專利名稱：對生物假體組織進行處理以緩解植入后鈣化的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明一般涉及醫(yī)學方法/裝置，更具體涉及用于固定(例如，鞣制
(tanning)或者交耳關)和消毒生物組織以降低所述固定后的組織發(fā)生 植入后朽化的趨勢以及減少所述固定后的組織形成血栓的方法。
背景技術(shù)：
可植入的生物組織可以由人體組織形成，所述人體組織通過冷凍 (即，低溫保存)所謂的同種移植組織進行保存；或者由動物組織形成， 所述動物組織通過化學固定(即，鞣制)所謂的生物假體來保存 (Carpentier, Biological Tissues in Heart Valve Replacement, Butterworth ( 1972 ) , Ionescu編輯)。用作生物々￡體的生物組織類型 包括心臟瓣膜、血管、皮膚、硬腦膜、心包、小腸粘膜下層("SIS組 織")、韌帶和腱。這些生物組織通常包含充當所述組織的支撐支架的 結(jié)締組織蛋白(即，膠原和彈性蛋白)。每種生物組織的柔韌性或者剛 性很大程度上由該組織中存在的膠原和彈性蛋白的相對量和/或其結(jié)締 組織支架的物理結(jié)構(gòu)和構(gòu)造來決定。膠原是大多數(shù)組織中存在的最豐富 的結(jié)締組織蛋白。每個膠原分子由以螺旋構(gòu)造盤繞在一起的三個(3) 多肽鏈形成。
用于化學固定生物組織的技術(shù)通常包括將該生物組織暴露到一種或 多種化學固定劑(即，鞣制劑)中，所述化學固定劑在給定膠原分子內(nèi) 的多肽鏈之間形成交聯(lián)(即，分子內(nèi)交聯(lián))，或者在相鄰膠原分子之間 形成交聯(lián)(即，分子間交聯(lián))。
已經(jīng)用于交聯(lián)膠原生物組織的化學固定劑的實例包括曱醛、戊二 醛、二醛淀粉、六亞曱基二異氰酸酯和一些聚環(huán)氧化合物。在可以采用 的各種化學固定劑中，戊二醛自從在1968年由Dr. Carpentier發(fā)現(xiàn)它 具有抗免疫和抗降解效果以來已經(jīng)得到了最廣泛的應用。具體參見 Carpentier, A., J. Thorac. Cardiovascular Surgery, 58: 467-69 (1 969 )。另外，戊二醛是最有效的消毒劑之一。戊二醛被用作許多市 售生物假體制品的固定劑和消毒劑，所述生物假體制品比如豬生物假體
心臟瓣膜(例如，Carpentier-Edwards TM帶支架的豬生物假體)、牛心 包心臟瓣膜(例如，Carpentier-Edwards Pericardial Bioprosthesis )和不帶支架的豬主動脈瓣膜(例如，Edwards PRIMA Plus Stentless Aortic Bioprosthesis),以上制品老卩有Edwards Lifesciences LLC, Irvine, CA制備和銷售。
固定例如通過防止組織發(fā)生酶性降解而提供了機械穩(wěn)定。戊二醛已 經(jīng)被廣泛用作交聯(lián)劑來和膠原中的氨基酸殘基，比如賴氨酸和羥基賴氨 酸的s-氨基或者天冬氨酸和谷氨酸的羧基，發(fā)生反應。由于戊二醛分 子的反應性以及二醛的自聚合性，戊二醛-胺反應的化學本質(zhì)很復雜。 醛和伯胺的反應產(chǎn)物的最重要組分涉及形成Schiff堿，其中氮和醛的 碳形成雙鍵，代替羰基碳和氧之間的雙鍵。
和許多生物假體材料植入相關的 一個問題是這些材料中的結(jié)締組織 蛋白(即，膠原和彈性蛋白)在植入到體內(nèi)后可能被鉤化。這種《丐化可 能導致該生物假體發(fā)生不希望的硬化或者降解。在固定的膠原性生物假 體中，已知發(fā)生兩種類型的4丐化——內(nèi)在性的和外源性的。內(nèi)在性鉤化 (intrinsic calcification)源于該纟且織^j"脂蛋白和鉤結(jié)合蛋白的p及 附。夕卜源')"生4丐4匕(extrinsic calcification)源于細月包(例々口，血小 板)在該生物假體上的粘附并導致在該生物假體上形成含有磷酸釣的表 面斑塊。
影響固定組織生物假體的4丐化速率的因素到目前為止還沒有完全弄 清楚。但是，認為會影響鈣化速率的因素包括病人的年齡、存在新陳代 謝紊亂(即，血鈣過多、糖尿病等)、飲食因素、存在感染、腸道外鈣 給藥、脫水、該生物-假體的原位變形(例如，機械應力)、在外科手術(shù) 植入初期內(nèi)的抗凝血治療不當、以及免疫宿主-組織響應。
另外，戊二醛固定可能對組織鈣化有影響。而且，在許多情況下， 固定組織存儲在含有戊二醛的介質(zhì)中以保持無菌狀態(tài)。未反應的戊二醛 或者在存儲期間吸附的戊二醛可能溶出并進入到該身體植入體中，并導 致副作用，這是因為人們懷疑戊二醛具有細胞毒性。另外，未反應的醛 基團通常存在于固定組織上，其可以一皮氧化成羧酸部分。這些部分可以 在體內(nèi)吸收釣離子，從而引發(fā)鈣化。
近年來，已經(jīng)在阻止生物假體組織的4丐化方面作了很多的努力。由 這些努力收獲的技術(shù)可以廣義分成兩類涉及用抑制鈣化(或者，對固
定組織進行改性以使其《丐化傾向下降)的一種或多種化合物對戊二醛固 定的組織進行預處理或者后處理，和涉及用除了戊二醛以外的化合物固
定所述組織，從而降低4丐化。
前一類技術(shù)包括但不限于用如下所述化合物進行處理a)在戊二醛 固定后，用清潔劑或者表面活性劑；b)二膦酸鹽，其共價結(jié)合到戊二 醛固定的組織上，或者通過注射給藥到該生物假體的賦型劑上，或者經(jīng) 由滲透泵或者受控釋放基質(zhì)進行部位特異性遞送；c)氨基取代的脂族 官能酸，其在戊二醛固定后共價結(jié)合；d)硫酸化的多糖，尤其是硫酸 軟骨素，在戊二醛固定后進行處理，優(yōu)選隨后用其它基質(zhì)穩(wěn)定材料進行 處理；e)脫乙酰殼多糖/肝素連接，在固定后；f)鐵鹽或者錫鹽，在 戊二醛固定之前或者之后；g)聚合物，尤其是彈性體聚合物，結(jié)合到 戊二醛固定的組織中；或者h)磷酸酯或者季銨鹽或者硫酸化的高級脂 肪醇的水溶性溶液，在戊二醛固定后。
用于降低生物假體組織鉀化的后一類技術(shù)，也即涉及用除了戊二醛 之外的化合物固定組織的技術(shù)，包括但不限于如下技術(shù)a)通過將生 物假體組織浸泡在含有光氧化催化劑的高重量克分子滲透壓濃度的水 溶液中并隨后將所述組織暴露在光下進行處理，由此經(jīng)由光氧化固定所 述組織；和b)通過用聚環(huán)氧化合物，比如聚縮水甘油醚(聚環(huán)氧)化 合物，進行處理來固定。
