱烤干)分別植入皮下，縫合創(chuàng)口，并在創(chuàng)口局部涂以少量抗生素。第8次給藥后頸椎脫臼處死，取出棉球，剝離附著的結(jié)締組織，在60'C烤箱烘12h后稱重，減去原來棉球重量，即為肉芽腫凈重，取兩側(cè)肉芽腫質(zhì)量的均值。結(jié)果見表14，6,7-去氫羅列酮組和地塞米松組的肉芽重均明顯低于空白對照組，可見6,7-去氫羅列酮能有效抑制肉芽腫的程度。表146,7-去氫羅列酮對大鼠棉球肉芽腫的影響(x勤)組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量(mg'kg—"肉芽重(g)抑制率(％)空白對照組1020mL'kg—10.1738±0扁4-地塞米松1050.1367爆052**226,7-去氫羅列酮9100.1468爆047'156,7-去氫羅列酮10200.1532±0.046*13(4)對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響小鼠60只，劑量與分組同(2)項(xiàng)，連續(xù)給藥10天。在末次給藥前，于右足踝關(guān)節(jié)處劃線作標(biāo)記，在毛細(xì)管放大裝置中測足的原始體積。給藥lh后，于右足皮下注射1%角叉菜膠0.05ml。致炎后30min、lh、2h、4h測體積，并計(jì)算各組腫脹度。結(jié)果見表15，6,7-去氫羅列酮組對角叉菜膠致小鼠足腫脹足跖腫脹均有抑制作用，對致炎2h和4h后的抑制作用有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表156,7-去氫羅列酮對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響(；妨)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5、6，7-去氫羅列酮治療心肌梗塞損傷的藥效試驗(yàn)；(1)材料與動(dòng)物氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色液配制取O.5g硝基四氰唑藍(lán)加入0.2mol/L磷酸緩沖溶液100ml中即成。鹽酸維拉帕米片上海黃河制藥廠生產(chǎn)。批號060801-6，每片含量40rag，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水溶解成10ml體積溶液后灌胃。健康新西蘭家兔24只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重在2-2.5Kg之間，雌雄不拘。(2)實(shí)驗(yàn)方法家兔稱重標(biāo)記，隨機(jī)分為4組，每組6只，即生理鹽水組、維拉帕米組、6,7-去氫羅列酮低、高劑量組(即IO、20mg'kg—"。實(shí)驗(yàn)前l(fā)周給生理鹽水組動(dòng)物每d灌服生理鹽水10mL/只，維拉帕米組動(dòng)物每d灌服維拉帕米13mg'kg"，6,7-去氫羅列酮低、高劑量組動(dòng)物每天分別灌服IO、20n^kg—'只。實(shí)驗(yàn)時(shí)將家兔仰位固定于兔手術(shù)臺上。針形電板扎入四肢皮下，記錄心電圖。用20W烏拉坦5ml/kg從耳緣靜脈注射作全身麻醉，除毛，沿胸骨中線切開皮膚，暴露胸骨，器胸骨左緣剪斷1一3板肋軟骨，心匆破壞胸膜，不用人工呼吸，用小開胸器輕輕撐開胸腔切口，可見心包及搏動(dòng)之心臟，提起心包膜正中。用眼科剪將心包膜前部剪開.用止血鉗將左心耳輕輕提起，用持針器持小圓彎針在冠狀動(dòng)脈前降支根部(較深部)穿絲線，結(jié)扎之。此時(shí)可見動(dòng)脈收縮減弱，閉塞冠脈前降支所支配的區(qū)域變?yōu)榘底仙?，膨出，記錄心電圉可見顯著抬高的成弓背樣改韭的ST段，隨岳逐漸出現(xiàn)壞死性Q渡。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后6h從心內(nèi)取血，然后處死動(dòng)物，迅速取出心臟，切片染色。將實(shí)驗(yàn)后心臟取下.用生理鹽水沖洗.除去血污，剔除血管脂肪等非心肌組織.用吸水紙吸去水份，稱全心濕重。沿冠狀溝切除心房，留下心室，稱重。順房室溝從心尖到心基部平行將兔心室切成0.3-0.5cm厚的心肌片，用生理動(dòng)或攪拌染色液，使之與心肌有克分的接觸機(jī)會。染色后立即用水沖洗多泉的染料.梗塞區(qū)不著色.非梗塞區(qū)被NBT染為藍(lán)色。剪去各心肌片被染色的非梗塞區(qū)心肌，把未染色的梗塞心肌稱重，除以心室重即得到梗塞范圍占心室重的百分比，用IS表示。