專(zhuān)利名稱(chēng)：表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物載藥膠團(tuán)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬聚合物膠團(tuán)的表面修飾，涉及雙功能性有機(jī)小分子對(duì)疏水改性殼寡糖聚合物膠團(tuán)的表面修飾，以及通過(guò)對(duì)聚合物膠團(tuán)的表面修飾程度的控制，達(dá)到聚合物載藥膠團(tuán)的緩控釋性能。
背景技術(shù)：
聚合物膠團(tuán)(polymeric micelles，PMs)是近幾年正在發(fā)展的一類(lèi)新型的納米載體，具有增溶、靶向、低毒和長(zhǎng)循環(huán)的優(yōu)點(diǎn)。它是由兩親性的聚合物在水性環(huán)境中自發(fā)形成，具有獨(dú)特的核—膜(殼)結(jié)構(gòu)。其內(nèi)部的核可為難溶性藥物、多肽和蛋白類(lèi)藥物及基因提供儲(chǔ)庫(kù)，親水性外膜則可進(jìn)行理化性質(zhì)修飾，達(dá)到體內(nèi)靶向分布、逃避單核巨噬細(xì)胞的吞噬、提高生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)等作用。聚合物膠團(tuán)自身可通過(guò)“增強(qiáng)的透過(guò)及滯留效應(yīng)”(enhanced permeability andretention effect)聚集到腫瘤組織。
聚合物膠團(tuán)是當(dāng)兩親性的聚合物在溶液中的濃度高于其臨界聚集濃度時(shí)，所自發(fā)形成的具有動(dòng)態(tài)平衡特征的納米膠團(tuán)。在體研究發(fā)現(xiàn)，聚合物給藥膠團(tuán)經(jīng)體液稀釋后，存在著穩(wěn)定性的問(wèn)題；而提高聚合物的濃度，會(huì)導(dǎo)致載體自身的高毒性。同時(shí)聚合物膠團(tuán)是通過(guò)兩親性聚合物的疏水性鏈段間的疏水性相互作用力所形成的，聚合物膠團(tuán)對(duì)親脂性藥物的增溶也是由于藥物與兩親性聚合物的疏水性鏈段間的疏水性相互作用力的結(jié)果，疏水性相互作用力屬于一種物理力(范德華力)，因此聚合物載藥膠團(tuán)的藥物釋放普遍存在著突釋和藥物釋放快速的問(wèn)題。雖然聚合物膠團(tuán)能夠具有靶向和長(zhǎng)循環(huán)的功能，但它的突釋和藥物快速釋放特征，大大減低了聚合物膠團(tuán)中藥物對(duì)組織、細(xì)胞及細(xì)胞器的靶向。因此聚合物載藥膠團(tuán)的臨床應(yīng)用仍為空白。
殼聚糖是一類(lèi)由氨基葡萄糖組成的陽(yáng)離子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性。殼聚糖被廣泛應(yīng)用于藥物輔料、止血材料、組織工程支架等。大分子量殼聚糖在生理pH條件下(7.2-7.4)不溶于水，而通過(guò)酶降解的低分子量殼聚糖(殼寡糖，Chitosan oligosaccharide，CSO)具有良好的水溶性，殼寡糖經(jīng)長(zhǎng)鏈脂肪酸嫁接改性后，可自發(fā)在水溶液中形成5～1000nm的聚合物膠團(tuán)，并具有細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)功能。該聚合物膠團(tuán)已應(yīng)用于親脂性和蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子藥物的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物載藥膠團(tuán)，膠團(tuán)的組成為平均分子量1.5kD～51kD的殼聚糖與C10～C22的脂肪酸嫁接得到，嫁接物中殼聚糖的氨基取代度為1％～50％，臨界膠團(tuán)濃度為0.01～0.1mg/ml。本發(fā)明在疏水改性殼寡糖聚合物膠團(tuán)的基礎(chǔ)上，以雙功能性有機(jī)小分子對(duì)聚合物表面殼寡糖分子上的氨基或羥基進(jìn)行表面化學(xué)修飾，通過(guò)對(duì)聚合物膠團(tuán)表面分子間的化學(xué)鍵架橋，改善聚合物膠團(tuán)經(jīng)稀釋后的不穩(wěn)定性；同時(shí)通過(guò)對(duì)聚合物膠團(tuán)表面分子間的化學(xué)鍵架橋，改變聚合物膠團(tuán)表面原有的松散結(jié)構(gòu)，形成較為致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，來(lái)減少聚合物膠團(tuán)特有的藥物突釋?zhuān)⑦_(dá)到對(duì)藥物的緩控釋目的。作為表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的藥物為親脂性藥物，如紫杉醇等。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的制備方法，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)(1)殼寡糖制備取市售分子量為450kDa的高分子量的殼聚糖(90～95％脫乙酰度)，在55～60℃和pH5.0條件下攪拌溶解，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶降解，過(guò)濾除去雜質(zhì)。按照使用要求，分別從1kDa、10kDa、50kDa、100kDa、200kDa的超濾膜中，選擇合適的超濾分子量膜超濾分級(jí)，超濾液冷凍干燥，得分子量小于200kDa(優(yōu)選殼寡糖為1～50kDa)、脫乙酰度大于80％的低分子量殼寡糖，凝膠滲透色譜法測(cè)定分子量。