最近，在美國專利公開No. 2003/012581 3A1中描述了緩解鉤化的新 技術(shù)，在此全文引入作為參考。該方法涉及將固定的、未固定的的或者 部分固定的組織和戊二醛溶液接觸，所述戊二醛溶液在和該組織接觸之 前已經(jīng)經(jīng)過加熱處理或者調(diào)節(jié)pH。 Lee等(J. Biomed. Mater. Res., 58(1); 27 - 35 ( 2001 ))公開了通過用氨基化合物例如NH2-PEO-S03 或者含有氨基的肝素封閉來減少未反應的戊二醛殘基的方法。
盡管這些技術(shù)中的一部分已經(jīng)證明能有效地降低鉀化，但是在本領 域中仍然需要對現(xiàn)有技術(shù)作進一步的改善或者研制新的緩解釣化技 術(shù)，以減少固定的生物假體組織在植入后的釣化傾向。

發(fā)明內(nèi)容
法。根據(jù)本發(fā)明的一種方法，將組織浸沒到預處理過的戊二醛溶液中或 者以其它方式和其接觸。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過將戊二醛溶
液的pH調(diào)到大約5. 0-7. 0,優(yōu)選到大約6. 0,來對所述戊二醛溶液進 行預處理。隨后，將該預處理后的戊二醛溶液用來處理所述組織，優(yōu)選 在大約30-7(TC,更優(yōu)選在大約40-6(TC,最優(yōu)選在大約45 - 55°C 。 在優(yōu)選實施方案中，所述組織被處理大約1小時-6個月，更優(yōu)選為大 約1天-2個月。該組織在與所述預處理過的戊二醛接觸的步驟之前、 之后或者同時至少被部分固定，其中所述固定是通過將該組織浸沒到含 有戊二醛作為交聯(lián)劑的溶液中進行的。和預處理過的戊二醛的接觸導致 在該組織上形成游離胺基團，這些基團隨后通過該交聯(lián)后的組織和封閉 齊。(blocking agent)的4妻觸而,皮去:f閉。
在本發(fā)明方法的另一實施方案中，組織和戊二醛溶液或者經(jīng)過pH調(diào) 節(jié)的戊二醛溶液4^觸足夠的時間以^f吏該組織交^關。該交^:的組織首先經(jīng) 過加熱，然后用還原劑進行處理，所述還原劑使得在該固定后的組織上 的醛和羧酸基團減少。
在本發(fā)明的每種方法中，預處理的戊二醛溶液在所述封閉步驟之后 也可以用作最終(terminal)消毒溶液。另外，戊二醛溶液無i侖是否預處 理過的都可以含有其它化學物質(zhì)以提供其效力，比如表面活性劑(例 如，Tween 80)、醇(例如，乙醇)和/或醛(例如，甲醛)。
根據(jù)本發(fā)明，提供了全部或者部分由已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法的各種 實施方案處理過的組織形成的生物假體裝置或者制品?？梢杂糜诒景l(fā)明 的生物假體裝置或者制品中的源自人體或者動物的生物組織實例，包括 但不限于心臟瓣膜、靜脈瓣膜、血管、尿管、腱、硬腦膜、皮膚、心包、 軟骨(例如，半月板)、韌帶、骨、腸子(例如，腸壁)、小腸粘膜下 層("SIS組織")和骨膜。
另外根據(jù)本發(fā)明，提供了通過植入已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明方法的各種實施 方案進行過緩解鈣化處理的生物假體材料，治療哺乳動物患者的疾病和 紊亂的方法。所述治療方法包括但不限于a)用已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明用戊二 醛處理過的生物假體心臟瓣膜通過外科手術(shù)替換有疾病的心臟瓣膜， b)通過植入已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明用戊二醛處理過的生物血管植入體修復血
科^術(shù)替換或者修補老化的或者不足的韌帶，d)通過植入根據(jù)本發(fā)明 制備的一種或多種生物聚合物組織支架(tissue scaffold)或者生物 假體組織支架來修補、重建、重構(gòu)、改善、強化、生長、重建或者重新
生成天然組織(例如，用天然組織或者生物聚合物支架進行組織工程)。 緩解生物假體組織植入后鈣化的方法的各種實施方案和現(xiàn)有技術(shù)相
比具有顯著的優(yōu)勢，這是因為封閉游離胺基團或者減少醛和酸官能團這
些理想特征，使得在固定組織和存在于儲存和/或消毒溶液中的戊二醛
之間發(fā)生不希望或者不想要的反應的可能性下降。
同樣考慮的是采用含有促進長期、低酸穩(wěn)定性存儲的抗氧化劑(例
如，抗壞血酸)的pH緩沖制劑。
本發(fā)明的其它益處和新型特征一部分列在下面的描述中， 一部分對 于本領域普通技術(shù)人員而言在實施下列說明書時是顯而意見的或者可 以通過實施本發(fā)明踐而了解。通過特別在所附權(quán)利要求中指出的手段、 組合、組成和方法，可以實現(xiàn)和獲得本發(fā)明的益處。


在本文中結(jié)合了附圖并成為說明書的 一 部分，對本發(fā)明的優(yōu)選實施 方案進行了舉例說明，而且和描述一起用于解釋本發(fā)明的原理。
圖1是通過封閉生物假體組織上的游離胺基團減緩生物假體組織《丐 化的流程圖。
圖2是通過還原連接到生物假體組織上的醛和酸基團減緩生物假體 組織朽化的流程圖。
具體實施例方式
以前已經(jīng)報道過，在50°C、流體流動的情況(例如，搖晃)下在0. 625 %戊二醛磷酸鹽溶液中后處理2個月的交聯(lián)生物假體組織，和在典型條 件下(即，室溫，1-M天)在0.625 %戊二醛磷酸鹽溶液中固定的對 照交聯(lián)生物假體組織相比，在小鼠皮下植入才莫型和家兔肌肉內(nèi)植入^t型 中顯示出較少的鉤化。具體參見美國專利No. 5931969，在此全文引入作 為參考。
以前已經(jīng)報道過，戊二醛溶液在和組織接觸之前經(jīng)過加熱步驟是有 利的。參見美國專利公開No. 2003/012581 3,在此全文引入作為參考。 隨后，可以將所述熱處理過的戊二醛冷卻到更低的溫度，然后可以在苛 刻性下降、更方便或者兩者兼具的條件下(例如，時間等短、溫度更低 或者兩者兼具)將該組織加入到冷卻的戊二醛溶液中。通過在該組織不 在的條件下對所述戊二醛溶液進行熱處理，可以在熱處理過程中采用更高的溫度、濃度或者兩者，而不會給該組織帶來風險或者對其造成任何
負面影響。
在US公開系列No. 2003/012581 3中也有如下寺艮導可替換地，可以 通過調(diào)節(jié)戊二酪溶液的pH至大約5. 0-7. 0，優(yōu)選大約6. 0，對該戊二 醛溶液進行緩沖處理而不是熱處理。緩沖的戊二醛溶液具有和熱處理的 戊二醛溶液相似4旦略樣i:差 一 點的有利效果。
