專利名稱：Hcv ns3－ns4a蛋白酶抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制絲氨酸蛋白酶、特別是抑制丙型肝炎病毒NS3-NS4A蛋白酶活性的化合物。這些化合物通過干擾HCV生命周期發(fā)揮作用，并且是有用的抗病毒藥。本發(fā)明進(jìn)而涉及既可離體應(yīng)用也可給予HCV感染病人的組合物。本發(fā)明也涉及給病人施用本發(fā)明組合物治療HCV感染的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(“HCV”)感染是一個(gè)備受關(guān)注的人類醫(yī)學(xué)問題。估計(jì)全球有3％的人血清流行，故HCV被認(rèn)為是大多數(shù)非甲非乙型肝炎病例的致病因子[Alberti A等.丙型肝炎的自然史.J Hepatology.1999，31(Suppl.1)17～24]。單單在美國(guó)約有4百萬(wàn)人可能被感染[Alter MJ等.美國(guó)病毒性肝炎的流行病學(xué).Gastroenterol Clin North Am，1994，23437～455；Alter MJ.美國(guó)的HCV感染.J Hepatology，1999，31(Suppl 1)88～91]。
首次暴露于HCV，僅約20％感染者發(fā)展成臨床急性肝炎，而其他人表現(xiàn)出感染自發(fā)消退?？墒窃趲缀?0％病例中HCV確立了能持續(xù)幾十年的慢性感染[Iwarson S.慢性肝炎的自然病程.FEMS Microbiology Reviews，1994，14201～204；Lavanchy D等.丙型肝炎的全球監(jiān)督和管理.J Viral Hepatitis，1999，635～47]。這通常會(huì)造成復(fù)發(fā)和進(jìn)行性惡化的肝臟炎癥，常常會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病狀態(tài)如肝硬化和肝細(xì)胞癌[Kew MC.丙型肝炎和肝細(xì)胞癌.FEMS Microbiology Reviews，1994，14211～220；Saito I等.HCV感染伴發(fā)肝細(xì)胞癌.Proc Natl Acad Sci USA，1990，876547～6549]。遺憾的是，對(duì)慢性HCV使人衰弱的進(jìn)程尚無(wú)普遍有效的治療方法。
HCV基因組編碼一種3010～3033個(gè)氨基酸的多聚蛋白[Choo QL等.HCV的多樣性與基因組成.Proc Natl Acad Sci USA，1991，882451～2455；Kato N等.日本非甲非乙型肝炎病人的人類HCV基因組的分子克隆.ProcNatl Acad Sci USA，1990，879524～9528；Takamizawa A等.從人攜帶者中分離得到HCV基因組的結(jié)構(gòu)和組織.J Virol，1991，651105～1113]。推測(cè)這種HCV非結(jié)構(gòu)性(NS)蛋白為病毒復(fù)制提供了必需的催化機(jī)制。NS蛋白由多聚蛋白的蛋白裂解而來[Bartenschlager R等.HCV的非結(jié)構(gòu)性蛋白3編碼切割NS3/4和NS4/5接頭所需的絲氨酸型蛋白酶.J Virol，1993，673835～3844；Grakoui A等.HCV編碼的絲氨酸蛋白酶的特征蛋白酶依賴性多聚蛋白切割位點(diǎn)的測(cè)定.J Virol.1993，672832～2843；Grakoui A等.HCV多聚蛋白裂解產(chǎn)物的表達(dá)和鑒定.J Virol，1993，671385～1395；Tomei L等.NS3是HCV多聚蛋白加工所需的絲氨酸蛋白酶.J Virol，1993，674017～4026]。
HCV NS3包含絲氨酸蛋白酶活性，它可幫助加工處理大多數(shù)病毒酶，因此被認(rèn)為對(duì)病毒復(fù)制和感染性是必需的。HCV NS3絲氨酸蛋白酶對(duì)病毒復(fù)制是必需的，因?yàn)榇呋?lián)體的取代導(dǎo)致在黑猩猩上感染性的喪失[Kolykhalov AA等.HCV編碼的酶活性和3’非翻譯區(qū)RNA保守元件是體內(nèi)病毒復(fù)制所必需的.J Virol，2000，742046～2051]。已知NS3的頭181個(gè)氨基酸(病毒多聚蛋白的1027～1207殘基)含有NS3的絲氨酸蛋白酶區(qū)域，能加工處理HCV多聚蛋白所有4個(gè)下游位點(diǎn)[Lin C等.HCVNS3絲氨酸蛋白酶反式裂解要求和加工動(dòng)力學(xué).J Virol，1994，68，8147～8157]。
HCV NS3絲氨酸蛋白酶及其相關(guān)輔助因子NS4A幫助加工病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白區(qū)成為包括所有病毒酶在內(nèi)的各非結(jié)構(gòu)性蛋白。這種加工類似于人免疫缺陷病毒天冬氨酰蛋白酶所進(jìn)行的加工，此酶也涉及病毒蛋白的加工。抑制病毒蛋白加工的HIV蛋白酶抑制劑，對(duì)人是有效的抗病毒藥，提示阻斷病毒生命周期的這一階段可導(dǎo)致具有治療作用的活性藥物產(chǎn)生。因此它是發(fā)現(xiàn)藥物的有吸引力的靶標(biāo)。
現(xiàn)有技術(shù)描述了幾種潛在的HCV蛋白酶抑制劑[PCT公開號(hào)WO02/18369，WO 02/08244，WO 00/09558，WO 00/09543，WO 99/64442，WO99/07733，WO 99/07734，WO 99/50230，WO 98/46630，WO 98/17679和WO97/43310，美國(guó)專利5,990,276，Llinas-Brunet M等.Bioorg Med Chem Lett，1998，81713～18；Han W等.Bioorg Med Chem Lett，2000，10711～13；Dunsdon R等.Bioorg Med Chem Lett，2000，101571～79；Llinas-Brunet M等.Bioorg Med Chem Lett，2000，102267～70和LaPlante S等.Bioorg Med ChemLett，2000，102271～74]。不清楚這些化合物是否具有成為可接受藥物的合適特征。而且發(fā)現(xiàn)那些抑制劑即使不是全部，也大多數(shù)是將基因型1(1a或1b)NS3-4A絲氨酸蛋白酶用作靶標(biāo)?？墒荋CV存在有各種基因型，而且每種基因型中又有各種亞型。例如目前已知有11種(編號(hào)1～11)主要HCV基因型，盡管其他人將它們分成6種主要基因型。每種基因型又進(jìn)一步細(xì)分成各種亞型(1a～1c，2a～2c，3a～3b，4a～4e，5a，6a，7a～7b，8a～8b，9a，10a和11a)。
亞型的流行性在全球范圍內(nèi)有如下變化

目前流行的科學(xué)信念是HCV基因型或亞型可決定病人對(duì)治療的反應(yīng)性。已經(jīng)注意到病人對(duì)干擾素療法的反應(yīng)與HCV基因組的復(fù)雜程度之間有相關(guān)性，可是這種相關(guān)的原因不清楚。一般認(rèn)為基因2型HCV和基因3型HCV病毒感染的病人對(duì)常規(guī)治療的反應(yīng)程度不同于那些基因1型HCV感染的病人。因此雖然設(shè)計(jì)/開發(fā)了一系列抗基因1型HCV蛋白酶的HCV蛋白酶抑制劑，但不清楚這些抑制劑是否會(huì)有效地抑制其他基因型諸如基因2型和基因3型HCV的N3-4A絲氨酸蛋白酶。
所以目前對(duì)HCV的了解沒有導(dǎo)致產(chǎn)生令人滿意的抗HCV藥劑或療法。HCV疾病的唯一確定的療法是用聚乙二醇化的(pegylated)干擾素加利巴韋林聯(lián)合治療?？墒歉蓴_素有明顯的副作用[Wlaker MA等.HCV對(duì)流行方法及進(jìn)展的看法.DDT，1999，4518～29；Moradpour D等.丙型肝炎的現(xiàn)行和將來的療法.Eur J Gastroenterol Hepatol，1999，111199～1202；Janssen HLA等.與慢性病毒性肝炎的α-干擾素療法相關(guān)的自殺.J Hepatol，1994，21241～243；Renault PF等.α-干擾素的副作用.Seminars in Liver Disease，1989，9273～277]，而且僅使一部分(～25％)病人長(zhǎng)期緩解[Weiland O.慢性HCV感染的干擾素療法.FEMS Microbiol Rev，1994，14279～288]。另外，這種聯(lián)合用藥療法在基因2型或3型HCV感染病人中，約80％有持久的病毒應(yīng)答(SVR)，而在基因1型HCV感染病人中約40～50％有SVR[McHutchison JG等.N Engl J Med，1998，3391485～1492；Davis GL等.NEngl J Med，1998，3391493～1499]。此外，有效的抗HCV疫苗的前景仍不明朗。
