專利名稱：脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及一種脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒的方法，是通過改進(jìn)的脫水-再水化法構(gòu)建脂質(zhì)體并用于包裹弓形蟲pcDNA3-致密顆粒蛋白4(pGRA4)真核表達(dá)質(zhì)粒的生物方法。這種方法能提高弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫保護(hù)效果。
背景技術(shù)：
剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)能侵入所有類型的有核細(xì)胞，適應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)寄生生活，存活于一種被稱為納蟲泡的特化空泡內(nèi)。弓形蟲入侵宿主細(xì)胞后，蟲體內(nèi)眾多的致密顆粒(Dense graunule organelles)被胞吐入納蟲泡，并分泌一類蛋白質(zhì)稱為致密顆粒蛋白(Graunule protein，GRA)。已知至少有7種不同的速殖子致密顆粒蛋白。其中致密顆粒蛋白4(GRA4)能刺激機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫和全身免疫，具有重要的研究意義。
已有的弓形蟲核酸疫苗技術(shù)方法基本為用裸露的質(zhì)粒直接免疫動物。這類技術(shù)方法能在一定程度上提供動物對弓形蟲的免疫保護(hù)。但由于真核表達(dá)質(zhì)粒免疫原性較差，質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞效率較低，誘發(fā)的免疫效果相對較弱。脂質(zhì)體(liposomes)是一種人工制備、類似于生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子層微囊。它能促進(jìn)所包裹的藥物通透上皮組織和內(nèi)皮組織進(jìn)入血液系統(tǒng)并促進(jìn)所包裹的藥物透過細(xì)胞膜進(jìn)入人體組織細(xì)胞內(nèi)。采用脂質(zhì)體技術(shù)能使所輸送藥物的定向釋放、增強(qiáng)藥物的生物利用度、易為機(jī)體細(xì)胞內(nèi)化、減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性、保護(hù)藥物免受腸胃液的降解和變性、使所包裹藥物長效化等?，F(xiàn)已有相當(dāng)數(shù)量的藥物脂質(zhì)體制劑問世，實踐表明脂質(zhì)體在許多疾病尤其是癌癥的治療中顯示了明顯的優(yōu)越性。應(yīng)用脂質(zhì)體對真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行包裹、然后免疫動物，可以保護(hù)質(zhì)粒免受機(jī)體核酸酶的降解，并可促進(jìn)質(zhì)粒的吸收，增強(qiáng)免疫效果。目前尚未開展脂質(zhì)體對弓形蟲真核表達(dá)質(zhì)粒增強(qiáng)免疫保護(hù)作用的系統(tǒng)研究。目前制備脂質(zhì)體的常見方法有經(jīng)典鏡壁法、反向抽提法(去垢劑法)、超聲波法、分子膜過濾法、排擠法、脫水-再水化法及凍融法等。其中脫水-再水化法多應(yīng)用于包裹蛋白或DNA的脂質(zhì)體制備。傳統(tǒng)的脫水-再水化法在冷凍干燥步驟之前加入需包裹的蛋白或DNA，并最終水化形成液態(tài)脂質(zhì)體。但在液態(tài)狀況下脂質(zhì)體常不穩(wěn)定易造成氧化分解，導(dǎo)致包裹物的泄露，產(chǎn)生聚集沉淀等現(xiàn)象。本發(fā)明中采用改進(jìn)的脫水-再水化法制備脂質(zhì)體，即在冷凍干燥過程之前和之后分別加入需包裹的真核表達(dá)質(zhì)粒，可提高對真核表達(dá)質(zhì)粒的包裹率，并且在使用前以凍干方式保存脂質(zhì)體，使用時再水化，可提高構(gòu)建脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，減少構(gòu)建的脂質(zhì)體不穩(wěn)定對包裹造成的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒的方法，是通過改進(jìn)的脫水-再水化法構(gòu)建脂質(zhì)體，對弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒包裹后免疫小鼠，提高小鼠對弓形蟲攻擊的免疫保護(hù)效果。脂質(zhì)體組成成分為磷脂酰膽堿(PC；北京華清美恒公司)，1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨(DOTAP；武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE；上海實生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司)。摩爾比為16∶8∶4。