基于上述公開內(nèi)容，申請人發(fā)現(xiàn)從固定組織上去除羧酸殘基和醛殘 基(這兩者都可能被氧化成羧酸)是有利的，這是因為已經(jīng)提出羧基部 分吸引釣離子并導致引發(fā)生物假體組織的鈣化。相應地，在本發(fā)明的一 個方法中，將組織浸沒在戊二醛溶液(少于大約5重量％ )中或者通過 其它方式與其接觸。鈣組織在和戊二醛接觸的步驟之前、之后或者同時 被至少部分固定，其中所述組織是通過浸沒在含有戊二醛作為交聯(lián)劑的 溶液中進行固定的。以此方式和該溶液接觸使得位于或靠近所述組織的 膠原超螺旋表面的不穩(wěn)定S c h i f f堿(席夫堿)鍵發(fā)生水解，從而去除了 經(jīng)由所述S c h i f f石咸鍵連接到所述組織上的醛和酸基團，并在該組織上 生成游離胺基團。在該超螺旋更深處的Schiff堿鍵受到位阻保護，所 以不被水解。隨后，游離胺基團在通過使交聯(lián)組織和封閉劑接觸的后續(xù) 步驟中得以封閉。
在本發(fā)明的替換性實施方案中，用預處理的戊二醛處理該組織，其 中所述預處理戊二醛是通過調(diào)節(jié)戊二醛溶液的pH至大約5. 0-7. 0,優(yōu) 選至大約6. 0來制備的。在將該組織和該pH調(diào)節(jié)過的戊二醛接觸的步 驟之前、之后或者同時，該組織至少部分被固定，其中所述組織的固定 是通過將該組織浸沒在含有戊二醛作為交聯(lián)劑的溶液中進行的。然后， 將該pH調(diào)節(jié)過的戊二醛溶液用來處理所述組織，優(yōu)選在大約30 - 70°C, 更優(yōu)選在大約40-6(TC,最優(yōu)選在大約45 - 55°C。在優(yōu)選實施方案中， 所述組織被處理大約1小時-6個月，更優(yōu)選為大約1天-2個月。以 此方式和pH調(diào)節(jié)過的戊二醛接觸使得位于或靠近膠原超螺旋表面的不 穩(wěn)定Schiff堿鍵發(fā)生水解，從而去除了經(jīng)由所述Schiff堿鍵連接到所 述組織上的醛和酸基團，并在該組織上生成游離胺基團。隨后，游離胺 基團在通過使交聯(lián)組織和封閉劑接觸的后續(xù)步驟中得以封閉。
在本發(fā)明方法的另一實施方案中，該組織和未處理的戊二醛溶液或 者經(jīng)過pH調(diào)節(jié)的戊二醛溶液在沒有加熱的情況下接觸足以促進交聯(lián)的
時間。該交聯(lián)的組織然后用還原劑進行處理，所述還原劑使得連接在該
固定后的組織上的醛和羧酸基團減少。
A 、采用預處理的戊二醛緩解生物假體材料鈣化的方法
圖1是對本發(fā)明方法的一個實施方案進行一般性舉例說明的示意
圖。如圖l所示，該方法的第一步驟是在組織不存在的情況下制備預處
理過的戊二醛溶液，例如，熱處理的或者pH調(diào)節(jié)過的戊二醛。 1、在組織不存在的情況下制備熱處理過的戊二醛
簡而言之，通過將戊二醛溶液加熱到第 一溫度第 一時間段來在組織不存 在的情況下制備熱處理過的戊二醛溶液。然后，在戊二醛溶液和組織接觸 之前，將其溫度調(diào)節(jié)至第二溫度(優(yōu)選低于第一溫度)。但是，這個步驟 也可以用水溶液或者未加熱的戊二醛溶液扭J亍。
應該認識到，起始溶液中戊二醛的濃度可以變化。雖有，如果需要， 可以在組織加入之前調(diào)節(jié)溶液濃度。相信在熱處理步驟中可以采用低至
0.1%、高至25%的戊二醛濃度。迄今為止，申請人已經(jīng)成功實現(xiàn)和使 用了 0.6% - 2.5%的低戊二醛濃度，本領域技術(shù)人員將認識到，在本方 法的熱處理步驟中更高或者更低的戊二醛濃度可能真正證明是有利 的。在熱處理步驟(圖1 )中使用的優(yōu)選濃度是1. 0-2. 0%。戊二醛的 這種熱處理可以通過加熱該溶液直到溶液的游離酪含量下降約2 5 %或 以上并且在該水平保持穩(wěn)定(例如，1.8%的溶液下降到大約0. 6%或以 下)的情況下完成。首先，含有戊二酪的溶液可以用磷酸鹽緩沖液、非 磷酸鹽緩沖液比如HEPES緩沖液、或者其它合適緩沖液緩沖至pH為 7.4,并且在這種情況下，加熱溶液以使游離醛含量下降也會導致該溶 液pH下降。
在一個實施方案中，在清潔惰性的容器(例如，由不銹鋼、塑料或 者硼硅玻璃制成的容器)中中制備戊二醛的1. 8重量％溶液，然后通過 加入磷酸鹽緩沖的鹽水溶液將所述溶液緩沖到大約7. 4的pH值。
戊二醛加熱到的第一溫度足夠高，并維持充分長，以使戊二醛溶液 中的游離醛含量和pH下降預定的量。優(yōu)選地，戊二醛溶液的這種預熱 處理使得該溶液的游離醛濃度下降大約25% ,更優(yōu)選大約50%。該戊 二醛溶液可以進行l(wèi)l沖以使pH首先為大約7. 2 - 7. 8,優(yōu)選大約7. 4。 在進行了所述加熱之后，溶液的pH通常下降到大約5.0-7.0,優(yōu)選 6.0。由于經(jīng)過這種預熱，所以戊二醛溶液在該程序中隨后用于處理組
織時，不會顯著改變其化學性質(zhì)。
戊二醛的熱處理可以通過任何合適的方式進行。例如，戊二醛可以
預熱到并保持在大約20-9Q。C,優(yōu)選大約60-8(TC,最優(yōu)選65 - 75 °C 的時間足以使得游離醛濃度下降至少25%并直到該溶液的pH下降至大 約6. 0 (即，pH為6. 0對應于游離醛濃度是大約0. 3 - 0. 7% )。在這一 點上，溶液顏色可以是無色至金色或者棕色。溶液pH下降到6. Q以及 伴隨著的顏色變成金色或者棕色表明預熱處理已經(jīng)完成。取決于采用的 溫度，對戊二醛進行熱處理的步驟可以花費1小時至6個月或者更多， 具體取決于所用的溫度，通常是1-14天。優(yōu)選的方法是加熱戊二醛溶 液到大約65 - 75。C大約1天-2個月，或者直到發(fā)現(xiàn)游離醛濃度理想地 下降至少25%或以上并且pH為大約6. 0時為止?？梢圆捎酶咧链蠹s90 。C的較高溫度，這種較高溫度的使用通常加速了游離醛濃度的所需下降 以及伴隨著的pH變化(例如，在90。C，起始pH調(diào)至7. 4的溶液在大約 1 - 3天后降到大約6. 0)。也可以采用更低的溫度，直到大約20。C,使 用這種較低溫度常常導致花費更長的時間實現(xiàn)所需的游離醛含量和pH 的變化。
在完成了戊二醛的熱處理之后，將溶液過濾和冷卻到不損害該組織 的第二溫度(例如，大約30 - 70。C,優(yōu)選大約40-6(TC,或者最優(yōu)選 大約5Q。C )。