(2)疏水改性殼寡糖制備取上述殼寡糖水溶液，按照殼寡糖、脂肪酸、交聯(lián)偶合劑碳二亞胺摩爾比1∶1～50∶1～50，控制50℃～90℃，反應(yīng)5～48小時(shí)。終反應(yīng)液透析純化，冷凍干燥得到疏水改性殼寡糖；脂肪酸選自、癸酸豆蔻酸、軟脂酸、油酸、硬脂酸、山萮酸等中任一種。
(3)載親脂性藥物疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的制備取疏水改性殼寡糖，加入蒸餾水適量，水浴超聲分散，得膠團(tuán)溶液，取膠團(tuán)溶液，加入親脂性藥物或其溶液，探頭超聲，得疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)。
(4)載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液，加入定量(控制疏水改性殼寡糖與雙功能性有機(jī)小分子的摩爾比1∶1～100)雙功能性有機(jī)小分子，溶液常溫下磁力攪拌一定時(shí)間，得表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)。
所述的雙功能性有機(jī)小分子包括可與殼寡糖上的氨基進(jìn)行反應(yīng)的雙功能有機(jī)小分子表面修飾劑戊二醛、京尼平、二元脂肪酸、乙二醇縮水甘油醚等；以及可與殼寡糖上的羥基進(jìn)行反應(yīng)的雙功能有機(jī)小分子表面修飾劑異佛爾酮-二異氰酸酯。
所述戊二醛的結(jié)構(gòu)式為 所述京尼平的結(jié)構(gòu)式為 所述乙二醇縮水甘油醚的結(jié)構(gòu)式為 所述二元脂肪酸如月桂二酸的結(jié)構(gòu)式為 所述異佛爾酮-二異氰酸酯的結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明所用表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的材料為專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00510050798.1和200610050516.2中所公開(kāi)的膠團(tuán)材料。膠團(tuán)的組成為平均分子量1.5kD～51kD的殼聚糖與C10～C22的脂肪酸嫁接得到，嫁接物中殼聚糖的氨基取代度為1％～50％，臨界膠團(tuán)濃度為0.01～0.1mg/ml。通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)(1)殼寡糖制備取市售分子量為450kDa的高分子量的殼聚糖(90～95％脫乙酰度)，在55～60℃和pH5.0條件下攪拌溶解，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶降解，過(guò)濾除去雜質(zhì)。按照使用要求，分別從分子量1kDa、10kDa、50kDa、100kDa、200kDa的超濾膜中，選擇合適的超濾膜超濾分級(jí)，超濾液冷凍干燥，得分子量小于200kDa(優(yōu)選殼寡糖為1～50kDa)、脫乙酰度大于80％的低分子量殼寡糖，凝膠滲透色譜法測(cè)定分子量。
(2)疏水改性殼寡糖制備取上述殼寡糖水溶液，按照殼寡糖、脂肪酸、交聯(lián)偶合劑碳二亞胺摩爾比1∶1～50∶1～50，控制50℃～90℃，反應(yīng)5～48小時(shí)。終反應(yīng)液透析純化，冷凍干燥得到疏水改性殼寡糖；脂肪酸選自、癸酸豆蔻酸、軟脂酸、油酸、硬脂酸、山萮酸等中任一種。
(3)載親脂性藥物疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的制備取疏水改性殼寡糖，加入蒸餾水適量，水浴超聲分散，得膠團(tuán)溶液。
本發(fā)明的有益之處是(1)提供的功能性有機(jī)小分子修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)，是一種具有優(yōu)良細(xì)胞器靶向的納米載體，可應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域與制藥領(lǐng)域。利用這種載體，可用于藥物的靶向治療，提高藥物的療效。
(2)本發(fā)明中，采用的膠團(tuán)表面修飾技術(shù)，通過(guò)對(duì)聚合物膠團(tuán)表面分子間的化學(xué)鍵架橋，改善聚合物膠團(tuán)經(jīng)稀釋后的不穩(wěn)定性；同時(shí)通過(guò)對(duì)聚合物膠團(tuán)表面分子間的化學(xué)鍵架橋，改變聚合物膠團(tuán)表面原有的松散結(jié)構(gòu)，形成較為致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可減少聚合物膠團(tuán)特有的藥物突釋?zhuān)⑦_(dá)到緩控釋目的。
