專利名稱：：含有效成分聚-γ-谷氨酸的透明質(zhì)酸酶抑制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種含有活性成分為聚-，谷氨酸(PGA)的透明質(zhì)酸酶抑制劑，和一種用于保持皮膚彈性的化妝品混合物以及一種用于改善過敏性的混合物，其特征在于，每種混合物都含有作為活性成分的PGA。
背景技術：
：透明質(zhì)酸酶屬于透明質(zhì)酸水解酶家族。它們是碳水化合物消化酶，其可以裂解碳水化合物的糖苷鍵，也叫"粘蛋白酶或擴散因子"。透明質(zhì)酸酶的種類包括內(nèi)切氨基己糖苷酶(endohexosaminidase)類型、內(nèi)切葡萄糖醛酸酶(endoglucuronidase)類型、內(nèi)切氨基己糖裂解酶(endohexosaminecleavage)類型以及內(nèi)切氨基葡萄糖裂解酶(endoglucosaminecleavage)類型。這些透明質(zhì)酸酶存在于高等動物的睪丸或精子、肝臟溶酶體、蛇毒液、肺炎克雷伯菌C臉Zw/e〃a/"e訓畫'"eJ或者鏈球菌n，ococcw51)當中。同時，皮膚結締組織包括膠原蛋白、透明質(zhì)酸多糖等等。透明質(zhì)酸酶是一種降解透明質(zhì)酸的酶，并且透明質(zhì)酸酶的活性化會導致皮膚結締組織中透明質(zhì)酸的降解，從而使皮膚結締組織疏松并導致皮膚失去彈性和產(chǎn)生皺紋。在防止皮膚結締組織疏松的現(xiàn)有技術中，其中有一種方法為用維生素A、C、E等處理皮膚以刺激膠原蛋白的合成并防止皮膚氧化。然而，該方法的缺點在于，所用維生素不僅價格昂貴而且其在外部環(huán)境中容易被降解且很難長期保存。也有提出直接用膠原蛋白處理皮膚或口服膠原蛋白，但該方法療效沒有得到證實。另有一種方法為用植物提取物處理皮膚，諸如檳榔、丹皮等，這種提取物具有透明質(zhì)酸酶抑制作用。然而，該方法具有經(jīng)濟效益低的缺點，因為其不僅要培育植物而且要從培育的植物中提取活性成分。同時，PGA是一種由D、L-谷氨酸與，谷氨酰結合的粘液質(zhì)聚合物，該聚合物從微生物中產(chǎn)生。尤其是從芽孢桿菌(gem/s5船7/w^菌株中產(chǎn)生，該菌株是從大豆醬(Chungkookjang采用稻草制備的韓國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品)、納豆(Natto日本傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品)、可尼瑪(Kinema尼泊爾制造的大豆發(fā)酵食品)等中分離得到。由芽孢桿菌(gem^Sac///^)菌株所產(chǎn)生的PGA是一種具有可食用性、水溶性、帶陰離子的且可生物降解的聚合物。該聚合物可用作濕潤劑、保濕劑以及其它化妝品的原材料。近來，發(fā)達國家廣泛開展了PGA用途的研究，如通過酯化反應發(fā)展PGA新材料來替代不可降解聚合物和耐熱塑料的研究以及用PGA生產(chǎn)水溶性纖維及膜的研究。此外，關于PGA的研究報道包括錳離子對產(chǎn)生PGA的影響、通過超聲降解法把PGA用作水溶性聚合物以及通過合成酯類衍生物法開發(fā)低水溶性塑料(Biosci.Biotechnol.Biochem.,60:1239,1996)。在關于PGA用途的現(xiàn)有專利中，日本專利特許公開文本平6-32742公開了利用枯草芽胞桿菌(^ac///^產(chǎn)生PGA的方法，以及該PGA在治療骨質(zhì)疏松癥療效的健康食品中應用，例如鈣溶劑。歐洲專利838160公開了PGA具有通過降低水中磷的含量來降低水污染的功效。同樣地，日本專利特許公開本文平10-251402、7-300522以及6-322358公開了通過放射物輻射利用PGA來制備的具有吸收性及生物降解性的樹脂在衛(wèi)生用品(例如尿布)、食品以及園藝中的應用，上述樹脂具有具有高膠凝率和高吸水性。同樣，通過溶解、沉淀和干燥利用PGA制備固化的生物可降解纖維、薄膜、或模型制品也已經(jīng)公開了(日本專利特許公開文本平7-138364和5-117388)。