專利名稱：白蟻菌圃提取物的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制藥領(lǐng)域，涉及一種從中藥白蟻菌圃中提取有效物質(zhì)的方法。該有效物質(zhì)具有抗炎活性，可用于制備治療炎癥性疾病的藥物。
背景技術(shù)：
炎癥是致病因子作用下機(jī)體采取的一種防御措施的病理過程。致病因子可以是病毒、細(xì)菌及其它微生物。許多疾病都可歸為炎癥性疾病，如肝炎、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、腎炎、胸膜炎、胃腸炎和艾滋病等。如表現(xiàn)為局部則為瘡癤、癰疽等。
白蟻是一種古老的昆蟲，在地球上已生存2.5億年。世界上已發(fā)現(xiàn)的白蟻有44屬3000余種，分布在熱帶、亞熱帶及溫帶的大部分地區(qū)。我國北緯40°以南的大部分地區(qū)，特別是長江以南地區(qū)最為常見。白蟻主食木材及含纖維的物質(zhì)，常在橋梁堤壩、樹林和房舍中筑巢，對人類危害極大，已被列為世界五大害蟲之一。但白蟻的藥用價(jià)值在歷代醫(yī)書中均有記載，其主要功效是滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用，臨床用于老弱體虛，久病氣血兩虧等。
蟻巢在生物學(xué)上稱為菌圃，是白蟻的分泌物，是一種純生物物質(zhì)，民間用于治療肝炎、慢性支氣管炎、胃炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效。臨床上，白蟻菌圃的主要藥效作用是提高機(jī)體免疫力、抗炎、鎮(zhèn)痛及抗衰老作用。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)多年的研究，從白蟻菌圃中提取和分離出了其中所含的多種抗炎活性物質(zhì)，其中有效部位是五環(huán)三萜化合物木栓酮和熊果酸為主要活性成分，含有該有效部位的藥物可用于治療炎癥性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中藥白蟻菌圃提取物的制備方法及其在抗炎藥物中的用途。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)路線來實(shí)施一種具有抗炎活性的中藥提取物的制備方法，其特征在于，該中藥提取物是從中藥白蟻菌圃中提取分離有效部位得到，其制備方法如下將粉碎后的白蟻菌圃用原料重量的8～12倍的甲醇或乙醇或重量比為水1～99％、乙醇1～99％的溶劑加熱回流提取3次，每次2～3小時(shí)，合并提取液，室溫下靜置24小時(shí)后過濾，濾液于0.09～0.1Mpa條件下減壓濃縮，濃縮液上大孔吸附樹脂行柱層析，先用4～6倍樹脂床體積的水沖洗，再用4～6倍樹脂體積的乙醇梯度洗脫，收集20％以上乙醇濃度的洗脫液，回收乙醇，噴霧或冷凍干燥得到白蟻菌圃提取物干粉。
所述的白蟻菌圃，可以是黑翅土白蟻(Odontotermes formosanus Shiraki)菌圃、黃翅大白蟻(Macrotermes barneyi Light)菌圃、土垅大白蟻(Macrotermes annandalei Slivestri)菌圃或臺(tái)灣乳白蟻(Coptotermes formosanus Shiraki)菌圃。
所述樹脂為非極性或弱極性的大孔吸附樹脂，包括型號(hào)為HPD-100、HPD-300、HPD-450、D101、DM-130或AB-8。
所述的白蟻菌圃提取物干粉含總?cè)祁惣捌渌嵝猿煞值扔行镔|(zhì)30～50％(重量)。
一種中藥白蟻菌圃提取物的用途，其特征在于，該中藥提取物是從白蟻菌圃中制得，用于制備預(yù)防和治療炎癥性疾病的藥物。
以上制備的干粉，為棕黃色固體物質(zhì)，易吸潮，含總?cè)祁惣捌渌嵝晕?0～50％。該干粉可以加入相關(guān)輔料制成各種不同的劑型，如注射劑、散劑、丸劑、顆粒劑、膠囊劑、微囊劑、軟膠囊劑、緩釋劑、粉針劑、膏劑、沖劑、氣霧劑、膜劑、酊劑、各種外用制劑等供臨床藥用。
本發(fā)明可用以下方法控制質(zhì)量1、取少許干粉，加入冰醋酸及醋酐各1mL，水浴微熱使溶，沿溶液邊緣滴加1滴濃H2S04，顏色應(yīng)由淺黃色逐漸變成深綠色。