(3)本發(fā)明提供的雙功能性有機(jī)小分子修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的制備方法，方法簡(jiǎn)單。所選取的主要原材料為殼寡糖，源于自然界甲殼類(lèi)動(dòng)物，具有低毒、可生物降解的特性。


圖1為不同表面修飾程度的載紫杉醇疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的體外釋放曲線(xiàn)。
圖2為不同表面修飾程度的載紫杉醇疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的體外釋放曲線(xiàn)。
圖3為不同表面修飾程度的載紫杉醇疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的體外釋放曲線(xiàn)。
圖4為不同表面修飾程度的載紫杉醇疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的體外釋放曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一1、殼寡糖的制備殼聚糖(平均分子量450kDa)6g加至200mL 1.25％(v/v)的鹽酸水溶液中，55～60℃條件下攪拌溶解，用稀氨水或稀鹽酸調(diào)pH至5.0，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，控制反應(yīng)時(shí)間8小時(shí)后，將反應(yīng)產(chǎn)物4000r×min-1離心10分鐘，上清液用0.45μm微孔濾膜預(yù)處理，以不同分子量的超濾膜超濾分級(jí)，超濾液冷凍干燥，得到一定分子量的殼寡糖。并由凝膠滲透色譜法測(cè)定平均分子量為50.6kDa。
2、疏水改性殼寡糖的制備取上述殼寡糖5.0g，精密稱(chēng)定。加40ml雙蒸水?dāng)嚢枞芙夂螅尤胩级啺?0mg，攪拌溶解。將0.35g的硬脂酸，加至10ml甲醇溶液中，超聲溶解后，加至上述殼寡糖溶液中，在400r·min-1磁力攪拌條件下，控制溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h以上。終反應(yīng)液置透析袋，雙蒸水透析24h，除去反應(yīng)副產(chǎn)物。透析液冷凍干燥制備得到疏水改性殼寡糖。
疏水改性后殼寡糖的氨基取代度，采用三硝基苯磺酸法測(cè)定。取不同量的殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱(chēng)定，分別溶于2ml的重蒸水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取上述的殼寡糖4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其取代度為5％。
3、疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)制備取疏水改性殼寡糖10mg，精密稱(chēng)定。加適量雙蒸水水浴超聲10min分散，定容至100ml，得疏水改性殼寡糖膠團(tuán)溶液。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的平均粒徑為74.6nm；表面電位為53.2±0.1mV。
取膠團(tuán)溶液5ml，加入定量體積的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液(濃度1mg/ml)。減壓抽濾除去甲醇后，在冰浴條件下探頭超聲50次(400W，工作2s，停3s)，得載藥膠團(tuán)。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為175.1nm；表面電位為58.7±0.1mV。藥物的包封率為94.82％。
4.載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液5ml，加入定量的戊二醛，使聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶10和1∶20，在常溫下磁力攪拌4小時(shí)，對(duì)載藥膠團(tuán)進(jìn)行表面修飾。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。使用聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶10的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為131.6nm；表面電位為55.6±0.1mV；藥物的包封率為97.49％。使用聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶20的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為112.6nm表面電位為44.6±0.1mV；藥物的包封率為97.27％。
