專利名稱::包含殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒的制作方法包含殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及被設(shè)計用于生物活性分子的釋放的納米顆粒系統(tǒng)。特別地,本發(fā)明涉及由聚合物殼聚糖和環(huán)糊精的混合物組成的、可將生物活性分子置于其中的納米顆粒系統(tǒng),還涉及獲得該納米顆粒系統(tǒng)的方法。發(fā)明背景由于聚合的納米顆粒具有以下前景改善穩(wěn)定性、促進藥物輸送以及控制釋放至身體的某些區(qū)域內(nèi)、克服與上皮屏障的有限滲透性相關(guān)的問題,因此聚合的納米顆粒正受到人們的特別關(guān)注。在生物可降解的聚合物中,殼聚糖由于其作為粘膜粘著劑(C,M.Lehr,J.A.Bouwstra,E.H.Schacht和H.E.Junginger,丄泡亂,1992,78,43-48)和吸收促進劑(P.Artursson,T.Lindmark,S.S.Davis和L.Illum,尸/flrm.ies.,1994,11,1358-1361)的性質(zhì)近年來受到廣泛關(guān)注。此外,科學(xué)研究認可殼聚糖為具有可接受的毒理學(xué)特征譜(toxicologicalprofile)的物質(zhì)(S.B.Rao和C.P.Sharma,J.Biomed.Ma欣to"1997,34,21-28),其已被FDA批準為動物營養(yǎng)品中的添加劑(J.D.McCurdy,draweesC7Y/朋dCMos朋,ElsevierAppliedScience,London,1992,pp.757-764)。殼聚糖[a(l-4)2-氨基-2-脫氧-Z3-D-葡聚糖]是由甲殼質(zhì)的脫乙酰作用產(chǎn)生的天然多糖。然而,實際上,用作營養(yǎng)補充劑或用于醫(yī)藥應(yīng)用的殼聚糖是乙?;膯误w和脫乙酰化的單體的無規(guī)聚合物。作為用于大量的治療分子的跨粘膜給藥的載體,殼聚糖的納米顆粒已得到廣泛研究(A.M.DeCampos,Y.Diebold,E.L.Carvalho,A.Sanchez和M.J.Alonso,尸Awm.Was.,2004,21,803-810;R.Fernandez-Urrusuno,P.Calvo,C.Remufi&n-L6pez,J.L.Vila-Jato和M.J.Alo謂,泡度i仏,1999,16,1576-1581;A.Prokov,E.Kozlov,G.W.Newman禾口M.J.Newman,Sz'oewg7,ween7zg,2002,78,459-466;A.Vila,A.Sanchez,K.Janes,I.Behrens,T.Kissel,J.L.Vila-Jato和M.J.Alo勵,Eur.,泡亂腸//^亂,2004,57,123-131)。這些顆粒系統(tǒng)的顯著特征是其改善低滲透性分子的吸收特性的能力(R.Fernandez-Urrusuno,P.Calvo,C.Remufi&n-L6pez,J.L.Vila-Jato禾口M.J.Alonso,1999,16,1576-1581;A.Vila,A.Sanchez,K.Janes,I.Behrens,T.Kissel,J.L.Vila-Jato和M.J.Alonso,五wJ",i^am.所印;mnw.,2004,57,123-131)。雖然殼聚糖的納米顆粒已證實其具有與親水性藥物有效結(jié)合的能力,但是這些系統(tǒng)通常對疏水性藥物的結(jié)合,特別是對那些低水溶性的疏水性藥物的結(jié)合表現(xiàn)出局限性。目前,雖然僅發(fā)現(xiàn)一篇關(guān)于殼聚糖的納米顆粒與極低水溶性藥物的應(yīng)用的參考文獻(A.M.DeCampos,'A.Sanchez和M.J.Alonso,/"Li^arm.,2001,224,159-168),但是在本研究中,需要使用有機溶劑的制備方法是必需的。另一方面,公知環(huán)糊精是低溶解性分子的絡(luò)合劑以及用于有效成分給藥的載體。其中,化學(xué)改性的環(huán)糊精由于其更高的化學(xué)多樣性目前被最廣泛地用于藥物技術(shù)中。例如,通過曱基、羥丙基或羧曱基基團對羥基的取代賦予分子更大的水溶性和更好的毒性特征。其它環(huán)糊精有可能賦予配合物有限的溶解性(用于緩釋系統(tǒng)的制劑)或溫度依賴的溶解性。近來,環(huán)糊精作為藥物賦形劑的其它潛在效用已展現(xiàn)出來。因此,已證實環(huán)糊精的配位作用能夠降低某些不穩(wěn)定藥物的降解動力學(xué),或減少形成諸如胰島素等不活潑的肽聚集體的傾向。此外,已顯示,某些環(huán)糊精由于其與脂質(zhì)的配位作用使得該環(huán)糊精在細胞膜中產(chǎn)生輕微變性,從而具有促進藥物吸收的能力。多篇文獻公開了環(huán)糊精和殼聚糖作為溶液、凝膠中的聚合物或作為肉眼可見的固體基質(zhì)的共同應(yīng)用(US2002150616、US5476654、US5330764、US6677346、US6497901、US5849327)。美國專利申請US2002150616提出由低溶解性藥物、環(huán)糊精和親水性聚合物組成的混合物。EP07308697〉開了同樣由聚合物和環(huán)糊精的混合物組成的藥物釋放系統(tǒng)。文獻US5843347、US5840341和US5639473公開了溶液中、肉眼可見的顆粒中或微粒中的聚合物組合物。所描述的用于形成顆粒的方法,例如擠壓(US5843347),或用于形成油包水乳液的方法(US5639473)不可能產(chǎn)生比若干微米更小的顆粒。WO9961062涉及含有環(huán)糊精的聚合微粒的制備,其中該環(huán)糊精具有保護藥物使其不與聚合物基質(zhì)發(fā)生潛在不利的相互作用的功能。專利US6630169公開了作為通過跨粘膜途徑給藥的疫苗載體的微觀結(jié)構(gòu)的形成。專利US5639473涉及通過與二硫基團交聯(lián)使親水聚合物(例如殼聚糖)或寡糖(例如環(huán)糊精)改性。根據(jù)所述發(fā)明的描述,所提出的方法導(dǎo)致顆粒系統(tǒng)在0.1微米至20微米之間。WO03027169公開了用共價結(jié)合的環(huán)糊精形成親水聚合物衍生物以及其對藥物系統(tǒng)(包括微粒和納米顆粒)的形成的效用。專利US619757公開了制備方法,其包括在構(gòu)成基質(zhì)的多糖或寡糖乳液中進行交聯(lián)以在這些分子中產(chǎn)生醚型鍵。??芔S5700459和US6649192公開了形成用于藥物應(yīng)用的殼聚糖的納米顆粒的方法。在這兩個專利中,通過聚陽離子(例如殼聚糖)和聚陰離子(例如三聚磷酸鹽)的相互作用形成納米顆粒。US5700459提及某些環(huán)糊精(氨基環(huán)糊精)可以用作諸如殼聚糖的另一潛在聚陽離子的替代物。WO9704747提出了將藥物或藥物-環(huán)糊精配合物在納米級水凝膠基質(zhì)中進行包嚢,隨后將其用脂質(zhì)體和/或粘膜粘附佐劑進行包衣。所提出的方法需要將聚合物從有機相沉淀至水相中,并且將包含環(huán)糊精的藥物加入到聚合物沉淀于其中的水相中,以上兩步驟不同時發(fā)生。所述方法的這一因素可導(dǎo)致某些藥物的包嚢化效果不佳。值得強調(diào)的是,為形成微粒而設(shè)計的微嚢化技術(shù)通常不同于為形成納米顆粒而設(shè)計的納米技術(shù)。WO98042447>開了殼聚糖的納米顆粒的形成。發(fā)明的簡要說明本發(fā)明發(fā)現(xiàn),由殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒組成的系統(tǒng)允許生物活性分子的有效結(jié)合,也允許其隨后在適合的生物環(huán)境中釋放。