專利名稱：具棲冬青苷的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療心腦血管系統(tǒng)疾病的藥物和保健食品及其制備方法，具體地說是中藥救必應(yīng)的有效成分具棲冬青苷、含具棲冬青苷的藥物和保健食品的組合物及其相應(yīng)的制備方法。
背景技術(shù)：
救必應(yīng)為冬青科植物冬青科冬青屬植物鐵冬青Ilex rotunda Thunb.的樹皮，主產(chǎn)于廣西、廣東省，具有清熱解毒，消腫止痛等功效。用于感冒，扁桃體炎，咽喉腫痛，急性胃腸炎，風(fēng)濕骨痛；外用治跌打損傷，癰癤瘡瘍，外傷出血，燒燙傷。化學(xué)成分主要含三萜皂苷、黃酮苷、酚類、鞣質(zhì)等，其皂苷類成分含量較高，約為7-8％。文東旭等[1](中草藥，1991，22(6)，246-248)從中分離出皂苷類成分具棲冬青苷(Pedunculoside)，分子式為C36H58O10。結(jié)構(gòu)式為 近年來，文獻(xiàn)[2.3](中藥藥理與臨床，1998；14(4)，22-24、中藥材，1997；20(6)，303-305)報道救必應(yīng)醇提取物具有抗心律失常和保護(hù)缺血缺氧心肌作用。但由于救必應(yīng)醇提物屬粗制劑，確切的有效成分尚不清楚。龐小雄等[4](廣東藥學(xué)院學(xué)報，1997，13(2)，103～104)報道具棲冬青苷的提取和分離方法，是將取救必應(yīng)粉碎成粗粉，用95％乙醇回流三次，提取液濃縮至小體積，加入等量的蒸餾水，靜置過夜，離心，沉淀物用適量水洗，干燥得粗品，粗品用氯仿回流除去脂溶性成分，殘渣用50％乙醇加熱處理，濾除不溶物，濾液放置，過濾，所得結(jié)晶經(jīng)過硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇∶水(72∶1)下層洗脫，薄層層析檢查，合并相同組份后，用50％乙醇重結(jié)晶得具棲冬青苷。
現(xiàn)有技術(shù)的不足是需用劇毒的氯仿脫脂并進(jìn)行硅膠柱層析分離，產(chǎn)量小，周期長，成本高，操作復(fù)雜，工藝條件無法適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是研制治療心律失常、心肌缺血、腦缺血等心腦血管系統(tǒng)疾病的有效成分具棲冬青苷，以及具棲冬青苷的藥物組合物。本發(fā)明還包括一種適合大批量工業(yè)化生產(chǎn)的具棲冬青苷制備方法。
一種治療心腦血管系統(tǒng)疾病的具棲冬青苷，可用下述方法制備取救必應(yīng)粗粉，用乙醇回流提取，合并提取液，濃縮至浸膏狀，加水，加熱，攪拌，靜置過夜，離心，得沉淀物和上清液。沉淀物加50-95％乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，放置，濾過，沉淀物干燥，得一部分總皂苷，總皂苷加10-100倍的50-95％乙醇結(jié)晶，得一部分具棲冬青苷。上清液濃縮，放冷至室溫，離心，沉淀物用適量水洗，干燥后用50-95％乙醇結(jié)晶，又制得另一部分具棲冬青苷。兩次制得的具棲冬青苷合并，用10-100倍量的50-95％乙醇多次重結(jié)晶，得具棲冬青苷純品。
所述的具棲冬青苷，其制備方法為取救必應(yīng)粗粉，用2-10倍的50-95％乙醇回流提取三次，每次1-3小時，合并提取液，濃縮至浸膏狀，加3-10倍的水，加熱，攪拌，靜置過夜，離心，得沉淀物和上清液。沉淀物加50-95％乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，放置，濾過，沉淀物干燥，得一部分總皂苷，總皂苷加10-100倍的50-95％乙醇結(jié)晶，得一部分具棲冬青苷。上清液濃縮至1/2-2倍體積，放冷至室溫，離心，沉淀物用適量水洗三次，干燥，用10-100倍量的50-95％乙醇結(jié)晶，又制得另一部分具棲冬青苷粗晶，兩次制得的具棲冬青苷合并，用10-100倍量的50-95％乙醇多次重結(jié)晶，得具棲冬青苷純品。
上述具棲冬青苷制備方法，其特征在于用2-10倍的50-95％乙醇回流提取，提取液濃縮至浸膏，加水，離心，得沉淀物和上清液。沉淀物加50-95％乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，放置，濾過，沉淀物干燥，得一部分總皂苷，總皂苷加10-100倍的50-95％乙醇結(jié)晶，得一部分具棲冬青苷。上清液濃縮，離心，得沉淀物，干燥，用10-50倍量的50-95％乙醇結(jié)晶，又制得另一部分具棲冬青苷粗晶，兩次制得的具棲冬青苷合并，用10-100倍量的50-95％乙醇多次重結(jié)晶，得具棲冬青苷純品。其含量大于98.0％。
