專利名稱：氨基酸改性殼聚糖親核no供體及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域的藥物及其合成方法，具體是一種氨基酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法。
背景技術(shù)：
在最近的十年中，國外對(duì)基于含有[N(O)NO]-官能團(tuán)的NO供體控釋材料進(jìn)行了大量的研究。最初的研究集中于將離子型的親核NO供體NONOate分散于各種疏水性聚合物中，通過NO的釋放增強(qiáng)這些材料的血液相容性。雖然這些研究取得了相當(dāng)大的成功，但是研究發(fā)現(xiàn)，親水性的NO供體會(huì)從聚合物中滲出，在血液中形成致癌性的N-亞硝胺物質(zhì)。將這類材料應(yīng)用于臨床，還必須考慮以下幾點(diǎn)作為聚合物基體材料的生物相容性和生物可降解性。親核試劑的細(xì)胞毒性和生物相容性。有一些[N(O)NO]-基團(tuán)載體如二乙烯三胺發(fā)現(xiàn)對(duì)身體有害；聚乙烯亞胺(PEI)會(huì)誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞死亡，生物相容性較差。因此選用無毒的有良好生物相容性的NO載體引起人們的關(guān)注。其中的解決辦法之一就是采用對(duì)身體無害的具有仲胺基團(tuán)的親核載體如聚氨基酸、小分子多肽。
氨基酸是生物體內(nèi)大量存在的同時(shí)具有氨基和羧基的雙官能團(tuán)生命小分子配體。氨基酸是合成人體蛋白質(zhì)、激素、酶及抗體的原料，參與人體內(nèi)正常的代謝和生理活動(dòng)。而且，氨基酸是生物體中重要的生命物質(zhì)，是組成酶和蛋白質(zhì)的基本單元。作為小分子，氨基酸對(duì)生物大分子的活性及其生理功能起著極為重要的作用；作為配體，它可與多種金屬離子配位，為研究抗腫瘤、抗癌藥物提供信息。各種氨基酸在生物體中具有不同的生物功能，如生物體中的色氨酸與腦的正常代謝有密切的關(guān)系，L-半胱氨酸能增強(qiáng)生物體的抗病能力等。因此目前，聚氨基酸類材料在藥物控制釋放方面的應(yīng)用又引起了廣泛的關(guān)注。氨基酸在人體內(nèi)通過酶的作用，參與新陳代謝，營養(yǎng)物質(zhì)被人體吸收，代謝產(chǎn)物為無機(jī)小分子，由排泄系統(tǒng)排出體外，所以具有良好的生物相容性。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Bohl等在《Biomaterials》(生物材料)(2000，212273-2278)上發(fā)表了“Nitric oxide-generating polymers reduceplatelet adhesion and smooth muscle cell proliferation”(NO產(chǎn)生聚合物減少血小板粘附和平滑肌細(xì)胞增殖)，該文提出了采用氨基酸對(duì)具有光學(xué)活性的聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇(PVA)改性使其具有親核的NH基團(tuán)。同NO反應(yīng)后，得到一系列不同半衰期的NO釋放凝膠材料。其不足之處在于所用的基體材料生物相容性欠佳，由于基體材料的水溶性不能制備機(jī)械性能良好的薄膜和涂層。
美國專利USP6261594(Chitosan-based nitric oxide donor compositions)以及USP6451337(Chitosan-based nitric oxide donor compositions)提出了將改性殼聚糖作為親核NO載體，合成出系列殼聚糖-NO加成物。殼聚糖的具體的改性分為兩類(1)親水基團(tuán)改性N-羧丁基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖，N-羧甲基殼聚糖。(2)疏水性基團(tuán)改性N-丙基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖甲酯。其不足之處在于改性殼聚糖的生物相容性差，NO的負(fù)載程度較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種氨基酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法。本發(fā)明采用氨基酸對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性，從而提供更多的親核位點(diǎn)，提高NO的負(fù)載量，同時(shí)通過殼聚糖和氨基酸這兩種都具有良好生物相容性的材料的結(jié)合，有助于解決此類NO供體藥物應(yīng)用于臨床存在的問題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，殼聚糖作為基體材料，采用氨基酸改性增加其親核位點(diǎn)(NH基團(tuán))，與NO反應(yīng)產(chǎn)生[N(O)NO]-官能團(tuán)，分子結(jié)構(gòu)如下