與不帶有環(huán)糊精的殼聚糖的納米顆粒相比,這些納米顆粒顯示出改進的包嚢或結(jié)合疏水性藥物的能力。此外,環(huán)糊精賦予該納米顆粒系統(tǒng)新的特征,例如對所結(jié)合的生物活性分子的保護作用增強以及促進吸收的能力增加,尤其對于那些低滲透性分子更是如此。因此,體內(nèi)研究已證實了本發(fā)明系統(tǒng)通過與鼻粘膜的相互作用,又穿過鼻上皮,經(jīng)上皮屏障輸送低滲透性藥物的能力。存在于本發(fā)明系統(tǒng)中的納米顆粒所顯示出的附加特征是其在細胞培養(yǎng)基中的高穩(wěn)定性,且更顯著的是其在模擬的腸液中的高穩(wěn)定性,已顯示出納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)在模擬的腸液中至少4小時內(nèi)無變化。該性質(zhì)使這些系統(tǒng)適用于通過不同的給藥途徑,尤其是口服給藥,其使得藥物在合適的生物環(huán)境中釋放。此外,不同藥物的釋放研究顯示,納米顆??梢砸钥煽氐?、漸進的速率釋放有效成分。另一方面,結(jié)合并釋放基于核酸的大分子,例如DNA質(zhì)粒的可能性使得可以通過體外研究,觀察納米顆粒以非常有效的方式轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)物的能力,這使得本發(fā)明系統(tǒng)潛在地適用于基因治療。因此,本發(fā)明的一方面涉及包含納米顆粒的系統(tǒng),該納米顆粒凈皮設(shè)計用于生物活性分子的釋放,且包含a)至少40%重量比的殼聚糖或其衍生物以及b)小于60%重量比的環(huán)糊精或其衍生物,其中將組分a)和組分b)混合而不形成共價鍵。任選地,納米顆??闪硗獍箽ぞ厶且约{米結(jié)構(gòu)形式凝膠化的離子交聯(lián)劑。本發(fā)明的第二方面涉及納米顆粒系統(tǒng),諸如上述所定義的納米顆粒系統(tǒng),其還包含生物活性分子。在另一方面中,本發(fā)明涉及藥物組合物,該藥物組合物包含諸如上述所定義的納米顆粒系統(tǒng)和能夠預(yù)防、減輕或治愈疾病的生物活性分子。此外,技術(shù)人員可以使用被截留在納米結(jié)構(gòu)中的肽、蛋白質(zhì)或多糖,該肽、蛋白質(zhì)或多糖"本身"不被認為是活性生物分子,但是其可促進給藥系統(tǒng)的效能。本發(fā)明的另一方面涉及包含如上所定義的納米顆粒系統(tǒng)和抗原的疫苗。在優(yōu)選的方面中,該組合物或疫苗被設(shè)計用于跨粘膜給藥。在另一方面中,本發(fā)明涉及包含如上所述的納米顆粒系統(tǒng)的化妝用纟且合物。本發(fā)明的另一方面是獲得諸如所定義的被設(shè)計用于釋放生物活性分子的系統(tǒng)的方法,其包括a.在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備殼聚糖或其衍生物的溶液;b.在任選加入交聯(lián)劑的水介質(zhì)中或在任選加入交聯(lián)劑的水與極性溶劑的混合物中制備環(huán)糊精或其衍生物的溶液;以及c.在攪拌下,以自發(fā)獲得殼聚糖-環(huán)糊精的納米顆粒的方式混合步驟a)和b)的溶液。或者,任選地a.在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備殼聚糖或其衍生物與環(huán)糊精或其衍生物的溶液;b.在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備交聯(lián)劑的溶液;c.在攪拌下,以自發(fā)獲得殼聚糖-環(huán)糊精的納米顆粒的方式混合步驟a)和b)的溶液??蓪⑸锘钚苑肿又苯蛹尤氲讲襟Ea)或b)的溶液中;然而,在該方法的變體中,在將活性分子加入到步驟a)或b)之前,可將其溶解于水介質(zhì)中或水與極性溶劑的混合物中。本發(fā)明的最后一方面涉及如以上所述的系統(tǒng)在基因治療藥物的制備中的用途。附圖的詳細說明圖l:殼聚糖-(羥丙基-/3-環(huán)糊精)制劑的TEM圖像。由25mM的羥丙基-i8-環(huán)糊精和2mg/ml的三聚磷酸鹽(左圖)或1.25mg/ml的三聚磷酸鹽(右圖)制備該制劑。圖2:殼聚糖-(羥丙基-!S-環(huán)糊精)制劑的SEM圖像。由25mM的環(huán)糊精和2mg/ml的三聚磷酸鹽制備該制劑。圖3:在37。C下,殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒在pH6.4的HBSS中的穩(wěn)定性(平均值±S.D.,n=3)。CS:殼聚糖;SBE-CD:磺丁基醚-環(huán)糊精;CM-CD:羧曱基-環(huán)糊精;TPP:三聚磷酸鈉;HBSS:Hanks平衡鹽溶液。圖4:在37°C和pH6.8下,殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒在模擬的腸液中的穩(wěn)定性(平均值±S.D.,n=3)。(□)CS/CM-CD/TPP=4/5.5/0;0)CS/CM-CD/TPP=4/4.5/0.25。CS:殼聚糖;SBE-CD:磺丁基醚-(3-環(huán)糊精;CM-CD:羧曱基-P-環(huán)糊精;TPP:三聚磷酸鈉。圖5:在37。C和pH6.8下,殼聚糖和羧曱基-P-環(huán)糊精的納米顆粒在模擬的腸液中的穩(wěn)定性(平均值±S.D.,n=3)。(□)CS/CM-CD/TPP=4/3/0.5;()CS/CM-CD/TPP=4/1.5/0.75。CS:殼聚糖;CM-CD:羧曱基-P-環(huán)糊精;TPP:三聚磷酸鈉。圖6:藥物三氯生和呋塞米從殼聚糖-(羥丙基-環(huán)糊精)制劑中的釋放曲線圖。制劑TRICHPoCD(三氯生和羥丙基-a-環(huán)糊精的制劑)、TRICHP/3CD(三氯生和羥丙基-(8-環(huán)糊精的制劑)、FURHPoCD(吹塞米和羥丙基-a-環(huán)糊精的制劑)、FURHPj3CD(呋塞米和羥丙基-/3-環(huán)糊精的制劑)(平均值±Std.Dev.,n=3)。圖7:殼聚糖-磺丁基環(huán)糊精納米顆粒的瓊脂糖凝膠。泳道(l)分子量標(biāo)準、(2)溶液中的DNA、(3)無DNA的納米顆粒、(4)帶有DNA的納米顆粒、(5)帶有脫乙酰幾丁質(zhì)酶降解的DNA的納米顆粒。培養(yǎng)時間為30分鐘。圖8:用1jitg的在殼聚糖-磺丁基環(huán)糊精中的pGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞的熒光圖像。在第48h達到轉(zhuǎn)染水平。圖9:用熒光素-環(huán)糊精標(biāo)記的殼聚糖的納米顆粒在海藻糖(5%)中的穩(wěn)定性。()FI-CS/SBE國CD4/4;(□)FI-CS/CM-CD4/6。FI-CS:熒光素標(biāo)記的殼聚糖;SBE-CD:磺丁基醚-P-環(huán)糊精;CM-CD:羧曱基-p-環(huán)糊精;TPP:三聚磷酸鈉。發(fā)明的詳細描述本發(fā)明的系統(tǒng)包含分散于水介質(zhì)中的納米顆粒,所述納米顆粒具有包含殼聚糖和環(huán)糊精的結(jié)構(gòu),其中可加入生物活性分子。所述結(jié)構(gòu)是通過兩組分之間的靜電相互作用接合,這兩種組分之間沒有任何共價鍵。任選地,納米顆粒可還包含離子交聯(lián)劑,該離子交聯(lián)劑使殼聚糖通過離子致凝膠化作用(ionotropicgelation)發(fā)生交聯(lián)的,從而促進納米顆粒的自發(fā)形成。