用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其中含有治療有效量的前述任一項(xiàng)的具棲冬青苷和藥學(xué)上可接受的載體。
所述的藥物組合物，其特征在于基本上由具棲冬青苷和口服制劑輔料和注射劑輔料組成；是滴丸劑、口服液、注射液、滴注劑、凍干粉、微囊劑、膠囊劑、片劑或各種緩釋或速釋片劑。
前述藥物組合物的制備方法，可用如下步驟制得取聚乙二醇6000和/或聚乙二醇4000于90-100℃，混合熔融，加入具棲冬青苷混合，常規(guī)制成滴丸。其特征在于按重量比計，取聚乙二醇6000和/或聚乙二醇40001-4份，于90-100℃混合熔融后，加入具棲冬青苷原料1-2份混合，常規(guī)制成滴丸。
前述藥物組合物的制備方法，可用如下步驟制得取具棲冬青苷，加入5-25％聚乙二醇溶液，水浴加熱使溶解，放冷，用5-25％聚乙二醇(400)溶液稀釋，配成注射液。其特征在于取具棲冬青苷160mg，加入5-25％聚乙二醇溶液500ml稀釋，與80℃水浴加熱使溶解，放冷，過濾，加入5-25％聚乙二醇(400)溶液，配成2000ml注射液。
為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用具棲冬青苷的藥理試驗(yàn)及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
一、小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)1.試驗(yàn)方法將適應(yīng)喂養(yǎng)3天的20只小鼠(雌雄各半)禁食12小時，不禁水，受試物用蒸餾水配成小鼠能耐受的最大濃度，以小鼠能耐受的最大體積(0.4ml/10g)給小鼠一次灌胃，連續(xù)觀察14天，記錄動物的反應(yīng)情況，以不產(chǎn)生死亡的最大劑量為最大耐受量。計算出總給藥量，推算出相當(dāng)于臨床用量的倍數(shù)。
2.試驗(yàn)結(jié)果以小鼠能耐受的最大濃度(33％)，以小鼠能耐受的最大體積(0.4ml/10g)給小鼠2次/1日灌胃，連續(xù)觀察14天，結(jié)果無一例死亡。
小鼠一次灌胃給予具棲冬青苷的最大耐受量為13.2g/kg。
二、大鼠長期毒性試驗(yàn)1.方法大鼠灌胃給予具棲冬青苷300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg，每天給藥一次，每周給藥6天，連續(xù)給藥13周，對照組給予同體積溶媒(20ml/kg)。結(jié)果各給藥組大鼠毛色光澤、體重增長正常。血液學(xué)、血清生化學(xué)檢查顯示各劑量組同對照組比較無差異。
2.結(jié)果2.1對血液學(xué)指標(biāo)的影響(表1)大鼠口服給予具棲冬青苷，各組動物血液學(xué)指標(biāo)(Hb，RBC，Ret，PT，TT，PLT)檢查均在正常范圍內(nèi)，與對照組比較無差異。
2.2對血清各生化指標(biāo)的影響(表2)所測血清生化指標(biāo)(包括AST，ALT，ALP，TP，ALB，BUN，T·CHO，GLU，Crea，T·BIL，TG，CK，NA，CL，K)，各組動物指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，與對照組比較無差異。
表1-1 具棲冬青苷給藥期對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(X±SD) 各給藥組與空白組比較均無差異表1-2 具棲冬青苷恢復(fù)期對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(X±SD) 各給藥組與空白組比較均無差異表2-1 具棲冬青苷給藥期對大鼠血液生化學(xué)的影響(X±SD) 與空白組比較*P＜0.05
表2-2 具棲冬青苷恢復(fù)期對大鼠血液生化學(xué)的影響(X±SD) 各給藥組與空白組比較均無差異三、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1.具棲冬青苷對心律失常的影響1.1方法取體重200±20克的大白鼠40只，隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半，分為生理鹽水組、具棲冬青苷大劑量組(100mg/kg)、具棲冬青苷中劑量組(50mg/kg)、具棲冬青苷小劑量組(25mg/kg)、利多卡因組(5mg/kg)。用10％水合氯醛麻醉，用心電圖機(jī)描記用藥前后的心電圖變化。用氯化鋇靜脈注射(4mg/kg)誘發(fā)大鼠心律失常模型后，分別靜脈注射藥物或等量生理鹽水，記錄出現(xiàn)室性停搏數(shù)。結(jié)果見表3。