任選地，在戊二醛已經(jīng)進行了熱處理之后，使溶液冷卻到大約5(TC, 并通過加入磷酸鹽緩沖地鹽水或者一些其它合適緩沖液將其pH調(diào)至到 大約7. 4。
2、 制備pH調(diào)節(jié)過的戊二醛
在本發(fā)明的另一實施方案中，戊二醛溶液沒有經(jīng)過預熱，相反是該 戊二醛溶液的pH被調(diào)至大約5. 0- 7. 0,優(yōu)選至大約6. 0的范圍。
3、 組織的獲取和預備
所需的生物組織從人類尸體或者動物供體上獲取，并經(jīng)過預備以供 后續(xù)固定和處理。組織通常通過從宿主動物上用外科手術(shù)切割或者移除 來獲取。隨后，它通常被修整或者切割至尺寸，并用消毒水、堿性鹽溶 液、鹽水或者其它合適的清洗液清洗。
在一個實施方案中，組織可以在固定之前在表面活性劑溶液(例如， 丁ween 80,具有或者不具有乙醇和/或曱醛)或者在生理溶液(例如，
鹽水或者平衡鹽溶液)中于大約37 - 6(TC、優(yōu)選大約45。C熱處理大約1 小時-6個月，優(yōu)選大約1-15天，然后如上所述在熱處理過的戊二醛 〉容液中熱處理。
在一個實施方案中，組織在固定之前用表面活性劑處理以去除脂 質(zhì)、脂肪酸、膽固醇等，以確保該組織整體被固定而不是僅僅在表面上 被固定。但是，必須小心不要采用太強的溶液使得清潔工作過度并從而 損害基礎組織。因此，優(yōu)選采用含有0. 5 - 6重量％表面活性劑的水溶 液形式的表面活性劑。合適的處理時間是2 - 6小時，優(yōu)選大約3小時
(參見美國專利No. 4553974,在此全文引入作為參考)。表面活性劑可 以是陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或者 其混合物。合適的陰離子表面活性劑的實例是十二烷基硫酸鈉、十二烷 基硫代乙酸鈉和烷芳基聚醚磺酸鈉。合適的非離子表面活性劑的實例是 辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)、聚氧乙烯(20)脫水山梨 糖醇單油酸酯(Tween 80)、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯
(Tween 60)。合適的兩性離子表面活性劑的實例是通常稱作兩性離子 表面活性劑(Zwittergent)的碌^代甜菜堿。
或者，通過將組織浸沒在高重量克分子滲透壓濃度含水溶液中來去 除脂質(zhì)，所述含水溶液比如鹽和糖的溶液，其中所述鹽能夠穿透所述樣 品而且所述糖用于保持所述溶液的高重量克分子滲透壓濃度，如同在美 國專利No. 6350732中所述，在此全文引入作為參考。合適鹽的實例包 括但不限于氯化鈉和氯化鉀，合適糖的實例包括但不限于蔗糖和果糖。 4、生物組織的固定
生物組織可以在用預處理過的戊二醛處理之前、之中或者之后固 定。在圖1所示的實例中，該組織在用預處理過的戊二醛處理之前固定。 在該實例中，通過將組織浸沒在通過合適緩沖液比如磷酸鹽緩沖液緩沖 至大約7.4的0.625重量％戊二醛溶液中于室溫1-14天進行固定。
優(yōu)選地，通過將組織浸沒在包含具有低的酸形成可能性的戊二醛溶 液，比如高純戊二醛單體(分子量(廳)100)、高純戊二醛二聚體(MW 1M)、兩者混合物、低酸透析的或者市售戊二醛，的溶液中進行所述 固定。
為了增加固定或者消毒，可以在戊二醛中加入其它化學化合物比如 表面活性劑(例如，Tween 80)和/或乙醇和/或甲醛。
在組織從固定溶液中移開之后，用鹽水溶液、石成性鹽溶液、游離戊 二醛溶液、或者一些其它合適洗液對該組織進行充分沖洗。
5、 未固定的、部分固定的或者固定的組織的熱處理
隨后，將未固定的、部分固定的或者固定的組織和如上制備的、預 處理過的戊二醛溶液(熱處理的或者pH調(diào)節(jié)過的)接觸。就此而言"充 分固定"的組織是指該組織已經(jīng)被固定到適于用作植入體的程度，而"部 分固定的"是指該組織已經(jīng)被固定到不足以是充分固定的程度。
根據(jù)圖1的實施例的組織處理步驟優(yōu)選通過將固定的、部分固定的 或者未固定的組織浸沒在預處理過的戊二醛溶液中并同時保持該溶液
在大約3G-7(TC、優(yōu)選大約40-6(TC、或者最優(yōu)選大約5(TC、而且在 具有流體移動或者沒有流體移動的情況下進行的。優(yōu)選在將組織放置于 溶液中之前將溶液的pH保持在大約6. 0。隨后，將其中浸沒有組織的該 溶液的溫度保持在大約50°C，以使該預處理過的戊二醛溶液可以和組織 相互作用或者改性該組織。在于50。C浸沒到該預處理過的戊二醛中低至 1小時直至多達6個月或者以上(主要取決于所用溫度)，但是通常是l -15天，之后，組織在植入后4丐化的可能性明顯下降。隨后，將組織從 溶液中去除。該組織通常此時為棕色。在從該預處理過的戊二醛溶液中 取出之后，用鹽水、堿性鹽溶液或者一些其它合適的洗液徹底沖洗該組 織。
6、 封閉游離胺基團
用戊二醛處理組織的一個終端結(jié)果就是該組織表面上和/或附近的 不太穩(wěn)定的Schiff堿鍵的碳-氮雙鍵發(fā)生水解，由此同時去除了經(jīng)由 Sch i f f堿鍵連接到該組織上的醛和酸基團。由于未反應的醛基團可以被
所以這是理想的。但是，用戊二醛處理導致交if關的組織在其表面上和/ 或附近具有游離胺殘基。
由于Schiff堿鍵的水解也導致在組織上存在著伯胺殘基，而其可以 和后消毒溶液以及存儲溶液(圖1)中的戊二^反應，所以本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)有利的做法是使所述伯胺和包含封閉試劑的溶液接觸，所述封閉試劑 和所述伯胺反應并將其封閉，從而避免了在本發(fā)明后續(xù)步驟中使用的溶 液中存在的游離胺和戊二醛之間的反應。這進而減少了連接到組織上有 可能氧化成酸的游離醛基團的量。所以，在用該預處理過的戊二醛處理
之后，組織經(jīng)過沖洗并隨后和封閉劑接觸(圖1 )。在本文中使用的"封 閉劑"是具有和胺基團有充分反應性的官能團或者化學部分的任何化合 物。和胺基團具有反應性并適用于本發(fā)明的封閉劑包括但不限于單醛 (即，含有單一醛官能團的分子，比如甲醛)、糖、水溶性多還原化物，
比如乙二醇二縮水甘油醚(也稱作Denacol )、膠原和本領域公知的含 有胺反應性官能團的任何其它試劑，前提是所述胺基團和封閉劑之間的 反應產(chǎn)物并不含有游離的醛或者羧酸基團。