術(shù)語"納米顆粒,,應(yīng)理解為由殼聚糖和環(huán)糊精之間的靜電相互作用形成的結(jié)構(gòu),其中當(dāng)將用作交聯(lián)劑的聚陰離子鹽加入到系統(tǒng)中時,所述結(jié)構(gòu)還可以被交聯(lián)。所得到的不同納米顆粒組分之間的靜電相互作用以及任選地通過加入交聯(lián)劑引起的殼聚糖的交聯(lián)產(chǎn)生特有的、獨立的、可觀察的物理實體,其平均粒徑小于1(im,即平均粒徑為lnm至999nm。"平均粒徑"應(yīng)理解為由水介質(zhì)中共同移動的殼聚糖和環(huán)糊精所組成的納米顆粒群體的平均直徑。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準方法可測定這些系統(tǒng)的平均粒徑,所述標(biāo)準方法例如將在下文的實驗部分中進行描述。jim,其平均粒徑優(yōu)選為1nm至999nm,優(yōu)選為10nm至800nm。所述顆粒的平均粒徑主要受到殼聚糖相對于環(huán)糊精的比例、殼聚糖的脫乙?;某潭纫约邦w粒形成條件(殼聚糖的濃度、環(huán)糊精的濃度、交聯(lián)劑的濃度(若有的話)以及它們之間的比率)的影響。另一方面,所述納米顆粒可顯示帶有電荷(使用CLK作為稀釋介質(zhì),通過Z電位來測定),取決于上述變量,其量值可在0mV直至+60mV內(nèi)變化。納米顆粒的正電荷是受關(guān)注的,因為其有助于該納米顆粒與生物表面的相互作用,尤其是與那些帶負電荷的粘液表面的相互作用。然而,中性電荷可能更適于其腸胃外給藥。上述定義的包含被設(shè)計用于生物活性分子釋放的納米顆粒的系統(tǒng),其混合物中的殼聚糖含量大于40%重量比,優(yōu)選為至少40%重量比至95.5%重量比之間。另一方面,混合物中的環(huán)糊精含量小于60%重量比,優(yōu)選為0.5%重量比至小于60%重量比。殼聚糖殼聚糖是源自殼質(zhì)(聚-N-乙?;?D-葡萄糖胺)的天然聚合物,其中N-乙?;鶊F的重要部分通過水解去除。脫乙酰的程度優(yōu)選為30%至95%,更優(yōu)選為50%至95%,這表明5%至50%的氨基基團被乙?;?。因此,殼聚糖顯示出氨基多糖結(jié)構(gòu)和陽離子特性。其包含式(I)的單體單元的重復(fù)(i)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中n是整數(shù),此外,還包含了m個其中氨基基團被乙?;膯卧?。n+m之和表示聚合度,即殼聚糖鏈中的單體單元數(shù)。用于產(chǎn)生本發(fā)明的納米膠嚢的殼聚糖的分子量為1kDa至2,000kDa,優(yōu)選為5kDa至500kDa,更優(yōu)選為5kDa至200kDa??墒褂玫纳逃脷ぞ厶堑膶嵗荱PG113、UPCL213和UPCL113,其可從NovaMatrix、Drammen、Norway處才尋至!J。包含用于產(chǎn)生納米顆粒的殼聚糖的單體單元的數(shù)目為5至5000單體,優(yōu)選為60至600單體。作為殼聚糖的替代物,也可以使用其衍生物,應(yīng)理解其衍生物為其中一個或多個羥基基團和/或一個或多個氨基基團被改性的殼聚糖,以便增強殼聚糖的穩(wěn)定性或增強其粘合特性。這些衍生物包括乙酰化的、烷基化的或磺化的殼聚糖、硫醇化衍生物等等,正如Roberts,C/n'^iCAemWo;(曱殼質(zhì)化學(xué)),Macmillan,1992,166所描述的。優(yōu)選地,當(dāng)使用衍生物時,其選自O(shè)-烷基醚、O-?;?、三曱基殼聚糖、用聚乙二醇改性的殼聚糖等等。其它可能的衍生物是鹽,諸如檸檬酸鹽、硝酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽等等。無論如何,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定可對殼聚糖實施的改性,而不影響最終制劑的穩(wěn)定性和商業(yè)用途。環(huán)糊精環(huán)糊精在結(jié)構(gòu)上由通過a(l-4)糖苷鍵結(jié)合的6、7或8個D-吡喃葡萄糖基單元組成,其分別被稱作a、P或y。這些寡糖的最穩(wěn)定的三維構(gòu)型是復(fù)曲面的,其中伯羥基和仲羥基向溶劑取向。在該構(gòu)型中,在超環(huán)面內(nèi)形成的空穴顯示出高疏水性,其是環(huán)糊精和藥物之間通過范德華力和氫橋的共同作用形成包合配合物的原因。環(huán)糊精衍生物應(yīng)理解為如下環(huán)糊精或其混合物,其中在葡萄糖的2-、3-和6-位上的部分或全部羥基基團的氫被其它官能團所取代,如二羥基烷基基團、糖類殘基、羥基烷基基團、磺酸酯基團、磺烷基基團、烷基基團、烷?;?alkanoyl)基團、乙酰基基團或苯甲?;鶊F。用于本發(fā)明的環(huán)糊精或其衍生物可以是商業(yè)購得的或通過本身已知的方法合成。環(huán)糊精或其衍生物的實例包括天然環(huán)糊精(a、/5或力、羥丙基環(huán)糊精、羧曱基環(huán)糊精、磺丁基環(huán)糊精、氨基環(huán)糊精、二曱基環(huán)糊精、環(huán)糊精磷酸酯(cyclodextrinphosphate),鞋乙基環(huán)糊精、乙?;h(huán)糊精、乙基環(huán)糊精、三曱基環(huán)糊精、羧乙基環(huán)糊精、葡糖基環(huán)糊精、6-0-a-麥芽糖基環(huán)糊精、丁基環(huán)糊精、硫酸化環(huán)糊精、N,N-二乙基氨基乙基環(huán)糊精、叔丁基曱硅烷基環(huán)糊精、曱硅烷基[(6-0-叔丁基二曱基)-2,3,-二-0-乙酰基)-環(huán)糊精、琥珀酰-(2-羥丙基)-環(huán)糊精、琥珀酰-環(huán)糊精、磺丙基-環(huán)糊精、聚環(huán)糊精。在本發(fā)明的具體實施方案中,環(huán)糊精是羥丙基-a-環(huán)糊精、羥丙基-p-環(huán)糊精、磺丁基乙基-P-環(huán)糊精或其混合物??蓪⑺鼈冎械娜我猸h(huán)糊精用于本發(fā)明系統(tǒng)中。平均取代度(DS)是指每單位環(huán)糊精的被取代的羥基的平均數(shù),然而摩爾取代度(MS)是指每單位的葡糖酐的羥基基團數(shù)。在本發(fā)明中,所使用的環(huán)糊精顯示出平均取代度的范圍是4.2至7,盡管也可以使用具有超出該范圍的DS的環(huán)糊精。本發(fā)明的納米顆粒系統(tǒng)的特征在于,在包含殼聚糖和任選的環(huán)糊精的聚陽離子相與由環(huán)糊精、或由交聯(lián)劑或由兩者的組合形成的聚陰離子相混合后,通過納米顆粒的自發(fā)沉淀形成所述納米顆粒系統(tǒng)。重要的是兩相均為水性的,因此在制備本發(fā)明的系統(tǒng)中避免使用或最小化地使用有機溶劑。所述交聯(lián)劑是使殼聚糖發(fā)生交聯(lián)的陰離子鹽,其促使納米顆粒的自發(fā)形成。在本發(fā)明中,該交聯(lián)劑是聚磷酸鹽,優(yōu)選使用三聚磷酸鈉(TPP)。當(dāng)環(huán)糊精是陰離子時,其自身可形成陰離子相,則TPP的存在是不必要的,因為通過帶負電荷的環(huán)糊精和帶正電荷的殼聚糖之間的靜電相互作用可形成所述納米顆粒。然而,共同加入TPP和陰離子環(huán)糊精在某些情況下可改變交聯(lián)密度以及促進納米顆粒的穩(wěn)定性。另一方面,在不帶有陰離子電荷的環(huán)糊精的情況中(不帶任何電荷或帶有正電荷),有必要向聚陰離子相中加入TPP以使殼聚糖交聯(lián)并促使納米顆粒的形成。殼聚糖-環(huán)糊精的納米顆粒是具有很高的結(jié)合生物活性分子能力的系統(tǒng)。該結(jié)合能力取決于所加入的分子的類型以及特定的配方參數(shù)。