專利名稱：短葉老鸛草素在腫瘤生長和增殖抑制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及短葉老鸛草素(Brevilin)的用途，特別涉及短葉老鸛草素在制備腫瘤生長和增殖抑制劑中的應用。
背景技術：
鵝不食草(Centipeda minima(L.)A.Br.et Aschers.)系菊科石胡荽屬植物，又名石胡荽、雞腸草。鵝不食草始載于南唐《食性本草》，在我國著名的藥典《本草綱目》中亦有記載，“鵝不食草可以通鼻氣，利七竅，吐風痰，塞鼻息自落”。鵝不食草生長于海拔300～1900米的陰濕處，主產(chǎn)于我國浙江、湖北、江蘇、廣東等地。在國外主要分布于印度平原和錫蘭島。
鵝不食草主要成分包括有揮發(fā)性油類，甾體類，萜類化合物和黃酮類等主要有效成分。藥理研究證明，它有廣泛的藥理作用，如抗炎，抗原生生物，抗菌抗過敏等作用。
萜類化合物是鵝不食草的主要化學成分之一，很多萜類化合物具有重要的生理活性，比如，山金車內酯C和D具有相似的抗枯草桿菌作用，MIC值為150微克/毫升。鵝不食草揮發(fā)油0.05毫升/千克和0.01毫升/千克劑量組對小鼠急性炎癥均有明顯抑制作用。
有關短葉老鸛草素的公開專利和發(fā)表的文獻大致可分為二類第一類是關于利用植物化學的方法研究短葉老鸛草素分離提取或者在植物中的含量，Bohlmann F，Chen ZL.New guaianolides from Centipeda minima.KeXue TongBao 1984；29(7)900-3。劉宇 楊艷芳 吳和珍 劉焱文.RP-HPLC法測定鵝不食草中短葉老鸛草素的含量，中藥材2005，6(28)473-474報道鵝不食草中短葉老鸛草素的含量為3毫克/克。
第二類是關于短葉老鸛草素生物活性的研究，在這些報道中短葉老鸛草素具有抗原生蟲活性，如瘧原蟲和阿米巴蟲等，Sharma P，Sharma J D.A Review of Plant Species Assessedin vitro for Antiamoebic Activity or both Antiamoebic and Antiplasmodial Properties.Phytother.Res.2001 15，1-17.
目前，在相關檢索中并未發(fā)現(xiàn)關于短葉老鸛草素用于制備抗癌藥物的專利，然而，當前腫瘤化療治療領域急需解決的問題是尋找出新的低毒、高效抗癌藥物資源。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對腫瘤治療領域急需解決的問題，尋找出新的低毒、高效抗癌藥物資源。提供應用短葉老鸛草素(Brevilin)或其與藥理學上允許的添加成分相組合而制成的腫瘤生長和增殖抑制劑。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖抑制劑，應用分子結構如下式的短葉老鸛草素，作為腫瘤生長和增殖抑制劑中的有效成分。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖抑制劑，為短葉老鸛草素(Brevilin)或其與藥理學上允許的添加成分相組合而成的抑制劑。所述抑制劑劑型為經(jīng)口給藥的固型制劑散劑，丸劑，片劑或膠囊劑，或為非經(jīng)口給藥的外用劑，軟膏，貼敷劑，注射劑。
本發(fā)明的腫瘤生長和增殖抑制劑中的短葉老鸛草素由鵝不食草提取或向SIGMA(西格瑪)公司購買，純度大于等于99％時，藥效更好。
本發(fā)明中所說的腫瘤為醫(yī)學上所屬的各類腫瘤，包括良性腫瘤和惡性腫瘤。而所說的惡性腫瘤包括惡性黑色素瘤，惡性淋巴瘤，消化器官的腫瘤(胃癌，腸癌，肝癌，膽囊癌，膽道癌，胰腺癌)，肺癌，乳癌，睪丸癌，卵巢癌，子宮癌，前列腺癌，上顎癌，舌癌，口腔癌，咽喉癌，甲狀腺癌，腦部腫瘤，各類肉瘤，骨肉瘤，白血病，神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，膀胱腫瘤，皮膚癌，皮膚附屬器官癌和皮膚轉移癌。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑，小劑量即產(chǎn)生抑制多種腫瘤細胞生長的作用且具有劑量依賴性，可將它們作為治療腫瘤的藥物，應用于腫瘤的化學治療中。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑，在低濃度的情況下具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，說明不僅具有殺滅腫瘤細胞的作用而且可以遏制腫瘤細胞的無限增殖能力，因而可以發(fā)揮更進一步更大程度治療腫瘤的效果。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑，對不同的人類癌細胞和人類正常細胞有不同的細胞毒性，尤其是對癌細胞的IC50要比正常細胞的IC50低很多，而且兩者差異顯著(p＜0.05)。
