專利名稱：一種益母草注射劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高品質(zhì)的益母草注射劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
中藥材因種子、產(chǎn)地及生長條件、收采日期等因素的影響，其品質(zhì)往往存在較大差異，內(nèi)在物質(zhì)的組成和比例也相應(yīng)存在較大差異；通常中藥產(chǎn)品中，其有效物質(zhì)基礎(chǔ)不僅受藥材的影響，工藝參數(shù)的合理性和波動也嚴重影響內(nèi)在組份和組成比例的一致性。部分中藥產(chǎn)品，特別是中藥注射劑因這些不可控因素使同一品種不同生產(chǎn)時期的中藥注射劑存在很大差別。近年來，由于人們對藥品的認識水平和消費水平均大幅度提高，對中藥注射液的負面評價呈上升趨勢，中藥注射液已陷入了療效信任危機之中，規(guī)范提高中藥注射劑的生產(chǎn)水平，提高質(zhì)量控制水平，提高中藥注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范中藥注射劑的呼聲高漲。國家藥監(jiān)局于2001年決定開展注射劑指紋圖譜的研究，以提高中藥注射劑的質(zhì)量水平。由此可見，生產(chǎn)出高品質(zhì)的中藥產(chǎn)品例如中藥注射劑一直是人們所期望的。
目前，國內(nèi)已有人提出了一些采用中藥指紋圖譜來控制中藥產(chǎn)品質(zhì)量的設(shè)想，例如，沙明等提到將HPLC指紋譜技術(shù)應(yīng)用于中藥新藥質(zhì)量控制，中草藥，33(2)，第8-10頁，2002；謝培山提出了中藥色譜指紋圖譜質(zhì)量控制模式的研究與應(yīng)用，世界科學(xué)技術(shù)·中藥現(xiàn)代化，3(6)，第28-31頁，2001；屠鵬飛提到中藥注射液指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn)的實施與中藥材GAP基地建設(shè)，中藥研究與信息，3(10)，第17-18頁。但由于中藥品種的多樣性，將指紋圖譜技術(shù)具體化，并實際應(yīng)用于某一具體中藥材產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)上，尚有相當(dāng)艱難的路要走。
益母草注射劑已有了一些相關(guān)研究報道。章崇儀報道了益母草注射劑的制備及質(zhì)量控制的研究，其中涉及到益母草注射液質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，中成藥研究1984(9)，第12頁；CN1456548A、CN1415603A涉及一種益母草堿鹽及其制劑，其中公開了采用益母草總堿或其堿鹽制備益母草注射液；CN1530126A、CN1262118A涉及一種含益母草的藥物組合物，該組合物可制成注射劑或其它制劑，用于治療婦科疾病和慢性腎功能衰竭。
關(guān)于鹽酸水蘇堿的測定方法，同樣也有相關(guān)文獻報道。中國藥典(一部)2000年收載了雷氏鹽剩余比色法測定總生物堿量的定量方法(以鹽酸水蘇堿為對照)；姜舜堯報道了采用高效液相色譜法(HPLC)分析益母草藥材中水蘇堿成分，藥物分析雜志，21(4)，第243頁，2001；宋晶萍等也對益母草的鹽酸水蘇堿的HPLC分析法作了研究和報道，廣西醫(yī)藥，24(8)，第1289頁，2002。
與其它中藥產(chǎn)品一樣，如何提高益母草注射劑的品質(zhì)，一直是人們期望解決的問題。本發(fā)明者通過對益母草注射劑進行深入細仔的研究，確立了益母草注射劑HPLC指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，通過鎖定益母草注射劑的整體特征性物質(zhì)基礎(chǔ)，優(yōu)化提取工藝，提高注射劑整體特征性物質(zhì)基礎(chǔ)的一致性，使產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定一致，從而生產(chǎn)出高品質(zhì)的益母草注射劑，于是完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種高品質(zhì)的益母草注射劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)高品質(zhì)益母草注射劑的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供益母草中的鹽酸水蘇堿的測定方法，用于控制益母草注射劑的產(chǎn)品質(zhì)量。