在該發(fā)明中,此類型的納米顆粒尤其旨在結(jié)合疏水性活性分子和低滲透性活性分子,無論其是疏水性的還是親水性的。因此,本發(fā)明的第二方面是如上定義的納米顆粒系統(tǒng)還包含生物活性分子。術(shù)語"生物活性分子"是指用于治療、治愈、預(yù)防或診斷疾病的或用于改善人和動物的身體和精神健康的任何物質(zhì)。這些生物活性分子可包括低分子量的藥物至多糖、蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)類型的分子,以及基于核酸的分子及其組合。在具體的實施方案中,根據(jù)FDA定義,生物活性分子是屬于II類(非滲透性水溶性)、III類(可滲透性疏水性)以及優(yōu)選的IV類(非滲透性疏水性)的藥物??膳c本發(fā)明系統(tǒng)一起使用的生物活性分子包括下述II類分子達那唑(Danazol)、酮康唑(Ketoconazole)、曱芬那酸(mefenamicacid)、尼索地平(Nisoldipine)、硝苯地平(Nifedipine)、尼卡地平(Nicardipine)、非洛地平(Felodipine)、阿4乇伐醌(Atovaquone)、灰黃霉素(Griseofulvin)、曲格列酮(Troglitazone)、格列本脲(Glybenclamide)、卡馬西平(Carbamazepine);III類分子無環(huán)鳥苦(Acyclovir)、新霉素B(NeomycinB)、卡托普利(Captopril)、依那普利拉(Enalaprilate)、阿侖膦酸鈉(Alendronate)、阿替洛爾(Atenolol)、西咪替丁(Cimetidine)、雷尼替丁(Ranitidine);IV類分子氯噻漆(Chlorothiazide)、呋塞米(Furosemide)、妥布霉素(Tobramycin)、頭孢呋辛(Cefuroxime)、伊曲康唑(Itraconazole)、環(huán)孑包菌素(Cyclosporin)。在優(yōu)選的實施方案中,生物活性分子是三氯生(triclosan)。在另一優(yōu)選的實施方案中,生物活性分子是呋塞米(furosemide)。在另一具體的實施方案中,生物活性分子是肽、多糖或蛋白質(zhì)類型的大分子或基于核酸的大分子(寡核芬酸、DNA、siRNA)。在優(yōu)選的實施方案中,生物活性分子是胰島素。在另一優(yōu)選的實施方案中,生物活性分子是肝素。在另一優(yōu)選的實施方案中,生物活性分子是DNA。本發(fā)明的另一方面是包含上文所定義的納米顆粒系統(tǒng)和抗原的疫苗。抗原通過該包含納米顆粒的系統(tǒng)進行給藥,可以實現(xiàn)免疫應(yīng)答。所述疫苗可包含蛋白質(zhì)、多糖或者其可以是DNA疫苗。嚴格地講,DNA疫苗是編碼將引起免疫應(yīng)答的抗原的表達的DNA分子。通過包括活性分子和聚合物之間形成非共價相互作用,或者活性分子與環(huán)糊精結(jié)合形成包合配合物,且該配合物與聚合物基質(zhì)形成非為了向殼聚糖的納米顆粒中充分加入生物活性分子,使用活性分子-環(huán)糊精的配位方法,由于活性分子與環(huán)糊精的配位作用,這需要首先溶解合理量的活性分子,然后將足量的配合物包嚢在納米結(jié)構(gòu)中。本發(fā)明的另一方面是藥物組合物,其包含上文所定義的納米顆粒系統(tǒng)以及能夠預(yù)防、減輕或治愈疾病的生物活性分子。藥物組合物的實例包括通過口服、含服或舌下途徑給藥的任意液態(tài)(納米顆粒的懸法液)或固態(tài)組合物(凍干或霧化的納米顆粒,形成可用于制備粒劑、片劑或膠嚢的粉末),或者通過經(jīng)皮、眼部、鼻腔、陰道或腸胃外途徑給藥的液態(tài)或半固態(tài)形式的組合物。在非腸胃外途徑的情況中,通過賦予所述納米顆粒相當(dāng)數(shù)量的正電荷可改善該納米顆粒與皮膚或粘膜的接觸,賦予該納米顆粒相當(dāng)數(shù)量的正電荷將有助于其與上述的帶負電荷的表面相互作用。在腸胃外途徑的情況中,更具體地在靜脈給藥的情況中,這些系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)與之結(jié)合的藥物或分子的體內(nèi)分布。在優(yōu)選的方面中,所述藥物組合物通過跨粘膜途徑給藥。殼聚糖-環(huán)糊精混合物的正電荷通過與粘膜和帶負電荷的上皮細胞的表面的相互作用提供了該藥物在粘液表面上的較好吸收。加入到納米顆粒中的活性成分的比例可高達為相對于系統(tǒng)總重的40%重量比。然而,在每種情況中,合適的比例取決于待加入的活性成分、設(shè)計該比例所為的適應(yīng)證以及釋放效率。本發(fā)明的納米顆粒系統(tǒng)還可以加入不顯示治療效果,但產(chǎn)生化妝用組合物的化妝品用活性分子。這些化妝用組合物包括用于局部給藥的任意液態(tài)組合物(納米顆粒的懸浮液)或乳液。在可加入到該納米顆粒的化妝用活性分子中,技術(shù)人員可以列舉抗痤瘡劑、抗真菌劑、抗氧化劑、除臭劑、止汗劑、去頭屑劑、皮膚增白劑、助曬劑、紫外線吸收劑、酶、化妝用抗微生物劑等等。本發(fā)明的另一方面涉及制備諸如上文所定義的殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的方法,其包括a.在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備殼聚糖或其衍生物的溶液;b.在任選加入交聯(lián)劑的水介質(zhì)中或在任選加入交聯(lián)劑的水與極性溶劑的混合物中制備環(huán)糊精或其衍生物的溶液;以及c.在攪拌下,混合步驟a)和b)的溶液以使得自發(fā)地產(chǎn)生殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒?;蛘?,任選地的a.在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備殼聚糖或其衍生物和環(huán)糊精或其衍生物的溶液;b.在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備交聯(lián)劑的溶液;c.在攪拌下,混合步驟a)和b)的溶液以使得自發(fā)地產(chǎn)生殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒。無毒溶劑可以用作極性溶劑,其包括乙腈、醇和丙酮等等。同樣地,所使用的水介質(zhì)可以含有不同類型的鹽。在所述方法的變體中,所得到的殼聚糖/環(huán)糊精/交聯(lián)劑的質(zhì)量比是4/4/1至4/80/1。然而,也可以使用殼聚糖相對于環(huán)糊精或相對于交聯(lián)劑的更高比率,這取決于所使用的環(huán)糊精的類型。因此,對于天然環(huán)糊精(例如HPPCD),環(huán)糊精的存在似乎不影響納米顆粒的形成過程??梢灾苯訉⑺錾锘钚苑肿蛹尤氲讲襟Ea)或b)的溶液中,以使得自發(fā)產(chǎn)生含有該生物活性分子的殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒。然而,在所述方法的變體中,在制備所述顆粒(步驟c)前,可以將所述分子在先前的步驟中溶解在水相或水相和極性溶劑的混合物中,并加入到步驟a)或b)。然而,對于低溶解性藥物,如果將該活性分子與環(huán)糊精一起在同一步驟中進行溶解,則可得到較高的濃度。制備殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的方法還可以包括另外的步驟,其中所述納米顆粒被凍干。從藥學(xué)觀點上看,獲得凍干形式的納米顆粒是重要的,因為這改善了其在貯存過程中的穩(wěn)定性并減少了待處理的產(chǎn)品的體積。