因此，需要開發(fā)更有效的抗HCV療法，特別是抑制HCV NS3蛋白酶的化合物。這樣的化合物可能是有用的抗病毒藥，尤其是抗HCV藥。也需要開發(fā)抑制各種基因型HCV絲氨酸蛋白酶的化合物。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供用VX-950抑制基因2型和3型HCV的方法解決了這些需求。雖然本發(fā)明列舉說明VX-950在特異性抑制基因2型和3型HCV方面優(yōu)于其它蛋白酶抑制劑，但考慮VX-950也能有益于抑制其它非基因1型HCV基因型。
本發(fā)明也涉及包括VX-950的組合物及其用途。這樣的組合物可用于待插入病人體內(nèi)的侵入性裝置的預(yù)處理，在給予病人前的生物樣品如血液的處理，也可直接給予病人。在每一種情況下本發(fā)明組合物將會(huì)用來抑制HCV復(fù)制和減輕HCV感染的危險(xiǎn)性或嚴(yán)重度。
附圖簡(jiǎn)述

圖1 11種基因2型HCVNS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的氨基酸序列對(duì)比；圖2基因2a型NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的共有氨基酸和核苷酸序列；圖3 6種基因3型HCVNS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的氨基酸序列對(duì)比；
圖4基因3a NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的共有氨基酸和核苷酸序列；圖5每種基因型或亞型(1a，1b，2a，2b，3a和3b)的共有氨基酸序列對(duì)比。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供單獨(dú)或者同時(shí)抑制基因型-2或基因型-3蛋白酶的方法，所述方法是通過使基因型-2或基因型-3蛋白酶和VX-950接觸而實(shí)現(xiàn)的。
VX-950是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的、可逆轉(zhuǎn)的擬肽NS3/4A蛋白酶抑制劑，其穩(wěn)態(tài)結(jié)合常數(shù)(Ki*)為3nM(其Ki為8nM)[WO 02/018369]。VX-950一般可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的方法制備(參見，如WO 02/18369)。
本發(fā)明化合物可以含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱碳原子，因而可以外消旋體與外消旋混合物、單一的對(duì)映體、非對(duì)映體混合物和單獨(dú)的非對(duì)映體存在。這些化合物的所有這類異構(gòu)體形式都明確包括在本發(fā)明中。每個(gè)立體碳可以是R或S構(gòu)型。
例如，在特定的實(shí)施方案中，所使用的化合物可以是如下結(jié)構(gòu)所示的位于N-丙基側(cè)鏈的D-和L-異構(gòu)體的混合物。
結(jié)構(gòu)A使用如VX-950或者結(jié)構(gòu)A化合物為起始化合物，通過合理藥物設(shè)計(jì)產(chǎn)生的其他藥物可被用于測(cè)試其作為蛋白酶抑制劑的活性。
優(yōu)選地，本發(fā)明化合物具有如化合物VX-950所描繪的結(jié)構(gòu)和立體化學(xué)。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方式提供包含VX-950或其藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。按照一種優(yōu)選的實(shí)施方式，VX-950的含量可有效降低樣品或患者中的病毒負(fù)載，其中所述病毒編碼病毒生命周期所必需的絲氨酸蛋白酶，該組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。
如果在這些組合物中采用本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，那么這些鹽優(yōu)選地是從無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和堿衍生的。在這類酸的鹽中包括如下乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。堿加成鹽包括銨鹽；堿金屬鹽，例如鈉和鉀鹽；堿土金屬鹽，例如鈣和鎂鹽；有機(jī)堿鹽，例如二環(huán)己胺鹽、N-甲基-D-葡糖胺鹽；以及與氨基酸如精氨酸、賴氨酸的鹽，等等。
而且，堿性含氮基團(tuán)可以被一些試劑季銨化，所述試劑為例如低級(jí)烷基鹵化物，如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷酯，如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；長(zhǎng)鏈鹵化物，如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基鹵化物，如芐基和苯乙基的溴化物；以及其他化合物。由此得到水或油溶性或可分散性產(chǎn)物。
本發(fā)明組合物和方法中所用的化合物還可以通過添加適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)加以修飾，以增強(qiáng)選擇性生物學(xué)性質(zhì)。這類修飾是本領(lǐng)域已知的，包括增加進(jìn)入給定生物系統(tǒng)(例如血液、淋巴系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng))的生物穿透性、增加口服生物利用度、增加溶解度以便注射給藥、改變代謝和改變排泄速率。
可以用在這些組合物中的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、緩沖物質(zhì)(例如磷酸鹽)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)，例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素類物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
按照一種優(yōu)選的實(shí)施方式，將本發(fā)明的組合物配制成對(duì)哺乳動(dòng)物給藥的形式，所述哺乳動(dòng)物優(yōu)選人類。
本發(fā)明的這類藥物組合物可以被口服、腸胃外、通過吸入噴霧、局部、直腸、鼻、頰、陰道或經(jīng)由植入藥庫(kù)給藥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病灶內(nèi)與顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。組合物優(yōu)選口服或靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明組合物的無(wú)菌可注射形式可以是水性或油性混懸劑。這些混懸劑可以按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)、利用適合的分散或潤(rùn)濕劑和懸浮劑加以配制。無(wú)菌的可注射制劑還可以是在無(wú)毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液劑或混懸劑，例如在1，3-丁二醇中的溶液?？梢圆捎玫目山邮艿妮d體和溶劑有水、林格氏溶液和等滲的氯化鈉溶液。另外，無(wú)菌的不揮發(fā)油也經(jīng)常被用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以采用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的單-或二-甘油酯。脂肪酸、例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制備注射劑，它們是天然的藥學(xué)上可接受的油，例如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙基化形式。這些油溶液劑或混懸劑還可以含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，例如羧甲基纖維素或類似的分散劑，它們通常用于配制藥學(xué)上可接受的劑型，包括乳劑和混懸劑。出于制劑的目的，還可以使用其他常用的表面活性劑，例如吐溫類、司盤類，和其他乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑，它們普遍用在藥學(xué)上可接受的固體、液體或其他劑型的制造中。