益母草注射液是市售中藥產(chǎn)品，原有產(chǎn)品發(fā)布過二個執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，一是中國藥典《1977版》標(biāo)準(zhǔn)，第493頁頒布的益母草注射劑本品為唇形科植物益母草制成的滅菌水溶液。含總生物堿以鹽酸水蘇堿(C7H13NO2·HCl)計算，應(yīng)為標(biāo)示量的90-110％。
本品可加0.5-1.0％的苯甲酸。
檢查PH值應(yīng)為4.5-6.5(附錄42頁)。
含量測定照比色法(附錄32頁)，在525nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱座標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中的含量，計算含量。
規(guī)格1ml:20mg。
按其可波動的合格范圍換算，本品每支含總生物堿以鹽酸水蘇堿(C7H13NO2·HCl)計算，應(yīng)為18-22mg。
另一是現(xiàn)在執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，衛(wèi)生部中藥成方制劑第二十冊WS3-B-3969-98中頒布的益母草注射液本品為益母草經(jīng)加工制成的滅菌水溶液。
制法取益母草加水煎煮三次，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.36～1.38(80℃)，加水稀釋至含水量約為35％，分別以88％-95％的乙醇提取三次，靜置，濾過，回收乙醇，用活性炭(用量為0.01％-0.5％)脫色至溶液無色，加1％的苯甲醇，加注射用水使成1ml中含水蘇堿20mg，脫炭，精濾，灌封，滅菌，即得。
含量測定總生物堿照分光光度法(附錄VB)，D525nm的波長處分別測定吸收度，用空白試劑的吸收度分別減去對照品與供試品的吸收度，計算，即得。
規(guī)格1ml:20mg。
按其可波動的合格范圍換算，本品每支含總生物堿以鹽酸水蘇堿(C7H13NO2·HCl)計算，應(yīng)為18-22mg。
已批準(zhǔn)上市的中藥注射劑，由于注射用中藥材的質(zhì)量受種子來源、產(chǎn)地、采收期等因素的影響；由于受生產(chǎn)工藝波動的影響，中藥注射制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性在生長的時期內(nèi)沒有很好的保證，已有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的各項控制指標(biāo)和手段，對注射劑的質(zhì)量不能達到有效控制。
同樣，對于益母草注射劑而言，雖然上述已有標(biāo)準(zhǔn)中給出了每1ml注射劑中含總生物堿以鹽酸水蘇堿計算應(yīng)為18-22mg的含量標(biāo)準(zhǔn)，考慮到中藥制劑成分復(fù)雜，影響因素較多，選用已有標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的比色法分析，在測定的鹽酸水蘇堿含量符合要求的情況下，并不能確保注射劑品質(zhì)的一致性。
本發(fā)明者按照國家藥監(jiān)局頒布的《中藥注射劑指紋圖譜技術(shù)要求》和《中藥注射劑指紋圖譜研究指南》的思路，采用HPLC法，研究并確立了益母草注射液指紋圖譜，用以控制產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明中，采用選擇性好、靈敏度高的HPLC法，對現(xiàn)在執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)加以補充，以確保益母草注射劑的品質(zhì)，對益母草注射劑品質(zhì)的提高是大有裨益的。
本發(fā)明采用HPLC法，以離子型鍵合相為分離基質(zhì)，通過包含有離子交換在內(nèi)的混合保留機理，使益母草注射劑中鹽酸水蘇堿得以分離，從而測定其含量。
不僅如此，本發(fā)明還通過成份改變和優(yōu)化的工藝，來提高益母草注射劑的品質(zhì)。
在具體的實施方案中，本發(fā)明益母草注射劑為益母草經(jīng)加工制成的滅菌水溶液。本發(fā)明產(chǎn)品的制備工藝如下取益母草加水煎煮多次，例如2-5次，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.36～1.38(80℃)，分別以不同濃度的乙醇提取，靜置，濾過，合并濾液，用適量活性炭脫色至溶液無色或淡黃色，靜置，濾過，回收乙醇，加注射用水使至所需濃度規(guī)格，例如成1ml中含總生物堿約20mg，精濾，灌封，滅菌，即得。與現(xiàn)有技術(shù)不同的是，本發(fā)明工藝在采用水提醇沉工藝制得藥液中，即合并的濾液中，加入適量活性炭例如(用量為藥液量的0.01％-0.5w/v％)除熱原、脫色，同時加入吸附劑，吸附劑是例如選自滑石、膨潤土、硅藻土和陶土等礦物中的一種或多種，優(yōu)選含有已滅菌活化的滑石∶硅藻土(1∶0.1-10)，按0.5％-5％(以藥液量計，w/v％)混合于藥液中存放一段時間，可以是例如12-48小時，通常12-24小時即可，視需要，此段時間可以稍短或更長，濾過，回收乙醇，然后加注射用水使至所需濃度規(guī)格，精濾，灌封，滅菌，即得。產(chǎn)品配制中不添加苯甲醇。所述的活化是指高溫或其他物理條件的處理。