在濃度為1%至5%重量比的低溫防護劑的存在下,殼聚糖-環(huán)糊精納米顆??梢员粌龈?,該低溫防護劑例如為葡萄糖、蔗糖或海藻糖。事實上,本發(fā)明的納米顆粒的另一優(yōu)點為凍干前后的粒徑未顯著受到影響。即,納米顆粒具有被凍干并重新懸浮時其物理性質(zhì)未經(jīng)任何改變的優(yōu)點。本發(fā)明的系統(tǒng)已證實其在與上皮細胞的相互作用以及促進多核苷酸在細胞中轉(zhuǎn)染方面是非常有效的載體。被包含在所述系統(tǒng)中的納米顆??蓪⑦z傳物質(zhì)引入到細胞中,例如基于核酸的分子、寡核苷酸、siRNA或多核芬酸,優(yōu)選編碼所關(guān)注的蛋白的DNA質(zhì)粒,這使該系統(tǒng)潛在地適用于基因治療。在特別的實施方案中,所述DNA質(zhì)粒是pEGFP。體外研究可以觀察DNA質(zhì)粒的極為有效的釋放,這實現(xiàn)了相當(dāng)數(shù)量水平的細胞轉(zhuǎn)染。因此,本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的納米顆粒系統(tǒng)在制備基因治療藥物中的用途。在特別方面中,該系統(tǒng)包含多核苷酸,該多核苷酸含有能夠在待治療患者的細胞中功能性表達其自身的基因。在這點上,可使用本發(fā)明系統(tǒng)來治療的疾病的某些實例是使用抗VEGF反義藥物治療的黃斑變性、大皰性表皮松解癥和嚢性纖維化。該系統(tǒng)還可用于用短暫性轉(zhuǎn)4匕方案(transitorytransformationschemes)使創(chuàng)傷愈合。最后,由于其高轉(zhuǎn)染能力,包含合成或天然多核苷酸的本發(fā)明的系統(tǒng)和組合物可用于靶細胞的轉(zhuǎn)染,優(yōu)選腫瘤性或"正常"哺乳動物細月包,以及干細月包或細胞系。此外,本發(fā)明的系統(tǒng)和組合物是用于細胞的遺傳操作的有用工具。在這點上,本發(fā)明還涉及本發(fā)明的系統(tǒng)對細胞的遺傳操作的用途。優(yōu)選地,本發(fā)明的系統(tǒng)用于核酸在體外或先體外后體內(nèi)的釋放。這種釋放針對靶細胞,其包括真核細胞,例如哺乳動物細胞、細胞系,并且這種釋放可導(dǎo)致體外或先體外后體內(nèi)的細胞轉(zhuǎn)染或細胞轉(zhuǎn)化。因此,本發(fā)明還涉及被設(shè)計用于真核細胞轉(zhuǎn)染的試劑盒,其包括本發(fā)明的系統(tǒng)以及適當(dāng)?shù)南♂寗┖?或用于細胞洗滌的緩沖液。以下我們描述了本發(fā)明的一些示例性實施例;然而,不應(yīng)當(dāng)認為它們是對本發(fā)明的限制。實施例使用光子相關(guān)光譜(PCS)和激光多鐠勒測速技術(shù)來表征含有不同組合物和不同聚合物之比的制劑的物理化學(xué)性質(zhì)。通過透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯^:鏡(SEM)研究了納米顆粒的形態(tài)學(xué)。使用元素分析技術(shù)研究所制備的納米顆粒的組合物。該研究證實納米顆?;|(zhì)中殼聚糖-環(huán)糊精混合物的存在。實施例1.作為殼聚糖類型和TTP濃度的函數(shù),對殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的性質(zhì)進行評估用不同的殼聚糖(CS)(0.2%w/w)來制備羥丙基-j8-環(huán)糊精(HPi8CD)的固定濃度的(6.29mM)溶液(3ml)。在;茲力攪拌下將這些溶液培養(yǎng)24h,然后用0.45-/xm過濾器進行過濾并且通過加入濃度為1.25mg/ml或2mg/ml的不同體積的三聚磷酸鹽使其交聯(lián),以使得殼聚糖/三聚磷酸鹽的質(zhì)量比總是維持在4:1。通過16000xg的離心將納米顆粒分離并將其重新懸浮于水中。通過光子相關(guān)光譜(PCS)測定納米顆粒的粒徑。作為所使用的殼聚糖的分子量和用作交聯(lián)劑的三聚磷酸鹽的濃度的函數(shù),該納米顆粒的平均粒徑以及多分散指數(shù)的結(jié)果如表1所示。表l:殼聚糖的分子大小(CSMw)、HP/3CD的存在和交聯(lián)劑三聚磷酸鹽(TPP)的濃度對納米顆粒的平均粒徑和多分散性的影響(平均值±std.dev.,n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例2.作為環(huán)糊精的類型和濃度的函數(shù),對殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的性質(zhì)的評估(TTP濃度=2mg/ml)使用不同量的羥丙基環(huán)糊精(a-或)3-)(0至25mM)制備0.2%(w/w)的殼聚糖溶液(3ml),尤其是0.2%(w/w)的殼聚糖鹽酸鹽(chitosanhydrochloride)(ProtasanC1110)溶液。在磁力攪拌下將這些溶液培養(yǎng)24h,然后通過0.45-/mi的孔徑大小過濾該溶液并且通過加入濃度為2mg/ml的0.75ml的三聚磷酸鹽使其交聯(lián)。通過16000xg的離心將納米顆粒分離并將其重新懸浮于水中。通過光子相關(guān)光譜(PCS)表征所得顆粒的粒徑及其多分散性、由激光多譜勒測速儀表征Zeta電勢以及通過稱重所分離的納米顆粒樣品的干殘渣表征產(chǎn)率。結(jié)果如表2所示。圖1(左圖)和圖2顯示了分別通過TEM和SEM進4亍分析的由25mM的HP/3CD制備的顆粒的形態(tài)學(xué),證實形成球形納米顆粒。表2:羥丙基環(huán)糊精的類型和濃度對殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的性質(zhì)(粒徑、多分散性、Zeta電勢和產(chǎn)率)的影響(平均值±std.dev.,n=3)HPCD濃度(mM)HPCD類型粒徑(nm)多分散指數(shù)7+山執(zhí),、,、(pi)Zeta電勢(mV)0---686±10.5+33.8±3.43.14625±40.6+34.7±2.3/3590±10.3+35.3±3.86.29a645±70.6+33.8±0.5/5624±00.3+36.2±0.525a690±30.4+35.3士3.8670士40.6+33.1±3.3實施例3.作為環(huán)糊精的類型和濃度的函數(shù),對殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的性質(zhì)的評估(TTP濃度=1.25mg/ml)使用不同量的羥丙基環(huán)糊精(a-或(0至25mM)來制備0.2%(w/w)的殼聚糖(ProtasanC1110)溶液(3ml)。在^茲力攪拌下將這些溶液培養(yǎng)24h,然后通過0.45卞m的孔徑大小過濾該溶液并且通過加入濃度為1.25mg/ml的1.2ml的三聚磷酸鹽使其交聯(lián)。通過16000xg的離心將納米顆粒分離并將其重新懸浮于水中。通過光子相關(guān)光語(PCS)表征所得顆粒的粒徑及其多分散性、由激光多譜勒測速儀表征Zeta電勢以及通過稱重所分離的納米顆粒樣品的干殘渣表征產(chǎn)率。結(jié)果如表3所示。圖1(右圖)顯示了通過TEM分析的由25mM的HP/3CD制備的顆粒的形態(tài)學(xué)。表3:羥丙基環(huán)糊精的類型和濃度對殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的性質(zhì)(粒徑、多分散性、Zeta電勢和產(chǎn)率)的影響(平均值±Std.Dev.,n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例2和實施例3中所得到的結(jié)果顯示,環(huán)糊精的摻雜物(inclusion)影響所得的納米顆粒的粒徑,但不過分地改變其數(shù)值。