例如，具有單一醛官能團的甲醛可以和組織上的伯胺反應， 一行程 Schiff堿鍵，其中伯胺上的單和甲醛羰基碳形成雙鍵。和伯胺與戊二醛 之間的反應不同，伯胺和曱醛之間反應形成的Schiff堿鍵沒有可以氧 化成羧酸的游離醛部分，所以用曱醛封閉胺不會增加組織發(fā)生植入后鈣 化的可能性。采用曱醛作為封閉劑的另一優(yōu)點在于Schiff堿鍵在植入 后緩慢水解，從而釋放曱醛到植入組織周圍的區(qū)域中。緩慢釋放的曱醛 會抑制組織植入體上的增生(組織細胞數(shù)的異常增加)，從而降低或者 防止在組織過度生長在植入的生物j艮體組織上。
合適封閉劑的另一實例是聚縮水甘油醚，它很容易和胺反應。聚縮 水甘油醚封閉劑的實例包括但不限于各種Denacols和其各個反應物種 的任何一種，包括單、二、三和多官能環(huán)氧化物。
糖也和胺反應，所以也適于作為本發(fā)明的封閉劑。合適的糖包括還 原糖，它可以和組織上的游離胺基團形成Schiff石咸4建。還原糖的實例 包括但不限于甘油糖、蘇糖、赤蘚糖、來蘇糖、木糖、阿糖、核糖、阿 洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖或 者任何其它二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖、九糖或者十 糖。
B、采用未處理的或者pH調(diào)節(jié)過的戊二醛以及后續(xù)還原來緩解生物 假體材料鉤化的方法
在圖2中舉例說明了本發(fā)明的替換性方法。
從人尸體或者動物供體上獲取生物組織，并如本文所述那樣進行預備以 供后續(xù)固定和處理。該組織任選采用表面活性劑或者高重量克分子滲透壓 濃度水溶液在固定之前進行處理以去除脂質(zhì)、脂肪酸、膽固醇等，以確保 該組織被整體固定而不是僅僅在表面上固定，如同本文所描述的那樣。 然后，該組織和或者未預處理的戊二醛或者pH調(diào)節(jié)過的戊二醛溶液
(其中pH為大約5. 0 _ 7. 0，優(yōu)選大約6. 0)接觸足以使其交聯(lián)的時間。 然后，用還原劑處理所述交聯(lián)的組織，所述還原劑還原連接在固定 組織上的醛和羧酸基團。在此處，交聯(lián)組織用還原羧酸或者具有酸形成 潛力的官能團比如醛的還原劑進行處理。由此，全部或者基本全部去除 交聯(lián)組織上的羧酸和/或具有酸形成潛力的官能團，會去除發(fā)生鈣化的 潛在形核位點。
雖然在理論上任何可以優(yōu)選還原羧酸和醛官能團的還原劑都可以用 于本步驟，例如，氫化物、硫醇、曱酸等，但是優(yōu)選還原劑是硼氬化物， 更優(yōu)選是硼氬化鈉。其它還原劑包括氫，即采用氫的標準還原方法中使 用的那樣，通常在壓力下進行，和l-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基) 碳二酰亞胺(EDAC)。本領域技術(shù)人員知道采用EDAC和N-羥基琥珀酰 亞胺(或者，可替換的，N-羥基硫代琥珀酰亞胺)(NHSS)來提高產(chǎn) 率。EDAC通過連接到任何可得的胺上將"還原"(連接)任何游離羰基， 所以也可以用作胺的封閉劑。
C、另外的4丐化緩解程序
已知離子比如磷酸根離子的存在將導致釣化發(fā)生率增加。所以，在 本發(fā)明方法的工藝步驟的任一或者全部中采用的緩沖液或者溶液優(yōu) 選，優(yōu)選包括磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、釣、和/或鎂含量降低到能有 效降低組織植入后釣化的量的緩沖或者抗礦化溶液。在一個實施方案 中，緩沖液是貧乏磷酸鹽溶液。磷酸鹽貧乏的溶液具有的磷酸鹽水平降 低到了能有效地降低所述組織植入后鈣化的有效量，所述溶液進一步對 于所述組織而言是非破壞性的或者非失穩(wěn)性的?；静缓姿猁}的溶液 是那些僅僅含有痕量磷酸鹽的溶液，所述痕量比如在制備常規(guī)組織處理 溶液中采用的大多數(shù)化學物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的污染量。貧乏磷酸鹽溶液的實例 包括但不限于硼酸鹽、碳酸氫鹽、二甲胂酸鹽、HEPES、 MPRS和PIPES。 抗鉤化溶液或者緩沖液的其它實例包括但不限于氯化鈉、抗壞血酸和戊 二酸溶液。
在另 一 實施方案中，在本發(fā)明方法的任何或全部工藝步驟中采用的 緩沖液包括非等滲緩沖液，也即，高滲性或者低滲性緩沖液，其中緩沖 液的重量克分子滲透壓濃度已經(jīng)經(jīng)過調(diào)節(jié)以誘發(fā)出所需的組織性質(zhì)(例 如，密度、模量、拉伸強度、伸長率等)。例如，高滲性緩沖液(即， 壁正常細胞中鹽濃度高的緩沖液)將從組織吸收水。結(jié)果，所述組織的
組分被吸得互相靠近，這使得它們更容易交聯(lián)并因而提高了密度?；?者，低滲性緩沖液(即，鹽濃度比正常細胞中低的緩沖液)將使組織膨 脹并使得交聯(lián)劑可以穿透得更深。
在另一實施方案中，在非氧化性調(diào)節(jié)下進行本發(fā)明方法得一個或多
個步驟，包括但不限于在氮氣保護、低光化性安全光Uow actinic safety 1 ight)和/或機械蓋層下執(zhí)行所述步驟。 D、生物假體的后消毒、組裝/制備和存儲
1、第一次減輕生物負擔(First Bioburden Reduction, BREP I)
在組織被固定、根據(jù)本發(fā)明的方法處理以減緩植入后鈣化、以及沖 洗之后，將其進行第一次減輕生物負擔處理。例如，將該組織浸沒在含 有下述物質(zhì)的混合物中或者以其它方式和其接觸i)交聯(lián)劑，ii)變 性劑和iii)表面活性劑(即，CDS溶液)。 一種優(yōu)選的CDS溶液(在 美國專利No. 4885005和US專利No. 4648881中描述，每篇專利在此全 文引入作為參考)是如下物質(zhì)的混合物i)曱醛，ii)乙醇和iii)表 面活性劑(例如，Tween 8(T表面活性劑，得自ICI Americas, Brant ford, Ontario)。所述優(yōu)選CDS溶液也可以用首字母縮寫"FETS"表示，優(yōu) 選式子如下曱醛(4. 0 ± 0. 4重量％ )、乙醇(22. 0士2. 0重量％ )和 Tween 80 ( 1. 2±0. 2重量％ )。該組織優(yōu)選在CDS溶液中浸沒2小時-7 天，通常是大約2小時。在此浸沒期間，該CDS溶液保持在4 - 50°C， 優(yōu)選大約20 - 37 °C。
本領域技術(shù)人員會認識到各種替換性化合物或溶液可以替代所述 CDS溶液中的每一種組分，如下所述。
潛在的替換性變性劑包括但不限于醇/溶劑(例如，乙醇或者異 丙醇)；酸化醚(例如，硫酸/醚混合物、丙酮、低級烷基比如甲基、 乙基等的醚)；酮(例如，甲基乙基酮)；市售溶劑系統(tǒng)(例如，GenesolveTM (Allied Signal, Inc., Morristown, N. J. ) ) ; 二醇(例如,甘油 乙二醇、聚乙二醇、低分子量聚乙二醇)；和高濃度鹽溶液(例如，氯 化鎂和氯化鈉)。