現(xiàn)有工藝采用乙醇除雜，專一性差，在除雜的同時，其有效組分含量大幅下降，而需除去的離子則需多次醇沉也不易去掉。而本發(fā)明工藝則將醇沉工藝與專一的吸附工藝相結(jié)合，嚴格控制鉀離子，顯著提高產(chǎn)品質(zhì)量。活性炭雖然也具吸附性能，但本發(fā)明的給出的吸附劑可以顯著提高產(chǎn)品的各種性能指標(biāo)，從而提升產(chǎn)品的品質(zhì)。
具體地說，本發(fā)明產(chǎn)品由于工藝優(yōu)化，去除了注射液中鉀離子，而取消了原益母草注射液因肌注疼痛而加入的苯甲醇，并具有減輕注射疼痛的效果。
本發(fā)明產(chǎn)品是一種高品質(zhì)的注射劑，該注射劑理化性質(zhì)穩(wěn)定，其澄明度高和微粒少，每供試品中含10μm以上微?！?000粒，含25μm以上微粒≤400粒。不溶性微粒檢測法為取樣品50ml，照“中國藥典2005版附錄IXR不溶性微粒檢查法”第一法，光阻法檢查。較之于現(xiàn)有產(chǎn)品的每供試品中含10μm以上微粒小于6000粒，含25μm以上微粒小于600粒，品質(zhì)有了很大的提高。
此外，本發(fā)明產(chǎn)品還具有如下性能蛋白質(zhì)取本品1ml，加新配制的30％磺基水楊酸試液1ml，混合。放置5分鐘，未出現(xiàn)渾濁，符合規(guī)定；鞣質(zhì)取本品1ml，加新配制的含1％雞蛋清的生理氯化鈉溶液5ml，放置10分鐘，未出現(xiàn)渾濁或沉淀，符合規(guī)定；樹脂取本品5ml，加鹽酸1滴，放置30分鐘，未出現(xiàn)沉淀，符合規(guī)定；草酸鹽取本品適量，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至1～2，濾過，取濾液2ml，濾液調(diào)節(jié)PH至5～6，加3％氯化鈣溶液2～3滴。放置10分鐘，未出現(xiàn)渾濁或沉淀。
本發(fā)明指紋圖譜的確定和含量測定條件如下指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID測定)及《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術(shù)指南(試行)》色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗儀器Waters 2690液相色譜儀；色譜柱Aichrom Bond-AQ C18 4.6mm×250mm，5μm；流動相0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液(用0.1％磷酸調(diào)pH至5.5)；柱溫30℃；波長242nm；以隨行系統(tǒng)參照物進行試驗，出現(xiàn)的色譜峰應(yīng)不少于參照圖譜，圖形應(yīng)相似。連續(xù)進樣5針，其圖形間的相似度應(yīng)不低于0.99。
隨行系統(tǒng)參照物溶液的制備取隨行參照物一支，加300μl水使溶解，即得。隨行參照物合成的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖的標(biāo)樣。
供試品溶液的制備益母草注射劑作為供試品溶液。
測定法分別精密吸取隨行系統(tǒng)參照物溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，設(shè)置積分參數(shù)，積分峰面積；用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度軟件計算，益母草注射劑標(biāo)準(zhǔn)指紋圖與本品的相似度應(yīng)不低于0.9。
確定的指紋圖譜是益母草注射劑生產(chǎn)過程中原料采集，中間體、成品生產(chǎn)及產(chǎn)品穩(wěn)定性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)圖譜，具有專一性和獨創(chuàng)性。用標(biāo)準(zhǔn)指紋圖檢測用本發(fā)明工藝制備的產(chǎn)品中無苯甲醇峰存在。
含量測定總生物堿對照品溶液的制備精密稱取在105℃干燥至恒重的鹽酸水蘇堿對照品25mg，置25ml量瓶中，用0.1mol/l鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml含鹽酸水蘇堿1mg)。