對于Z電位,在存在環(huán)糊精的情況下制備的納米顆粒呈現(xiàn)極為相似的數(shù)值。該數(shù)據(jù)使我們推論出環(huán)糊精不妨礙納米顆粒的形成過程,以及它們不一定與納米顆粒的形成過程相關(guān)。另一方面,當(dāng)環(huán)糊精的濃度增加時,產(chǎn)率顯著增加。實施例4.殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒在細胞培養(yǎng)物中的穩(wěn)定性在交聯(lián)劑TPP的存在下,在磁力攪拌下,通過將磺丁基醚-p-環(huán)糊精(SBE-CD)水溶液或羧曱基-P-環(huán)糊精(CM-CD)水溶液與殼聚糖(CS)的水溶液混合,以如下方式用兩種類型的環(huán)糊精制備殼聚糖的納米顆粒,該方式為不同組分之間的比率為CS/SBE-CD/TPP:(4/3/0.25)CS/CM-CD)/TPP:(4/4/0.25)然后,通過離心將該納米顆粒分離,隨后在37°C下,在Hanks鹽溶液(HBSS)中將其進行培養(yǎng)。該緩沖溶液(其含有無機鹽和葡萄糖)很可能最廣泛地用于使用細胞培養(yǎng)物的實驗中,這是由于該緩沖液可以將該細胞維持在生理學(xué)pH以及滲透壓下,因此在短期內(nèi)將其保持在存活狀態(tài)而不促進其生長。通過測定納米顆粒的粒徑變化來進行穩(wěn)定性研究。如圖3所示,殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒在實驗條件下是穩(wěn)定的。實施例5.殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒在模擬的腸液中的穩(wěn)定性在存在TPP或不存在TPP的情況下,按照實施例4所描述的通過離子膠凝法來制備殼聚糖和羧曱基-P-CD的納米顆粒。在37。C下,pH=6.6的模擬腸液中評定這些納米顆粒的穩(wěn)定性。該介質(zhì)重現(xiàn)了小腸的條件,但是也可反映納米顆粒在鼻粘膜上的穩(wěn)定性。納米顆粒經(jīng)證實在4小時內(nèi)是穩(wěn)定的,正如圖4所示,因此其對于不同給藥途徑似乎是合適的系統(tǒng)。實施例6.將胰島素包嚢進殼聚糖和環(huán)糊精的納米顆粒中的能力的評估使用不同濃度的殼聚糖和TPP以及,在某些情況下,向初始水溶液中加入0.24%的胰島素濃度,按照實施例4或5所描述的制備殼聚糖和羧曱基-P-CD的納米顆粒。然后,通過離心分離該納米顆粒。圖4顯示裝載或未裝載胰島素的納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)。表4:裝載或未裝載胰島素的CS/CM-CD/TPP納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)。(*)裝載胰島素的納米顆粒CS/CM畫CD/TPP粒徑(nm)多分散指數(shù)Zeta電勢(mV)4/3/0200±130.11-0.16+2.0±1.44/4/0238±160.08-0.10+27.0±2.44/3.5/0("482±330.04-0.19+29.6±0.84/2/0.5299±250.36-0.46+32.0±0.34/3/0.25264±180.23-0.37+27.0±0.64/4/0.25("436±340.10-0.23+25.9±1.84/3/0.5(*)555±1190.02-0.52+31.4±1.44/2/0.75(*)631±1530.29-0.41+31.2±1.54/1.5/0,75(*)613±1240.11-0.5831.0±1,54/0/1(*)454±1200.22-0.3137.1±1.3正如所觀察到的,已裝載的納米顆粒的粒徑為430nm至635nm,所述粒徑比未裝載胰島素的納米顆粒的粒徑大高達一倍。另一方面,表5顯示了將胰島素裝載在納米顆粒中的能力。技術(shù)人員可以觀察到可以將胰島素非常有效地加入到該納米顆粒中,顯示超過85%的結(jié)合效率。表5:將胰島素包嚢進CS/CM-CD/TPP納米顆粒中的效率(胰島素的濃度為0.24%)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>此外,在37。C下,對裝載月夷島素的CS/CM-CD/TPP納米顆粒在pH6.8的模擬的腸液中的穩(wěn)定性進行評估,如實施例5所描述。在第一個兩小時內(nèi),相對于初始粒徑,納米顆粒的粒徑未增加(圖5)。實施例7.作為環(huán)糊精的類型和濃度的函數(shù),對三氯生的溶解度、其在納米顆粒中的包囊效率及裝載量的評估根據(jù)實施例2中描述的方法獲得殼聚糖-環(huán)糊精的納米顆粒,但是向初始溶液中加入足量的藥物三氯生以使該溶液過飽和。在過濾(通過0.45/mi)過程中棄去未被環(huán)糊精-聚合物混合物溶解的藥物,隨后通過離子致交聯(lián)(ionotropiccrosslinking)將所述聚合物交聯(lián)(參見實施例2)。表6顯示三氯生在用于形成所述顆粒的初始溶液中所達到的溶解度、將三氯生包嚢進納米顆粒中的效率以及三氯生在這些納米顆粒中達到的裝載量。通過分光光度法測定三氯生()^280nm)。包嚢效率(EE)是指相對于納米顆粒制備過程中所加入的藥物量,截留在殼聚糖-環(huán)糊精系統(tǒng)中的藥物的百分比。由仍然溶于納米顆粒懸濁液介質(zhì)中的未包嚢藥物的計算來間接測定藥物裝載。該值與理論藥物含量之間的差異被認為是裝載在納米顆粒中的藥物量。片劑中出現(xiàn)的藥物裝載百分比是相對于100mg納米顆粒中被包嚢的藥物量的百分比。表6:所使用的環(huán)糊精的類型和濃度對三氯生的增溶作用、所得到的其在最終納米顆粒中的包嚢效率(EE)及裝載量的影響(中間值±Std.Dev.,n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實施例8.作為環(huán)糊精的類型和濃度的函數(shù),對呋塞米的溶解度、其在納米顆粒中的包嚢效率及裝載量的評估根據(jù)實施例3中描述的方法,制備殼聚糖-環(huán)糊精的納米顆粒,但是向初始溶液中加入足量的藥物呔塞米以使所述溶液過飽和。在過濾(通過0.45pim)過程中棄去未被環(huán)糊精-聚合物混和物溶解的藥物,隨后將該聚合物交聯(lián)(參見實施例3)。表7顯示呋塞米在用于形成所述顆粒的初始溶液中所達到的溶解度、將呋塞米包嚢進納米顆粒中的效率以及呋塞米在這些納米顆粒中達到的裝載量。通過分光光度法測定所述呋塞米0=230nm)。為了測定已包嚢的呋塞米的量,在將其分離后,測定顆粒上清液中呋塞米的量(未結(jié)合的量),并計算差值。表7:所使用的環(huán)糊精的類型和濃度對呋塞米的增溶作用、所得到的其在最終納米顆粒中的包嚢效率(EE)及裝載量的影響(中間值±Std.Dev.,n=3)HPCDHPCD濃度呔塞米的類型(mM)溶解度(mg/1)呋塞米的EEw呋塞米的裝載量/307.8±1.322.3±1.43.1442.3±2.417.1±3.06.2995.4±10.112.1±1.3253873±10.37.2±3.125253.5±9.88.8±2.70.23±0.070.89±0.041.43±0.242.39±0.721.92±0.55實施例9.藥物三氯生或呋塞米從殼聚糖-環(huán)糊精的納米顆粒中的釋放制備帶有三氯生和呋塞米的殼聚糖-環(huán)糊精的納米顆粒。為了制備含有三氯生的制劑,遵循實施例7中所描述的方法(含有25mM的HPCDa或/3的制劑)以及,為了制備含有呋塞米的制劑,遵循實施例8中所描述的方法(含有25mM的HPCDa或j3的制劑)。