5.載藥膠團(tuán)的體外釋放取載藥膠團(tuán)或表面修飾載藥膠團(tuán)溶液2ml，密閉于透析袋(分子量7000)中，置于30ml的2M水楊酸鈉PBS(7.4)釋放介質(zhì)中進(jìn)行體外釋放，定時(shí)取樣，樣品過(guò)0.22μm微孔濾膜，HPLC測(cè)定濾液藥物濃度(色譜柱C18柱，流動(dòng)相乙腈∶水＝50∶50，檢測(cè)波長(zhǎng)227nm，進(jìn)樣量20μl，流速1ml/min。)。取樣后補(bǔ)加或更換釋放介質(zhì)，維持釋放介質(zhì)體積恒定。其結(jié)果參見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，隨著聚合物膠團(tuán)的表面修飾程度的增加，藥物的釋放速率明顯減緩。
實(shí)施例二1、殼寡糖的制備殼聚糖(平均分子量450kDa)6g加至200mL 1.25％(v/v)的鹽酸水溶液中，55～60℃條件下攪拌溶解，用稀氨水或稀鹽酸調(diào)pH至5.0，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，控制反應(yīng)時(shí)間8小時(shí)后，將反應(yīng)產(chǎn)物4000r×min-1離心10分鐘，上清液用0.45μm微孔濾膜預(yù)處理，以不同分子量的超濾膜超濾分級(jí)，超濾液冷凍干燥，得到一定分子量的殼寡糖。并由凝膠滲透色譜法測(cè)定平均分子量為50.6kDa。
2、疏水改性殼寡糖的制備取上述殼寡糖5.0g，精密稱(chēng)定。加40ml雙蒸水?dāng)嚢枞芙夂?，加入碳二亞?20mg，攪拌溶解。將1.4g的硬脂酸，加至10ml甲醇溶液中，超聲溶解后，加至上述殼寡糖溶液中，在400r·min-1磁力攪拌條件下，控制溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h以上。終反應(yīng)液置透析袋，雙蒸水透析24h，除去反應(yīng)副產(chǎn)物。透析液冷凍干燥制備得到疏水改性殼寡糖。
疏水改性后殼寡糖的氨基取代度，采用三硝基苯磺酸法測(cè)定。取不同量的殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱(chēng)定，分別溶于2ml的重蒸水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取上述的殼寡糖4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其取代度為12％。
3、疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)制備取疏水改性殼寡糖10mg，精密稱(chēng)定。加適量雙蒸水水浴超聲10min分散，定容至100ml，得疏水改性殼寡糖膠團(tuán)溶液。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的平均粒徑為67.7nm；表面電位為52.1±0.1mV。
取膠團(tuán)溶液5ml，加入定量體積的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液(濃度1mg/ml)。減壓抽濾除去甲醇后，在冰浴條件下探頭超聲50次(400W，工作2s，停3s)，得載藥膠團(tuán)。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為117.8nm；表面電位為56.8±0.1mV。藥物的包封率為97.11％。
4.載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液5ml，中加入定量的戊二醛，使聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶10和1∶20，在常溫下磁力攪拌4小時(shí)，對(duì)載藥膠團(tuán)進(jìn)行表面修飾。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。使用聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶10的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為126.5nm；表面電位為56.8±0.1mV；藥物的包封率為96.8％。使用聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶20的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為77.7nm；表面電位為46.7±0.1mV；藥物的包封率為97％。
5.載藥膠團(tuán)的體外釋放取載藥膠團(tuán)或表面修飾載藥膠團(tuán)溶液2ml，密閉于透析袋(分子量7000)中，置于30ml的2M水楊酸鈉PBS(7.4)釋放介質(zhì)中進(jìn)行體外釋放，定時(shí)取樣，樣品過(guò)0.22μm微孔濾膜，HPLC測(cè)定濾液藥物濃度。取樣后補(bǔ)加或更換釋放介質(zhì)，維持釋放介質(zhì)體積恒定。其結(jié)果參見(jiàn)圖2。結(jié)果同樣顯示，隨著聚合物膠團(tuán)的表面修飾程度的增加，藥物的釋放速率明顯減緩。
實(shí)施例三1、殼寡糖的制備殼聚糖(平均分子量450kDa)6g加至200mL 1.25％(v/v)的鹽酸水溶液中，55～60℃條件下攪拌溶解，用稀氨水或稀鹽酸調(diào)pH至5.0，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，控制反應(yīng)時(shí)間8小時(shí)后，將反應(yīng)產(chǎn)物4000r×min-1離心10分鐘，上清液用0.45μm微孔濾膜預(yù)處理，以不同分子量的超濾膜超濾分級(jí)，超濾液冷凍干燥，得到一定分子量的殼寡糖。并由凝膠滲透色譜法測(cè)定平均分子量為50.6kDa。
