專利名稱：鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領域，具體涉及鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆、表達技術。
背景技術：
人B淋巴細胞刺激因子(hBAFF)是1999年新發(fā)現(xiàn)的一種與人體免疫調控密切相關的腫瘤壞死因子家族成員，主要在外周血單核細胞、脾臟、淋巴結和骨髓中表達。hBAFF具有很強的B細胞趨化性，體外它作為B細胞增殖和分化的共刺激因子，能誘導活化的B細胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，對于休眠B細胞，hBAFF雖不能獨立激活使之進入細胞周期循環(huán)，但通過上調細胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達，延長休眠B細胞的壽命。體內它可以促進脾臟內T1-B細胞向T2-B細胞以及成熟B細胞的發(fā)育。hBAFF的正常表達是GC形成、抗體親和力成熟、記憶性B細胞形成及B細胞正常發(fā)育的必須條件。BAFF-/-小鼠的次級淋巴器官囊外及過渡區(qū)B細胞完全缺失。hBAFF刺激B細胞增殖、分化并分泌抗體，成熟的B細胞及其產(chǎn)生的抗體構成了機體抵御感染和抑制腫瘤滋生的關鍵組分。由于hBAFF的免疫增強特異活性，自從被發(fā)現(xiàn)以來就顯示了巨大的臨床應用前景。2000年11月，美國FDA已正式批準重組人hBAFF進入人體臨床試驗，用于治療普通變異免疫缺乏癥(CVID)患者。
根據(jù)GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列數(shù)據(jù)庫搜索結果得知，目前只有人、鼠、雞、鴨的BAFF cDNA已被克隆，并分別已在GenBank數(shù)據(jù)庫中申請了序列號，序列號分別是AF116456、AF119383、AF506010及DQ445092。鵝B淋巴細胞刺激因子(gBAFF)cDNA還未被克隆出來，關于鵝BAFF基因的研究在整個國內外還處于完全空白狀態(tài)。鵝是十分重要的禽類，由于B淋巴細胞刺激因子(BAFF)具有較強的免疫增強能力，基因工程鵝BAFF蛋白有可能開發(fā)成一種能增強鵝類免疫能力的生物制劑，用于體質弱、免疫功能低下的病鵝，增加鵝類抗病毒能力，尤其是在禽流感對人類已構成威脅的今天。近年來，隨著對細胞因子研究的不斷深入和分子生物學技術的發(fā)展，大量的禽類細胞因子得以克隆及重組表達，許多細胞因子基因工程藥物面市，給治療禽類疾病提供了新的手段，同時創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟和社會效益，因此，重組鵝BAFF蛋白具有潛在的巨大市場應用價值。同時，B淋巴細胞刺激因子(BAFF)是新發(fā)現(xiàn)的免疫系統(tǒng)重要調控因子，對鵝BAFF的研究有助于探索鵝類的免疫調控機制，推動其免疫系統(tǒng)研究的發(fā)展。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種從鵝提取的B淋巴細胞刺激因子cDNA，并提供鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法及重組技術。
本發(fā)明從鵝中克隆到B淋巴細胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。
鵝B淋巴細胞刺激因子，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。
本發(fā)明的鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)根據(jù)雞，鴨B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物正義寡核苷酸引物gBAFF15’-GGAGGAAAGAGCAGCGATG-3’反義寡核苷酸引物gBAFF25’-GCAGTAAGCATAACAACAGAATC-3’(2)從鵝脾臟提取總RNA，(3)通過RT-PCR方法，以上述引物gBAFF1及gBAFF2為特異性引物，擴增出一段cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，并對其堿基序列進行測定，上述鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法具體操作如下(1)根據(jù)B淋巴細胞刺激因子全長cDNA兩段高保守區(qū)域設計同源克隆的正義寡核苷酸引物gBAFF1(5’-GGAGGAAAGAGCAGCGATG-3’)與反義寡核苷酸引物gBAFF2(5’-GCAGTAAGCATAACAACAGAATC-3’)，(2)應用RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen公司)，按照操作手冊，提取出鵝脾臟細胞的總RNA，(3)應用RT-PCR方法，以上述gBAFF1及gBAFF2為特異性引物，擴增出一段cDNA序列，全長為914bp，克隆入pMD18-T載體，并對其堿基序列進行測定。RT-PCR的反應條件為以總RNA為模板，在50μl反應體系中，加入5×RT-PCR反應緩沖液10μl、25mM MgSO42μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆轉錄酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，補水至50μl。RT-PCR循環(huán)參數(shù)為48℃逆轉錄45min，94℃變性2min，再進行29個PCR循環(huán)(94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s)，最后于72℃延伸7min。RT-PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒回收約914bp的DNA條帶，克隆入pMD18-T載體，挑取8個陽性克隆進行堿基序列測定。