潛在的可替換性表面活性劑包括但不限于
a) 陰離子表面活性劑例如，月桂酸的酯，包括但不限于月桂基硫 酸鈉(也稱作十二烷基硫酸鈉)和烷基磺酸鹽(例如，1-癸烷磺酸鈉鹽)。
b) 非離子化合物例如，基于聚氧乙烯醚結(jié)構(gòu)的化合物，包括Triton
X-IOO、 114、 405、 N-101 (可得自Sigma Chemical, St,Louis, MO)和 相關結(jié)構(gòu)；Pluronic和Tetronic表面活性劑(可得自BASF Chemica 1 s, Mount 01 ive, N. J.)。
c)烷基化的苯氧基聚乙氧基醇:例如，NP40、 NonidetP40、 Igepal、 CA630、水解的/官能化的動物和植物化合物，包括Tween80、 Tween 20、 辛基衍生物、辛基P-葡糖苷、辛基b-硫代吡喃葡糖苷、脫氧膽酸鹽和 其衍生物、兩性離子化合物、3-([膽氨基丙基]-二曱基氨基)-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS) 、 3-([膽氨基丙基]-二曱基氨基)2 -羥基-1 -丙烷磺酸鹽(CHAPS0 )(可得自Pierce Biotec Company, Rockford, IU 。
脫氧膽酸鹽/Triton或者市售混合物，比如Micro-80/90。
2、 制備/組裝
在完成了第一次生物負擔減輕后，該組織可以再次用合適的沖洗溶 液比如等滲鹽水或者Q. 625 %戊二醛沖洗，并轉(zhuǎn)移到清潔的房間或者無 菌環(huán)境中。隨后，該組織可以進一步修整或者成形(如果需要)并連接 到任何非生物部件(例如，支架、框架、縫合環(huán)、導管、防止縫合撕裂 的聚酯網(wǎng)格片段等等)上或者與之組裝在一起，以形成所需的生物假體 裝置。由生物組織和非生物部件組裝而成的生物假體裝置實例包括豬生 物假體心臟瓣膜(例如，Carpent ier-Edwards Biopros thes i s )和牛 '"、包'"、月莊麵爭月莫(侈寸^口， Carpent ier—Edwards Pericardial Bioprosthesis )、結(jié)合了織物強化件的無支架豬主動脈瓣膜(例如， Edwards PRIMA Plus Stentless Aortic Bioprosthesis)、和用于生 物機械心室輔助裝置的膽管瓣膜(例如，Novacor N-IOOPC型號)，所 有的都可以構(gòu)在Edwards Lifescience LLC, Irvine, CA。
3、 第二次生物負擔減輕(BREP II )
在生物假體完成制備和組裝之后，將其進行第二次生物負擔減輕， 基本上就是重復如上所述的第一次生物負擔減輕，但是，在第二次生物 負擔減輕中，溶液優(yōu)選保持在大約37。C大約2小時-10天，優(yōu)選大約9小時。
4、 最終消毒和存儲
在完成了第二次生物負擔減輕之后，將組織(或者生物假體)用合
適的沖洗溶液(比如，等滲鹽水或者G. 625 %戊二趁溶液)沖洗然后置 于最終溶液中進行存儲和消毒。優(yōu)選的最終消毒溶液是戊二醛濃度為大 約0. 2 - 1. 0重量％ ,最優(yōu)選大約0. 625重量％的戊二醛溶液。該溶液 具有可以通過對其進4亍最終加熱而改善的強消毒效應。
在所述最終消毒步驟的一個實施方案中，將該組織(例如，生物假 體)浸沒在該最終消毒溶液或者與之接觸并加熱足以確保生物假體一直 到植入時的無菌性的時間。所述加熱時間隨著采用的溫度而變，也即， 溫度越低，時間越長。例如，對于大約5(TC - 2(TC之間的溫度，時間分 別是1或2小時-l個月。優(yōu)選，在37。C的時間是1 - 6天，或者在50 。C為6小時-2天，但是，本領域技術(shù)人員會知道這些溫度或者時間值 可以在本發(fā)明的范圍之內(nèi)改變。
為了避免額外的轉(zhuǎn)移和操作，所述最終消毒優(yōu)選在密封的存儲容器 或者包裝中進行，生物假體將在所述容器或者包裝中輸送和存儲直到植 入時為止。該組織(或者生物假體)無菌性沉沒在所述儲存容器中，在 該容器內(nèi)已經(jīng)預先填充了用氳氧化鈉緩沖至pH 7. 4的0. 625 %的戊二醛 水溶液，使得該組織完全浸沒在所述緩沖的戊二醛溶液中。隨后，將該 容器密封并置于室溫至少7天，或者在37。C烘箱中24小時，或者在50 。C時6小時，以增強戊二酪的消毒能力。隨后，將容器冷卻到室溫并輸 送到醫(yī)院或者其它位置，在該處被存儲起來直到使用生物假體時為止。
在另一實施方案中，組織通過包含如下步驟的容器內(nèi)最終消毒方法 消毒提供含有一定量最終消毒溶液的容器，所述溶液包含緩沖至大約 7. 4pH的Q. 2 - 1. Q重量％戊二醛；將該組織浸沒在所述容器中的最終消 毒溶液中；密封容器；將該容器、其中的最終消毒溶液和生物假體加熱 到大約37 - 5(TC大約6小時-6天；冷卻所述容器、其中包含的最終消 毒溶液和生物假體至室溫；和使該容器保持密封直至希望將該生物假體 植入到哺乳動物患者中為止。
在另一實施方案中，所述最終消毒在將該組織或者生物假體置于存 儲容器之前進行。
在一些情況下，已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明處理過的戊二醛可以用作該最終溶 液，在這種情況下，可能可以縮短或者完全取消前面將該組織浸沒在預 先處理過的戊二醛中的步驟，相反選擇來直到最后的存儲步驟時，也 即，和最終消毒步驟同時進行根據(jù)本發(fā)明方法處理組織的 一 些步驟或者
全部步驟。
在優(yōu)選實施方案中，用其實施本發(fā)明方法的組織基本包括任何可用 于制備其中具有生物部件的假體裝置的任何哺乳動物組織。例如，在一 個實施方案中，該組織源自器官。在另一實施方案中，該組織選自神經(jīng) 組織、！^體組織(例如，淋巴組織)、呼吸組織、消化組織、尿管組織、 感官組織(例如，角膜、晶狀體等)、和生殖組織。但是，在其中生物 材料時生物流體的相關實施方案中，添加液體可能是不必要的，除非是 為了稀釋該生物流體的離子強度以使得萃取溶劑可以混溶。
在目前的優(yōu)選實施方案中，該組織選自肌肉組織、脂肪組織、上皮 組織和內(nèi)皮組織。在特別優(yōu)選的實施方案中，該組織選自心肌組織和脈 管組織。在相關實施方案中，該組織選自包括但不限于心臟瓣膜、靜脈 瓣膜、血管、尿管、腱、硬腦膜、皮膚、心包膜、腸子(例如，腸壁) 或者骨膜。在特別優(yōu)選的實施方案中，該組織源自骨、軟骨(例如，半 月板)、腱、韌帶或者任何其它結(jié)締組織。
