專利名稱：山羊精液液態(tài)保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山羊精液液態(tài)保存的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
盡管利用山羊凍精進(jìn)行人工授精已經(jīng)成功，但是使用冷凍精液的成本很高。因此，采用鮮精進(jìn)行人工授精可大大提高山羊繁殖率和加快遺傳進(jìn)展。精液一般是用含卵黃或脫脂乳稀釋液稀釋，山羊精子在脫脂乳稀釋液中的受精能力僅能維持大約12-24小時[Leboeuf B，Restall B，Salamon S.Production and storage of goatsemen for artificial insemination.Anim Reprod Sci 2000；62113-141]，因此鮮精人工輸精必須在采精的當(dāng)天進(jìn)行。這在實踐中造成了精液的極大浪費和動物管理的不方便。因此，急切需要對山羊精液進(jìn)行長期液態(tài)保存，這樣就可以在農(nóng)場(村)輸精時有較大的機(jī)動余地。
長期以來一直困擾著山羊精液液態(tài)保存的一個問題是精液中的精漿對保存于含卵黃或脫脂乳稀釋液中的精子存活非常有害。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自于山羊尿道球腺分泌物中的卵黃凝集酶[Roy A，Egg yolk-coagulating enzyme in the semen andCowper’s gland of the goat.Nature 1957；179318-319]，[Cabrera F，Gonzalez F，Batista M et al.The effect of removal of seminal plasma，egg yolk level and season on sperm freezability of canarybuck(Capra hircus).Reprod Domest Anim 2005；40191-195.]和BUSgp60蛋白[Pellicer-RubioMT，MagallonT，Combarnous Y,Deterioration of goat sperm viability in milk extenders is due to abulbourethral 60-kilodalton glycoprotein with triglyceride lipase activity.Biol Reprod 1997；571023-1031]對保存于含卵黃或脫脂乳稀釋液中的精子產(chǎn)生了有害的影響。因此，在利用含卵黃或脫脂乳的稀釋液保存山羊精液的時候，精液稀釋之前需要先離心、洗滌除去大部分精漿。但是，離心、洗滌是一個復(fù)雜而耗時的過程，會對精子造成損害[Harrison RA，White IG，Glycolytic enzymes in the spermatozoa and cytoplasmicdroplets of bull，boar and ram，and their leakage afte shock.J Reprod Fertil 1972；30105-115]，也會丟失一些精子[Corteel JM.Collection，processing and artificial insemination of goat semen.InGall C.(eds)Goat Production.Academic Press，London，1981，pp.171-191]。這樣，化學(xué)成分明確的稀釋液在長期保存山羊精液上就具有了明顯的優(yōu)勢。但是，關(guān)于這方面的研究很少[Leboeuf B，Guillouet P，Batellier Fetal.，Effect of native phosphocaseinate onthe in vitro preservation of fresh semen.Theriogenology 2003；60867-877]。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在不同物種的精液液態(tài)保存過程中，諸如稀釋液組成、稀釋方法[Johnson LA，KFWeitze，P Fiser et al.Storage of boar semen.Anim Reprod Sci 2000；62143-172]、降溫方法[Fernandez-Santos M R，Esteso M C，Soler A J，et al.Effects of egg yolk and cooling rate on thesurvival of refrigerated red deer(Cervus elaphus hispanicus)epididymal spermatozoa.ReprodDomest Anim 2006；41114-118]、保存溫度[LeboeufB，Guillouet P，Batellier F，etc.Effect ofnative phosphocaseinate on the in vitro preservation of fresh semen.Theriogenology 2003；60867-877]、[Zhou J B，Yue K Z，Luo M J，etc.Effect of extenders and temperatures on spermviability and fertilizing capacity of Harbin White boar semen during long-term liquid storage.Asian-Aust J Anim Sci 2004；171501-1508]以及稀釋液的pH值[Maxwell W M，Salamon S.Liquid storage of ram semena review.Reprod Fertil Dev 1993；5613-638]等因素都會對精子的存活產(chǎn)生影響，所以山羊精液液態(tài)保存方案必須進(jìn)一步完善。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是研制用化學(xué)成分明確的稀釋液對山羊精液進(jìn)行長期液態(tài)保存，優(yōu)化稀釋液配方、pH值、精液處理方法及保存溫度，最終研制出山羊精液液態(tài)保存的方法。