將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進行相似性搜索，發(fā)現(xiàn)與已知的鴨、雞、人、鼠BAFF序列相似率最高，分別是98％、92％、55％、44％，可以確定該序列是鵝B淋巴細胞刺激因子(gBAFF)的全長cDNA，其開放閱讀框如SEQ ID NO.1所示。
對該基因的進一步研究表明該基因主要表達在鵝類免疫器官中，包括法氏腔上囊、脾臟及胸腺。其中法氏腔上囊和脾臟表達水平較高，胸腺次之；該基因的重組融合蛋白具有gBAFF的高活性功能；該基因編碼的蛋白對鵝B淋巴細胞具有明顯的促存活/增殖效應；對人及鼠的B淋巴細胞都具有促存活/增殖的生物學功能；充分表明本發(fā)明克隆得到的基因就是鵝B淋巴細胞刺激因子(gBAFF)的cDNA。
上述鵝B淋巴細胞刺激因子(gBAFF)的cDNA的重組應用，通過現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組goose BAFF，作為鵝類免疫增強劑。
所說的鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現(xiàn)有基因工程方法，轉入鵝體內，增加其免疫力，在飼養(yǎng)中應用。


圖1是goose BAFF全長cDNA的克隆過程示意圖；箭頭代表引物位置；全長cDNA共914bp。
圖2是goose BAFF全長cDNA堿基序列及推測編碼氨基酸序列。
圖3是goose BAFF與鴨、雞、人、鼠BAFF全長氨基酸序列同源性比較圖。其中陰影代表保守的氨基酸；箭頭所指代表弗林蛋白酶識別位點，切割后的C端為BAFF的胞外可溶功能區(qū)。
圖4是goose BAFF mRNA在各組織中的表達水平分析圖。β-actin作為內參。
圖5是融合蛋白His-gsBAFF在BL21(DE3)中的誘導表達，Ni+柱純化的SGS-PAGE鑒定及鼠抗His6-tag的western-blotting鑒定結果，A圖中條帶1是經(jīng)IPTG誘導4.5小時后的全菌蛋白，2是未經(jīng)IPTG誘導的全菌蛋白，3是經(jīng)Ni+柱純化后目的蛋白；4是鼠抗His6-tag單抗的western-blotting鑒定結果，5是兔抗His-gsBAFF多抗的western-blotting鑒定結果。
圖6是本發(fā)明克隆的基因對鵝B淋巴細胞的促存活作用結果示意圖。圖A是說明不同濃度的His-gsBAFF相對于對照His-TRAIL在作用鵝B淋巴細胞48小時后，對鵝B淋巴細胞可見顯著的促存活作用，且呈劑量依賴效應；圖B是說明固定濃度的His-gsBAFF相對于對照His-TRAIL分別在作用鵝B淋巴細胞24/48/72小時后的鵝B淋巴細胞存活數(shù)量比較情況，PMA為陽性對照，His-gsBAFF的兔多抗能中和His-gsBAFF的生物學活性。
圖7是goose BAFF、duck BAFF和chicken BAFF之間存在功能交叉反應。圖A是說明不同濃度的His-gsBAFF對雞、鴨、鵝B淋巴細胞的促存活作用；圖B是說明不同濃度的His-gsBAFF對雞、鴨、鵝B淋巴細胞的促存活作用；圖C是說明不同濃度的His-csBAFF對雞、鴨、鵝B淋巴細胞的促存活作用具體實施方式
在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內容相同。
實施例1鵝(Anser cygnoides)，人工飼養(yǎng)。
(1)引物設計應用ClustalX軟件對已克隆出的人、鼠、雞、鴨B淋巴細胞刺激因子全長cDNA序列進行同源性比對分析，精心選取出兩段高保守區(qū)域用來設計同源克隆的正義寡核苷酸引物gBAFF1(5’-GGAGGAAAGAGCAGCGATG-3’)與反義寡核苷酸引物gBAFF2(5’-GCAGTAAGCATAACAACAGAATC-3’)。
(2)提取總RNA應用RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen公司)按照其操作手冊提取出約0.5克鵝脾臟細胞的總RNA，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質量和純度，紫外分光光度計測定其濃度。