2、疏水改性殼寡糖的制備取上述殼寡糖5.0g，精密稱(chēng)定。加40ml雙蒸水?dāng)嚢枞芙夂?，加入碳二亞?00mg，攪拌溶解。將3.5g的硬脂酸，加至10ml甲醇溶液中，超聲溶解后，加至上述殼寡糖溶液中，在400r·min-1磁力攪拌條件下，控制溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h以上。終反應(yīng)液置透析袋，雙蒸水透析24h，除去反應(yīng)副產(chǎn)物。透析液冷凍干燥制備得到疏水改性殼寡糖。
疏水改性后殼寡糖的氨基取代度，采用三硝基苯磺酸法測(cè)定。取不同量的殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱(chēng)定，分別溶于2ml的重蒸水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取上述的殼寡糖4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其取代度為40％。
3、疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)制備取疏水改性殼寡糖10mg，精密稱(chēng)定。加適量雙蒸水水浴超聲10min分散，定容至100ml，得疏水改性殼寡糖膠團(tuán)溶液。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的平均粒徑為31.4nm；表面電位為39.0±0.1mV。
取膠團(tuán)溶液5ml，加入定量體積的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液(濃度1mg/ml)。減壓抽濾除去甲醇后，在冰浴條件下探頭超聲50次(400W，工作2s，停3s)，得載藥膠團(tuán)。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為57.3nm；表面電位為53.2±0.1mV。藥物的包封率為97.04％。4.載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液5ml，中加入定量的戊二醛，使聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶1和1∶100，在常溫下磁力攪拌4小時(shí)，對(duì)載藥膠團(tuán)進(jìn)行表面修飾。不同的固化比例對(duì)所形成的固化載藥膠團(tuán)的粒徑、電位和藥物包封率的影響見(jiàn)表1。
表1.固化比例對(duì)固化載藥膠團(tuán)的粒徑、電位和藥物包封率的影響

Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。使用聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶1的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為35.7nm；表面電位為38.0±0.1mV。藥物的包封率為97.83％。使用聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶10的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為67.2nm；表面電位為49.8±0.1mV；藥物的包封率為98.77％。使用聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶20的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為35.8nm；表面電位為44.0±0.1mV；藥物的包封率為99.14％。使用聚合物與戊二醛的摩爾比為1∶100的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為27.5nm；表面電位為18.0±0.1mV；藥物的包封率為99.36％。
5.載藥膠團(tuán)的體外釋放取載藥膠團(tuán)或表面修飾載藥膠團(tuán)溶液2ml，密閉于透析袋(分子量7000)中，置于30ml的2M水楊酸鈉PBS(7.4)釋放介質(zhì)中進(jìn)行體外釋放，定時(shí)取樣，樣品過(guò)0.22μm微孔濾膜，HPLC測(cè)定濾液藥物濃度。取樣后補(bǔ)加或更換釋放介質(zhì)，維持釋放介質(zhì)體積恒定。其結(jié)果參見(jiàn)圖3。結(jié)果同樣顯示，隨著聚合物膠團(tuán)的表面修飾程度的增加，藥物的釋放速率明顯減緩。
實(shí)施例四1、殼寡糖的制備殼聚糖(平均分子量450kDa)6g加至200mL 1.25％(v/v)的鹽酸水溶液中，55～60℃條件下攪拌溶解，用稀氨水或稀鹽酸調(diào)pH至5.0，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纖維素酶，控制反應(yīng)時(shí)間8小時(shí)后，將反應(yīng)產(chǎn)物4000r×min-1離心10分鐘，上清液用0.45μm微孔濾膜預(yù)處理，以不同分子量的超濾膜超濾分級(jí)，超濾液冷凍干燥，得到一定分子量的殼寡糖。并由凝膠滲透色譜法測(cè)定平均分子量為50.6kDa。