結(jié)果見表16。表166,7-去氫羅列酮對心肌梗塞范圍的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與生理鹽水組比較*><0.01;與維拉帕米組比較M尸O.Ol研究結(jié)果表明.6，7-去氫羅列酮低、高劑量組的梗死范圍明顯低于生理鹽水組和維拉帕米組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有非常顯著性差異CPO.Ol)。顯示6,7-去氫羅列酮對家兔急性心肌梗塞有明顯的保護(hù)作用，療效優(yōu)于維拉帕米。6、6，7-去氫羅列酮治療病毒性心肌炎的藥效試驗(yàn)；(1)材料與動(dòng)物CVB3病毒是由中山大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存毒株，按常規(guī)方法傳代增殖，CVB3病毒在Hela細(xì)胞中增殖，經(jīng)凍融3次，3000rpm離心15min，取上清液分裝-70°C保存?zhèn)溆?；健康Balb/c純系雄性小鼠，4周齡，體質(zhì)量16-18g,購于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。(2)實(shí)驗(yàn)方法將40只小鼠隨機(jī)分為模型組、6，7-去氫羅列酮低、高劑量組(即IO、20fflg*kg—"及正常對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日模型組及各治療組小鼠腹腔內(nèi)接種100Tcid50)CVB30.5mLAR，30min后模型組用生理鹽水灌胃0.5mL/只，治療組用藥物灌胄0.5mL/只，灌胃l次/d，共7d。正常對照組用2%胎牛清RPMI1640液腹腔注射，30min后用生理鹽水灌胃0.5mL/只。接種病毒治療7d后用乙醚麻醉小鼠，在無菌條件下取鼠心臟上1/3，用電子天平稱重，按0.1g/mL比例加Hank，s液研磨后3000rpm離心15min，取上清液在Hela細(xì)胞上進(jìn)行病毒滴定(用固定血清稀釋病毒法)，用維持液遞倍稀釋的上清液滴人生長成層的Hela細(xì)胞孔，每個(gè)稀釋度4L，每孔O.lmL,加人維持液O.lmL，設(shè)正常細(xì)胞對照孔；37'C5%二氧化碳(€02)溫箱培養(yǎng)，每日觀察病變，72h判斷結(jié)果，記錄細(xì)胞病變(CEP)程度，以不出現(xiàn)細(xì)胞病變稀釋倍數(shù)為有效效價(jià)。心肌組織病理檢査鼠心臟中或下1/3心肌用2%甲醛固定，作連續(xù)石蠟切片，HE染色，觀察心肌病理變化。采用Rezkalla法計(jì)算心肌病理積分，每張切片取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中炎性浸潤細(xì)胞及壞死區(qū)域面積與整個(gè)視野面積之比，無病變記O分，病變<25%記1分，25%~50%記2分，50%75%記3分，>75%記4分。心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變鼠心臟中或下1/3心肌用2%戊二醛固定，常規(guī)方法進(jìn)行，在JE-1200EX型透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變及細(xì)胞凋亡情況。數(shù)據(jù)均用SPSS11.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用；is表示，各組比較采用方差分析，戶O.05為有顯著差異。結(jié)果見表17。表176，7-去氫羅列酮對小鼠心肌組織病毒滴定及病變面積結(jié)果比較(x±iy，=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與模型組比較丫O.Ol常規(guī)HE染色，光鏡下觀察，病毒感染后模型組心外膜見炎性細(xì)胞廣泛浸潤，接近心外膜的心肌細(xì)胞壞死崩解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，部分心肌細(xì)胞呈空泡樣變性，細(xì)胞核仍存在。心臟內(nèi)廣泛分布炎性病變，遍及心室壁各層。炎癥病灶內(nèi)尚有未完全失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)的心肌細(xì)胞。6，7-去氫羅列酮低、高劑量組整個(gè)心肌病灶分布面積減少，呈小局灶性，不累及心室壁各層，心肌細(xì)胞不出現(xiàn)壞死崩解。