(3)應用RT-PCR方法，以上述gBAFF1及gBAFF2為特異性引物，擴增出goose BAFFcDNA的一段序列，全長為914bp，克隆入pMD18-T載體，并對其堿基序列進行測定。RT-PCR的反應條件為以總RNA為模板，在50μl反應體系中，加入5×RT-PCR反應緩沖液10μl、25mM MgSO42μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆轉錄酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，補水至50μl。RT-PCR循環(huán)參數(shù)為48℃逆轉錄45min，94℃變性2min，再進行29個PCR循環(huán)(94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s)，最后于72℃延伸7min。RT-PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒回收約914bp的DNA條帶，克隆入pMD18-T載體，經(jīng)含Amp抗生素(50mg/ml)的瓊脂糖平板篩選轉化子，挑取出8個陽性克隆送往上海英駿測序公司進行堿基序列測定，得到如圖2所示的goose BAFF全長cDNA堿基序列及推測編碼氨基酸序列。
(6)同源檢索將所得序列向http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/提交克隆得到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列數(shù)據(jù)庫進行相似性搜索及同源性分析，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)與已知的鴨(GenBank登錄號DQ445092)、雞(GenBank登錄號AF506010)、人(GenBank登錄號AF116456)、鼠(GenBank登錄號AF119383)BAFF氨基酸序列相似性最高(不包括其他種屬BAFF的預測氨基酸序列)，分別是98％、92％、55％、44％，可以確定該序列是鵝B淋巴細胞刺激因子(gBAFF)的全長cDNA。并且其開放閱讀框具有SEQ ID NO.1序列，碥碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
實施例2goose BAFF 基因在各組織的表達水平分析采用實施例1中的提取RNA的方法，分別提取了鵝肝(1iver)、腎(kidney)、胸腺(thymus)、腔上囊(bursa)、脾(spleen)、心(heat)及腦(brain)的總RNA，運用半定量RT-PCR法對goose BAFF基因在各組織的表達水平進行了研究，結果如圖4所示，goose BAFF基因主要表達在鵝類免疫器官中，包括法氏腔上囊、脾臟及胸腺；其中法氏腔上囊和脾臟表達水平較高，胸腺次之。試驗中鵝β-actin作為內參，采用的引物為gβ-actin1(5’-ATCGTCACCAACTGGGACGACATGG-3’)和gβ-actin1(5’-TCTCCTGCTCGAAGTCCAGGGCGAC-3’)。RT-PCR體系如實施例1。
可溶性goose BAFF重組載體的構建及其在大腸桿菌中的誘導表達以實施例1得到的goose BAFF全長cDNA為模板，設計引物gsBAFF1(5’-TCAGGACATATGTCTGTCGTCCACACGGAAG-3’(Nde I))及gsBAFF1(5’-ACTGAGGGATCCTCAGAAGAGTCTGACGGCACCA-3’(BamH I))擴增出goose BAFF cDNA胞外可溶區(qū)段(gsBAFF)，引物分別引入酶切位點Nde I及BamH I，亞克隆入pET-28a載體，構建成重組載體pET-28a-gsBAFF。將此重組載體轉入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，胞漿內可高可溶性表達出目的蛋白His-gsBAFF，此融合蛋白經(jīng)促存活與增殖試驗(圖6，7)，活性檢測證實具有gsBAFF的高活性功能。
重組目的蛋白的的Ni+親和純化IPTG誘導含有重組載體pET-28a-gsBAFF的大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)4.5小時后，4℃收菌，冰上超聲破碎(工作10s，暫停10s，共99次)表達菌體，4℃，13，000×g，20min離心超聲破碎液后，棄沉淀，留上清過Ni+-NTA柱。簡要過程是3體積Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，手動上樣含可溶性重組蛋白的上清，6體積WashBuffer(60mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗去未結合上Ni+-NTA柱的雜蛋白，最后6體積Elute Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脫目的蛋白，PBS透析除鹽，以SGS-PAGE及毛細管電泳分析純度并以紫外分光光度計檢測蛋白濃度，如圖5(A，條帶3)所示，表達得到的目的蛋白經(jīng)Ni+柱親和純化得到純度達95％的活性目的蛋白。
western印跡分析Western-blot中所用一抗為羊抗His6單抗和兔抗His-gsBAFF多抗，二抗為辣根過氧化酶標記的鼠抗羊和羊抗兔IgG。其簡要步驟是將誘導的產(chǎn)物先行SGS-PAGE，然后以浸入式法將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，用記號筆標記蛋白marker各條帶，然而依次經(jīng)5％脫脂奶粉室溫封閉1h，與一抗孵育1h，與HRP標記的二抗IgG孵育1h，每步完成后均嚴格洗膜，最后加TMB避光顯色。結果如圖5所示在目的蛋白位置出現(xiàn)了特異性條帶。