1.2結(jié)果具棲冬青苷能使氯化鋇誘導(dǎo)大鼠心律失常恢復(fù)正常，與生理鹽水組比較P＜0.01。
表3 具棲冬青苷對大鼠心律失常的影響

*與生理鹽水組比較P＜0.012.具棲冬青苷抗心肌缺血作用2.1.方法2.1.1犬實(shí)驗(yàn)性心肌缺血模型制備取成年健康雜種犬，體重10-15kg，靜脈注射3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，氣管插管連接呼吸機(jī)，開胸暴露心臟，分離并結(jié)扎冠狀動脈前降支根部，放置心外膜電極，經(jīng)生物電放大器記錄于八導(dǎo)生理記錄儀，股動脈插管經(jīng)壓力換能器連接于八導(dǎo)生理記錄儀。
2.1.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分5組，每組6條犬，經(jīng)十二指腸分別給予蒸餾水、具棲冬青苷大劑量40mg/kg、具棲冬青苷中劑量20mg/kg、具棲冬青苷小劑量10mg/kg、陽性藥地奧心血康100mg/kg，給藥體積為0.5ml/kg，手術(shù)完畢記錄正常值后給藥，記錄給藥后15、30、60、90、120、180分鐘的各項(xiàng)參數(shù)，以各時間點(diǎn)心外膜心電圖ST段升高值的總和(∑ST)作為心肌缺血程度指標(biāo)，將心外膜心電圖ST段升高值超過2mv的點(diǎn)定為缺血點(diǎn)，計算總?cè)毖c(diǎn)數(shù)(NST)，作為心肌缺血范圍指標(biāo)，同時記錄HR及MBP，以血壓和心率的乘積開方代表心肌耗氧量。結(jié)果見表42.2結(jié)果2.2.1具棲冬青苷對犬心外膜心電圖的影響十二指腸給予具棲冬青苷，30min后使抬高的ST段明顯下降，與給藥前比較P＜0.05，空白對照組的ST段雖有下降，但與給藥前比較無顯著性差異，見表4。十二指腸給予具棲冬青苷，90min后NST明顯減少，與給藥前比較P＜0.05，空白對照組的NST雖有波動，但與給藥前比較無顯著性差異，見表5。
表4 具棲冬青苷對犬心外膜心電圖∑ST的影響(單位mv)

*與給藥前比較P＜0.01 △與給藥前比較P＜0.05表5 具棲冬青苷對犬心外膜心電圖NST的影響

*與給藥前比較P＜0.01
2.2.2具棲冬青苷對心肌耗氧指數(shù)的影響給予心肌缺血的犬蒸餾水后，心肌耗氧指數(shù)增加(P＜0.05)，表明在急性心肌缺血狀態(tài)下，心肌耗氧量增加，但十二指腸給予具棲冬青苷后，心肌耗氧指數(shù)增加未見增加，表明具棲冬青苷能明顯抑制由于心肌缺血而造成的耗氧量的增加。見表6。
表6 具棲冬青苷對心肌缺血犬心肌耗氧指數(shù)的影響

*與給藥前比較P＜0.013.具棲冬青苷對大鼠局灶性腦缺血的影響3.1方法3.1.1模型制備取體重220-240g大白鼠，用10％水合氯醛麻醉，分離頸內(nèi)動脈，將消毒膠線插入頸內(nèi)動脈，縫合切口，3h后拔出線栓，待大鼠蘇醒后給藥。
3.1.2動物分組和給藥取造模成功大鼠80只，隨機(jī)分組，每組20只，雌雄各半，分為生理鹽水組、具棲冬青苷大劑量組(100mg/kg)、具棲冬青苷中劑量組(50mg/kg)、小劑量組(25mg/kg)、尼莫地平組(1mg/kg)。灌胃給藥，連續(xù)7d，給藥結(jié)束后檢測腦組織含水量及腦梗死面積。
3.2結(jié)果3.2.1具棲冬青苷對腦組織含水量的影響對照組手術(shù)側(cè)腦含水量明顯高于其它組(P＜0.05)，而具棲冬青苷組和尼莫地平組腦兩側(cè)含水量差異無顯著性。見表7。
表7 具棲冬青苷對大鼠腦組織含水量的影響

*與對照組比較P＜0.053.2.2具棲冬青苷對腦梗死面積的影響各組動物均出現(xiàn)梗死灶，但具棲冬青苷組和尼莫地平組腦梗死面積顯著降低，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01)。見表8。
表8 具棲冬青苷對大鼠腦梗死面積的影響

*與對照組比較P＜0.01四、結(jié)論本研究結(jié)果表明，具棲冬青苷毒性較低，可明顯減輕犬冠脈前降支導(dǎo)致的心肌缺血程度和范圍，降低心肌耗氧指數(shù)，并能明顯對抗氯化鋇誘導(dǎo)的大鼠抗心律失常，還可減少局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積，提示具棲冬青苷對腦缺血及心肌缺血具有一定的保護(hù)作用，本研究為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