本發(fā)明的目的是通過以下方案實現(xiàn)(一)構(gòu)建pcDNA3-致密顆粒蛋白4(pGRA4)真核表達(dá)質(zhì)粒從復(fù)蘇的弓形蟲RH株(國際標(biāo)準(zhǔn)株，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所)中提取DNA，并通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法合成GRA4，分別用KpnI和EcoRI(華美生物工程公司)雙酶切經(jīng)凝膠純化的GRA4和pcDNA3載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，經(jīng)T4DNA連接酶(TaKaRa公司)處理后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切證實構(gòu)建的正確性。堿裂解法收集大量質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒DNA。GRA4基因擴(kuò)增引物為5`-CGC GGG TAC CATGCA GGG CAC TTG GTT TTC-3`和5`-CGC GGA ATT GTC ACT CTT TGCGCATTC TTT-3`。
本發(fā)明所用的真核質(zhì)粒表達(dá)載體是采用pcDNA3載體，獲得含有GRA4重組片段的pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒。
(二)通過改進(jìn)的脫水-再水化法構(gòu)建脂質(zhì)體，并包裹弓形蟲pcDNA3-致密顆粒蛋白4(pGRA4)真核表達(dá)質(zhì)粒將磷脂酰膽堿(PC)、1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨(DOTAP)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)按16∶8∶4混合，溶于氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至氯仿完全蒸干后，加入1ml含100mg pGRA4的磷酸鹽緩沖液(PBS)4℃振蕩3h使之完全混溶，冷凍干燥24h后小瓶中可見一塊狀白色多孔固體，使用時再加入1ml含50mg pGRA4的PBS水化，由此完成脂質(zhì)體構(gòu)建及包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒的工作。
本發(fā)明的另一個目的是提供脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒在制備提高動物免疫保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明用脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒對小鼠進(jìn)行免疫，觀察其對小鼠的免疫保護(hù)效果。實驗中使用6-8周齡雌性C57BL/6和BALB/c小鼠(中國科學(xué)院上海實驗動物中心)。將每個品系小鼠各分成四組(1)脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫組(n＝14)；(2)pGRA4免疫組(n＝14)；(3)空質(zhì)粒組(n＝14)；(4)生理鹽水+脂質(zhì)體組(n＝14)。首次免疫后，14天和28天后分別再加強(qiáng)免疫一次。每組取3只小鼠檢測抗體水平、脾細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子的表達(dá)。最后用弓形蟲強(qiáng)毒RH株和弱毒ME49株(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所)分別攻擊感染免疫小鼠，觀察對小鼠的免疫保護(hù)效果。
本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明提供的方法中采用改進(jìn)的脫水-再水化法構(gòu)建脂質(zhì)體，先制成凍干的包裹質(zhì)粒的脂質(zhì)體，使用時再加入含質(zhì)粒的PBS水化，提高了對真核表達(dá)質(zhì)粒的包裹率，并提高構(gòu)建脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。
(2)本發(fā)明方法構(gòu)建的脂質(zhì)體包裹pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后，有效提高了小鼠的細(xì)胞免疫水平，可提供更有效的免疫保護(hù)效果。免疫攻擊試驗證明，無論是用強(qiáng)毒株還是用弱毒株感染小鼠，從小鼠存活數(shù)量、時間以及腦包囊數(shù)等都表明脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫組獲得了更有效的免疫保護(hù)。
(3)本發(fā)明方法設(shè)計合理，操作簡便。


圖1為pGRA4表達(dá)載體構(gòu)建圖。
圖2為pGRA4在細(xì)胞中表達(dá)SDA-PAGE及Western blot分析。
圖3為免疫BALB/c鼠IgG抗體及抗體亞型分析。