goose BAFF對鵝法氏腔上囊B淋巴細胞促存活作用實驗采用淋巴細胞分離液常規(guī)無菌分離鵝法氏腔上囊淋巴細胞(約98％為B淋巴細胞)，用RPMI1640調節(jié)細胞密度至5×107個/mL.將B細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl。向每孔內加入不同濃度的His-gsBAFF/His-TRAIL，37℃，5％CO2培養(yǎng)72h后每孔加入10μl 5mg/mLMTT，37℃，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)5h，加入100μl SGS-HCl溶解沉淀物，37℃過夜，測定各孔OD570值實驗設三復孔，取其平均值，并計算標準誤差。在體外通過MTT細胞毒試驗檢測goose BAFF對鵝B淋巴細胞的促存活作用，如圖6所示，結果表明本發(fā)明克隆得到的goose BAFF對鵝B淋巴細胞具有明顯的促存活效應，與鴨、雞、人、鼠BAFF的生物學功能相同，且呈現(xiàn)劑量依賴效應，即當His-gsBAFF為3μg/ml時goose BAFF的促增殖作用最強。同時，固定濃度的His-gsBAFF相對于對照His-TRAIL分別在作用鵝B淋巴細胞24/48/72小時后，可觀察到72小時時對鵝B淋巴細胞的促存活效應最明顯。
goose BAFF、duck BAFF和chicken BAFF之間存在功能交叉反應采用淋巴細胞分離液從雞、鴨、鵝法氏囊中無菌分離雞、鴨、鵝B淋巴細胞，在體外通過MTT細胞毒試驗檢測goose BAFF、duck BAFF和chicken BAFF對雞、鴨、鵝B淋巴細胞的促存活，方法同上，結果如圖7所示，表明goose BAFF、duck BAFF和chicken BAFF之間存在功能交叉反應，且呈現(xiàn)劑量依賴效應，飽和濃度分別為3μg/ml，4μg/ml和3μg/ml，進一步證實了BAFF在生物體內生物學功能的保守性。
實施例3將實施例1獲得的鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組goose BAFF，作為鵝類免疫增強劑。
實施例4將實施例1獲得的鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現(xiàn)有基因工程方法，轉入鵝體內，增加其免疫力，在飼養(yǎng)中應用。
按照本發(fā)明的方法可以通過現(xiàn)有基因工程技術，修飾鵝B淋巴細胞刺激因子基因并用于所述研究和生產(chǎn)。
SEQUENCE LISTING<110>南京師范大學<120>鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用<160>2<210>1<211>867<212>cDNA<213>鵝(Anser cygnoides)<400>1atgaaatccg tggactgtgt gcacgtcatc caacagaagg ataccgcctc ctctccctct60gccccccccg gtgctgcttc aggcaccacg ggactttttt ctgtcacatt cctgtggctt120gcaatgctcc tgtcctcttg tcttgcagca gtgtctcttt accatgttct caccctgaaa180acagagctag aagctctgcg ccatgagctg atctacaggg tccaggcaag gtctccgcta240gagcggccag ccgtctcccc tgatgacgag aaagcgggtg cccctgtttc ttccttcctg300caagcctctg cagctggtgc caggcaggag aacaagcttc ctggccctag cccagctgaa360agtttccgaa acgaaatctc gaatgggagc agaaacaggg ggagaaggtc tgtcgtccac420acggaagaaa cagtgctgca ggcctgcttg caactgatcg ctgacagcaa aagtgatatc480caacagaaag atgattcaag cattgtccct tggcttctga gctttaaacg tggaacagct540ctggaagaac atggaaataa aatagtgatc aaagaaacag gatatttttt catatatggc600caggttttat atacagatac aacatttgct atgggacatc taatacagag gaagaaggcc660catgtgtttg gtgatgatct gagcttggtg acattatttc gctgcataca aaatatgcca720cagtcttatc cgaataattc ttgctatact gctggcattg caaaattaga agaaggggac780gaacttcaac ttacaatacc acgaagacga gccaaaatat ccttggatgg cgatggtact840ttttttggtg ccgtcagact cttctga 867<210>2<211>288<212>PRT<213>鵝(Anser cygnoides)<400>2Met Lys Ser Val Asp Cys Val His Val Ile Gln Gln Lys Asp Thr15 1015Ala Ser Ser Pro Ser Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ser Gly Thr Thr20 2530Gly Leu Phe Ser Val Thr Phe Leu Trp Leu Ala Met Leu Leu Ser35 4045Ser Cys Leu Ala Ala Val Ser Leu Tyr His Val Leu Thr Leu Lys50 5560