由于用于此目的的材料源可以隨著組織類型而變，所以該材料源也 可以根據(jù)物種類型而變(自體組織、同種組織或者異種組織)。本領域 技術(shù)人員會認識到，本發(fā)明的方法可以用于包括一種或者多種類型組織 或者材料的生物假體裝置中。
在生物材料是固態(tài)組織或者制品的優(yōu)選實施方案中，可以首先將其 懸浮在水溶液中以使其適于萃取過程。例如，腦組織可以以10重量/體
積懸浮在蔗糖溶液(例如，0. 32M蔗糖)中。其它低滲性或者等滲性溶 液包括5%葡萄糖、磷酸鹽緩沖的鹽水、tri-緩沖的鹽水、HEPES緩沖 的鹽水或者任何前述緩沖液。該水溶液中的生物材料也可以經(jīng)過均質(zhì) 化、研磨或者以其它方式打斷，以使得處理試劑和該生物材料之間的接 觸最大化。
在特別優(yōu)選的實施方案中，生物材料將形成針對植入到植入體受體 中而設計的生物4艮體組織的 一部分或者全部。
在又一優(yōu)選實施方案中，組織的結(jié)構(gòu)完整性得以保持。結(jié)構(gòu)完整性 可以定義為組織執(zhí)行其必需生物功能的能力。本領域技術(shù)人員將認識到 組織執(zhí)行其必需功能所需的結(jié)構(gòu)完整性可以隨著組織類型的不同而 變。另外，該組織所用于的特定應用也可能要求不等等級的結(jié)構(gòu)完整 性。 前面的描述僅僅是用于描述和舉例說明本發(fā)明的 一些示例性實施方 案。本領域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的其它實施方案也是可行的，但是 在本文中沒有詳細描述。因此，這些實例絕對不是旨在限制本發(fā)明的范 圍。除非有另外定義，本文中所用的所有技術(shù)術(shù)語和科技術(shù)語具有和本 發(fā)明所述技術(shù)領域的普通技術(shù)人員普遍性了解相同的含義。雖然本文中 描述了優(yōu)選方法和材料，但是和本文中描述的這些等同或者相似的任何 方法和材料都可以用于實施或者測試本發(fā)明。詞語"包括，，、"包括"、
"包含"和"包含"旨在強調(diào)存在所述的特征、整體、部分或者步驟， 但是并不排除一個或多個其它特征、整體、部分、步驟或者其組合的存 在性和附加性。
實施例
應該理解，本文描述的實施例和實施方案僅僅用于示例，據(jù)此向本 領域技術(shù)人員暗示了各種改變或修改，它們也包括在本發(fā)明的精神和范 圍之內(nèi)，認為其落在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文中引用的所有公開 文獻、專利和專利申請都在此針對所有目的全文引入。
盡管前面的描述是對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的完整描述，但是可以采 用各種替換、變體和等同物。而且，顯而易見的是一些其它改變也可以 在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實施。
權(quán)利要求
1、用于緩解包含結(jié)締蛋白組織并且已經(jīng)部分固定的的生物組織的植入后鈣化的方法，所述方法包括a)將所述部分固定的組織在水溶液中加熱；b)將所述加熱的、部分固定的組織和含有用于封閉游離胺基團的封閉劑的溶液接觸，其中所述游離胺基團可能包含在所述加熱的、部分固定的組織。
2、 權(quán)利要求l的方法，其中所述封閉劑包含和所述游離胺基團成反 應性的官能團。
3、 權(quán)利要求2的方法，其中所述封閉劑是單官能醛、聚環(huán)氧化合物或者糖。
4、 權(quán)利要求3的方法，其中所述單官能醛是曱醛。
5、 權(quán)利要求3的方法，其中所述聚環(huán)氧化合物是乙二醇二縮水甘油醚。
6、 權(quán)利要求l的方法，其中所述水溶液包含具有低酸含量的戊二醛溶液。
7、 權(quán)利要求6的方法，其中所述戊二醛溶液包括抗礦化的緩沖液。
8、 權(quán)利要求7的方法，其中所述抗礦化緩沖液是貧乏磷酸根離子的緩沖液。
9、 權(quán)利要求l的方法，其中所迷水溶液的pH是大約6。
10、 權(quán)利要求l的方法，其中所述水溶液包括非等滲緩沖液。
11、 權(quán)利要求10的方法，其中所述非等滲緩沖液是低滲性緩沖液。
12、 權(quán)利要求l的方法，其中所述水溶液是貧乏磷酸根的溶液。
13、 權(quán)利要求1的方法，進一步包括在步驟(a)之前將所述組織和 表面活性劑或者鹽和糖的高重量克分子滲透壓濃度水溶液接觸。
14、 權(quán)利要求l的方法，進一步包括將所述組織進行生物負擔減輕。
15、 權(quán)利要求15的方法，其中所述生物負擔減輕方法包括將所述組 織和含有表面活性劑、醛和醇的生物負擔減輕溶液接觸。
16、 權(quán)利要求16的方法，其中所述生物負擔溶液包含.-甲醛2 - 10重量％ ;乙醇10-45重量％;和Tween 80: 0. 1 - 10重量％ 。
17、 權(quán)利要求l的方法，進一步包括消毒所述生物假體。
18、 權(quán)利要求18的方法，其中所述消毒包括將所述生物假體和最終 消毒溶液接觸，以及加熱所述最終消毒溶液到大約20- 5(TC足夠的時間以確保到植入時為止所述生物假體的無菌性。
19、 權(quán)利要求19的方法，其中所述最終消毒溶液包含緩沖到pH為 大約7. 4的0. 2 - 1. Q重量％戊二醛的水溶液。
20、 權(quán)利要求19的方法，其中所述最終消毒溶液包含重量克分子滲 透壓濃度平tf的鹽溶液和至少 一種化學消毒劑。
21、 權(quán)利要求l的方法，進一步包括將所述組織承受第 一 次生物負擔減輕過程；將任何所需的非生物部件加入到所述組織中并制備生物假體；將所述組織承受第二次生物負擔減輕過程；和消毒所述生物假體。
22、 權(quán)利要求l的方法，進一步包括將所述生物假體存儲在包含戊 二醛和抗氧化劑的儲存溶液中。
23、 權(quán)利要求23的方法，其中所述抗氧化劑是抗壞血酸。
24、 權(quán)利要求l的方法，其中所述步驟的一步或多步在非氧化條件 下進行。
25、 權(quán)利要求25的方法，其中所述非氧化條件選自如下 氮氣保護；低光化性安全光；和 機械蓋層。