我們基于Zorlesco和Androhep稀釋液，研制了一種新的稀釋液(稱為改進(jìn)的Zorlesco/Androhep液，mZA)。mZA維持精子活力的效果好于Zorlesco或Androhep，而且用PVA(聚乙烯醇)代替mZA中的BSA(牛血清白蛋白)(稱mZA為mZAP)并不影響保存效果。試驗還發(fā)現(xiàn)，5℃的保存效果最好，并且隨著保存溫度的升高保存效果顯著下降。山羊精液用不含卵黃或乳汁的稀釋液稀釋后，可以不用離心除去精漿而直接保存，并且稀釋液的pH值顯著影響保存效果。
本方法的關(guān)鍵是用pH6.04的mZAP稀釋液10倍稀釋山羊精液，保存于5℃，精子活力維持30％以上的時間達(dá)9天。用上述條件下保存7天的精液進(jìn)行人工輸精出生了羔羊。


圖1山羊精液液態(tài)保存的程序示意圖1是mZAP溶液配制2是山羊精液采集3是山羊精液質(zhì)量檢測4是山羊精液稀釋5是稀釋的山羊精液質(zhì)量檢測6是稀釋的山羊精液保存7是保存的山羊精液質(zhì)量檢測8是人工授精具體實施方式
1、mZAP溶液配制葡萄糖1.15g、果糖1.45g、檸檬酸鈉1.17g、乙二胺四乙酸0.23g、碳酸氫鈉0.125g、羥乙基哌嗪乙磺酸0.9g、聚乙烯醇0.25g、青霉素5000IU、鏈霉素0.1g溶于100mL蒸餾水中，調(diào)整溶液pH為6.04。
2、山羊精液采集在繁殖季節(jié)，應(yīng)用假陰道法，采集魯北白山羊和波爾山羊的精液。精液保存于30℃水浴的集精杯中。
3、精液質(zhì)量檢測1)檢測采集的精液體積和精子密度。
2)精子活力檢測 在顯微鏡下檢查精子的活力，只有活力超過85％的精子，才能應(yīng)用。
4、精液稀釋精液質(zhì)量檢測后，用30℃的mZAP溶液進(jìn)行稀釋。
5、稀釋的山羊精液質(zhì)量檢測1)精子活力檢測 在顯微鏡下檢查精子的活力，只有活力超過30％的精子，才能應(yīng)用。
2)精子脂膜完整性檢測 將精液置于低滲溶液中，38℃孵育45min，加入2％戊二醛，在顯微鏡下檢測精子的彎尾率。
6、稀釋的山羊精液保存稀釋后的精液置于1.5mL的離心管中(0.5mL/管)降溫，降溫速率為-0.11～-0.17℃/min，降至5℃，保存?zhèn)溆谩?br> 7、保存的山羊精液質(zhì)量檢測1)精子活力檢測 從保存精液的離心管中取出l0μL，置于顯微鏡下檢測精子的活力。只有活力超過30％的精子，才能應(yīng)用。
2)精子脂膜完整性檢測 將保存的精液置于低滲溶液中，38℃孵育45min，加入2％戊二醛，在顯微鏡下檢測精子的彎尾率。
3)精子頂體完整性和獲能檢測 利用金霉素(CTC)/Hoechst33258染色，在顯微鏡下觀察，確定保存的精子頂體完整性和獲能情況。當(dāng)精子頭部未被Hoechst 33258著色時被視作質(zhì)膜完整。質(zhì)膜完整的精子在用CTC染色時分為三種類型F型，整個精子頭部有均一熒光；B型，精子頭部頂體后區(qū)無熒光；AR型，整個精子頭部無熒光或赤道段有非常弱的熒光。其中F型和B型頂體完整，并且B型已獲能。
8、人工授精應(yīng)用保存的精子活力超過30％的精液，對發(fā)情正常的魯北白山羊進(jìn)行人工授精。25d后進(jìn)行妊娠檢查，將妊娠羊隔離飼養(yǎng)直至分娩。
權(quán)利要求
1.一種山羊精液液態(tài)保存方法，其特征在于精液稀釋液各組分及其適宜濃度為葡萄糖1.15g、果糖1.45g、檸檬酸鈉1.17g、乙二胺四乙酸0.23g、碳酸氫鈉0.125g、羥乙基哌嗪乙磺酸0.9g、聚乙烯醇0.25g、青霉素5000IU、鏈霉素0.1g溶于100mL蒸餾水中，調(diào)整稀釋液pH為6.04，山羊精液10倍稀釋，5℃保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種山羊精液液態(tài)保存方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。篩選出了適宜山羊精液液態(tài)保存的稀釋液配方。稀釋液的主要成分為葡萄糖1.15g、果糖1.45g、檸檬酸鈉1.17g、乙二胺四乙酸0.23g、碳酸氫鈉0.125g、羥乙基哌嗪乙磺酸0.9g、聚乙烯醇0.25g、青霉素5000IU、鏈霉素0.1g，溶于100mL蒸餾水中。實驗證明，該稀釋液對山羊精液液態(tài)保存的效果明顯好于以往的稀釋液。應(yīng)用pH6.04的稀釋液10倍稀釋山羊精液，保存于5℃，精子活力維持30％以上的時間達(dá)9d。并在上述條件下，用保存7d的精液進(jìn)行人工輸精出生了羔羊。
文檔編號A61K35/48GK1951185SQ20061007004
公開日2007年4月25日 申請日期2006年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月7日
發(fā)明者譚景河, 許常龍, 周佳勃, 羅明久, 常仲樂, 樊新忠, 趙本田, 蘭國成, 隋宏書 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)