圖4為免疫C57BL/6小鼠攻擊感染后生存曲線。
圖5為免疫BALB/c小鼠攻擊感染后的生存曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合具體實施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例1本發(fā)明方法采用DNA抽提試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)分離提取弓形蟲基因組DNA，然后采用PCR擴(kuò)增試劑盒，以基因組DNA為模板，擴(kuò)增弓形蟲GRA4基因。GRA4基因擴(kuò)增引物5`-CGC GGG TAC CAT GCA GGG CACTTG GTT TTC-3`和5`-CGC GGA ATT CTC ACT CTT TGC GCA TTC TTT-3`。GRA4基因PCR反應(yīng)的總體積為25μl，95℃5分鐘預(yù)變性后30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃60秒、55℃45秒、72℃60秒。GRA4基因擴(kuò)增產(chǎn)物約995bp。
GRA4基因序列通過KpnI和EcoRI(華美生物工程公司)酶切位點用連接酶(TaKaRa公司)連接到pcDNA3載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。構(gòu)建成高效表達(dá)GRA4的表達(dá)載體pGRA4參見圖1。圖1中泳道1為真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3，泳道2為構(gòu)建的pGRA4表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)KpnI/EcoRI雙酶切，泳道3為pGRA4表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。
實施例2本發(fā)明方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法和免疫印漬法檢測pGRA4在Cos-7細(xì)胞中的表達(dá)。
SDS-PAGE法用磷酸鈣介導(dǎo)的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化法介導(dǎo)重組質(zhì)粒pGRA4在細(xì)胞中表達(dá)。將重組質(zhì)粒pGRA4約20μg溶于三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(TE；pH 8.0；來源)，使其濃度為40μg/mL。轉(zhuǎn)染前，用胰蛋白酶(華美生物工程公司)消化HeLa細(xì)胞(細(xì)胞來源)，每個50mL培養(yǎng)瓶接種2×106個細(xì)胞，于37℃5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長成單層(一般需36h～48h)后，按如下方法制備磷酸鈣-DNA共沉淀DNA 220μL，2×HBS(280mmol/LNaCl，10mmol/L KCl，1.5mmol/L Na2HPO42H2O，50mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES))250μL，2mmol/L CaCl230μL于Eppendorf離心管中混勻30s，置室溫20min～30min。吸出培養(yǎng)細(xì)胞上層1640培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次。將磷酸鈣-DNA共沉淀物加入Cos-7細(xì)胞，混勻，置室溫15min，再加入5mL(懸液∶培養(yǎng)液＝1∶10)1640培養(yǎng)液(上海水源生物科技有限公司)在37℃，5％CO2條件下轉(zhuǎn)化8h～10h，吸出培養(yǎng)液和沉淀物，用PBS洗3次，加入5mL37℃預(yù)溫的1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，加入基因菌素(G418；200μg/mL；北京經(jīng)科宏達(dá)生物公司)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，選擇單個細(xì)胞集落進(jìn)行亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，再加大G418濃度(一般為篩選的2倍～3倍，400μg/mL～800μg/mL)，將能在高濃度G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并用于表達(dá)。將篩選的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并分別收集培養(yǎng)上清和培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)上清液7500rpm離心10min，棄沉淀物，上清加入飽和硫酸銨，室溫攪拌2h，4℃過夜，于10000rpm離心30min，沉淀加入生理鹽水，透析后，-20℃冰箱保存。