其中[N(O)NO]-官能團(tuán)為NH基團(tuán)同NO反應(yīng)形成，NH基團(tuán)來自于氨基酸的氨基NH2或殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的氨基NH2改性反應(yīng)；R為直鏈或支鏈的烷基。
當(dāng)氨基酸在殼聚糖的C6位上發(fā)生反應(yīng)時(shí)，氨基酸分子上的氨基NH2與C6位羧化殼聚糖分子上的COOH反應(yīng)，形成NH位點(diǎn)，與NO反應(yīng)形成[N(O)NO]-基團(tuán)。
當(dāng)氨基酸在殼聚糖的C2位發(fā)生反應(yīng)時(shí)，氨基酸分子上的羧基和殼聚糖分子中的氨基NH2反應(yīng)形成NH位點(diǎn)，與NO反應(yīng)形成[N(O)NO]-基團(tuán)。
本發(fā)明所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，可以采用以下兩種中的任意一種方法(1)在C6位點(diǎn)引入氨基酸。將C6-O羧化殼聚糖的羧基COOH先用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或EDC進(jìn)行活化，再同氨基酸的氨基(NH2)反應(yīng)，可制得C6位點(diǎn)氨基酸改性殼聚糖。將改性產(chǎn)物同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行高壓反應(yīng)(Na+/NH≥3)，壓力為5-10atm，室溫反應(yīng)3-7天，產(chǎn)生[N(O)NO]-基團(tuán)。
方法(2)在C2位點(diǎn)引入氨基酸。將氨基酸的羧基先用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或EDC進(jìn)行活化再同殼聚糖分子上的氨基(NH2)反應(yīng)，可制得C2位點(diǎn)氨基酸改性殼聚糖。將改性產(chǎn)物同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行高壓反應(yīng)(Na+/NH≥3)，壓力為5-10atm，室溫反應(yīng)3-7天，產(chǎn)生[N(O)NO]-基團(tuán)。
所用殼聚糖的粘均分子量為1-100萬，脫乙酰度50-100％。
所用羧化殼聚糖分子的羧化取代度為1.1，以C6-O羧甲基殼聚糖為主。
所用的氨基酸包括甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等常見的酸性、堿性和中性氨基酸。
本發(fā)明制備的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，可以制備成能夠釋放NO分子的藥物膜、微球、納米球，可廣泛的應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)疾病，肺部高壓，促進(jìn)傷口愈合，有效的預(yù)防成型術(shù)后再狹窄，提高醫(yī)療裝置的抗血栓性能。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明合成方法的合成路線如下方法(1)在C6位點(diǎn)引入氨基酸(以甘氨酸(中性)GLY和賴氨酸(堿性)LYS為例)羧基活化
方法(2)在C2位點(diǎn)引入氨基酸因氨基酸中也存在羧基，先將氨基酸中的羧基活化，再與殼聚糖中的2號(hào)碳位的-NH2反應(yīng)。
以下結(jié)合本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容提供實(shí)施例實(shí)施例1在C6位點(diǎn)引入甘氨酸羧甲基殼聚糖的制備將殼聚糖15g和異丙醇200ml加入三頸瓶中，攪拌使殼聚糖均勻分散在異丙醇中，將10mol/L NaOH溶液50ml分為5份，每隔30min加入一份，室溫?cái)嚢?小時(shí)，得反應(yīng)物淤漿。將24g固體氯乙酸溶于70ml異丙醇中，分4次加入反應(yīng)物淤漿中。加完后將反應(yīng)物用水浴加熱到70℃，控溫下開啟回流冷凝裝置，攪拌2小時(shí)。停止后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值到7-8，析出大量淺黃色絮狀沉淀，真空抽濾，得黃色固體，并用甲醇洗滌3次，將所得黃色固體真空干燥1天，溫度為60℃。