供試品溶液的制備精密量取本品5ml，置100ml量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至度，搖勻，即得。
測定法分別精密量取對照品溶液、供試品溶液、0.1ml/L鹽酸溶液各10ml，分別置于三個25ml量瓶中，各精密加入新制的2％硫氰酸鉻銨溶液3ml，搖勻，加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，置冰浴中放置1小時，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，以0.1mol/L鹽酸溶液為空白。照分光光度法(附錄VB)，D525nm的波長處分別測定吸收度，用空白試劑的吸收度分別減去對照品與供試品的吸收度，計算，即得。
鹽酸水蘇堿照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID測定)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用磺酸基團鍵合硅膠(SCX)的陽離子交換劑為填充劑；以0.05±0.02mol/L磷酸二氫鉀-三乙胺100∶0.1±0.05，用磷酸調(diào)pH值至2.3±0.5為流動相；檢測波長為203nm。理論板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計算應(yīng)不低于1500。
對照品溶液的制備精密稱取鹽酸水蘇堿對照品適量，加流動相配制成每1ml含0.4mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備精密量取本品1ml，置25ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
本發(fā)明產(chǎn)品具有附圖2所述的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。并且分光光度法測每1ml注射液中含總生物堿以鹽酸水蘇堿為20mg時，采用HPLC法測定含鹽酸水蘇堿不少于8mg。


圖1是鹽酸水蘇堿對照品圖譜。
圖2是益母草注射液標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
圖3是益母草注射液標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖4是本發(fā)明益母草注射液的液相色譜圖。
圖5是3種市售益母草注射液的液相色譜圖。
具體實施例方式
實施例1 益母草注射液的制備取益母草加水煎煮三次，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.36-1.38(80℃)，加水稀釋至含水量約為35％，分別以88％-95％濃度的乙醇提取三次，靜置，濾過，回收乙醇，加入活性炭(用量為0.1％)和已滅菌活化的滑石∶硅藻土(1∶1)的吸附劑(用量為1％)混合物藥液中脫色至溶液無色或淡黃色，并存放24小時后，加注射用水使成1ml中含總生物堿約20mg，脫炭和吸附劑，精濾，灌封，滅菌，即得益母草注射液。照分光光度法(附錄VB)，D525nm波長處測定，生物總堿以鹽酸水蘇堿計含量為20mg/ml，采用實施例3中給出的HPLC法測定，鹽酸水蘇堿含量為13.78mg/ml。采用實施例4的指紋圖譜色譜條件測定，測出的圖譜用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度軟件計算，本品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度為0.99。
該注射液理化性質(zhì)穩(wěn)定，其澄明度高和微粒少，制劑性能檢測不溶性微粒取樣品50ml，照“中國藥典2005版附錄IXR不溶性微粒檢查法”第一法，光阻法檢查，每供試品中含10μm以上微粒小于4000粒，含25μm以上微粒小于400粒。
蛋白質(zhì)取本品1ml，加新配制的30％磺基水楊酸試液1ml，混合。放置5分鐘，未出現(xiàn)渾濁，符合規(guī)定；鞣質(zhì)取本品1ml，加新配制的含1％雞蛋清的生理氯化鈉溶液5ml，放置10分鐘，未出現(xiàn)渾濁或沉淀，符合規(guī)定；樹脂取本品5ml，加鹽酸1滴，放置30分鐘，未出現(xiàn)沉淀，符合規(guī)定；草酸鹽取本品適量，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至1～2，濾過，取濾液2ml，濾液調(diào)節(jié)PH至5～6，加3％氯化鈣溶液2～3滴。放置10分鐘，未出現(xiàn)渾濁或沉淀。