培養(yǎng)細(xì)胞用PBS洗滌3次，用200μL PBS懸浮，再加入等體積的1×SDS加樣緩沖液(50mMTris Cl pH 8.0，100mM二硫蘇糖醇(DTT)，2％SDS，0.1％溴酚蘭，10％的甘油)溶解細(xì)胞，在100℃水浴中加熱10min，用Soniprep 150型超聲機(jī)粉碎細(xì)胞，18W～20W功率處理6次，每次20s，間隔20s，然后10000rpm離心10min，上清即為培養(yǎng)細(xì)胞粗提液，吸取上清，于-20℃保存。15％分離膠(1.5mol/LTris pH8.8，10％SDS，10％硫酸胺，30％丙烯酰胺，N，N，N，N′一四甲基乙二胺(TEMED))，5％濃縮膠(1.0mol/L Tris pH6.8，10％SDS，10％過硫酸胺，30％丙烯酸胺，TEMED)，電泳緩沖液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氯酸pH 8.3，0.1％SDS)，應(yīng)用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直電泳。取10μL上述制備的樣品及蛋白分別加等量1×SDS凝膠緩沖液，100℃加熱5min，點樣。電壓分離膠120V，濃縮膠80V。電泳完畢后，進(jìn)行固定、染色和脫色，觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果參見圖2A，圖2A為SDS-PAGE分析，其中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為pGRA4轉(zhuǎn)化的Cos-7細(xì)胞裂解物上清液；泳道2為pGRA4轉(zhuǎn)化的COS-7細(xì)胞裂解物沉淀；泳道3為正常Cos-7細(xì)胞裂解物沉淀；泳道4為正常Cos-7細(xì)胞裂解物上清液。
免疫印漬法細(xì)胞在含有50mM Tris-HCl(pH 7.4)(AMRESCO，上海生物工程有限公司)、1％Nonidet P40(NP40；Sigma)、150mM NaCl(上海生物工程有限公司)和蛋白酶抑制劑(Sigma)的緩沖液中裂解后，取50μg裂解液于12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(上海生物工程有限公司)上電泳，電泳后采用半干轉(zhuǎn)移儀(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜(Millipore公司)上，以兔抗弓形蟲高免血清(本實驗室自制)為初抗，1∶400稀釋；以辣根過氧化酶結(jié)合羊抗兔IgG抗體(Amersham Pharmacia Biotech，HongKong，China)為二抗，1∶4000稀釋，進(jìn)行免疫印漬檢測。結(jié)果參見圖2B，圖2B為免疫印漬分析，其中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為裸露pGRA4，泳道2為脂質(zhì)體包裹pGRA4。
SDA-PAGE分析表明了GRA4基因的高效表達(dá)，分子量在40KD左右；免疫印漬分析同樣證明了轉(zhuǎn)導(dǎo)的GRA4基因的表達(dá)(參見圖2)。結(jié)果表明GRA4基因成功構(gòu)建進(jìn)真核表達(dá)質(zhì)粒并能得到有效表達(dá)。
實施例3本發(fā)明方法采用PicoGreen試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)檢測脂質(zhì)體對質(zhì)粒DNA的包封率，并比較本技術(shù)應(yīng)用的改進(jìn)脫水-再水化法與傳統(tǒng)的脫水-再水化法DNA包封率的差異。
PicoGreen試劑是一種高靈敏度雙鏈DNA熒光顯色染料。該染料與雙鏈DNA結(jié)合形成復(fù)合物，在波長480nm激發(fā)下產(chǎn)生超強(qiáng)熒光信號，可用熒光酶標(biāo)儀在波長520nm處進(jìn)行檢測，在一定的DNA濃度范圍內(nèi)以及在該熒光染料過量的情況下，熒光信號與DNA濃度成正比。本技術(shù)采用PicoGreen試劑盒檢測脂質(zhì)體對質(zhì)粒DNA的包封率。
DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線建立標(biāo)準(zhǔn)DNA用TE緩沖液2倍連續(xù)稀釋，每個稀釋度做3孔，與PicoGreen反應(yīng)液(用TE緩沖液1∶200倍稀釋)等體積混合，室溫避光反應(yīng)5min，用GEMINIXS熒光酶標(biāo)儀(Molecular Devices，USA)測定，以480nm為激發(fā)光波長，以520nm為增強(qiáng)的發(fā)射熒光檢測波長進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)用SOFTmaxPRO軟件(Molecular Devices，USA)進(jìn)行分析，以熒光讀數(shù)平均值(n＝3)對DNA含量作出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y＝1.587X+1.131，相關(guān)系數(shù)為0.99。