羧甲基殼聚糖的活化將羧甲基殼聚糖(CMCS)加入反應(yīng)器中，然后加入溶劑(水，乙睛，醇)，攪拌使羧甲基殼聚糖充分溶解。已溶解的N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide NHS)水溶液和二環(huán)己基碳二亞胺(Dicuclohexylcarbodiimide DCC)醇溶液分別加入上述溶液，在上述反應(yīng)體系中，CMCS∶NHS∶DCC的摩爾比為1∶1.5∶1。室溫?cái)嚢?4h得乳黃色混濁液。過濾后，將白色固體用有機(jī)溶劑充分洗滌后真空干燥，然后將濾液中的反應(yīng)物再次沉淀出來后洗滌、真空干燥備用。
甘氨酸改性羧甲基殼聚糖稱取摩爾比為1∶1的甘氨酸和已活化的羧甲基殼聚糖加入0.05mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)1天后得淡黃色溶液。將所得溶液濃縮后，透析三天，冷凍干燥后得白色纖維狀物質(zhì)。
甘氨酸改性殼聚糖FTIR1650-1655cm-1(酰胺I)，1560cm-1(酰胺II)，1600cm-1(-COONa)，13C NMR176.0ppm，-COOH；43.0ppm，-CH2-，1H NMR4.22(1H)，2.52(2H)，3.91(3H)，3.0-3.3(4H，5H，6H)，1.42(7H)，4.33(8H)，3.62(9H)實(shí)施例2在C6位點(diǎn)引入賴氨酸稱取摩爾比為1∶1的賴氨酸和實(shí)施例1中已活化的羧甲基殼聚糖加入0.05mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)1天后得淡黃色溶液。將所得溶液濃縮后，透析三天，冷凍干燥后得白色纖維狀物質(zhì)。
賴氨酸改性殼聚糖FTIR1730cm-1(-COOH)，1630cm-1和1514cm-1(NH3+)，1415cm-1(-CH2和-CH3)，2928cm-1(-CH2)。1H NMR4.33(8H)，3.41(9H)，1.05(10H)，0.88(11H)，2.35(12H)，3.60(13H).
實(shí)施例3在C2位點(diǎn)引入氨基酸因氨基酸中也存在羧基，先將氨基酸中的羧基活化，再與殼聚糖中的2號(hào)碳位的-NH2反應(yīng)。將氨基酸溶于100ml水醇(2∶1)中，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，攪拌反應(yīng)1h，加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的醇溶液，室溫反應(yīng)24h。在上述反應(yīng)體系中，氨基酸∶NHS∶DCC的摩爾比為1∶1.5∶1。取定量的殼聚糖(氨基酸∶殼聚糖摩爾比1∶1)溶于0.1M醋酸溶液在攪拌下滴加入上述溶液中，室溫反應(yīng)24h，將所得溶液濃縮后，透析三天，冷凍干燥后得白色纖維狀物質(zhì)。
FTIR1650cm-1(酰胺I)，1560cm-1(酰胺II)，1310cm-1(酰胺III)；1H NMR3.53(8H)實(shí)施例4氨基酸改性殼聚糖負(fù)載NO反應(yīng)將CH3ONa(1.5g，13.9mmol)溶于50ml甲醇中制備甲醇鈉溶液，然后將氨基酸改性后的殼聚糖(1g，4.5mmol)懸浮于該溶液中，需要滿足Na+/NH≥3。將其置于高壓反應(yīng)釜中，在5atm的NO壓力下反應(yīng)，每天通NO 60min，反應(yīng)3天后，過濾用乙醚洗滌產(chǎn)物，常溫真空干燥，貯存于密閉干燥器中，溫度為-20℃。
對(duì)于含有[NONO]-的官能團(tuán)，最有效的表征方法是紫外特征吸收取少量產(chǎn)物溶于0.1M的NaOH溶液中，測(cè)得[NONO]-的官能團(tuán)特征吸收256nm。
NO釋放性能研究氨基酸改性殼聚糖產(chǎn)物因?yàn)橐肓唆然?，因此水溶性較好，試驗(yàn)研究顯示，其在酸性和堿性溶液中都具有較好的溶解性。將其放入透析袋中測(cè)定其NO的釋放過程。對(duì)釋放曲線進(jìn)行函數(shù)擬合，求出其釋放半衰期。對(duì)于C6GLYCS/NO釋放總量為423nmol/mg，半衰期為0.143h；C6LYSCS/NO，釋放總量為327nmol/mg，半衰期為0.223h；C2GLYCS/NO，釋放總量為310nmol/mg，半衰期為0.311h。
從上述數(shù)據(jù)可以看出C6位點(diǎn)改性殼聚糖NO親核供體的釋放量大于C2位點(diǎn)改性殼聚糖NO親核供體，但半衰期卻明顯小于C2位點(diǎn)改性殼聚糖NO親核供體。C6位點(diǎn)甘氨酸改性殼聚糖NO的釋放量大于賴氨酸改性殼聚糖NO的釋放量，半衰期則是賴氨酸改性殼聚糖大于甘氨酸改性殼聚糖。
權(quán)利要求