本發(fā)明的腫瘤生長和增殖的抑制劑，低毒，適合于人和哺乳類動物經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑，在劑型方面無特定的限制，可作為經(jīng)口給藥的散劑，丸劑，片劑，膠囊劑等固型制劑，也可作為非經(jīng)口給藥的外用劑，軟膏，貼敷劑，注射劑。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑，通常能與不影響藥理學作用的輔助料配合制成經(jīng)口或非經(jīng)口給藥的制劑。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑，可經(jīng)水溶劑(如蒸餾水)，水溶性制劑(如生理鹽水)，脂溶劑(如胡麻油)等溶劑用常規(guī)法調制。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑，通常能與藥理學上允許的稀釋劑，著色劑，安定劑，界面活性劑，助溶劑，緩沖劑，矯味劑，香料，保存劑或糖衣劑相組合，用于經(jīng)口或非經(jīng)口劑型。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑，在劑型上通常能與藥理學上允許的稀釋成分和成型成分相組合，用于經(jīng)口或非經(jīng)口劑型。
本發(fā)明提供的腫瘤生長和增殖的抑制劑經(jīng)口劑型，是指片劑，丸劑，顆粒劑，散劑或膠囊。非經(jīng)口劑型是指靜脈注射劑，肌肉注射劑，皮下注射劑，浴劑，直腸，肛門或陰道給藥。
本發(fā)明的顯著的優(yōu)點和技術上的進步本發(fā)明提供的具有抑制多種人類腫瘤細胞生長和增殖作用的天然化合物，克服了傳統(tǒng)上中藥服用計量大且療效不穩(wěn)定的缺陷，用現(xiàn)代生物技術作為發(fā)明的手段，明確了有效成分，運用純化合物作為抗腫瘤藥物，減少了未知成分引起負作用的可能性。該種化合物具有顯著的抑制人類腫瘤細胞生長和增殖作用(體內和體外實驗)，同時對人類正常細胞的細胞毒性較小，具有良好的應用前景。


表1為不同濃度的短葉老鸛草素對A375，A431，95D，MKN45，BEL-7402，LoVo細胞的抑制作用。
表2為不同濃度的短葉老鸛草素對293，L02細胞的細胞毒性作用。
圖1為不同藥物及濃度抑制C57小鼠體內腫瘤生長的比較。
圖2為短葉老鸛草素結構式。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明內容作進一步說明。所舉之例并不限制本發(fā)明的保護范圍實施例1短葉老鸛草素對腫瘤細胞的毒性作用短葉老鸛草素為從鵝不食草中分離得到的純天然產(chǎn)物，純度大于99％，用DMEM(杜氏改良依格培養(yǎng)基，Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。采用噻唑藍(MTT)快速比色法測定短葉老鸛草素對A375，A431，95D，MKN45，BEL-7402，LoVo，HL60細胞的毒性作用。將對數(shù)生長期細胞(106細胞/毫升)，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2毫升，分別加入設定濃度的短葉老鸛草素處理，每濃度平行4孔，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4天，實驗終止前4小時每孔加入5毫克/毫升MTT 10微升，培養(yǎng)結束后每孔加入0.04當量的二甲基亞砜(DMSO)，每孔150微升，振蕩10分鐘，待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad 550型酶標儀，以550納米為實驗波長，655納米為參照波長測定其吸收度，計算腫瘤細胞的抑制率和藥物對細胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細胞的抑制率作圖，確定細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實驗結果如下表1所示。