此外，把PGA用作藥物載體的聚合物也已經(jīng)公開了(日本專利特許公開文本平6-92870和6-256220)。同時，本發(fā)明人獲得了一項關于生產(chǎn)PGA方法的發(fā)明專利，該發(fā)明利用枯草芽胞桿菌變種大豆醬(Sad〃Mw6"/"ww:c/zw"gbo^wg)產(chǎn)生高分子量的PGA(韓國專利注冊號500,796)。我們也獲得了關于含有PGA的抗癌混合物、免疫佐劑和免疫強化劑的專利(韓國專利注冊號496,606;517,114和475,406)。此外，我們已在進行PGA其它用途的研究。由此，本發(fā)明人已經(jīng)作了大量努力來尋找具有上述各種作用PGA的其它用途，結果，發(fā)現(xiàn)PGA可對降解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶產(chǎn)生抑制作用。由于透明質(zhì)酸是皮膚結締組織的組成成分，所以PGA不僅有助于保持皮膚彈性，而且PGA本身具有良好的保濕性和加濕性能以及優(yōu)良的皮膚接受性，由此才產(chǎn)生了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于提供一種含有活性成分PGA的透明質(zhì)酸酶抑制劑。本發(fā)明的另一目的在于提供一種能夠保持皮膚彈性的化妝品混合物，該混合物含作為活性成分的PGA。本發(fā)明的又一目的在于提供一種改善過敏性的混合物，該混合物含有作為活性成分的PGA。通過下列詳細描述和附圖將更清楚地理解本發(fā)明的其它特征和實施方式。圖1顯示PGA的透明質(zhì)酸酶抑制活性的示意圖。具體實施例方式一方面，本發(fā)明提供一種含有活性成分PGA的透明質(zhì)酸酶抑制劑。本發(fā)明中的PGA不僅能抑制透明質(zhì)酸酶來防止皮膚結締組織變松散，并且它本身具有良好的皮膚適應性、保濕及加濕性。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于保持皮膚彈性的功能性化妝品混合物，其含有作為活性成分的PGA。本發(fā)明中的化妝品混合物可以是選自下列物質(zhì)中的任一種保濕劑、乳液、精華素和潔面乳。本發(fā)明中的PGA能通過抑制透明質(zhì)酸酶的活性來減輕過敏癥狀，其隨著皮膚炎癥發(fā)展而被活性化從而分解皮膚組織結構并提高炎癥細胞通透性。另一方面，本發(fā)明提供一種用于改善過敏性的混合物，混合物中含有作為活性成分的PGA。本發(fā)明用于改善過敏性的混合物可以從下列物質(zhì)組中任一種選擇保濕劑、乳液、精華素、潔面乳、洗發(fā)水、沐浴露，以及沐浴治療品。本發(fā)明中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分子量為50kDa、2000kDa和4000kDa的PGA都具有很高的透明質(zhì)酸酶抑制活性，并在各種濃度下對透明質(zhì)酸酶顯示出相似的抑制模型。這說明分子量在50kDa和4000kDa之間的PGA都具有相似的透明質(zhì)酸酶抑制活性，抑制效果并不受其分子量的影響。因此，本和發(fā)明中所用PGA的分子量在lkDa和10000kDa之間。本發(fā)明中所用的PGA是通過化學合成或微生物發(fā)酵的方法來產(chǎn)生的，優(yōu)選通過微生物發(fā)酵法，其中更優(yōu)選通過枯草芽胞桿菌變種大豆醬swZ)〃7/sc/w"gA:oo^/awgJ發(fā)酵法。實施例下文將通過具體實施例對本發(fā)明作詳細描述。然而對于本領域技術人員來說，很明顯這些實施例僅僅用于說明性的目的而并非用來限制本發(fā)明的范圍。實施例hPGA的生產(chǎn)1%的枯草芽胞桿菌變種大豆醬(5ac/〃wsswZ)〃fcvar.c/nmg^o&'flwgKCTC0697BP)培養(yǎng)液接種到3L用于生產(chǎn)PGA的基本培養(yǎng)基中(含5%L-谷氨酸的GS培養(yǎng)基5%葡萄糖、1%(NH4)2S04、0.27%KH2P04、0.42%Na2HP04'12H20、0.05%NaCl、0.3%MgS04'7H20、lml/1維生素溶液、pH6.8)，然后在攪拌速度為150rpm、通氣量為lwm及溫度37°C下培養(yǎng)72小時。