在抗病毒尤其是抗HCV介導(dǎo)的疾病的預(yù)防和治療的單一療法中，本說明書所述蛋白酶抑制劑化合物的劑量水平為每天約0.01-約100mg/kg體重、優(yōu)選每天約0.5-約75mg/kg體重。通常，本發(fā)明藥物組合物每天約給藥1-5次或以連續(xù)輸注作為替代。這樣的給藥可用作慢性的或急性的治療?？膳c載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量因所治療的宿主和特定的給藥方式而變化。典型的制劑含有約5％-約95％(w/w)的活性化合物。優(yōu)選地，這種制劑含有約20％-約80％的活性化合物。正如熟練的專業(yè)人員所認(rèn)識(shí)到的那樣，通常以IU測(cè)定干擾素的劑量(例如約4百萬(wàn)IU至約1千2百萬(wàn)IU)。
當(dāng)本發(fā)明的組合物包含VX-950和一種或者一種以上其它治療或預(yù)防用藥物的組合時(shí)，該化合物和其他藥物的劑量水平都處于單一治療方案通常給藥劑量的約10％-100％，更優(yōu)選處于約10-80％。
本發(fā)明藥物組合物可以任何口服可接受的劑型口服給藥，包括但不限于膠囊劑、片劑、水性混懸劑或溶液劑。在口服片劑的情況下，常用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還加入潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂。就以膠囊劑型口服給藥而言，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)需要用水性混懸劑口服時(shí)，活性成分是與乳化和懸浮劑合用的。如果需要的話，還可以加入某些甜味劑、矯味劑或著色劑。
作為替代選擇，本發(fā)明藥物組合物可以栓劑形式直腸給藥。它們可通過將藥物與合適的無(wú)刺激性賦形劑混合而加以制備，所述賦形劑在室溫下是固體，但是在直腸溫度下是液體，因此會(huì)在直腸內(nèi)融化，釋放藥物。這類材料包括可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。
本發(fā)明藥物組合物還可局部給藥，尤其當(dāng)治療靶標(biāo)包括容易為局部用藥接近的區(qū)域或器官時(shí)，包括眼、皮膚或下部腸道的疾病。適合的局部制劑可根據(jù)每種這些區(qū)域或器官容易地制備。
下部腸道的局部用藥可以直腸栓劑(見上)或適宜的灌腸劑進(jìn)行。還可以使用局部透皮貼劑。
就局部用藥而言，可以將藥物組合物配制成適合的軟膏劑，其中含有懸浮或溶解在一種或多種載體中的活性組分。用于本發(fā)明化合物局部給藥的載體包括但不限于礦物油、液體石蠟、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。作為替代選擇，可以將藥物組合物配制成合適的洗劑或霜?jiǎng)?，其中含有懸浮或溶解在一種或多種藥學(xué)上可接受的載體中的活性組分。適合的載體包括但不限于礦物油、脫水山梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨脂蠟、芳基鯨脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
就眼用而言，可以將藥物組合物配制成在等滲的經(jīng)過pH調(diào)節(jié)的無(wú)菌鹽水中的微粉化混懸劑，或者優(yōu)選為在等滲的經(jīng)過pH調(diào)節(jié)的無(wú)菌鹽水中的溶液，其中含有或沒有防腐劑，例如苯扎氯銨(benzylalkonium chloride)。作為替代選擇，就眼用而言，可以將藥物組合物配制在軟膏劑例如凡士林中。
本發(fā)明藥物組合物還可以借助鼻氣霧劑或吸入給藥。這類組合物是按照藥物制劑領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備的，可以制成在鹽水中的溶液劑，其中采用苯甲醇或其他合適的防腐劑、增強(qiáng)生物利用度的吸收增強(qiáng)劑、碳氟化合物和/或其他常規(guī)的增溶或分散劑。
最優(yōu)選的是配制成用于口服給藥的藥物組合物。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物另外包含另一種抗病毒劑，優(yōu)選為抗-HCV劑。這類抗病毒劑包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑，例如α-、β-與γ-干擾素、聚乙二醇衍生化的干擾素-α化合物和胸腺素；其他抗病毒劑，例如利巴韋林、金剛烷胺和替比夫定；其他丙型肝炎蛋白酶抑制劑(NS2-NS3抑制劑和NS3-NS4A抑制劑)；HCV生命周期中其他靶點(diǎn)的抑制劑，包括螺旋酶與聚合酶抑制劑；內(nèi)部核糖體進(jìn)入抑制劑；廣譜病毒抑制劑，例如IMPDH抑制劑(例如美國(guó)專利5807876、6498178、6344465、6054472、WO 97/40028、WO 98/40381、WO 00/56331中的化合物、霉酚酸及其衍生物，包括但不限于VX-497、VX-148、和/或VX-944)；或任意上述抗病毒劑的組合。參見W.Markland等，Antimicrobial & Antiviral Chemotherapy，44，p.859(2000)和美國(guó)專利6541496。
本文使用下列定義(商標(biāo)指截止本申請(qǐng)的申請(qǐng)日時(shí)可獲得的產(chǎn)品的商標(biāo))。
“Peg-Intron”是指PEG-Intron，聚乙二醇干擾素(peginteferon)α-2b，得自于Schering Corporation，Kenilworth，NJ；“Intron”是指Intron-A，干擾素α-2b得自于Schering Corporation，Kenilworth，NJ；“利巴韋林”是指利巴韋林(1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-氨甲酰，得自于ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA；在Merck Index，條目8365，第12版中有描述；也可以是Rebetol，從Schering Corporation，Kenilworth，NJ得到，或者是Copegus，從Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ得到；“Pegasys”是指Pegasys，聚乙二醇干擾素α-2a，得自于Hoffmann-LaRoche，Nutley，NJ；“Roferon”是指Roferon，重組細(xì)胞干擾素α-2a，得自于Hoffmann-LaRoche，Nutley，NJ；“Berefor”是指Berefor，干擾素α-2，得自于Boehringer IngelheimPharmaceutical，Inc.，Ridgefield，CT；Sumiferon，天然α干擾素例如Sumiferon的純化混合物，得自于Sumitomo，日本；Wellferon，干擾素α n1，得自于Glaxo-Wellcome LTd.，Great Britain；Alferon，天然α干擾素的混合物，Interferon Sciences生產(chǎn)，得自于Purdue Frederick Co.，CT。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“干擾素”是指抑制病毒復(fù)制和細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的高度同源的種特異性蛋白的一個(gè)家族成員，例如干擾素α，干擾素β，或干擾素γ。The Merck Index，條目5015，第12版。