2、氣相色譜法(GC)采用氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器，GC色譜條件為Hp5-MS色譜柱(5％phenyl methyl siloxane，30m×0.25mm×0.25μm)；柱溫從140℃以20℃·min-1升溫到280℃后保持22min，進(jìn)樣量1μL，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度280℃，氦氣流速為1～5mL·min-1，檢測器溫度300℃，保留時(shí)間為27.1min應(yīng)有吸收峰。
3、高效液相色譜法(HPLC)取本品少量，用甲醇溶解配制成約0.01mg/mL的流液進(jìn)行高效液相色譜檢測，保留時(shí)間為28.5min應(yīng)有吸收峰。
檢測波長為210nm，用Waters C18柱(250mm×4.6mm，10μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1％磷酸溶液(85∶15)。
具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合具體實(shí)例及實(shí)驗(yàn)，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1粉碎后的白蟻菌圃1000g加入8L水，煮沸2小時(shí)，過濾，連續(xù)3次；合并濾液，濃縮至小體積后加入乙醇，使含醇量達(dá)到60％，常溫下放置24小時(shí)，離心去沉淀。濾液于0.09～0.1Mpa條件下減壓濃縮，濃縮液經(jīng)HPD-100型大孔吸附樹脂行柱層析，用5倍樹脂床體積的水沖洗，再用5倍樹脂床體積的乙醇梯度洗脫，當(dāng)流出液含醇量達(dá)到20％時(shí)收集洗脫液至李伯曼反應(yīng)為陰性時(shí)停止收集。收集液濃縮、真空干燥，得到3.2g棕色提取物(為總?cè)祁惓煞?。
實(shí)施例2粉碎后的白蟻菌圃1000g加入8L 95％乙醇于水浴回流3次，每次2小時(shí)，合并提取液，常溫下放置24小時(shí)，離心去沉淀。濾液回收乙醇至稠膏狀，上HPD-100型大孔吸附樹脂，先用5倍樹脂體積的水沖洗，再用5倍樹脂床體積的乙醇梯度洗脫，當(dāng)流出液含醇量達(dá)到20％時(shí)，收集洗脫液至李伯曼反應(yīng)為陰性時(shí)停止收集。收集液濃縮，真空干燥，得到9.1g棕色提取物(為總?cè)祁惓煞?。
實(shí)施例3
粉碎后的白蟻菌圃1000g，加8L甲醇于水浴回流3次，每次2小時(shí)，合并提取液，常溫下放置24小時(shí)，離心去沉淀，濾液回收甲醇至稠膏狀，上HPD-100型大孔吸附樹脂，先用5倍樹脂體積的水沖洗，再用5倍樹脂床體積的乙醇梯度洗脫，當(dāng)流出液含醇量達(dá)到20％時(shí)，收集洗脫液至李伯曼反應(yīng)為陰性時(shí)停止收集。收集液濃縮，真空干燥，得到9.5g棕色提取物(為總?cè)祁惓煞?。
實(shí)驗(yàn)1白蟻菌圃提取物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響昆明種小鼠112只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為8組陰性對照組(生理鹽水20ml/kg)、陽性對照組(地塞米松5mg/kg)、A組分組(45，22.5mg/kg)、B組分組(40，20mg/kg)、C組分組(23，11.5mg/kg)。分別ig給藥，連續(xù)14d。末次給藥后1h，用乙醚輕度麻醉。在小鼠右耳兩側(cè)共涂二甲苯0.02ml/只為致炎耳，左耳不作任何處理為非致炎耳。4h后將動(dòng)物處死，剪下兩耳，用直徑8mm的打孔器分別鑿出相同部位相同大小的耳廓，用電子天平稱重。以致炎耳廓重減去非致炎耳廓重的差值作為腫脹值。抑制率＝(對照組耳腫脹度-用藥組耳腫脹度)/對照組耳腫脹度×100％。結(jié)果見表1。
表1白蟻菌圃提取物對二甲苯致耳廓腫脹的影響