樣品中DNA含量測定及包裹率的計算吸取0.5ml含DNA的脂質(zhì)體溶液于1.5ml塑料離心管中，置臺式高速冷凍離心機(jī)18000rpm離心30min，分離上清液及下部脂質(zhì)體沉淀，吸取上清液。原液DNA(總質(zhì)粒DNA)和上清DNA樣品分別與PicoGreen反應(yīng)液等體積混合，平行做3孔。按以上方法進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)用SOFTmaxPRO軟件進(jìn)行分析，在標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中自動求得結(jié)果。

同時，用傳統(tǒng)的脫水-再水化法制備包裹pGRA4的脂質(zhì)體，不同之處是在凍干過程后直接水化，完成脂質(zhì)體的制備后，同樣用PicoGreen試劑盒測定脂質(zhì)體DNA的包封率，比較兩種方法的脂質(zhì)體DNA包封率的差異。為檢測脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，將兩種方法構(gòu)建的脂質(zhì)體分別在4℃下繼續(xù)保存1個月、3個月和6個月，采用PicoGreen試劑盒測定脂質(zhì)體DNA包封率的變化情況。
結(jié)果參見表1，構(gòu)建完成后的檢測結(jié)果表明，兩種構(gòu)建方法DNA包封率差異無顯著性，但隨著時間的延長，傳統(tǒng)脫水-再水化方法構(gòu)建的脂質(zhì)體包封率呈下降趨勢，6個月后脂質(zhì)體DNA包封率下降到67.4±5.2；而改進(jìn)脫水-再水化方法構(gòu)建的脂質(zhì)體包封率變化不大，兩者差異顯著(P＜0.05)。說明本技術(shù)構(gòu)建的脂質(zhì)體有效地延長了脂質(zhì)體的保存時間，可提高對真核表達(dá)質(zhì)粒的包裹率，減少構(gòu)建的脂質(zhì)體不穩(wěn)定對包裹造成的影響。
表1不同脂質(zhì)體構(gòu)建方法DNA包封率的檢測結(jié)果

結(jié)果表明，采用的改進(jìn)脫水-再水化方法可提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性。
實施例4本發(fā)明方法采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測免疫BALB/c小鼠IgG水平。
免疫接種之前，為了提高小鼠對真核表達(dá)質(zhì)粒的吸收，每只BALB/c小鼠后脛骨處注射100μl 10mM心臟毒素(cardiotoxin；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，5天后，開始免疫小鼠。實驗共分為四個組(1)脂質(zhì)體組注射50μg脂質(zhì)體包裹的pGRA4(n＝14)；(2)裸露質(zhì)粒組注射50μg裸露的pGRA4(n＝14)；(3)空質(zhì)粒組注射50μg空載體pcDNA3(n＝11)；(4)對照組脂質(zhì)體+PBS(n＝11)。2周后加強(qiáng)免疫一次，4周后再加強(qiáng)免疫一次。末次免疫2周后，小鼠尾靜脈收集血清，用GRA4重組抗原包被96孔酶標(biāo)板(Nunc，Roskilde，Denmark)，待測血清作1∶50、1∶100、1∶200等對倍稀釋。用正常鼠血清做陰性對照。HRP-羊抗鼠IgG(BD PharMingen，San Diego，CA)1∶4000稀釋，加底物液及顯色液顯色10min后終止反應(yīng)，置BIO-RAD550酶標(biāo)儀于450nm波長讀取A值。抗體亞型IgG1，IgG2a同以上方法測定。
結(jié)果參見圖3，脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫組和裸露pGRA4免疫組的IgG抗體水平較對照組明顯明顯升高(P＜0.05)?？贵w亞型分析顯示，IgG2a明顯大于IgG1，說明脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫和裸露pGRA4免疫小鼠均引起Th1類型的免疫反應(yīng)。
實施例5本發(fā)明方法采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測免疫C57BL/6小鼠IL-4，IL-2和IFN-γ水平。
免疫C57BL/6小鼠方法同實施例3，于末次免疫后第3周，每組各取3只小鼠，無菌取脾，分離脾細(xì)胞，RPMI-1640培養(yǎng)液(Life Technologies，Rockville，MD)中調(diào)節(jié)終濃度為5×106cells/ml，每份細(xì)胞懸液分4孔加入96孔培養(yǎng)板中，對照孔不加刀豆素A(ConA；北京世紀(jì)中葳科技發(fā)展有限公司)，實驗孔各加5μg/ml ConA體外刺激，平行兩孔，每孔細(xì)胞數(shù)3×105個，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。取脾細(xì)胞ConA刺激培養(yǎng)的上清液，用ELISA檢測試劑盒(Endogen，Pierce Biotechnology，Rockford，USA)檢測IL-4，IL-2和IFN-γ水平。