然后，向培養(yǎng)基中加入2N硫酸溶液直到pH為3，從而獲得含PGA的樣品溶液。含PGA的樣品溶液在4。C中保持IO小時以除去發(fā)酵液中的多糖，加入發(fā)酵液體積2倍的乙醇并充分混合。該混合液在4°C中保持10小時，隨后通過離心收集PGA沉淀物。所收集的沉淀物溶解在蒸餾水中并向其中加入100ug/ml蛋白酶。所得的PGA樣品在37°C的孵化器中放置6小時以降解存在于PGA樣品中的胞外蛋白質(zhì)。所得樣品在足夠量的蒸餾水中透析以除去游離的谷氨酸并隨后濃縮以獲得純PGA。利用GPC(凝膠滲透柱)測定所得PGA的分子量并根據(jù)分子量進行分離，收集分子量分別為50kDa、2000kDa和4000kDa的PGAs。分析所收集的PGAs對透明質(zhì)酸酶的抑制作用。實施例2:PGAs的透明質(zhì)酸酶抑制活性根據(jù)實施例1所獲得的分子量為50kDa、2000kDa和4000kDa的每種PGAs溶解成濃度為1%。添加400單位/ml透明質(zhì)酸酶，將每種PGA溶液加調(diào)成PGA濃度為0.002%、0.003%、0.004%、0.006%及0.008%，隨后在37°C下與透明質(zhì)酸酶反應20分鐘。然后，向與PGA反應的透明質(zhì)酸酶溶液中添加0.1mg/ml作為活性化劑的化合物48/80、2.5mMCaCl2禾P0.15MNaCl，該混合物在37°C下反應20分鐘。向反應溶液中添加0.4mg/ml的透明質(zhì)酸并在37。C下反應20分鐘。然后，通過添加0.4NNaOH終止反應。向反應溶液中添加3mllX的p-DABA(p-二甲氨基苯甲醛)并在37°C下反應20分鐘。然后，在吸光度585nm下，利用摩爾根-埃爾森法(Moegan-Elson)測定反應溶液的酶活性。PGA對透明質(zhì)酸酶活性的抑制作用百分數(shù)通過計算和PGA反應的透明質(zhì)酸酶溶液酶活性與未和PGA反應的透明質(zhì)酸溶液酶活性的比率來確定(NakoiFujitani，J.Appl.Phycol.,13:489，2001)。抑制百分數(shù)(％)={1-(與PGA反應的透明質(zhì)酸酶溶液的吸光度-與PGA反應的透明質(zhì)酸酶溶液的空白吸光度/未與PGA反應的透明質(zhì)酸酶溶液的吸光度-未與PGA反應的透明質(zhì)酸酶溶液的空白吸光度)》X100。結果，如圖1所示，分子量為50-4000kDa的PGAs具有相似的透明質(zhì)酸酶抑制活性，而不受其分子量大小的影響。此外，它們的IC5o值顯示為0.0025%而在濃度為0.008%的PGA溶液中抑制活性顯示為100%。配方在下文中，將描述本發(fā)明關于保濕劑(皮膚)、洗液(乳液)和洗發(fā)水的配方，但包含創(chuàng)造性化妝品混合物在內(nèi)的配方并不限于此。配方1:含PGA保濕劑混合物的制備0.05g聚吡咯垸酮、O.lg油醇、0.2g聚氧乙烯單油酸酯、0.2g香精、O.lg羥基苯甲酸甲酯和少量抗氧化劑混合并在8g95%乙醇中溶解。將該混合溶液與含0.4g50kDaPGA和5g甘油溶液溶解于85.33g純水中，并充分混合和攪拌，由此制備能改善皮膚彈性的保濕劑。配方2:含PGA洗液(乳液)的制備1.2g乙醇、10g海鮫油、2g凡士林、0.2g羥基苯甲酸乙酯、lg單硬脂酸甘油酯、lg聚氧乙烯(20M)單油酸酯和0.1g香精混合并在70。C下加熱溶解。在70°C下加熱溶解0.4g2000kDaPGA、5g二丙二醇、2g聚乙二醇1500、0.2g三乙醇胺和76,2g純水?；旌线@兩種溶液，并冷卻所得乳狀液，由此制備具有改善皮膚彈性的水包油洗液。配方3:含PGA洗發(fā)水的制備15g月桂基硫酸鈉、10g十二醇硫酸鈉、5g椰油酰胺丙基三甲銨乙內(nèi)酯(cocamidopropylenebetaine)、0.lg乙二胺四乙酸鈉和3g三甲銨乙內(nèi)酯混合。