Thr Glu Leu Glu Ala Leu Arg His Glu Leu Ile Tyr Arg Val Gln65 70 75Ala Arg Ser Pro Leu Glu Arg Pro Ala Val Ser Pro Asp Asp Gln80 85 90Lys Ala Gly Ala Pro Val Ser Ser Phe Leu Gln Ala Ser Ala Ala95 100 105Gly Ala Arg Gln Glu Asn Lys Leu Pro Gly Pro Ser Pro Ala Glu110 115 120Ser Phe Arg Asn Glu Ile Ser Asn Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg125 130 135Arg Ser Val Val His Thr Glu Glu Thr Val Leu Gln Ala Cys Leu140 145 150Gln Leu Ile Ala Asp Ser Lys Ser Asp Ile Gln Gln Lys Asp Asp155 160 165Ser Ser Ile Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Thr Ala170 175 180Leu Glu Glu His Gly Asn Lys Ile Val Ile Lys Glu Thr Gly Tyr185 190 195Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ala200 205 210Met Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Ala His Val Phe Gly Asp215 220 225Asp Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro230 235 240Gln Ser Tyr Pro Asn Asn Ser Cys Thr Thr Ala Gly Ile Ala Lys245 250 255Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu Thr Ile Pro Arg Arg Arg260 265 270Ala Lys Ile Ser Leu Asp Gly Asp Gly Thr Phe Phe Gly Ala Val275 280 285Arg Leu Phe288
權利要求
1.鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.一種權利要求1所述的鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)根據(jù)B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物正義寡核苷酸引物gBAFF15’-GGAGGAAAGAGCAGCGATG-3’，反義寡核苷酸引物gBAFF25’-GCAGTAAGCATAACAACAGAATC-3’(2)從鵝脾臟提取總RNA，(3)通過RT-PCR方法，以上述引物gBAFF1及gBAFF2為特異性引物，擴增出一段cDNA序列，克隆入pMD18-T載體，挑取陽性克隆進行堿基序列測定。
3.一種權利要求1所述的鵝B淋巴細胞刺激因子cDNA的重組應用，是通過現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組鵝B淋巴細胞刺激因子，作為鵝類免疫增強劑。
4.鵝B淋巴細胞刺激因子，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的序列。
全文摘要
鵝B淋巴細胞刺激因子(goose BAFF)cDNA及其克隆方法和重組應用，涉及生物基因工程領域。鵝B淋巴細胞刺激因子的基因，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。其克隆方法如下根據(jù)B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物；從鵝脾臟提取總RNA；通過RT－PCR方法，一步擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD18－T載體，挑取陽性克隆進行測序。所述鵝B淋巴細胞刺激因子的cDNA可通過現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組goose BAFF，作為鵝類免疫增強劑。
文檔編號A61P37/00GK1936001SQ20061009673
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權日2006年10月13日
發(fā)明者張雙全, 但文兵 申請人:南京師范大學