26、 用于緩解生物假體材料植入后鈣化的方法，所述方法包括 (a)調(diào)節(jié)戊二醛溶液的pH至大約5. 0-7. 0;(b )將含有結(jié)締組織蛋白的 一 定量生物組織和所述戊二醛溶液接觸；(c)加熱所述戊二醛溶液和所述組織到大約30-7(TC—定時間，從 而在所述組織上形成游離胺基團，其中所述組織是 (i)在執(zhí)行步驟(c)之前至少部分固定的， (ii )在執(zhí)行步驟(c)之后固定的，或者 (i i i )和執(zhí)行步驟(c )同時固定的，和其中所述組織通過被浸沒到包含戊二醛作為交聯(lián)劑的交聯(lián)劑溶液 中進行固定的；和(d )將所述固定的組織和含有阻斷所述游離胺基團的封閉劑的溶液接觸。
27、 權(quán)利要求27的方法，其中所述pH被調(diào)節(jié)至大約6. 0。
28、 權(quán)利要求27的方法，其中所述溫度是大約40 - 60°C。
29、 權(quán)利要求27的方法，其中所述時間是大約1小時_ 6個月。
30、 權(quán)利要求27的方法，其中所述封閉劑具有和所述游離胺基團反 應的官能團。
31、 權(quán)利要求27的方法，其中所述封閉劑是單官能醛、聚環(huán)氧化合 物、糖或者膠原。
32、 權(quán)利要求32的方法，其中所述單官能醛是甲醛。
33、 權(quán)利要求32的方法，其中所述聚還原化合物是乙二醇二縮水甘油醚。
34、 權(quán)利要求27的方法，其中所述戊二醛具有低酸含量。
35、 權(quán)利要求27的方法，其中所述交聯(lián)溶液包括非等滲的緩沖液。
36、 權(quán)利要求36的方法，其中所述非等滲緩沖液是低滲性緩沖液。
37、 權(quán)利要求27的方法，進一步包括將所述組織在步驟(a)之前 和表面活性劑或者鹽和糖的高重量克分子滲透壓濃度水溶液接觸。
38、 權(quán)利要求27的方法，進一步包括將所述組織進行生物負擔減輕。
39、 權(quán)利要求39的方法，其中所述生物負擔減輕過程包括將所述組 織和含有表面活性劑、醛和醇的生物負^a減輕溶液接觸。
40、 權(quán)利要求27的方法，進一步包括消毒所述生物假體。
41、 權(quán)利要求的方法，其中所述消毒包括將所述生物假體和最終消 毒溶液接觸并加熱所述最終消毒溶液到大約20 - 5(TC足夠的時間以確 保所述生物假體到植入時為止的無菌性。
42、 權(quán)利要求42的方法，其中所述最終消毒溶液包含緩沖到pH為大約7.4的o. 2 - i. o重量y。戊二醛的水溶液。
43、 權(quán)利要求42的方法，其中所述最終消毒溶液包含重量克分子滲 透壓濃度平4衧的鹽溶液和至少 一種化學消毒劑。
44、 權(quán)利要求27的方法，進一步包括將所述生物假體存儲在包含戊 二醛和抗氧化劑的存儲溶液中。
45、 權(quán)利要求45的方法，其中所述抗氧化劑是抗壞血酸。
46、 權(quán)利要求27的方法，其中所述步驟的一步或多步在非氧化性條件下進行。
47、 權(quán)利要求47的方法，其中所述非氧化條件選自如下 氮氣保護；低光化性安全光；和 機械蓋層。
48、 用于減緩包含結(jié)締蛋白組織并且已經(jīng)部分固定的生物組織植入 后釣化的方法，所述方法包括a)將所述部分固定的組織在戊二醛水溶液中加熱；b )將所述部分固定的組織和含有用于封閉游離胺基團的封閉劑的溶液接觸，所述游離胺基團可能包含在所述部分固定的組織；和b )用還原在所述組織上的醛和羧酸基團的還原劑處理所述部分固定的纟且織。
49、 權(quán)利要求49的方法，其中所述戊二醛溶液的pH是大約5. 0-7. 0。
50、 權(quán)利要求49的方法，其中所述還原劑是硼氫化鈉、氰基硼氫化 鈉或者氪。
51、 權(quán)利要求49的方法，其中所述戊二醛溶液具有低酸含量。
52、 權(quán)利要求49的方法，其中所述戊二醛溶液包含抗礦化緩沖液。
53、 權(quán)利要求53的方法，其中所述抗礦化緩沖液是貧乏磷酸鹽的緩沖液。
54、 權(quán)利要求49的方法，其中所述戊二醛溶液包括非等滲性緩沖液。
55、 權(quán)利要求55的方法，其中所迷非等滲性緩沖液是低滲性緩沖液。
56、 權(quán)利要求1的方法，進一步包括將所述組織在步驟(a)之前和 表面活性劑或者鹽和糖的高重量克分子滲透壓濃度水溶液接觸。
57、 權(quán)利要求49的方法，進一步包括將所述組織進行生物負擔減輕。
58、 權(quán)利要求49的方法，進一步包括消毒所述生物假體。
59、 權(quán)利要求49的方法，進一步包括將所述生物假體存儲在包含戊 二醛和抗氧化劑的存^t溶液中。
60、 生物假體，包括已經(jīng)承受過緩解鈣化處理的部分固定組織，所 述緩解鈣化處理包括如下步驟a)將所述部分固定的組織在戊二醛水溶液中加熱；和 b )將所述部分固定的組織和含有用于封閉游離胺基團的封閉劑的溶 液接觸，其中所述游離胺基團可能包含在所述部分固定的組織。
61、 權(quán)利要求61的生物假體，其中所述生物假體包括選自下列的組 織心臟瓣膜、血管、皮膚、硬腦膜、心包膜、韌帶、腱、小腸粘膜下 層、以及心臟薄膜、血管、皮膚、硬腦膜、心包膜、韌帶、腱和小腸粘 膜下層的組合。
62、 權(quán)利要求61的生物假體，其中所述步驟(a)中的戊二醛溶液 通過如下制備在所述生物組織不存在的情況下將所述戊二酪溶液加熱 直到達到預定終點，所述預定終點通過選自下列的至少一種指示信號來 表明溶液的游離酪含量下降大約25%或以上；溶液的pH從大約7.4 降到大約6. 0;溶液的pH下降大約20%;和溶液顏色變成黃色或者棕 色。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于處理組織以抑制生物組織植入后鈣化的方法。在本發(fā)明的一種方法中，將組織浸沒在預處理過的戊二醛溶液，也即熱處理過的或者pH調(diào)節(jié)過的戊二醛溶液中，或者以其它方式與之接觸。所述組織在所述和所述預處理的戊二醛接觸步驟之前、之后或者同時可以用戊二醛部分固定。和所述預處理的戊二醛的接觸使得在所述組織上形成了游離胺基團，所述胺基團隨后通過將所述交聯(lián)組織和封閉劑接觸而得以封閉。在另一個實施方案中，組織和或者未預處理的戊二醛或者pH調(diào)節(jié)過的戊二醛溶液接觸足夠的時間以使該組織交聯(lián)。交聯(lián)后的組織隨后用還原劑處理，從而還原所述固定組織上的醛和羧酸基團。
文檔編號A61L27/36GK101184516SQ200680018417
公開日2008年5月21日 申請日期2006年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者J·S·多夫 申請人:愛德華茲生命科學公司