按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，干擾素是α-干擾素。按照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的治療組合使用天然的α干擾素2a?；蛘?，本發(fā)明的治療組合使用天然的α干擾素2b。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合使用重組α干擾素2a或2b。在又一個(gè)實(shí)施方案中，干擾素是聚乙二醇化的α干擾素2a或2b。適合于本發(fā)明的干擾素包括(a)Intron(干擾素-α2B，Schering Plough)，(b)Peg-Intron，(c)Pegasys，(d)Roferon，(e)Berofor，(f)Sumiferon，(g)惠福仁(Wellferon)，(h)共有性α干擾素，得自于Amgen，Inc.，Newbury Park，CA，
(i)Alferon；(j)Viraferon；(k)干復(fù)津(Infergen)。
正如熟練的專業(yè)人員所認(rèn)識(shí)到的那樣，優(yōu)選口服給予蛋白酶抑制劑。通常不口服給予干擾素。盡管如此，本說明書并不將本發(fā)明的方法或組合限制于任何具體劑型或給藥方式。因此，按照本發(fā)明的組合中的每個(gè)組份可以單獨(dú)、一起或以它們的任何組合形式給予。
在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶抑制劑和干擾素是以分開的劑型的方式給予的。在一個(gè)實(shí)施方案中，任何附加的藥劑是作為含有蛋白酶抑制劑的單一劑型的一部分或作為分開的劑型給予的。由于本發(fā)明涉及化合物的組合，每個(gè)化合物的具體用量可以取決于組合中的每個(gè)其它化合物的具體用量。正如熟練的專業(yè)人員所認(rèn)識(shí)到的那樣，通常以IU定干擾素的劑量(例如約4百萬(wàn)IU至約1千2百萬(wàn)IU)。
相應(yīng)地，可以在與本發(fā)明化合物的聯(lián)合用藥中使用的藥物(無(wú)論起免疫調(diào)節(jié)劑或其它的作用)包括但是不局限于干擾素-α2B(Intron A，ScheringPlough)；Rebatron(Schering Plough，干擾素-α2B+利巴韋林)；聚乙二醇化的干擾素α(Reddy，K.R.等，“Efficacy and Safety of Pegylated(40-kd)interferon-α-2a compared with interferon alpha-2a in noncirrhotic patients withchronic hepatitis C(Hepatology，33，pp.433-438(2001)；共有性干擾素(Kao，J.H.，等，“Efficacy of Consensus Interferon in the Treatement of ChronicHepatitis”J.Gastroenterol.Hepatol.15，pp.1418-1423(2000)，干擾素-α 2A(Roferon A；Roche)，成淋巴細(xì)胞樣或“天然的”干擾素；干擾素tau(Clayette，P.等，“IFN-tau，A New Interferon Type I with Antiretroviral activity”Pathol.Biol.(Paris)47，pp.553-559(1999)；白介素2(Davis，G.L.等，“Future Optionsfor the Management of Hepatitis C.”Seminars in Liver Disease，19，PP.103-112(1999)；白介素6(Davis等，“Future Options for the Management ofHepatitis C.”Seminars in Liver Disease19，PP.103-112(1999)；白介素12(Davis，G.L.等，“Future Options for the Management of Hepatitis C.”Seminarsin Liver Disease，19，pp.103-112(1999)；利巴韋林；以及提高1型輔助T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)展的化合物(Davis等，“Future Options for the Management ofHepatitis C.”Seminars in Liver Disease，19，pp.103-112(1999)。干擾素可以通過發(fā)揮直接的抗病毒作用和/或通過調(diào)整對(duì)于感染的免疫應(yīng)答來減輕病毒感染。干擾素的抗病毒素作用常常通過抑制病毒侵入或脫殼、病毒RNA的合成、病毒蛋白的翻譯和/或病毒組裝和釋放來介導(dǎo)。
刺激細(xì)胞合成干擾素的化合物(Tazulakhova，E.B.等，“RussianExperience in Screening，analysis，and Clinical Application of Novel InterferonInducers”J.Interferon Cytokine Res.，21 pp.65-73)包括但不局限于雙鏈RNA，單用或與妥布霉素(tobramycin)和咪喹莫特(Imiquimod)聯(lián)用(3MPharmaceuticals；Sauder，D.N.“Immunomodulatory and PharmacologicProperties of Imiquimod”J.Am.Acad.Dermatol.，43 pp.S6-11(2000)。
其它可以與本發(fā)明的化合物組合使用的非免疫調(diào)節(jié)或免疫調(diào)節(jié)化合物包括但不限于在WO 02/18369中具體說明的那些，將其引入本文中作為參考(參見，例如，第273頁(yè)第9-22行和第274頁(yè)第4行至第276頁(yè)第11行，將其全文引入本文中作為參考)。
刺激細(xì)胞合成干擾素的化合物(Tazulakhova，E.B.等，J.InterferonCytokine Res.，21 pp.65-73)包括但不局限于雙鏈RNA，單用或與妥布霉素(tobramycin)和咪喹莫特(Imiquimod)聯(lián)用(3M Pharmaceuticals；Sauder，D.N.“Immunomodulatory and Pharmacologic Properties of Imiquimod”J.Am.Acad.Dermatol.，43 pp.S6-11(2000)。
其它具有或可能具有通過非免疫調(diào)節(jié)機(jī)制抗HCV病毒活性的化合物包括但不限于利巴韋林(ICN Pharmaceuticals)；肌苷5′-單磷酸脫氫酶抑制劑(本文提供的式VX-497)；金剛烷胺和金剛乙胺(Younossi等，Seminars inLiver Diseases，19，95-102(1999))；LY217896(美國(guó)專利4835 168)(Colacino等，Antimicrobial Agents & Chemotherapy 34，2156-2163(1990))；和9-肟基-6-甲氧基-1，4a二甲基1，2，3，4，4a，9，10，10a-八氫-菲-1-羧酸甲酯；6-甲氧基-1，4a二甲基-9-(4-甲基-哌嗪-1-基亞胺基)-1，2，3，4，4a，9，10，10a-八氫-菲-1羧酸甲酯鹽酸鹽；1-(2-氯-苯基)-3-(2，2-二苯基-乙基)-脲(美國(guó)專利6,127,422)。
上述分子的給藥劑型、劑量和途徑在如下引用的參考文獻(xiàn)中有說明，或者是本領(lǐng)域熟知的，例如F G，Hayden，Goodman & Gilman′s ThePharmacological basis of Therapeutics，第9版；Hardman等編，McGraw-Hill，New York(1996)，第50章，1191-1223頁(yè)和其中引用的參考文獻(xiàn)?；蛘撸坏╄b定出顯示有抗病毒活性的化合物，可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)測(cè)定該化合物的藥學(xué)有效量。例如見Benet等，Goodman & Gilman′s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，第9版；Hardman等編，McGraw-Hill，New York(1996)，第1章，第3-27頁(yè)和其中引用的參考文獻(xiàn)。因此不難用常規(guī)方法確定這類化合物的適合劑型、劑量范圍和劑量方案。