實施例2 益母草注射液的制備取益母草加水煎煮三次，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.36-1.38(80℃)，加水稀釋至含水量約為35％，分別以88％-95％濃度的乙醇提取三次，靜置，濾過，回收乙醇，加入活性炭(用量為0.5％)和含有已滅菌活化的滑石∶硅藻土(1∶1)的吸附劑(用量為3％)混合物藥液中脫色至溶液無色或淡黃色，并存放24小時后，加注射用水使成1ml中含總生物堿約20mg，脫炭和吸附劑，精濾，灌封，滅菌，即得益母草注射液。照分光光度法(附錄VB)，D525nm波長處測定，生物總堿以鹽酸水蘇堿計含量為20mg/ml，采用實施例3中給出的HPLC法測定，鹽酸水蘇堿含量為13.46mg/ml。采用實施例4的指紋圖譜色譜條件測定，測出的圖譜用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度軟件計算，本品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度為0.98。
該注射液理化性質(zhì)穩(wěn)定，其澄明度高和微粒少，制劑性能檢測不溶性微粒取樣品50ml，照“中國藥典2005版附錄IXR不溶性微粒檢查法”第一法，光阻法檢查，每供試品中含10μm以上微粒小于4000粒，含25μm以上微粒小于400粒。
蛋白質(zhì)取本品1ml，加新配制的30％磺基水楊酸試液1ml，混合。放置5分鐘，未出現(xiàn)渾濁，符合規(guī)定；鞣質(zhì)取本品1ml，加新配制的含1％雞蛋清的生理氯化鈉溶液5ml，放置10分鐘，未出現(xiàn)渾濁或沉淀，符合規(guī)定；樹脂取本品5ml，加鹽酸1滴，放置30分鐘，未出現(xiàn)沉淀，符合規(guī)定；草酸鹽取本品適量，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至1～2，濾過，取濾液2ml，濾液調(diào)節(jié)PH至5～6，加3％氯化鈣溶液2～3滴。放置10分鐘，未出現(xiàn)渾濁或沉淀。
實施例3益母草注射液鹽酸水蘇堿的HPLC檢測(一)實驗儀器和試藥(1)儀器Waters717-Waters2487-M32工作站W(wǎng)aters2690-Waters2487-M32工作站色譜柱Alltech SCX 5μ(4.6×250mm)Phenosphere SCX 5μ(4.6×250mm)MILLIPORE超純水制備儀(2)試藥樣品 由成都市時代第一藥物研究所有限公司提供。
對照品 中國藥品生物制品檢驗所(鹽酸水蘇堿，批號712-9903，供含量測定用)試劑 磷酸二氫鉀為成都化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，水為超純水，其余試劑為分析純。
(二)色譜條件(1)檢測波長203nm。
(2)分析柱Alltech SCX 5μ(4.6×250mm)陽離子交換色譜柱，以0.05mol/L磷酸二氫鉀-三乙胺(100∶0.1)(以磷酸調(diào)pH至2.3)為流動相，結(jié)果在203nm波長處，對照品和樣品均有最大吸收峰，樣品中鹽酸水蘇堿峰與相鄰峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以鹽酸水蘇堿峰計算均大于2000。
(3)流動相以0.05mol/L磷酸二氫鉀-三乙胺(100∶0.1)(以磷酸調(diào)pH至2.3)為流動相，流速1ml/min，柱溫30℃。對照品、供試品色譜圖見附圖1、2。
(4)色譜條件的評價通過不同的人、色譜系統(tǒng)和研究對象對色譜條件及系統(tǒng)適用性進行考察，結(jié)果如下
1.分離度樣品中鹽酸水蘇堿的峰能與其它雜質(zhì)峰達到良好的分離，分離度R≥1.5。
2.理論板數(shù)對照品及樣品中鹽酸水蘇堿峰的理論板數(shù)不小于2000。
(5)結(jié)論用磺酸基團鍵合硅膠(SCX)的陽離子交換劑為填充劑；以0.05mol/L磷酸二氫鉀-三乙胺(100∶0.1)(以磷酸調(diào)pH值至2.3)為流動相；檢測波長為203nm。理論板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計不低于2000的色譜條件能滿足檢測要求。
(三)供試品溶液的制備由于樣品為注射液，在澄明度和微粒上都有嚴格控制，并且盡量保留注射液中各物質(zhì)的實際存在狀態(tài)，所以我們采用樣品直接稀釋后進樣的方法。
(四)穩(wěn)定性試驗樣品穩(wěn)定性通過對同一樣品在室溫放置0、1、2、4、8、24小時的考察，其穩(wěn)定性較好，RSD＝1.4％，表明供試品溶液在24小時內(nèi)測定，結(jié)果穩(wěn)定。結(jié)果見表1。
表1益母草注射液穩(wěn)定性的考察