2、疏水改性殼寡糖的制備取上述殼寡糖5.0g，精密稱(chēng)定。加40ml雙蒸水?dāng)嚢枞芙夂螅尤胩级啺?00mg，攪拌溶解。將3.5g的硬脂酸，加至10ml甲醇溶液中，超聲溶解后，加至上述殼寡糖溶液中，在400r·min-1磁力攪拌條件下，控制溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間24h以上。終反應(yīng)液置透析袋，雙蒸水透析24h，除去反應(yīng)副產(chǎn)物。透析液冷凍干燥制備得到疏水改性殼寡糖。
疏水改性后殼寡糖的氨基取代度，采用三硝基苯磺酸法測(cè)定。取不同量的殼寡糖(0.5～9mg)，精密稱(chēng)定，分別溶于2ml的重蒸水中，加入4％(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，在344nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取上述的殼寡糖4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測(cè)定344nm波長(zhǎng)處的吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其取代度為40％。
3、疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)制備取疏水改性殼寡糖10mg，精密稱(chēng)定。加適量雙蒸水水浴超聲10min分散，定容至100ml，得疏水改性殼寡糖膠團(tuán)溶液。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的平均粒徑為31.4nm；表面電位為39.0±0.1mV。
取膠團(tuán)溶液5ml，加入定量體積的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)甲醇溶液(濃度1mg/ml)。減壓抽濾除去甲醇后，在冰浴條件下探頭超聲50次(400W，工作2s，停3s)，得載藥膠團(tuán)。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為57.3nm；表面電位為53.2±0.1mV。藥物的包封率為97.04％。
4.載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液5ml，中加入定量的異佛爾酮-二異氰酸酯，使聚合物與異佛爾酮-二異氰酸酯的摩爾比為1∶10和1∶20，在常溫下磁力攪拌4小時(shí)，對(duì)載藥膠團(tuán)進(jìn)行表面修飾。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。使用聚合物與異佛爾酮-二異氰酸酯的摩爾比為1∶10的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為53.4nm；表面電位為34.7±0.1mV；藥物的包封率為96.75％。使用聚合物與異佛爾酮-二異氰酸酯的摩爾比為1∶20的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為43.1nm；表面電位為35.2±0.1mV；藥物的包封率為98.34％。
5.載藥膠團(tuán)的體外釋放取載藥膠團(tuán)或表面修飾載藥膠團(tuán)溶液2ml，密閉于透析袋(分子量7000)中，置于30ml的2M水楊酸鈉PBS(7.4)釋放介質(zhì)中進(jìn)行體外釋放，定時(shí)取樣，樣品過(guò)0.22μm微孔濾膜，HPLC測(cè)定濾液藥物濃度。取樣后補(bǔ)加或更換釋放介質(zhì)，維持釋放介質(zhì)體積恒定。其結(jié)果參見(jiàn)圖4。結(jié)果同樣顯示，隨著聚合物膠團(tuán)的表面修飾程度的增加，藥物的釋放速率明顯減緩。
實(shí)施例五1、殼寡糖、疏水改性殼寡糖、疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)制備與實(shí)施例一～四相同。
2、載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液5ml，中加入1ml的京尼平乙醇溶液，使聚合物與京尼平的摩爾比為1∶20，在常溫下磁力攪拌4小時(shí)，對(duì)載藥膠團(tuán)進(jìn)行表面修飾。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為41.8nm；表面電位為43.2±0.1mV；藥物的包封率為98.15％。
實(shí)施例六1、殼寡糖、疏水改性殼寡糖、疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)制備與實(shí)施例一～四相同。
2、載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液5ml，中加入1ml月桂二酸的乙醇溶液，使聚合物與月桂二酸的摩爾比為1∶20，在常溫下磁力攪拌4小時(shí)，對(duì)載藥膠團(tuán)進(jìn)行表面修飾。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為37.6nm；表面電位為45.2±0.1mV；藥物的包封率為98.97％。