可將本發(fā)明的藥物組合給予細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞、或病人，以分開的藥學(xué)上可接受的劑型同時(shí)或依次給予，或以含有一種以上治療藥物的制劑形式給予，或以單一藥物和多種藥物配方的形式給予。不論何種給予途徑，這些藥物組合形成各組分的抗HCV有效量。
近年來能獲得的可用于本發(fā)明方法中的大量其他免疫調(diào)節(jié)和免疫刺激劑包括AA-2G；金剛酰胺二肽；腺苷脫氨酶；Enzon佐劑，Alliance；佐劑Ribi；佐劑Vaxcei；Adjuvax；agelasphin-11；AIDS治療藥物，Chiron；海藻葡聚糖，SRI；alganunulin，Anutech；Anginlyc；抗細(xì)胞因子，Yeda；抗皮質(zhì)素；抗胃泌素-17免疫原，Ap；抗原輸送系統(tǒng)，Vac；抗原制劑，IDBC；抗GnRH免疫原，Aphton；Antiherpin；阿比朵爾(Arbidol)；氮雙吡咯；Bay-q-8939；Bay-r-1005；BCH-1393；倍他非??；Biostim；BL-001；BL-009；Broncostat；Cantastim；CDRI-84-246；頭孢地嗪；驅(qū)化因子抑制劑，ICOS；CMV肽，City ofHope；CN-5888；細(xì)胞因子釋放劑，St；DHEAS，Paradigm；DISC TA-HSV；J07B；I01A；I01Z；地替卡鈉；ECA-10-142；ELS-1；內(nèi)毒素，Novartis；FCE-20696；FCE-24089；FCE-24578；FLT-3配體，Immunex；FR-900483；FR-900494；FR-901235；FTS-Zn；G-蛋白，Cadus；gludapcin；磺乙谷酰胺；糖磷肽；GM-2；GM-53；GMDP；生長(zhǎng)因子疫苗，EntreM；H-BIG，NABI；H-CIG，NABI；HAB-439；幽門螺桿菌疫苗；皰疹特異性免疫因子；HIV治療，United Biomed；HyperGAM+CF，ImmuMax；ImmunBCG；免疫治療，Connective；免疫調(diào)節(jié)劑，Evans；免疫調(diào)節(jié)劑，Novacell；伊姆雷-1；伊姆雷-2；Indomune；肌苷pranobex；干擾素，Dong-A(α-2)；干擾素，Genentech(γ)；干擾素，Novartis(α)；白介素-12，Genetics Inc；白介素-15，Immunex；白介素-16，Research Cor；ISCAR-1；J005X；L-644257；licomarasminic acid；LipoTher；LK-409，LK-410；LP-2307；LT(R1926)；LW-50020；MAF，Shionogi；MDP衍生物，Merck；甲硫啡肽，TNI；甲基呋喃基丁內(nèi)酯；MIMP；米立司亭；混合細(xì)菌疫苗，Tem，MM-1；moniliastat；MPLA，Ribi；MS-705；莫拉丁酯；marabutide；Vacsyn；胞壁酰二肽衍生物；胞壁酰二肽衍生物myelopid；-563；NACOS-6；NH-765；NISV，Proteus；NPT-16416；NT-002；PA-485；PEFA-814；肽，Scios；肽聚糖，Pliva； Perthon，Advanced Plant；PGM衍生物，Pliva；Pharmaproject No.1099；No.1426；No.1549；No.1585；No.1607；No.1710；No.1779；No.2002；No.2060；No.2795；No.3088；No.3111；No.3345；No.3467；No.3668；No.3998；No.3999；No.4089；No.4188；No.4451；No.4500；No.4689；No.4833；No.494；No.5217；No.530；匹多莫德；匹美勞肽；吡萘非特；PMD-589；鬼臼毒素，Conpharm；POL-509；poly-ICLC；poly-ICLC，Yamasa Shoyu；PolyA-PolyU；多糖A，蛋白質(zhì)A，Berlux Bioscience；PS34W0；Pseudomonas Mabs，Teijin；Psomaglobin；PTL-78419；Pyrexol；pyriferone；Retrogen；Retropep；RG-003；Rhinostat；rifamaxil；RM-06；Rollin；胞壁酰基二肽；RU-40555；RU-41821；風(fēng)疹抗體，ResCo；S-27649；SB-73；SDZ-280-636；SDZ-MRL953；SK&F-107647；SL04；SL05；SM-4333；Solutein；SRI-62-834；SRL-172；ST-570；ST-789；staphage裂解液；促病毒素；抑制素；T-150R1；T-LCEF；他比勞肽；temuritide；Theradigm-HBV；Theradigm-HBV；Theradigm-HSV；THF，Pharm & Upjohn；THF，Yeda；胸腺法新；胸腺激素各組分；胸腺卡??；thymolymphotropin；胸腺五肽；胸腺五肽類似物；胸腺五肽，Peptech；胸腺素組分5，Alpha；胸腺刺激素，胸腺曲南；TMD-232；TO-115；轉(zhuǎn)移因子，Viragen；促吞噬素，Selavo；烏苯美司；Ulsastat；ANGG-；CD-4+；Collag+；COLSF+；COM+；DA-A+；GAST-；GF-TH+；GP-120-；IF+；IF-A+；IF-A-2+；IF-B+；IF-G+；IF-G-1B+；IL-2+；IL-12+；IL-15+；IM+；LHRH-；LIPCOR+L LYM-B+；LYM-NK+；LYM-T+；OPI+；PEP+；PHG-MA+；RNA-SYN-；SY-CW-；TH-A-I+；TH-5+；TNF+；UN。
可用于本發(fā)明的代表性核苷和核苷酸化合物包括但不限于(+)-順式-5-氟-1-[2-(羥基-甲基)-[1，3-氧硫烷-5-基]胞嘧啶；(-)-2′-脫氧-3′-硫代胞苷-5′-三磷酸酯(3TC)；(-)-順式-5-氟-1-[2(羥基-甲基)-[1，3-氧硫烷-5-基]胞嘧啶(FTC)；(-)2′，3′-二脫氧-硫代胞苷[(-)-SddC]；1-(2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘代胞嘧啶(FIAC)；1-(2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘代胞嘧啶三磷酸酯(FIACTP)；1-(2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲基尿嘧啶(FMAU)；1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-酰胺；2′，3′-二脫氧-3′-氟-5-甲基-胞苷(FddMeCyt)；2′，3′-二脫氧-3′-氯-5-甲基-胞苷(ClddMeCyt)；2′，3′-二脫氧-3′-氨基-5-甲基-胞苷(AddMeCyt)；2′，3′-二脫氧-3′-氟胸苷(FddThd)；2′，3′-二脫氧-β-L-5-氟胞苷(β-L-FddC)；2′，3′-二脫氧-β-L-5-硫代胞苷；2′，3′-二脫氧-β-L-5-胞苷(β-L-ddC)；9-(1，3-二羥基-2-丙氧甲基)鳥嘌呤；2′-脫氧-3′-硫代-5-氟嘧啶；3′-氨基-5-甲基-脫氧胞苷(AddMeCyt)；2-氨基-1，9-[2-(羥甲基)-1-(羥甲基)乙氧基]甲基]-6H-嘌呤-6-酮(更昔洛韋gancyclovir)；2-[2-(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙基]-1，3-丙二醇二乙酸酯(法昔洛韋famciclovir)；2-氨基-1，9-二氫-9-[(2-羥基-乙氧基)甲基]-6H-嘌呤-6-酮(無(wú)環(huán)烏苷)；9-(4-羥基-3-羥甲基-丁-1-基)鳥嘌呤(戊昔洛韋)；9-(4-羥基-3-羥甲基-丁-1-基)-6-脫氧-鳥嘌呤二乙酸酯(法昔洛韋)；3′-疊氮-3′-脫氧胸苷(AZT)；3′-氯-5-甲基-脫氧胞苷(ClddMeCyt)；9-(2-磷酰-甲氧乙基)-2′，6′-二氨基嘌呤-2′，3′-二脫氧核糖苷；9-(2-磷酰-甲氧乙基)腺嘌呤(PMEA)；無(wú)環(huán)烏苷三磷酸酯(ACVTP)；D-碳環(huán)-2′-脫氧鳥苷(CdG)；二脫氧-胞苷；二脫氧-胞嘧啶(ddC)；二脫氧鳥嘌呤(ddG)；二脫氧肌苷(ddl)；E-5-(2′-溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷三磷酸酯；氟代-阿拉伯呋喃糖基-碘代尿嘧啶；1-(2′-脫氧-2′-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)-5-碘代-尿嘧啶(FIAU)；司他夫定；9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-9H-嘌呤-6-胺一水合物(Ara-A)；9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-9H-嘌呤-6-氨基-5′-單磷酰酯一水合物(Ara-AMP)；2′-脫氧-3′-硫-5-氟胞苷；2′，3′二脫氧-鳥嘌呤；和2′，3′二脫氧-鳥苷。