表1不同濃度的Brevilin對A375，A431，95D，MKN45，BEL-7402，LoVo細胞的抑制作用

注A375-95D-LoVo-A431-人表皮鱗狀癌細胞，HL60-人急性早幼粒白血病細胞，MKN45-人胃癌細胞，BEL-7402-人肝癌細胞，LoVo-結腸癌細胞，95D-人肺巨細胞癌高轉移株細胞，A375人惡性黑色素瘤。
表2不同濃度的Brevilin對293，L02細胞的細胞毒性

注293-人體正常胚胎腎細胞，L02-肝細胞。
以上實施例說明，短葉老鸛草素對不同種類的腫瘤細胞均具有良好的殺滅作用，而且這種抑制效果還具有劑量依賴性。
實施例2短葉老鸛草素對正常L02細胞的毒性作用短葉老鸛草素為從鵝不食草中分離得到的純天然產(chǎn)物，純度大于99％，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。采用噻唑藍(MTT)快速比色法測定短葉老鸛草素對L02細胞的毒性作用。將對數(shù)生長期細胞(106細胞/毫升)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2毫升，分別加入設定濃度的短葉老鸛草素處理，每濃度平行4孔，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4天，實驗終止前4小時每孔加入5毫克/毫升MTT 10微升，培養(yǎng)結束后每孔加入0.04當量二甲基亞砜(DMSO)，每孔150微升，振蕩10分鐘待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad 550型酶標儀，以550納米為實驗波長，655納米為參照波長測定其吸收度，計算腫瘤細胞的抑制率和藥物對細胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細胞的抑制率作圖，確定細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實驗結果如下表2所示。
以上實施例說明，短葉老鸛草素對人類腫瘤細胞的細胞毒性較大，對正常細胞的細胞毒性較弱，即GA-Me和GA-T對某些人類腫瘤細胞具有一定的靶向抑制作用。
實施例3短葉老鸛草素抑制C57小鼠體內腫瘤生長活性的比較短葉老鸛草素為從鵝不食草中分離得到的純天然產(chǎn)物，純度大于99％。雄性，荷瘤C57小鼠兩只，剝離小鼠的實體瘤，剪碎并用酸磷緩沖液(pH 7.4)研磨，80目篩網(wǎng)過濾。配成細胞懸浮液備用。雄性C57按體重隨機分組，前肢腋下注射腫瘤細胞懸浮液(1×106個/毫升)，在接種同時不同的藥物腹腔每日注射，陰性對照為生理鹽水(PBS)。以抗癌藥物為陽性對照，給藥8天，后處死，剝離小鼠的實體瘤稱重。與對照比較計算抑制率。藥物的不同濃度對腫瘤的抑制率的影響的實驗結果如圖1所示。
以上實施例說明，短葉老鸛草素在體內也能抑制腫瘤的生長，同時也具有劑量依賴性。
權利要求
1.短葉老鸛草素在制備腫瘤生長和增殖抑制劑中的應用，其特征在于，分子結構如下式的短葉老鸛草素，用作制備腫瘤生長和增殖抑制劑中的有效成分。
2.如權利要求1所說的短葉老鸛草素在制備腫瘤生長和增殖抑制劑中的應用，其特征在于，短葉老鸛草素或其與藥理學上允許的添加成分相組合制備成腫瘤生長和增殖抑制劑，所述抑制劑劑型為經(jīng)口給藥的固型制劑散劑，丸劑，片劑或膠囊劑，或為非經(jīng)口給藥的外用劑，軟膏，貼敷劑，注射劑。
3.如權利要求1或2所說的短葉老鸛草素在制備腫瘤生長和增殖抑制劑中的應用，其特征在于，所說的短葉老鸛草素的純度大于等于99％。
全文摘要
本發(fā)明公開了短葉老鸛草素(Brevlin)在制備腫瘤生長或增殖的抑制劑中的應用。體內和體外實驗證明短葉老鸛草素具有顯著的抑制人類腫瘤細胞生長或增殖作用，同時對正常細胞的毒性較小，具有良好的應用前景。
文檔編號A61K36/185GK1907277SQ20061001978
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月1日 優(yōu)先權日2006年8月1日
發(fā)明者吳和珍, 劉建文, 劉焱文, 楊艷芳, 李長龍 申請人:湖北中醫(yī)學院