結(jié)果參見表2，脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫C57BL/6小鼠的IFN-γ水平為1851±84pg/ml，IL-2168±10pg/ml，均高于裸露pGRA4免疫組的IFN-γ1204±60pg/ml和IL-2125±23pg/ml(P＜0.01)；各組均未檢測到IL-4的表達(dá)，而IL-2和IFN-γ表達(dá)升高，這表明脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫和裸露pGRA4免疫小鼠均引起Th1類型的免疫反應(yīng)。
結(jié)果表明，脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫C57BL/6小鼠能產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫水平。
表2.免疫C57BL/6小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子測定結(jié)果

*為具有顯著性差異(P＜0.05)。
實施例6本發(fā)明方法采用弓形蟲弱毒ME49株攻擊免疫C57BL/6小鼠，實驗證實脂質(zhì)體包裹的pGRA4免疫的C57BL/6小鼠能獲得更高的保護(hù)率，并能顯著減少腦內(nèi)包囊數(shù)目。
免疫C57BL/6小鼠的方法同實施例3。免疫結(jié)束后2周，尾靜脈采血(免疫之前采的血作為陰性對照)；并口服感染80個ME49株組織包囊。每天檢查死亡率。一個月后，處死存活小鼠，取腦計算組織包囊數(shù)。
結(jié)果表明，脂質(zhì)體pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒組小鼠獲得更高的保護(hù)率，且存活鼠腦組織包囊數(shù)目顯著減少(參見表3)。
表3免疫C57BL/6小鼠腦內(nèi)包囊數(shù)目

*為具有顯著性差異(P＜0.01)。
免疫C57BL/6小鼠攻擊感染后生存曲線參見圖4，在四組實驗動物中，空質(zhì)粒組和對照組全部死亡，裸露質(zhì)粒組存活率為54.5％(n＝11)脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒組存活率為72.7％(n＝11)。
結(jié)果表明脂質(zhì)體包裹真核表達(dá)質(zhì)粒能更提供更有效的免疫保護(hù)。
實施例7本發(fā)明方法采用弓形蟲強(qiáng)毒RH株攻擊免疫BALB/c小鼠，實驗證實脂質(zhì)體包裹的pGRA4免疫的BALB/c小鼠死亡時間明顯延長。
免疫BALB/c小鼠的方法參照實施例3。免疫結(jié)束后4周，弓形蟲RH株速殖子103個腹腔注射攻擊感染免疫BALB/c小鼠。每天檢查死亡率。
結(jié)果表明，脂質(zhì)體pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒組小鼠能有效延長死亡時間。
免疫BALB/c小鼠攻擊感染后的生存曲線參見圖5，在四組實驗動物中，空質(zhì)粒組和對照組在第8天全部死亡，裸露質(zhì)粒組在第10天全部死亡，脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒組在第12天全部死亡。
結(jié)果表明，脂質(zhì)體pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒組小鼠能有效延長死亡時間。
實例總結(jié)(1)本技術(shù)有效地構(gòu)建了能表達(dá)GRA4基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pGRA4，通過KpnI和EcoRI兩個酶切位點將GRA4片段克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3上，構(gòu)建成高效表達(dá)GRA4的表達(dá)載體pGRA4。SDS-PAGE和免疫印漬實驗證明了pGRA4的高效表達(dá)。
(2)本技術(shù)采用改進(jìn)的脫水-再水化法構(gòu)建脂質(zhì)體，先制成凍干的包裹真核表達(dá)質(zhì)粒，使用前再加入含真核表達(dá)質(zhì)粒的PBS，保證了對真核表達(dá)質(zhì)粒pGRA4的包裹，提高了構(gòu)建脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。
(3)抗體分析結(jié)果顯示，脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫組和裸露pGRA4免疫組的IgG抗體水平較對照組明顯明顯升高(P＜0.05)?？贵w亞型分析顯示，IgG2a明顯大于IgG1，說明脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫和裸露pGRA4免疫小鼠均引起Th1類型的免疫反應(yīng)。