基于以上結(jié)果可以得出本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明具棲冬青苷的制備方法，不需使用有毒的有機(jī)溶劑及硅膠柱層析分離，產(chǎn)量大，周期長，成本低，工藝簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
2.本發(fā)明對救必應(yīng)發(fā)掘了新的醫(yī)藥用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。
3.本發(fā)明的具棲冬青苷安全無毒，藥理作用強(qiáng)，藥效好，預(yù)示著有很好的藥用前景。
4.本發(fā)明的產(chǎn)品制備工藝簡單，未見毒副作用。既可做成口服制劑如片劑、滴丸、膠囊劑等口服制劑；也可做成注射制劑如粉針劑、滴注劑等。
5.本發(fā)明的產(chǎn)品制成的藥物可明顯減輕犬冠脈前降支導(dǎo)致的心肌缺血程度和范圍，降低心肌耗氧指數(shù)，并能明顯對抗氯化鋇誘導(dǎo)的大鼠抗心律失常，還可減少局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積，這些作用表明了其抗心律失常、心肌缺血、腦缺血作用顯著。臨床上用于預(yù)防和治療冠心病，心絞痛以及淤血內(nèi)阻之胸痹、眩暈、氣短、心悸、胸悶或痛；中風(fēng)、腦梗死等。
具體實(shí)施例方式
以下將描述本發(fā)明的幾個實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。
實(shí)施例1取救必應(yīng)粗粉2000g，用6倍的80％乙醇回流提取三次，分別提取2、1、1小時，過濾，濾液合并，濃縮至浸膏狀，加水6000ml，水浴加熱，攪拌，靜置過夜，濾過，得沉淀物和濾液。沉淀物加50-95％乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，放置，濾過，沉淀物干燥，得總皂苷，總皂苷加10-100倍的50-95％乙醇結(jié)晶，得一部分具棲冬青苷。濾液濃縮至1000ml，放冷至室溫，濾過，沉淀物用適量水洗三次，干燥，用10-50倍量的50-95％乙醇結(jié)晶，又制得另一部分具棲冬青苷粗晶，兩次制得的具棲冬青苷合并，用10-100倍量的50-95％乙醇多次重結(jié)晶，得具棲冬青苷純品。收率3.85％，依法測定，含量為98.59％。
實(shí)施例2取實(shí)施例1的方法制備的具棲冬青苷，采取本技術(shù)領(lǐng)域公知的輸液劑制備方法，制備成具棲冬青苷氯化鈉注射液和具棲冬青苷葡萄糖注射液具棲冬青苷40mg，氯化鈉2.25g，制成具棲冬青苷氯化鈉注射液，其規(guī)格為500ml，靜脈注射，每次1瓶，每日一次；具棲冬青苷40mg，葡萄糖12.5g，制成具棲冬青苷葡萄糖注射液，其規(guī)格為500ml，靜脈注射，每次1瓶，每日一次。
實(shí)施例3取按實(shí)施例1的方法制備的具棲冬青苷20g，加適量的注射用水，用碳酸鈉調(diào)PH值至7，攪拌溶解，再加相當(dāng)于具棲冬青苷10-15％量注射用的甘露醇，除菌濾過，測定含量，分裝1000支，20mg/支，封口，即得。靜脈注射，每次40mg，每日一次。
實(shí)施例4取實(shí)施例1方法制備的具棲冬青苷300g、10％羥丙甲基纖維素32ml。采取本技術(shù)領(lǐng)域公知的膠囊制備方法，制成1000粒膠囊，每粒含具棲冬青苷300mg?？诜?，每次1粒，每日1次。
實(shí)施例5取實(shí)施例1方法制備的具棲冬青苷300g、乳糖68g、淀粉60g、滑石粉20g。采取本技術(shù)領(lǐng)域公知的片劑制備方法，在適宜容器中混合所有組分，制成顆粒，再加入硬脂酸鎂2g，混勻，用9/32時標(biāo)準(zhǔn)凹沖壓片，制成1000片，(每片含具棲冬青苷300mg)?？诜?，每次1片，每日1次。
權(quán)利要求