實(shí)施例七1、殼寡糖、疏水改性殼寡糖、疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)制備與實(shí)施例一～四相同。
2、載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液5ml，中加入1ml乙二醇縮水甘油醚的乙醇溶液，使聚合物與乙二醇縮水甘油醚的摩爾比為1∶20，在常溫下磁力攪拌4小時(shí)，對(duì)載藥膠團(tuán)進(jìn)行表面修飾。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為45.3nm；表面電位為34.5±0.1mV；藥物的包封率為99.23％。
實(shí)施例八1、殼寡糖、疏水改性殼寡糖、疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)制備與實(shí)施例一～四相同。
2、載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液5ml，中加入1ml異佛爾酮-二異氰酸酯的乙醇溶液，使聚合物與異佛爾酮-二異氰酸酯的摩爾比為1∶20，在常溫下磁力攪拌4小時(shí)，對(duì)載藥膠團(tuán)進(jìn)行表面修飾。
Zetasizer 3000HS分析儀測(cè)定粒徑及表面電位。表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的平均粒徑為56.4nm；表面電位為31.4±0.1mV；藥物的包封率為98.67％。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)，膠團(tuán)的組成為平均分子量1.5kD～51kD的殼寡糖與C10～C22的脂肪酸嫁接得到，嫁接物中殼寡糖的氨基取代度為1％～50％，臨界膠團(tuán)濃度為0.01～0.1mg/ml，其特征是以雙功能性有機(jī)小分子對(duì)聚合物表面殼寡糖分子上的氨基或羥基進(jìn)行化學(xué)修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)，其特征是所述的雙功能性有機(jī)小分子選用戊二醛、京尼平、二元脂肪酸、乙二醇縮水甘油醚、異佛爾酮-二異氰酸酯中任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)，其特征是作為表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的藥物為親脂性藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)，其特征是作為表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的藥物選用紫杉醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的制備方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)殼寡糖制備取分子量為450kDa，90～95％脫乙酰度90～95％脫乙酰度的高分子量的殼聚糖，在55～60℃和pH5.0條件下攪拌溶解，按纖維素酶與殼聚糖重量比為0.5∶100加入纖維素酶降解，過(guò)濾除去雜質(zhì)，以超濾膜超濾分級(jí)，濾液冷凍干燥，得分子量小于200kDa、脫乙酰度大于80％的低分子量殼寡糖，凝膠滲透色譜法測(cè)定分子量；(2)疏水改性殼寡糖制備取上述殼寡糖水溶液，按照殼寡糖、脂肪酸、交聯(lián)偶合劑碳二亞胺摩爾比1∶1～50∶1～50，控制50℃～90℃，反應(yīng)5～48小時(shí)，終反應(yīng)液透析純化，冷凍干燥得到疏水改性殼寡糖；(3)載親脂性藥物疏水改性殼寡糖膠團(tuán)的制備取疏水改性殼寡糖，加入蒸餾水適量，水浴超聲分散，得膠團(tuán)溶液，取膠團(tuán)溶液，加入親脂性藥物或其溶液，探頭超聲，得疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)。(4)載藥膠團(tuán)的表面修飾取載藥膠團(tuán)溶液，加入雙功能性有機(jī)小分子溶液，控制疏水改性殼寡糖與雙功能性有機(jī)小分子的摩爾比為1∶1～100，15～50℃下磁力攪拌2～24小時(shí)，得表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表面修飾疏水改性殼寡糖載藥膠團(tuán)的制備方法，其特征是步驟(2)所述的殼寡糖水溶液選用分子量為1～50kDa制備疏水改性殼寡糖。
全文摘要
本發(fā)明提供表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物載藥膠團(tuán)，膠團(tuán)的組成為平均分子量1.5kD～51kD的殼聚糖與C
文檔編號(hào)A61K9/00GK1883708SQ20061005160
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者胡富強(qiáng), 杜永忠, 袁弘, 游劍, 任國(guó)飛 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)