正常對照組心肌電鏡檢査末見異常。電鏡下模型組可見心肌細(xì)胞凋亡小體，內(nèi)含濃縮的胞質(zhì)成分，并可見核染色質(zhì)濃縮、聚邊。細(xì)胞凋亡多存在于炎癥病灶周圍的心肌細(xì)胞及病灶處炎性浸潤細(xì)胞，還可見于血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。模型組心肌線粒體明顯腫脹，外膜溶解、破裂；嵴內(nèi)部空隙增大，部分嵴斷裂、溶解、消失，形成局部空泡變；肌原纖維溶解、斷裂，肌絲稀疏，排列紊亂，z線不清楚或增粗；肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，閏盤不同程度解離；毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管內(nèi)血小板聚集，血管基底膜破壞。治療組上述病變減輕，血管內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹，6，7-去氫羅列酮高劑量組最輕，僅見線粒體腫脹。圖l是體內(nèi)抑制小鼠二甲苯誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)結(jié)果的直方圖。具體實(shí)施方式例l將所得6，7-去氫羅列酮2.2g與大豆油按l:25的比例混合，加入4%的蜂蠟'熔融，放冷，再加入0.25%吐溫一80，上扎囊機(jī)壓制而成軟膠囊劑200粒。該制劑的用量為每天2次，每次2粒，口服。例2將6,7-去氫羅列酮2.3g與淀粉按l:50混合，再過80目篩2次，置攪拌機(jī)中，加入蒸餾水適量，攪拌10分鐘，制軟材，過16目篩制粒，濕粒于6(TC鼓風(fēng)干燥箱中干燥，干粒過16目篩整粒。加入1%羧甲基淀粉鈉及0.25%硬脂酸鎂，混合均勻，壓成400片，包薄膜衣，即得。該制劑的用量為每天3次，每次2片，口服。例3將6,7-去氫羅列酮2.3g與PEG4000及PEG6000按1:20:50比例混合，熔融，滴入冷卻劑甲基硅油中即得滴丸(50mg/粒)。該制劑的用量為每天兩次，每次1.0g，口服。例4將6，7-去氫羅列酮2.3g用20倍量的P-環(huán)糊精包合，再加入60g淀粉，混合，再過80目篩2次，置攪拌機(jī)中，加入蒸餾水適量，攪拌10分鐘，制軟材，過16目篩制粒，濕粒于6(TC鼓風(fēng)干燥箱中干燥，干粒過16目篩整粒，分包裝，即得顆粒劑。該制劑的用量為每天2次，每次l袋(lg)，溫水沖服。例5將6，7-去氫羅列酮與HPMC、乳糖及淀粉按1:9:9:12的比例混合均勻，用95%乙醇20目制粒，5(TC以下干燥1小時(shí)、16目篩整粒，再加入1%硬脂酸鎂混合均勾，壓制成片重為0.32g的片劑，即得分散片。該制劑的用量為每天2次，每次2片，溫水沖服。權(quán)利要求1、6，7-去氫羅列酮在制備抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶的抑制劑中的應(yīng)用。2、如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抑制劑是預(yù)治因一氧化氮水平升高而引起的疾病的藥物。3、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的疾病是敗血性或出血性休克。4、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的疾病是一氧化氮水平升高而引起的炎癥。5、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的疾病是心肌梗塞損傷或病毒性心肌炎。6、一種治療權(quán)利要求35之一所述的疾病的藥物，該藥物由6，7-去氫羅列酮和常用的藥劑輔料或載體組成，其中6,7-去氫羅列酮的含量為1440mg/g。全文摘要本發(fā)明利用6，7-去氫羅列酮具有抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶活性的藥理作用，提供了一種6，7-去氫羅列酮在制藥中的新用途，即在制備抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶的藥物中的應(yīng)用。文檔編號A61K31/122GK101167708SQ20071003107公開日2008年4月30日申請日期2007年10月26日優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日發(fā)明者張翠仙,林朝展,祝晨蔯,趙鐘祥申請人:廣州中醫(yī)藥大學(xué)