向混合液中加入0.4g4000kDaPGA和66.5g純水并溶解，由此制備具有改善過敏性的洗發(fā)水。實施例3:含PGA的化妝品和混合物用于改善過敏性的敏感性測試(1)皮膚彈性的提高1.測試方法(i)測試對象50名30-50歲婦女(對照組25個人；配方1和2測試組25人)。(ii)所測試的混合物測試組使用配方1和2的保濕劑和洗液，對照組使用具有和配方1和2相同組成成分但不含PGA的保濕劑和洗液。(iii)測試時期2個月(2005年5月到2005年6月)2.結果測試含PGA混合物的測試組的25個人中，有22人皮膚情況得到了改善。表1:含PGA混合物的功能性測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)過敏性的改善1.測試方法(i)測試對象:30名患異位性皮膚炎癥的小孩(年紀小于13歲)。對照組15人；測試配方3的測試組15人。(ii)所測試的混合物測試組使用配方3所配制的洗發(fā)水，對照組使用具有和配方3相同組成成分但不含PGA的混合物。(iii)測試時間2個月(2005年5月-2005年6月)2.結果測試含洗發(fā)水的測試組中15人中的8人的多種癥狀都有了效果，例如癢感減輕等。表2:含PGA洗發(fā)水的功能性測試結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>雖然上文已對本發(fā)明的特定實施方式作了具體描述，但是本領域技術人員可知這些描述僅僅是為了給出優(yōu)選實施方式而并不解釋為對本發(fā)明范圍的限定。相應地，本發(fā)明的實質(zhì)性范圍由所附權利要求及其等同實施方式來限定。工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明提供含有效成分為PGA的透明質(zhì)酸酶抑制劑、保持皮膚彈性的混合物和改善過敏性的混合物，其特征在于，每種混合物都含有效成分PGA。含PGA的獨創(chuàng)混合物通過抑制透明質(zhì)酸酶的活性從而有效保持皮膚濕潤和皮膚彈性，所述透明質(zhì)酸酶為降解皮膚真皮組織中透明質(zhì)酸的酶。同樣，該混合物也能夠通過抑制炎癥細胞的通透性從而減輕過敏癥狀。權利要求1、一種含有活性成分聚-γ-谷氨酸(PGA)的透明質(zhì)酸酶抑制劑。2、根據(jù)權利要求1所述的透明質(zhì)酸酶抑制劑，其特征在于，PGA的分子量為l-10,000kDa。3、一種用于保持皮膚彈性的功能性化妝品混合物，其特征在于，含有作為活性成分的聚-Y-谷氨酸(PGA)。4、根據(jù)權利要求3所述的用于保持皮膚彈性的功能性化妝品混合物，其特征在于，PGA的分子量為l-10,000kDa。5、根據(jù)權利要求3所述的用于保持皮膚彈性的功能性化妝品混合物，其特征在于，可以是選自如下組中的任一種保濕劑、乳液、精華素和潔面乳。6、一種用于改善過敏性的混合物，其特征在于，含有作為活性成分的聚-Y-谷氨酸(PGA)。7、根據(jù)權利要求6所述的用于改善過敏性的混合物，其特征在于，PGA的分子量為l-10,000kDa。8、根據(jù)權利要求6所述的用于改善過敏性的混合物，其特征在于，可以是選自如下組中的任一種保濕劑、乳液、精華素、潔面乳、洗發(fā)水、沐浴露、以及(沐浴治療品)。全文摘要本發(fā)明涉及一種含有效成分聚-γ-谷氨酸(PGA)的透明質(zhì)酸酶抑制劑，一種用于保持皮膚彈性的混合物以及一種用于改善過敏性的混合物，其特征在于，每種混合物都含有作為有效成分的PGA。該含有PGA的獨創(chuàng)性混合物可以通過抑制透明質(zhì)酸酶的活性來有效保持皮膚濕潤和皮膚彈性，其中所述透明質(zhì)酸酶是降解存在于皮膚真皮層中的透明質(zhì)酸的酶。同樣，該混合物也能夠通過抑制炎癥細胞的通透性來減輕過敏癥狀。文檔編號A61K8/00GK101304724SQ200580051876公開日2008年11月12日申請日期2005年10月31日優(yōu)先權日2005年10月20日發(fā)明者宇山浩,崔在喆,成文喜,清樸,樸昭林申請人:生物領先公司