1.一種氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征在于殼聚糖作為基體材料，采用氨基酸改性增加其NH親核位點(diǎn)，與NO反應(yīng)產(chǎn)生[N(O)NO]-官能團(tuán)，分子結(jié)構(gòu)如下 其中[N(O)NO]-官能團(tuán)為NH基團(tuán)同NO反應(yīng)形成，NH基團(tuán)來自于氨基酸的氨基NH2或殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的氨基NH2改性反應(yīng)；R為直鏈或支鏈的烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征是當(dāng)氨基酸在殼聚糖的C6位上發(fā)生反應(yīng)時(shí)，氨基酸分子上的氨基NH2與C6位羧化殼聚糖分子上的COOH反應(yīng)，形成NH位點(diǎn)，與NO反應(yīng)形成[N(O)NO]-基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征是當(dāng)氨基酸在殼聚糖的C2位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)時(shí)，氨基酸分子上的羧基和殼聚糖分子中的氨基NH2反應(yīng)形成NH位點(diǎn)，與NO反應(yīng)形成[N(O)NO]-基團(tuán)。
4.一種如權(quán)利要求1所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征在于C6位點(diǎn)或C2位點(diǎn)氨基酸改性殼聚糖分子上的NH基團(tuán)同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進(jìn)行反應(yīng)，其中Na+/NH≥3，壓力為5atm，室溫反應(yīng)3天，產(chǎn)生[N(O)NO]-基團(tuán)，得到含有[N(O)NO]-基團(tuán)的親核NO供體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，NH基團(tuán)來自于殼聚糖的氨基和羧化殼聚糖的羧基與氨基酸的羧基或氨基反應(yīng)后形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，C6位點(diǎn)氨基酸改性殼聚糖的制備是將C6位羧化殼聚糖的COOH先用N-羥基琥珀酰亞胺NHS和二環(huán)己基碳二亞胺DCC或EDC進(jìn)行活化再同氨基酸的氨基NH2反應(yīng)制得。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，C2位點(diǎn)氨基酸改性殼聚糖的制備是將氨基酸的羧基COOH先用N-羥基琥珀酰亞胺NHS和二環(huán)己基碳二亞胺DCC或EDC進(jìn)行活化再同殼聚糖的氨基NH2反應(yīng)，制得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或者7所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，所用的氨基酸包括甘氨酸、賴氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的氨基酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，其特征是，用氯乙酸和殼聚糖進(jìn)行羧甲基反應(yīng)，產(chǎn)物以C6-O羧甲基殼聚糖為主。
全文摘要
一種氨基酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法，屬于醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明選擇殼聚糖作為基體材料，采用氨基酸改性增加其親核位點(diǎn)(NH基團(tuán))，與NO反應(yīng)后生成含有[N(O)NO]官能團(tuán)的親核NO供體，供體分子結(jié)構(gòu)如下。這類新型的親核NO供體具有不同的NO釋放速率和半衰期，能夠克服目前此類NO供體臨床應(yīng)用中存在的難題親核試劑(多胺)的細(xì)胞毒性和致癌性副產(chǎn)物亞硝胺的生成，因此具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K47/36GK1868544SQ20061002831
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者萬錒俊, 高群 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)