1.一種治療心腦血管系統(tǒng)疾病的具棲冬青苷，可用下述方法制備救必應(yīng)用乙醇提取，提取物加水，離心，得沉淀物和上清液。沉淀物加50-95％乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，放置，濾過，沉淀物干燥，得一部分總皂苷，總皂苷用乙醇結(jié)晶，得一部分具棲冬青苷。上清液濃縮，離心，沉淀物用適量水洗，干燥后用乙醇結(jié)晶，又制得另一部分具棲冬青苷。兩次制得的具棲冬青苷合并，用乙醇多次重結(jié)晶，得具棲冬青苷純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具棲冬青苷，其特征在于取救必應(yīng)粗粉，用2-10倍的50-95％乙醇回流提取三次，每次1-3小時，合并提取液，濃縮至浸膏狀，加3-10倍的水，加熱，攪拌，靜置過夜，離心，得沉淀物和上清液。沉淀物加50-95％乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，放置，濾過，沉淀物干燥，得一部分總皂苷，總皂苷加10-100倍的50-95％乙醇結(jié)晶，得一部分具棲冬青苷。上清液濃縮至1/2-2倍體積，放冷至室溫，離心，沉淀物用適量水洗三次，干燥，用10-100倍量的50-95％乙醇結(jié)晶，又制得另一部分具棲冬青苷粗晶，兩次制得的具棲冬青苷合并，用10-100倍量的50-95％乙醇多次重結(jié)晶，得具棲冬青苷純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具棲冬青苷，其特征在于用2-10倍的50-95％乙醇回流提取，提取液濃縮至浸膏，加水，離心，得沉淀物和上清液。沉淀物加50-95％乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，放置，濾過，沉淀物干燥，得一部分總皂苷，總皂苷加乙醇結(jié)晶，得一部分具棲冬青苷。上清液濃縮，離心，沉淀物用適量水洗三次，干燥，用10-100倍量的50-95％乙醇結(jié)晶，又制得另一部分具棲冬青苷粗晶，兩次制得的具棲冬青苷合并，用10-100倍量的50-95％乙醇多次重結(jié)晶，得具棲冬青苷純品。其含量大于98.0％。
4.用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病的藥物組合物，為含有治療有效量的權(quán)力要求1-3任一項(xiàng)的具棲冬青苷和藥學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于基本上由具棲冬青苷和口服制劑輔料和注射劑輔料組成；是滴丸劑、口服液、注射液、滴注劑、凍干粉、微囊劑、膠囊劑、片劑或各種緩釋或速釋片劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物的制備方法，用如下步驟制得取聚乙二醇6000和/或聚乙二醇4000于90-100℃，混合熔融，加入具棲冬青苷混合，常規(guī)制成滴丸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于按重量比計，取聚乙二醇6000和/或聚乙二醇4000 1-4份，于90-100℃混合熔融后，加入具棲冬青苷原料1-2份混合，常規(guī)制成滴丸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物的制備方法，用如下步驟制得取具棲冬青苷，加入5-25％聚乙二醇溶液，水浴加熱使溶解，放冷，用5-25％聚乙二醇(400)溶液稀釋，配成注射液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于取具棲冬青苷160mg，加入5-25％聚乙二醇溶液500ml稀釋，與80℃水浴加熱便溶解，放冷，過濾，加入5-25％聚乙二醇(400)溶液，配成2000ml注射液。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療冠心病，心絞痛，中風(fēng)，腦梗死等心腦血管系統(tǒng)疾病的具棲冬青苷、含具棲冬青苷的藥物組合物及其提取分離方法；救必應(yīng)用乙醇提取，提取物加水，離心，得沉淀物和上清液。沉淀物加50－95％乙醇回流提取，濾過，濾液濃縮，放置，濾過，沉淀物干燥，得一部分總皂苷，總皂苷用乙醇結(jié)晶，得一部分具棲冬青苷。上清液濃縮，離心，沉淀物用適量水洗，干燥后用乙醇結(jié)晶，又制得另一部分具棲冬青苷。兩次制得的具棲冬青苷合并，用乙醇多次重結(jié)晶，得具棲冬青苷純品。制得的具棲冬青苷含量可達(dá)98.0％以上；將具棲冬青苷和口服制劑輔料或注射劑輔料混合，可制得各種口服制劑和注射劑。
文檔編號A61K31/7028GK101033245SQ20061001718
公開日2007年9月12日 申請日期2006年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月19日
發(fā)明者李超生 申請人:李超生, 潘書洋