分離所述納米顆粒并使其重新懸浮在乙酸鹽緩沖液(pH6.0,低離子強度)中。在37。C下,在水平攪拌(100rpm)下,在該介質(zhì)中培養(yǎng)該納米顆粒。在不同的時間(0.5h、1.5h和4.5h)從培養(yǎng)介質(zhì)中取出樣品,將藥品從溶液中分離(以200000xg離心30分鐘)并用分光光度法進行測定,如實施例7和8所述。所制備的制劑的藥物釋放曲線圖如圖6所示。實施例10.作為環(huán)糊精的類型和濃度的函數(shù),對三氯生的溶解性、其在納米顆粒中的包嚢效率及裝載量的評估在80%水和20%乙醇的混合物中,以足量制備殼聚糖(ProtasanC1110,0.2%)、HP/3CD(0,1.28mM和2.56mM)以及三氯生的溶液(3ml),以使溶液過飽和。在磁力攪拌下將這些溶液培養(yǎng)24h,然后通過0.45-zmi過濾器進^亍過濾,并且通過加入濃度為1.25mg/ml的1.2ml溶于80%水和20%乙醇的混合物的三聚磷酸鹽使其交聯(lián)。通過16000xg的離心將納米顆粒分離并將其重新懸浮于水中。通過光子相關(guān)光譜(PCS)來表征所得的納米顆粒的粒徑及其多分散性。通過用脫乙酰幾丁質(zhì)酶(Chitosanase-RD,PiasCo,Japan)降解等分的重新懸浮的納米顆粒來測定被包嚢的藥物的量,并通過分光光度法進行評定(X-280nm)。結(jié)果如表8所示。表8:所用的環(huán)糊精的濃度對三氯生在用于制備納米顆粒的相中的增溶作用、得到的納米顆粒的包嚢效率(EE)以及三氯生在納米顆粒中的最終裝載量的影響(中間值±Std.Dev.,n=3)丄,《,、落解的三氯生粒徑(nm)(mg/1)HP/5CD濃度(mM)1.282.56499±33568±25517±14719±792536±2833521±213三氯生的EE(%)22.3±1.437.7±7.333.5±2.7三氯生的裝載量(%)2.2±0.97.4±1.38.7±0.2實施例11.作為環(huán)糊精類型的函數(shù),對含有或不含有質(zhì)粒DNA的殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的粒徑及多分散性的評估制備下列溶液(A)曱基-z3-環(huán)糊精(Me-iS-CD)(7.4mM)、三聚磷酸鹽(1.25mg/ml)和編碼綠色螢光蛋白的質(zhì)粒(pGFP)(0.5mg/ml);以及(B)磺丁基-|8-環(huán)糊精(0.18mM)(SB-j8-CD)和編碼綠色螢光蛋白的質(zhì)粒(0.5mg/ml)。在攪拌下對這兩種溶液培養(yǎng)1h。在磁力攪拌下,將0.24-ml體積的溶液A或B加入到1.2ml的0.1%(w/w)殼聚糖中,形成納米顆粒通過光子相關(guān)光譜(PCS)來表征所得顆粒的粒徑及多分散性。結(jié)果如表9所示。表9:環(huán)糊精的類型對含有或不含有質(zhì)粒DNA的殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的粒徑及多分散性的影響(平均值±Std.Dev.,n=3)。*表達為數(shù)值的范圍<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>含有DNA的殼聚糖-磺丁基環(huán)糊精的制劑在將其分離前在瓊脂糖凝膠中進行電泳。對照包括溶液中的質(zhì)粒、無質(zhì)粒的制劑以及含有用脫乙酰幾丁質(zhì)酶(Chitosanase-RD,PiasCo,Japan)降解的質(zhì)粒的制劑。結(jié)果如圖7所示。實施例12.轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)物的效率的體外研究制備如實施例11中所述的納米顆粒的制劑。通過離心(16000xg,30分鐘)將所述制劑分離并將其重新懸浮于低離子強度、pH6.0的緩沖液中。將含有l(wèi)pg或2/zgDNA的一定量的制劑與細胞培養(yǎng)物一起培養(yǎng)。獲得的細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖8所示。熒光圖顯示了作為納米顆粒-pGFP系統(tǒng)轉(zhuǎn)染結(jié)果的表達綠色熒光蛋白的細胞集落。不含載體的質(zhì)粒不顯示出轉(zhuǎn)染細胞的能力,即沒有可觀察到的熒光細胞集落。實施例13.環(huán)糊精的類型和殼聚糖、環(huán)糊精和三聚磷酸鹽之間的質(zhì)量比對納米顆粒系統(tǒng)的最終組成的影響分別按照實施例3和11制備殼聚糖-HP/3CD和殼聚糖-SB^CD的納米顆粒。在用于制備該納米顆粒的初始溶液中使用不同量的環(huán)糊精。在將該納米顆粒分離后,通過元素分析技術(shù)(考慮到氮碳比或氮硫比)測定納米顆粒的實際組成(殼聚糖%、環(huán)糊精%、抗衡離子%)。通過熱解重量分析法測定樣品的濕度。表10:環(huán)糊精的類型以及殼聚糖(CS)、環(huán)糊精(CD)和三聚磷酸鹽(TPP)之間的質(zhì)量比對所制備的系統(tǒng)的最終組成的影響(干重的百分比)(平均值±Std.Dev.,n=3)。*約等于零<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例14.殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒通過大鼠的鼻粘膜進行輸送的研究為了評估本發(fā)明的納米顆粒系統(tǒng)作為被設(shè)計用于藥物給藥的載體的潛力,測定所述納米顆粒穿過鼻上皮的能力。使用不同比例的組分,用兩種特定制劑一殼聚糖/磺丁基乙基-P-環(huán)糊精(CS/SBE-P-CD)和殼聚糖/羧甲基-P-環(huán)糊精(CS/CM-P-CD)進行該研究。殼聚糖預(yù)先用熒光素標(biāo)記(FI-CS)。通過碳二亞胺與EDAC的反應(yīng)來完成該標(biāo)記方法,這使得熒光標(biāo)記與該殼聚糖分子形成共價—睫,如尸Aamz.及m.,2004,21,803-10中所述。表11顯示了^^皮評估的用熒光素標(biāo)記的納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)。表11.被評估的用熒光素標(biāo)記的納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>將這些納米顆粒的懸浮液(其穩(wěn)定性先前已在5%w/w海藻糖的轉(zhuǎn)移介質(zhì)中進行評估,圖9)通過鼻內(nèi)途徑向完全清醒的大鼠給藥。在預(yù)置時間過去后(具體地,給藥后10分鐘),大鼠由于頸脫位而無痛苦死去,用多聚甲醛固定鼻粘膜,切除,然后用共焦顯微鏡(CLSM,Zeiss501,Jena,Germany)在488nm下觀察。所觀察到的圖像顯示這些納米顆粒表現(xiàn)出顯著的與鼻粘膜的相互作用。權(quán)利要求1.包含用于釋放生物活性分子的納米顆粒的系統(tǒng),其中所述納米顆粒包含a)至少40%重量比的殼聚糖或其衍生物以及b)小于60%重量比的環(huán)糊精或其衍生物,其中組分a)和組分b)是混合的,且在所述兩種組分之間沒有任何共價鍵。2.如權(quán)利要求l所述的系統(tǒng),其中所述納米顆粒還包含能夠以納米結(jié)構(gòu)的形式離子交聯(lián)殼聚糖的陰離子鹽。3.如權(quán)利要求1和2所述的系統(tǒng),其中所述殼聚糖或其衍生物的比例為至少40%重量比至95.5%重量比。4.如權(quán)利要求1至3所述的系統(tǒng),其中相對于所述殼聚糖,所述環(huán)糊精或其衍生物的比例為0.5%重量比至小于60%重量比。5.