與陰性對照組比較*為P＜0.05；**為P＜0.01實(shí)驗(yàn)2白蟻菌圃提取物對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響昆明種小鼠160只，雌雄各半，體重隨機(jī)分為8組，每組20只。每天一次灌胃給藥，連續(xù)7天，末次給藥1h后，各組尾靜脈注射0.5％伊文思蘭0.1mg/10g體重，并立即腹腔注射0.6％的冰醋酸0.1ml/10g。20min后頸椎脫臼處死。腹腔注射5mL生理鹽水，輕柔，再剪開一小口，用吸管吸出洗液，如有出血?jiǎng)t棄去不用。再以3000rpm離心12-15min，取上清液于722分光光度計(jì)在590nm波長處測吸光度(A)值。
表2白蟻菌圃提取物對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

與陰性對照組比較*為P＜0.05；**為P＜0.01實(shí)驗(yàn)3白蟻菌圃提取物對大鼠棉球植入所致肉芽腫的影響取180-220克，SD大鼠112只，雌雄各半。手術(shù)前一天將大鼠按體重性別隨機(jī)分為八組并分別給相應(yīng)的藥物。第二次給藥后乙醚麻醉，在大鼠兩側(cè)腋窩下剪開約1cm的小口，將兩個(gè)滅菌棉球(每個(gè)棉球重50±1mg。高壓滅菌，各加入氨芐青霉素每個(gè)1mg/0.5ml。50℃烘箱烤干)分別值入皮下，縫合創(chuàng)口。并在創(chuàng)口局部涂以少量抗生素。第8次給藥后頸椎脫臼處死，取出棉球，剝離附著的結(jié)締組織，在60℃烤箱烘12小時(shí)后稱重，減去原來棉球重量，即為肉芽腫凈重，取兩側(cè)肉芽腫質(zhì)量的均值。
表3白蟻菌圃提取物對大鼠棉球植入所致肉芽腫的影響

與陰性對照組比較*為P＜0.05；**為P＜0.01***為P＜0.001實(shí)驗(yàn)4白蟻菌圃提取物對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響雄性Wistar大鼠60只，體重180-220克，按體重隨機(jī)分為6組B組(40，20mg/kg)、C組(23，11.5mg/kg)、空白對照組(生理鹽水20ml/kg)、陽性對照組(地塞米松5mg/kg)。在大鼠右足踝關(guān)節(jié)下0.5mm處劃線作標(biāo)記，用排水法測原始體積。按上述相應(yīng)藥物灌胃給藥。給藥1h后，在大鼠右足趾皮下注射0.1ml佛氏完全佐劑，連續(xù)給藥25天，并于致炎后18h、3d、8d、14d、18d、25d分別測致炎足的體積。同時(shí)觀察其左足、耳、鼻、尾部的變化，并按標(biāo)準(zhǔn)記分，作為繼發(fā)性病變的指標(biāo)之一。
表4對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎足腫脹的影響

與陰性對照組比較*為P＜0.05；**為P＜0.01實(shí)驗(yàn)5白蟻菌圃提取物對角叉菜膠致小鼠足腫脹炎癥組織及血清中PGE2含量的影響。
取2.1.3中致炎后4h的小鼠，拔眼球取血并脫臼處死。自踝關(guān)節(jié)下剪下致炎足，稱重，劃破足跖部皮膚投入有5ml生理鹽水的試管中，浸泡并不停地振搖。2h后棄足，將浸泡液和血于3000rpm離心15min。各取上清液0.15ml，加入0.5mol/L的KOH甲醇2ml。于50℃下溫育。20mim后每管加入2.5ml甲醇。于紫外分光光度計(jì)下測PGE2含量。
表5對角叉菜膠致小鼠足腫脹模型中PGE2的影響

**P＜0.01，與陰性對照組比較(模型組)*P＜0.05，與陰性對照組比較；▲▲P＜0.01，與空白組比較實(shí)驗(yàn)6白蟻菌圃提取物對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響昆明種小鼠80只，按性別體重隨機(jī)分為5組，每組16只，B組(40mg/kg)、C組(23mg/kg)、空白對照組(生理鹽水20ml/kg)、陽性對照組(地塞米松5mg/kg)、正常組(生理鹽水20ml/kg)。各組連續(xù)給藥10天。在末次給藥前，除正常組外，每鼠右足踝關(guān)節(jié)處劃線作標(biāo)記，于毛細(xì)管放大裝置中測足的原始體積。給藥1h后，于每只小鼠右足皮下注射1％角叉菜膠0.05ml。測致炎后30min 1h 2h 4h體積。計(jì)算出各組腫脹度。
表6白蟻菌圃提取物對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響