(4)因子檢測結(jié)果表明，脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫C57BL/6小鼠的IFN-γ水平和IL-2水平均明顯高于裸露pGRA4免疫組(P＜0.01)；各組均未檢測到IL-4的表達(dá)，這表明脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫和裸露pGRA4免疫小鼠均引起Th1類型的免疫反應(yīng)，而且脂質(zhì)體包裹pGRA4免疫C57BL/6小鼠能產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫水平。
(5)用弓形蟲弱毒ME49株攻擊免疫C57BL/6小鼠，結(jié)果表明，脂質(zhì)體包裹pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒免疫組小鼠獲得更高的保護(hù)率，且存活鼠腦組織包囊數(shù)目顯著減少。
(6)用弓形蟲強(qiáng)毒RH株攻擊免疫BALB/c小鼠，結(jié)果表明，脂質(zhì)體包裹pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒免疫組小鼠能有效延長死亡時間。
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒的方法，通過以下方案實現(xiàn)(一)構(gòu)建pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達(dá)質(zhì)粒從復(fù)蘇的弓形蟲RH株中提取DNA，并通過聚合酶鏈反應(yīng)方法合成致密顆粒蛋白4基因片段后，分別用華美生物工程公司的KpnI和EcoRI雙酶切經(jīng)凝膠純化的致密顆粒蛋白4基因片段和pcDNA3載體，經(jīng)T4DNA連接酶處理后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株，挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，堿裂解法收集大量pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達(dá)質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達(dá)質(zhì)粒DNA；致密顆粒蛋白4基因擴(kuò)增引物5`-CGC GGG TAC CAT GCA GGG CAC TTG GTT TTC-3`和5`-CGC GGA ATTCTC ACT CTT TGC GCA TTC TTT-3`，(二)通過改進(jìn)的脫水-再水化法構(gòu)建脂質(zhì)體，并包裹弓形蟲pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達(dá)質(zhì)粒將磷脂酰膽堿、1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨、二油酰磷脂酰乙醇胺按16∶8∶4混合，溶于氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至氯仿完全蒸干后，加入1ml含100mgpcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達(dá)質(zhì)粒的磷酸鹽緩沖液，4℃振蕩3小時使之完全混溶，冷凍干燥24小時后可見一塊狀白色多孔固體，使用時再加入1ml含50mg pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達(dá)質(zhì)粒的磷酸鹽緩沖液水化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒的方法，其特征是所用的真核質(zhì)粒表達(dá)載體是采用pcDNA3載體，獲得含有致密顆粒蛋白4基因重組片段的pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達(dá)質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒在制備提高動物免疫保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒的方法，采用改進(jìn)的脫水－再水化法制備脂質(zhì)體，即在冷凍干燥過程之前和之后分別加入需包裹的真核表達(dá)質(zhì)粒，可提高對真核表達(dá)質(zhì)粒的包裹率，并且在使用前以凍干方式保存脂質(zhì)體，使用時再水化，可提高構(gòu)建脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，減少構(gòu)建的脂質(zhì)體不穩(wěn)定對包裹造成的影響。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達(dá)質(zhì)粒，有效的提高了小鼠的細(xì)胞免疫水平，可在制備提高動物免疫保護(hù)藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61K48/00GK1884557SQ20061005215
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月27日
發(fā)明者陳睿, 王金福 申請人:浙江大學(xué)