對照品溶液穩(wěn)定性通過將濃度為0.0816mg/ml的鹽酸水蘇堿對照品溶液在室溫的條件下放置0、1、2、4、8、24小時的考察，其穩(wěn)定性較好，RSD＝1.25％，表明對照品溶液在24小時內(nèi)測定，結(jié)果穩(wěn)定。結(jié)果見表2。
表2對照品溶液穩(wěn)定性的考察

(五)方法學(xué)研究(1)對照品溶液精密度精密吸取濃度為0.452mg/ml的鹽酸水蘇堿對照品溶液10μl注入液相色譜儀5次，記錄色譜圖，按峰面積計算，結(jié)果見表3。說明進樣精密度能滿足本品的含量測定要求。
表3鹽酸水蘇堿對照品溶液的精密度

(2)線性范圍精密吸取濃度為0.328mg/ml的鹽酸水蘇堿對照品溶液5μl、10μl、20μl、30μl、40μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見表4，以峰面積為橫坐標(biāo)，鹽酸水蘇堿對照品進樣量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖，得回歸方程。Y＝2.8637E-06X+0.6571，r＝0.9996。顯示鹽酸水蘇堿在1.64～13.12mg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
表4鹽酸水蘇堿對照品線性試驗結(jié)果

(3)重復(fù)性試驗取益母草注射液(批號040807)按含量測定項下供試品制備方法平行操作5次，并測定，結(jié)果列于表5。
表5重復(fù)性試驗結(jié)果

(4)回收率試驗精密吸取樣品(批號為040806，鹽酸水蘇堿含量為13.04mg/ml)0.5ml，共5份，分別精密加入鹽酸水蘇堿對照品6.32mg，加水稀釋至1ml，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文含量測定項下鹽酸水蘇堿含量測定方法測定，按下述計算式計算回收率，結(jié)果見表6。如表所示，本方法加樣回收平均回收率為98.0％，RSD為1.8％，由計算結(jié)果可知此提取方法的準(zhǔn)確度較好。

表6加樣回收率試驗結(jié)果

(5)十六批樣品的含量測定按本發(fā)明的檢測方法，測定16批樣品，其結(jié)果見表7。
表7十六批樣品含量測定結(jié)果


根據(jù)16批樣品測定結(jié)果可見，本品的含量測定限度為每1ml含鹽酸水蘇堿大于8mg。
實施例4 指紋圖譜的確定指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID測定)及《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術(shù)指南(試行)》。
(一)儀器、設(shè)備使用同一根色譜柱，在柱溫、流動相、檢測波長相同的情況下，分別在兩種型號的儀器上試驗。
1、Waters 2690型高效液相色譜儀，Waters 2487檢測器；同一天連續(xù)進樣五次，色譜峰的保留時間重復(fù)性很好。
2、Agilent 1100型高效液相色譜儀在同一天連續(xù)進樣五次，色譜峰的保留時間重復(fù)性很好。
在兩種型號的儀器上的試驗結(jié)果表明，使用Waters和Agilent的高效液相色譜儀測定的重復(fù)性均好，均可用于益母草注射液水溶性成分指紋圖譜的測定，但前者峰形更好，故優(yōu)選Waters 2690型高效液相色譜儀。
(二)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗儀器Waters 2690液相色譜儀；色譜柱Aichrom Bond-AQ C184.6mm×250mm，5μm；流動相0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液(用0.1％磷酸調(diào)pH至5.5)；柱溫30℃；波長242nm；以隨行系統(tǒng)參照物進行試驗，出現(xiàn)的共有色譜峰應(yīng)不少于參照圖譜，圖形應(yīng)相似。連續(xù)進樣5針，其圖形間的相似度應(yīng)不低于0.99。
隨行系統(tǒng)參照物溶液的制備取隨行參照物一支，加300μl水使溶解，即得。
供試品溶液的制備取益母草注射液作為供試品溶液。
測定法分別精密吸取隨行系統(tǒng)參照物溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至15分鐘，設(shè)置積分參數(shù)，以峰面積百分率約為0.4％的色譜峰的峰面積設(shè)為最小峰面積值；用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度軟件計算本品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，應(yīng)不低于0.9。