與陰性對照組比較*為P＜0.05；**為P＜0.01實(shí)驗(yàn)7白蟻菌圃提取物對角叉菜膠致胸膜炎大鼠胸腔滲出液中自三烯LTB4含量的影響雄性SD大鼠50只，按體重隨機(jī)分為5組，給藥同2.1.3。于末次給藥12h后，每只大鼠胸腔注射2％角叉菜膠致炎。致炎10h后，股動(dòng)脈取血留用，并脫臼處死。在橫膈周邊部打開胸腔，吸出滲出液，于4℃下4000rpm離心15min。取上清液留用。按照大鼠白三烯LTB4試劑盒說明書用酶標(biāo)法測白三烯的含量。
表7對胸膜炎大鼠滲出液中白三烯含量的影響

**P＜0.01，與陰性對照組比較(模型組)；*P＜0.05，與陰性對照組比較；▲▲P＜0.01，與空白組比較實(shí)驗(yàn)7白蟻菌圃提取物對胸膜炎大鼠血清中皮質(zhì)醇含量的影響用3.1.2中取出的血液疑固后離心(3000rpm)15min。分離出血清，按照大鼠血漿皮質(zhì)醇試劑盒說明書，酶標(biāo)儀在540nm處測出吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出皮質(zhì)醇的含量表8對胸膜炎大鼠血漿皮質(zhì)醇含量的影響

**P＜0.01，與陰性對照組比較(模型組)；*P＜0.05，與陰性對照組比較；▲▲P＜0.01，與空白組比較
權(quán)利要求
1.一種具有抗炎活性的中藥提取物的制備方法，其特征在于，該中藥提取物是從中藥白蟻菌圃中提取分離有效部位得到。其制備方法如下將粉碎后的白蟻菌圃用原料重量的8～12倍的甲醇或乙醇或重量比為水1～99％、乙醇1～99％的溶劑加熱回流提取3次，每次2～3小時(shí)，合并提取液，室溫下靜置24小時(shí)后過濾，濾液于0.09～0.1Mpa條件下減壓濃縮，濃縮液上大孔樹脂柱層析，先用4～6倍樹脂床體積的水沖洗，再用4～6倍樹脂體積的乙醇梯度洗脫，收集20％以上乙醇濃度的洗脫液，回收乙醇，噴霧或冷凍干燥得到白蟻菌圃提取物干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蟻菌圃提取物的制備方法，其特征在于，所述的白蟻菌圃可以是黑翅土白蟻(Odontotermes formosanus Shiraki)菌圃、黃翅大白蟻(Macrotermesbarneyi Light)菌圃、土垅大白蟻(Macrotermes annandalei Slivestri)菌圃或臺(tái)灣乳白蟻(Coptotermes formosanus Shiraki)黃胸散白蟻(Reticulitermes flaviceps Oshima)菌圃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蟻菌圃提取物的制備方法，其特征在于，所述的樹脂為非極性或弱極性的大孔吸附樹脂，包括型號(hào)為HPD-100、HPD-300、HPD-450、D101、DM-130或AB-8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蟻菌圃提取物的制備方法，其特征在于，所述的白蟻菌圃提取物干粉含30～50％(重量)的總?cè)祁惣捌渌嵝猿煞值扔行镔|(zhì)。
5.一種白蟻菌圃提取物的用途，其特征在于，該提取物可用于制備抗炎藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的白蟻菌圃提取物，其特征在于，該提取物可用于制備預(yù)防和治療肝炎的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的白蟻菌圃提取物，其特征在于，該提取物可用于制備治療關(guān)節(jié)炎的藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的白蟻菌圃提取物，其特征在于，該提取物可用于制備治療腎炎的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的白蟻菌圃提取物，其特征在于，該提取物可用于制備治療支氣管炎的藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的白蟻菌圃提取物，其特征在于，該提取物可用于制備預(yù)防和治療艾滋病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以白蟻菌圃為原料制備含有多種生物活性成分的白蟻菌圃提取物的制備方法及用途。具體步驟是將已粉碎的白蟻菌圃用8～12倍重量比的醇或含水醇溶劑加熱回流得到提取液，將提取液過濾濃縮后通過大孔吸附樹脂，以水和梯度乙醇洗脫，收集乙醇洗脫部分，回收乙醇，濃縮制得的白蟻菌圃提取物。該提取物是由含總?cè)祁惣捌渌嵝猿煞终?0～50％的有效物質(zhì)所構(gòu)成。本發(fā)明制備的提取物可用于制備治療炎癥性疾病的藥物。所說的炎癥可以是肝炎、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、腎炎、胃腸炎以及艾滋病等。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101069698SQ20061007974
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日
發(fā)明者薛德鈞, 李紅勇, 王金平, 徐彭, 曹娟, 張敏, 張會(huì)明, 謝康 申請人:江西中醫(yī)學(xué)院