制備用于本發(fā)明的核苷和核苷酸的合成方法是本領(lǐng)域熟知的，見ActaBiochim Pol，43，25-36(1996)；Swed，Neuleosides Nuleotides 15361-378(1996)；Synthesis 12，1465-1479(1995)；Carbohyd.Chem.27，242-276(1995)；Chena Nucleosides Nucleotides 3，421-535(1994)；Ann.Reports in Med.Chena，Academic Press；和Exp.Opin.Invest.Drugs 495-115(1995)。
上述參考文獻(xiàn)中描述的化學(xué)反應(yīng)通常公開了它們?cè)谥苽浔景l(fā)明化合物中的最廣泛的應(yīng)用。偶爾，在本文所述化合物范圍中某一種化合物不能如所述應(yīng)用這些反應(yīng)。該領(lǐng)域技術(shù)人員容易識(shí)別這些化合物。此時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可按常規(guī)修改來成功進(jìn)行這些反應(yīng)，如對(duì)干擾基團(tuán)采用合適的保護(hù)，換成另外的常規(guī)試劑，常規(guī)修改反應(yīng)條件等，或用本文公開的或常規(guī)的其它反應(yīng)來制備本發(fā)明的相應(yīng)化合物。所有的制備方法中，所有的起始材料是已知的或容易從已知的起始材料制備。
雖然一般采用核苷類似物作為抗病毒藥物，但核苷酸(磷酸核苷)有時(shí)不得不轉(zhuǎn)變成核苷以有利于它們轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜。經(jīng)化學(xué)修飾能夠進(jìn)入細(xì)胞的一個(gè)核苷酸例子是S-1-3-羥基-2-磷酰甲氧丙基胞嘧啶(HPMPC，GileadSciences)。本發(fā)明所用的酸形式的核苷和核苷酸化合物可形成鹽。實(shí)施例包括但不限于與堿金屬或堿土金屬形成的鹽，如鈉、鉀、鈣或鎂鹽，或與有機(jī)堿形成的鹽或堿性季胺鹽。
本發(fā)明還涉及給予細(xì)胞色素P450單加氧酶(monooxygenase)抑制劑。CYP抑制劑可用于提高受CYP抑制的化合物的肝濃度和/或血濃度。
如果本發(fā)明的實(shí)施方式包括CYP抑制劑，可在本發(fā)明方法中采用任何能改善相關(guān)NS3/4A蛋白酶藥代動(dòng)力學(xué)的CYP抑制劑。這些CYP抑制劑包括但不限于利托那韋(WO 94/14436)、酮康唑、醋竹桃霉素、4-甲基吡唑、環(huán)孢素、氯甲噻唑、西米替汀、伊曲康唑、氟康唑、咪康唑、氟戊肟胺、氟西汀、奈法唑酮、舍曲林、茚地那韋、奈非那韋、安樸瑞那韋、氟彬樸瑞那韋、甲磺酸沙喹那韋、羅比那韋、地那韋定、紅霉素、VX-944和VX-497。優(yōu)選的CYP抑制劑包括利托那韋、酮康唑、醋竹桃霉素、4-甲基吡唑、環(huán)孢素和氯甲噻唑。利托那韋的優(yōu)選劑型見美國(guó)專利6,037,157和本文引用的文獻(xiàn)美國(guó)專利5,484,801；美國(guó)專利申請(qǐng)08/402,690和國(guó)際申請(qǐng)WO95/07696和WO 95/09614)。
檢測(cè)化合物抑制細(xì)胞色素P50單加氧酶活性的方法是已知的(見US6,037,157和Yun等，Drug Metabolism & Disposition，第21卷，403-407頁(yè)，(1993)。
很多已公開的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)峁┝丝梢员挥糜诤蚔X-950合用以治療肝炎的化合物和方法的其他教導(dǎo)。可以預(yù)料的是，任何這些方法和組合物可以與本發(fā)明的方法和組合物聯(lián)合使用。為簡(jiǎn)短起見，從這些出版物公開的內(nèi)容在此僅指出公開號(hào)以作為參考，但是，應(yīng)該注意到，尤其是化合物的公開是明確結(jié)合在此作為參考的。這些公開的例子包括美國(guó)專利公開號(hào)20040058982；美國(guó)專利公開號(hào)20050192212；美國(guó)專利公開號(hào)20050080005；美國(guó)專利公開號(hào)20050062522；美國(guó)專利公開號(hào)20050020503；美國(guó)專利公開號(hào)20040229818；美國(guó)專利公開號(hào)20040229817；美國(guó)專利公開號(hào)20040224900；美國(guó)專利公開號(hào)20040186125；美國(guó)專利公開號(hào)20040171626；美國(guó)專利公開號(hào)20040110747；美國(guó)專利公開號(hào)20040072788；美國(guó)專利公開號(hào)20040067901；美國(guó)專利公開號(hào)20030191067；美國(guó)專利公開號(hào)20030187018；美國(guó)專利公開號(hào)20030186895；美國(guó)專利公開號(hào)20030181363；美國(guó)專利公開號(hào)20020147160；美國(guó)專利公開號(hào)20040082574；美國(guó)專利公開號(hào)20050192212；美國(guó)專利公開號(hào)20050187192；美國(guó)專利公開號(hào)20050187165；美國(guó)專利公開號(hào)20050049220。
在與本發(fā)明方法非聯(lián)合治療中，可以低于本領(lǐng)域常規(guī)用量的劑量給予免疫調(diào)節(jié)劑、免疫刺激劑和其它藥物。例如，干擾素α在治療HCV感染的病人時(shí)通常給予的劑量是每人約1×106-10×106單位，每周三次(Simon等，Hepatology，25445-448，1997)。本發(fā)明方法和組合物中，此劑量范圍可以是每人約0.1×106-7.5×106單位，每周三次，更優(yōu)選每人約0.5×106-5×106單位，每周三次，最優(yōu)選每人約1×106-3×106單位，每周三次。由于存在本發(fā)明的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑時(shí)能增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)劑、免疫刺激劑或其它抗HCV藥物抗丙肝病毒的效果，故可考慮減少本文所述方法和組合物中所用的免疫調(diào)節(jié)劑/免疫刺激劑的用量。同樣的，由于存在免疫調(diào)節(jié)劑和免疫刺激劑時(shí)能增強(qiáng)本發(fā)明的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑抗丙肝病毒的效果，故可考慮減少本文所述方法和組合物中HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑的用量。所需減少的量可通過常規(guī)監(jiān)測(cè)接受治療的感染病人中丙肝病毒的滴度來確定。這可通過例如用狹線印跡(slot-blot)、斑點(diǎn)印跡(dot-blot)或RT-PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)病人血清HCV RNA、或測(cè)定HCV表面抗原或其它抗原來進(jìn)行。在用本文所述的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和其它具有抗HCV活性的化合物如核苷和/或核苷酸抗病毒藥物聯(lián)合治療時(shí)，可同樣監(jiān)測(cè)病人，以確定聯(lián)合用藥時(shí)各藥物的最低有效量。