(三)指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的表達內(nèi)容說明指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容，包括儀器型號及系統(tǒng)適用性的描述，測定方法，相似度計算，相似度限度5個內(nèi)容。其中系統(tǒng)適用性是決定標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行成功的關(guān)鍵，它不能按含量測定的方法來描述，其評價指標(biāo)包括色譜條件，檢測條件，記錄時間，數(shù)據(jù)處理參數(shù)，系統(tǒng)的穩(wěn)定性等；測定方法包括供試品溶液制備、進樣方法、相似度計算(關(guān)鍵是計算軟件的選擇和計算方法)；相似度限度根據(jù)成品的穩(wěn)定性、測定方法的重復(fù)性、被測定樣品的組分的復(fù)雜性來決定。
1、色譜條件與系統(tǒng)適用性指紋圖譜的測定對色譜條件和儀器的參數(shù)控制要求非常高，本標(biāo)準(zhǔn)中使用的色譜分離柱為水性柱，由于水性柱的穩(wěn)定性不及常用的十八烷基鍵合硅膠柱，因此系統(tǒng)適用性中，以進樣精密度來考察色譜柱是否達到平衡要求；使用儀器規(guī)定為WATERS公司生產(chǎn)的2690或2695，檢測器為2487，用AGILENT生產(chǎn)的1100液相色譜儀檢測器為VWD G1314A測定，除指紋圖的保留時間因死體積不同造成差異外，圖形基本相似，如在控制死體積的條件下，同樣可用此種儀器測定，由于色譜柱的分離狀態(tài)、檢測器的能量都處于動態(tài)，對于系統(tǒng)適用性的控制，以使用隨行系統(tǒng)參照物來評價最為有效。關(guān)于隨行系統(tǒng)參照物的制備有三種，現(xiàn)正在進一步的考察當(dāng)中，初步擬定用凍干作為隨行系統(tǒng)參照物。以隨行系統(tǒng)參照物進行試驗，出現(xiàn)的共有色譜峰應(yīng)不少于參照圖譜，圖形應(yīng)相似。連續(xù)進樣5針，其圖形間的相似度應(yīng)不低于0.99，以評價系統(tǒng)是否完全達到平衡。
2、樣品處理及測定方法由于樣品為注射液，在澄明度和微粒上都有嚴格控制，并且盡量保留注射液中各物質(zhì)的實際存在狀態(tài)，為簡化樣品制備過程，保證信息的完整性，并能與流動相匹配，采用注射液直接進樣的方式。進樣量10μl。測定方法為水性色譜柱—磷酸鹽緩沖溶液(pH5.5)—等度洗脫為流動相作為分離條件，一張色譜圖即完成分離測定。
3、數(shù)據(jù)處理方法在化學(xué)藥品有關(guān)物質(zhì)檢測時一般以1％作為有關(guān)物質(zhì)限度，所設(shè)最小峰面積應(yīng)保證大于總峰面積1.0％的色譜峰的檢出。因本品總體信息量較少，設(shè)置積分參數(shù)時，以峰面積百分率約為0.4％的色譜峰的峰面積設(shè)為最小峰面積值。域值應(yīng)保證即可排除基線噪音影響又能檢測出指紋峰的信息。
4、相似度限度用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度軟件考察16批樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，表明相似度均大于0.95，高于0.9的標(biāo)準(zhǔn)。
(三)指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的方法驗證1、重復(fù)性驗證由于本標(biāo)準(zhǔn)采用直接進樣，色譜條件研究中的重復(fù)性實驗也可視為重現(xiàn)性試驗，當(dāng)由一人在同一臺儀器，在不同時間測定時，測定結(jié)果的RSD為0.2％；當(dāng)由兩人在同一實驗室進行測定，相似度的RSD為0.5％。
2、耐用性驗證為了驗證本標(biāo)準(zhǔn)在不同實驗室，使用不同的儀器，由生產(chǎn)單位檢驗人員按照本標(biāo)準(zhǔn)進行檢驗，檢驗結(jié)果與本實驗室比較其相似度為RSD為0.93％。
3、指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)的整體性評價在展開方與色譜條件的研究中，研究重心是色譜成分的展開和檢出，由于展開方法我們采用了多種色譜條件和展開模式，其中等離子對(雙離子)—梯度有機溶劑展開法，毛細管電泳法，等濃度磷酸鹽反沖溶液—梯度有機溶劑展開法，均能較好的將色譜成分展開，克服了分離度影響整體性的可能；由于受展開條件的限制，質(zhì)量型檢測器如質(zhì)譜、蒸發(fā)光散射檢測器等均無用武之地，為了解決色譜成分檢出率問題，曾采用了WATTERS公司996檢測器及工作站的特殊功能--(MAXPLOT)最大值化，提取各色譜成分最大吸收的色譜圖與不同波長的色譜圖進行比較，當(dāng)選擇242nm為檢測波長時，其色譜成分的檢出率為最大值化色譜圖的82％，是檢出率最高的檢測條件，滿足了最大信息量化的原則。