如權(quán)利要求1至4所述的系統(tǒng),其中殼聚糖的聚合度或形成所述殼聚糖或其衍生物的單體單元的數(shù)目為5至5,000,優(yōu)選為30至600。6.如權(quán)利要求1至5所述的系統(tǒng),其中所述殼聚糖或其衍生物的分子量為1kDa至2,000kDa,優(yōu)選為5kDa至500kDa,更優(yōu)選為5kDa至200kDa。7.如權(quán)利要求1至6所述的系統(tǒng),其中所述殼聚糖或其衍生物的脫乙酰度為30%至95%,優(yōu)選為50%至95%。8.如權(quán)利要求1至7所述的系統(tǒng),其中所述環(huán)糊精選自天然環(huán)糊精(a、0或力、羥丙基環(huán)糊精、羧曱基環(huán)糊精、磺丁基環(huán)糊精、氨基環(huán)糊精、二曱基環(huán)糊精、環(huán)糊精磷酸酯、羥乙基環(huán)糊精、乙?;h(huán)糊精、乙基環(huán)糊精、三曱基環(huán)糊精、羧乙基環(huán)糊精、葡糖基環(huán)糊精、6-O-a-麥芽糖基環(huán)糊精、丁基環(huán)糊精、硫酸化環(huán)糊精、N,N-二乙基氨基乙基環(huán)糊精、叔丁基曱硅烷基環(huán)糊精、曱硅烷基[(6-0-叔丁基二曱基)-2,3,-二-O-乙?;?-環(huán)糊精、琥珀酰-(2-輕丙基)-環(huán)糊精、琥珀酰-環(huán)糊精、磺丙基-環(huán)糊精、聚環(huán)糊精。9.如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng),其中所述環(huán)糊精是羥丙基-a-環(huán)糊精、羥丙基-P-環(huán)糊精、磺丁基乙基-p-環(huán)糊精或其混合物。10.如權(quán)利要求1至9所述的系統(tǒng),其中所述環(huán)糊精顯示出的平均取代度為4.2至7。11.如權(quán)利要求1至IO所述的系統(tǒng),所述系統(tǒng)還包含生物活性分子,所述生物活性分子選自由低分子量藥物、多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、寡核苷酸、核酸以及其組合。12.如權(quán)利要求1至11所述的系統(tǒng),其中所述生物活性分子是根據(jù)FDA采用的生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)所定義的第2類、第3類或第4類藥物;其優(yōu)選為第4類藥物。13.如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng),其中所述交聯(lián)劑是聚磷酸鹽,優(yōu)選為三聚磷酸鈉。14.如權(quán)利要求1至13所述的系統(tǒng),其中所述納米顆粒的平均粒徑為1nm至999跳優(yōu)選為100rnn至800亂15.如;f又利要求1至14所述的系統(tǒng),其中在lmMKC1中測定的電荷(Z電勢)為0至+60mV。16.藥物組合物,其包含權(quán)利要求1至15中任一權(quán)利要求所定義的系統(tǒng)和能夠預(yù)防、減輕或治愈疾病的生物活性分子17.如權(quán)利要求16所述的組合物,其通過口服、含服、舌下、局部、經(jīng)皮、眼部、鼻腔、陰道或腸胃外途徑給藥。18.如權(quán)利要求16和17所述的組合物,其中所述生物活性分子選自多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、寡核苷酸、基于核酸的分子及其組合。19.如;f又利要求16至18所述的組合物,其中所述生物活性分子是根據(jù)FDA采用的生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)所定義的第2類、第3類或第4類藥物。20.如權(quán)利要求16至18中任一權(quán)利要求所述的組合物,其中所述生物活性分子是三氯生、呋塞米、胰島素、肝素或由核酸組成的分子。21.化妝用組合物,其包含權(quán)利要求1至10和13至15中任一權(quán)利要求所定義的系統(tǒng)和化裝用活性分子。22.如權(quán)利要求21所述的化妝用組合物,其中所述化妝用活性分子選自抗痤瘡劑、抗真菌劑、抗氧化劑、除臭劑、止汗劑、去頭屑劑、皮膚增白劑、助曬劑、紫外線吸收劑、酶和化妝用抗微生物劑。23.疫苗,其包含權(quán)利要求1至15中任一權(quán)利要求所定義的用于釋放生物活性分子的系統(tǒng)和抗原。24.如權(quán)利要求23所述的疫苗,其中所述抗原選自蛋白質(zhì)、多糖和DNA分子。25.獲得權(quán)利要求1至15中任一權(quán)利要求所述的被設(shè)計用于控制釋放生物活性分子的系統(tǒng)的方法,其包括a)在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備殼聚糖或其衍生物的溶液;b)在任選加入交聯(lián)劑的水介質(zhì)中或在任選加入交聯(lián)劑的水與極性溶劑的混合物中制備環(huán)糊精或其衍生物的溶液;以及c)在攪拌下,以自發(fā)獲得所述殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的方式混合步驟a)和b)的所述溶液?;蛘撸芜x地a)在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備殼聚糖或其衍生物和環(huán)糊精或其衍生物的溶液;b)在水介質(zhì)中或在水與極性溶劑的混合物中制備所述交聯(lián)劑的溶液;c)在攪拌下,以自發(fā)獲得所述殼聚糖-環(huán)糊精納米顆粒的方式混合步驟a)和b)的所述溶液。26.如權(quán)利要求25所述的獲得納米顆粒的方法,其中所述交聯(lián)劑是三聚磷酸鹽,優(yōu)選為三聚磷酸鈉。27.如權(quán)利要求25和26中任一權(quán)利要求所述的方法,其中將所述生物活性分子預(yù)先溶于步驟a)或b)中,或者預(yù)先溶于加入到a)或b)中的另一水相或有^L相中。28.如權(quán)利要求25所述的方法,其中所述生物活性分子選自多糖、蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、基于核酸的分子及其組合。29.如權(quán)利要求25和28所述的方法,其中所述生物活性分子是根據(jù)FDA(生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng))所定義的第2類、第3類或第4類藥物;優(yōu)選地,所述生物活性分子是第4類藥物。30.如權(quán)利要求28和29所述的方法,其中所述生物活性分子是三氯生、呋塞米,胰島素、肝素或DNA質(zhì)粒。31.權(quán)利要求1至15所述的系統(tǒng)在制備基因治療藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及包含被設(shè)計用于生物活性分子釋放的納米顆粒的系統(tǒng),其中該納米顆粒包含a)至少40%重量比的殼聚糖或其衍生物以及b)小于60%重量比的環(huán)糊精或其衍生物,其中組分a)和組分b)是混合的,且在兩者之間不存在任何共價鍵。該系統(tǒng)使得生物活性分子與其有效結(jié)合,以及隨后允許該生物活性分子在合適的生物環(huán)境中釋放。文檔編號A61K9/51GK101217947SQ200680020888公開日2008年7月9日申請日期2006年6月1日優(yōu)先權(quán)日2005年6月2日發(fā)明者M#+[a]何賽·阿隆索費爾南德斯,保拉·穆拉,弗蘭切斯卡·馬埃斯特雷利,馬羅什·加西亞富恩特斯申請人:圣地亞哥聯(lián)合大學(xué)