在本文所公開的聯(lián)合治療方法中，給予病人核苷或核苷酸抗病毒化合物、或其混合物的劑量范圍是每人每天約0.1mg-500mg，優(yōu)選每人每天約10mg-300mg，更優(yōu)選每人每天約25mg-200mg，再優(yōu)選每人每天約50mg-150mg，最優(yōu)選每人每天約1mg-50mg。
給予病人的化合物劑量可以是單劑量或適當(dāng)比例的劑量。后者的劑量單位組合物可含有組成每日劑量的多個(gè)分劑量。如果開處方者需要，每天的多個(gè)劑量也可加大每日總劑量。
用本發(fā)明化合物和/或組合物治療HCV感染病人的方案可根據(jù)多種因素進(jìn)行選擇，這些因素包括病人的年齡、體重、性別、飲食和醫(yī)療情況、感染的嚴(yán)重程度、給藥途徑、對(duì)所用具體化合物的藥理學(xué)考慮，如活性、藥效、藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)特征，和是否采用了藥物輸送系統(tǒng)。通常應(yīng)連續(xù)給予本文所述的藥物組合幾周至數(shù)月或數(shù)年直到病毒滴度達(dá)到可接受的水平，表明感染已得到控制或根除?？捎锚M線印跡、斑點(diǎn)印跡或RT-PCR技術(shù)測(cè)定病人血清中的肝炎病毒RNA，或測(cè)定血清丙肝病毒抗原如表面抗原，來常規(guī)監(jiān)測(cè)用本文所述藥物聯(lián)合治療的病人，以確定治療的效果。用這些方法連續(xù)分析獲得的數(shù)據(jù)可在治療中修正治療方案，從而給予聯(lián)合用藥中各組分的優(yōu)化劑量，并確定治療時(shí)間。因此可合理地修改整個(gè)治療期間的治療方案/劑量方案，從而給予聯(lián)合用藥中各抗病毒化合物的最低劑量，它們加在一起能呈現(xiàn)滿意的抗丙肝病毒效果，并且使這類抗病毒化合物的聯(lián)合給藥只持續(xù)到成功治療該感染所需要的時(shí)間。
本發(fā)明包括使用在本文公開的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和具有抗HCV活性的上述及相似類型的化合物以多種聯(lián)合用藥形式治療或預(yù)防病人的HCV感染。例如，一種或多種HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑可與下列化合物聯(lián)用一種或多種具有抗HCV活性的干擾素或干擾素衍生物；一種或多種具有抗HCV活性的非干擾素化合物；或一種或多種具有抗HCV活性的干擾素或干擾素衍生物及一種或多種具有抗HCV活性的非干擾素化合物。當(dāng)它們聯(lián)合使用以治療或預(yù)防人類患者的HCV感染時(shí)，可以藥學(xué)有效量或抗HCV有效量提供本說明書公開的任何HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和上述具有抗HCV活性的化合物。當(dāng)如上所述聯(lián)合使用時(shí)，借助它們的相加或協(xié)同效應(yīng)，可各自采用亞臨床藥學(xué)有效量或抗HCV有效量，即，此量如果單用時(shí)，與采用藥學(xué)有效量的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和具有抗HCV活性的化合物相比，其完全抑制或減少病人HCV病毒累積、和/或減少或減輕HCV感染相關(guān)病癥或癥狀、或病理進(jìn)程上的藥學(xué)效果降低。此外，本發(fā)明包括聯(lián)合使用HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和上述具有抗HCV活性的化合物來治療或預(yù)防HCV感染，當(dāng)這些抑制劑或化合物的一種或多種以藥學(xué)有效量提供時(shí)，由于相加或協(xié)同效應(yīng)，其它化合物可以亞臨床藥學(xué)有效量或抗HCV有效量提供。在這里，術(shù)語(yǔ)“相加效應(yīng)”描述兩種(或多種)藥學(xué)活性物質(zhì)的聯(lián)合效應(yīng)，其等于單用各藥物效應(yīng)之和。協(xié)同效應(yīng)是兩種(或多種)藥學(xué)活性物質(zhì)的聯(lián)合效應(yīng)，其大于單用各藥物作用之和。
如果必要的話，一旦患者的病情有所改善，可以給予本發(fā)明化合物、組合物或聯(lián)合用藥的維持劑量。隨后，可以根據(jù)癥狀減少給藥的劑量或頻率，或者同時(shí)降低兩者，至已改善的病情得以維持的水平，當(dāng)癥狀已經(jīng)減輕至所需水平，應(yīng)當(dāng)停止治療。不過，一旦疾病癥狀有任何復(fù)發(fā)，患者可能需要在長(zhǎng)期基礎(chǔ)上接受間歇性治療。
還應(yīng)當(dāng)理解的是，任意特定患者的具體劑量和治療方案將視多種因素而定，包括所采用的具體化合物的活性、病人的年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、排泄速率、藥物聯(lián)用、主治醫(yī)師的判斷和所治療的特定疾病的嚴(yán)重程度。活性成分的量也將視所述特定化合物和組合物中是否存在另外的抗病毒劑及其屬性而定。
按照另一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供治療病毒感染患者的方法，該病毒是以病毒編碼的絲氨酸蛋白酶為特征的，該蛋白酶是病毒生命周期所必需的，該方法是給予所述患者藥學(xué)上可接受的本發(fā)明組合物。本發(fā)明的方法優(yōu)選地用于治療罹患HCV感染的患者。這類治療可以完全根除病毒感染或者降低其嚴(yán)重程度。所述患者更優(yōu)選是人類。
在作為替代選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法還包含給予所述患者抗病毒劑、優(yōu)選抗-HCV劑的步驟。這類抗病毒劑包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑，例如α-、β-與γ-干擾素、聚乙二醇化的干擾素-α化合物和胸腺素；其他抗病毒劑，例如利巴韋林和金剛烷胺；其他丙型肝炎蛋白酶抑制劑(NS2-NS3抑制劑和NS3-NS4A抑制劑)；HCV生命周期中其他靶點(diǎn)的抑制劑，包括螺旋酶與聚合酶抑制劑；內(nèi)部核糖體進(jìn)入抑制劑；廣譜病毒抑制劑，例如IMPDH抑制劑(例如公開于美國(guó)專利5,807,876中的IMPDH抑制劑、霉酚酸及其衍生物)；或者上述任意物質(zhì)的組合。
這類另外的制劑可以作為單一劑型的一部分給予所述患者，所述劑型包含本發(fā)明的化合物和另外的抗病毒劑。作為替代選擇，另外的制劑可以作為多劑型的一部分與本發(fā)明化合物分開給藥，其中所述另外的制劑可以在包含本發(fā)明化合物的組合物之前、同時(shí)或之后給藥。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供擬給予患者的生物物質(zhì)的預(yù)處理方法，包括使所述生物物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的包含本發(fā)明化合物的組合物接觸的步驟。這類生物物質(zhì)包括但不限于血液及其組分，例如血漿、血小板、血細(xì)胞亞群，等等；器官，例如腎、肝、心、肺，等等；精子和卵子；骨髓及其組分；以及其他擬輸注給患者的流體，例如鹽水、葡萄糖，等等。
按照另一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供有可能與病毒接觸的材料的處理方法，該病毒是以病毒性編碼的絲氨酸蛋白酶為特征的，該蛋白酶是病毒生命周期所必需的。該方法包括使所述材料與根據(jù)本發(fā)明的化合物接觸的步驟。這類材料包括但不限于外科設(shè)備和服裝(如衣服、手套、圍裙、大褂、面罩、眼鏡、鞋類，等等)；實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和服裝(如衣服、手套、圍裙、大褂、面罩、眼鏡、鞋類，等等)；血液收集器具和材料；和侵入性裝置，例如分流器、支架，等等。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明化合物可以用作實(shí)驗(yàn)室工具，有助于病毒性編碼的絲氨酸蛋白酶的分離。該方法包含下列步驟提供附著在固相支持物上的本發(fā)明化合物；使所述固相支持物與含有病毒絲氨酸蛋白酶的樣品接觸，接觸的條件導(dǎo)致所述蛋白酶與所述固相支持物結(jié)合；和，從所述固相支持物上洗脫所述絲氨酸蛋白酶。優(yōu)選地，借助這種方法所分離的病毒絲氨酸蛋白酶是HCVNS3-NS4A蛋白酶。