4、供試品穩(wěn)定性試驗擬用的穩(wěn)定性試驗方法為以0月指紋圖譜為參照標(biāo)準(zhǔn)，比較不同放置時期指紋圖譜的相似度，以此評價放置樣品共有主組分變化；當(dāng)相似度為1時，即兩圖形完全相同。由于色譜參數(shù)多為動態(tài)變化，即使同一個樣品，也難保兩張色譜圖完全一致，將相似度系數(shù)定在0.90以上視為一致，以此提高評價“共有主組分變化的檢出率”的可信度。

結(jié)果表明以0月指紋圖譜為參照標(biāo)準(zhǔn)，比較不同放置時期指紋圖譜的相似度，均在0.95以上，表示穩(wěn)定性良好。
實施例5以本發(fā)明益母草注射液為樣品，采用實施例4給出的液相色譜方法和條件進行測定，結(jié)果如圖4。圖中，S為本發(fā)明樣品實測譜圖，R為隨行參照物樣品實測譜圖。結(jié)果分析表明，相似度為0.997。
權(quán)利要求
1.一種益母草注射劑的制備方法，它包括如下步驟向益母草在采用水提醇沉工藝制得藥液中加入適量活性炭和0.5％-5％吸附劑，混合于藥液中存放一段時間后，濾過，回收乙醇，然后加注射用水使至所需濃度規(guī)格，精濾，灌封，滅菌，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，活性炭的用量為所述藥液量的0.01％-0.5w/v％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中，制備過程中不添加苯甲醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一的方法，其中，所述的吸附劑選自滑石、膨潤土、硅藻土和陶土的礦物中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中，所述的吸附劑是含有已滅菌活化的重量比為1∶0.1-10的滑石和硅藻土。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一方法制備的益母草注射劑，其中，注射劑采用分光光度法測每1ml注射液中含總生物堿以鹽酸水蘇堿計為20mg時，采用HPLC法測定含鹽酸水蘇堿不少于8mg。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的注射劑，其中，注射劑中10μm以上微粒≤4000粒，含25μm以上微?！?00粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的益母草注射劑，其中，注射劑產(chǎn)品具有以下理化性能蛋白質(zhì) 取本品1ml，加新配制的30％磺基水楊酸試液1ml，混合，放置5分鐘，未出現(xiàn)渾濁，符合規(guī)定；鞣質(zhì) 取本品1ml，加新配制的含1％雞蛋清的生理氯化鈉溶液5ml，放置10分鐘，未出現(xiàn)渾濁或沉淀，符合規(guī)定；樹脂 取本品5ml，加鹽酸1滴，放置30分鐘，未出現(xiàn)沉淀，符合規(guī)定；草酸鹽取本品適量，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至1～2，濾過，取濾液2ml，濾液調(diào)節(jié)PH至5～6，加3％氯化鈣溶液2～3滴。放置10分鐘，未出現(xiàn)渾濁或沉淀。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一的方法制備的益母草注射劑，其特征在于，該注射劑采用Waters 2690液相色譜儀；色譜柱Aichrom Bond-AQ C184.6mm×250mm，5μm；流動相0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液；柱溫30℃；波長242nm下測定，出現(xiàn)的色譜峰與如圖1譜圖形相似度不低于0.9。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的注射劑，其中，該注射劑測定出的色譜峰與所述圖譜圖形相似度不低于0.95。
全文摘要
本發(fā)明涉及高品質(zhì)的制備方法及用該方法制備的益母草注射劑。本發(fā)明方法涉及優(yōu)化提取工藝，提高注射劑整體特征性物質(zhì)基礎(chǔ)的一致性，使產(chǎn)品質(zhì)量高效穩(wěn)定。
文檔編號A61P15/00GK1973854SQ20061015028
公開日2007年6月6日 申請日期2006年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月16日
發(fā)明者劉仲義, 吳大蓉, 李長富, 曾智輝 申請人:成都市時代第一藥物研究所有限公司