為了更充分地理解本發(fā)明，提供下列制備和測(cè)試的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅供闡述，決不被解釋為限制發(fā)明的范圍。
實(shí)施例下面的實(shí)施例代表優(yōu)選的實(shí)施方式和技術(shù)，而不意味著受這些實(shí)施例的限制。借助本說明書公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，對(duì)所公開的具體材料和方法可作改變，仍然獲得類似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實(shí)施例1HCV NS3蛋白酶HPLC肽裂解測(cè)定法本法系改良的Landro等[Landro JA等.Biochemistry，1997，369340～9348]所述的方法。對(duì)于所有蛋白酶，都使用基于基因1a型HCV的NS5A/NS5B分割位點(diǎn)的一個(gè)肽底物(NS5AB)。用含0.2M DTT的DMSO配制25mM底物儲(chǔ)備液，并在-20℃儲(chǔ)存。將適合于每種基因型的合成的肽輔助因子(KK4A)代替NS4A的中央核心區(qū)。肽序列見下文。在96孔微量滴定板上用25nM～50nM HCV NS3蛋白酶在含50mM HEPES(pH7.8)、100mMNaCl、20％甘油、5mM DTT和25μM KK4A的緩沖液中進(jìn)行水解反應(yīng)。DMSO的最終濃度不大于2％(v/v)。加10％三氟乙酸(TFA)，使TFA的最終濃度為2.5％，終止反應(yīng)。在反相微孔HPLC柱(Phenomenex Jupiter 5μ C18 300A柱，150×2.0mm)上分離底物和產(chǎn)物，該柱在帶自動(dòng)進(jìn)樣器的Agilent 1100型儀器中的恒溫柱室加熱到40℃，用210和280nm處二極管陣列檢測(cè)來評(píng)估酶活性。流速為0.2ml/min，溶劑A為H2O/0.1％TFA，溶劑B為CH3CN/0.1％TFA。采用線性梯度；5～60％溶劑B 12min，然后60～100％溶劑B 1min，3min等度洗脫，隨后用1min達(dá)到5％溶劑B，并用5％溶劑B等度洗脫，延時(shí)10min后結(jié)束。用在210nm處收集到的資料分析SMSY產(chǎn)物峰，此峰的典型保留時(shí)間為10min。

為了測(cè)試動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax，底物NS5AB濃度在3μM和200μM之間不等。從產(chǎn)物峰面積與反應(yīng)時(shí)間比值得到酶催化水解速率。經(jīng)非線性回歸，這些速率與相應(yīng)的底物濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合Michaelis-Menten方程。用額定(nominal)蛋白酶濃度和完全裂解的底物肽作為儀器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，從得到的Vmax確定Kcat值。

實(shí)施例2用HPLC肽分割法測(cè)定效價(jià)為了測(cè)定表觀Ki值，除受試化合物和底物外，所有組分室溫預(yù)孵5min。然后將溶于DMSO的受試化合物加入混合液中，室溫孵育15min。加入濃度等于Km(11μM～70μM)的NS5AB肽，并在30℃孵育15min引發(fā)反應(yīng)。用7至8個(gè)濃度的化合物滴定酶抑制活性。經(jīng)非線性回歸，活性與相應(yīng)的抑制劑濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合描述競(jìng)爭(zhēng)性牢固結(jié)合酶抑制反應(yīng)的Morrison方程[SculleyMJ & Morrison JF，Biochim Biophys Acta，1986，87444～53]。

實(shí)施例3HCV NS3蛋白酶熒光肽測(cè)定法用改良的Taliani等[Taliani M等.Anal Biochem，1997，24066～67]所述方法測(cè)定酶活性。所有反應(yīng)以RET-S1熒光肽(AanSpec，San Jose，CA)為底物，在緩沖液A(含50mM HEPES(pH7.8)、100mM NaCl、20％甘油、5mMDTT和25μM KK4A的緩沖液)中進(jìn)行。DMSO的終濃度維持在1～2％(v/v)。除有其他說明外，用恒溫于30℃的分別帶有355nm和495nm激發(fā)和發(fā)射濾光片的熒光微量滴定板讀數(shù)儀連續(xù)檢測(cè)反應(yīng)。
為了測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax，底物RET-S1在緩沖液A中的濃度在6μM和200μM之間不等，使其與5nM～10nM HCV NS3蛋白酶反應(yīng)5～10min。加入25μL10％TFA終止反應(yīng)。在反相微孔HPLC柱(PhenomenexJupiter 5μ C18 300A柱，150×2.0mm)上分離底物和產(chǎn)物，該柱在帶自動(dòng)進(jìn)樣的Agilent 1100型儀器中的恒溫柱室加熱到40℃，用350nm處激發(fā)和在490nm處進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法評(píng)估酶活性。流速為0.2ml/min，溶劑A為H2O/0.1％TFA，溶劑B為CH3CN/0.1％TFA。線性梯度為5～100％溶劑B 30min，然后100～5％溶劑B 2min，并用5％溶劑B等度洗脫延時(shí)10min后結(jié)束。經(jīng)非線性回歸，活性與相應(yīng)的底物濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合Michaelis-Menten方程。用額定蛋白酶濃度和完全裂解的底物肽作為儀器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，從得到的Vmax確定Kcat值。

實(shí)施例4延時(shí)孵育的效價(jià)測(cè)定用與VX-950延時(shí)預(yù)孵后檢測(cè)殘存酶活性的方法測(cè)定VX-950對(duì)HCVNS3蛋白酶的抑制常數(shù)。用緩沖液A配制的HCVNS3蛋白酶儲(chǔ)備液在室溫預(yù)孵育10min，然后變換成30℃。將溶于100％DMSO中的一份VX-950在零時(shí)間加到預(yù)熱過的酶儲(chǔ)備液中。在5～360min的各時(shí)間點(diǎn)將以緩沖液A配制的RET-S1 5μL加到95μL酶-抑制劑混合液中，使終濃度為4μMRET-S1和5nM～20nM HCV NS3蛋白酶，引發(fā)反應(yīng)。檢測(cè)150秒時(shí)間窗中的熒光變化，從熒光與相應(yīng)的時(shí)間數(shù)據(jù)點(diǎn)的線性回歸確定反應(yīng)速率。從只含DMSO的反應(yīng)確定對(duì)照速率。用7至8個(gè)濃度的化合物滴定酶抑制活性。從活性vs.相應(yīng)的抑制劑濃度的數(shù)據(jù)，用標(biāo)準(zhǔn)邏輯2參數(shù)擬合計(jì)算IC50值。在這些測(cè)定條件下，延長(zhǎng)孵育后，HCV NS3蛋白酶的VX-950抑制IC50等于牢固結(jié)合的酶-抑制劑復(fù)合物的抑制常數(shù)。

實(shí)施例5從累積曲線分析抑制特征用改良的Narjes等[Narjes F等，Biochemistry，2000，391849～1861]描述的累積曲線(progress curves)測(cè)定法測(cè)算慢結(jié)合抑制反應(yīng)的開始速率。用緩沖液A配制的HCVNS3蛋白酶儲(chǔ)備液室溫預(yù)孵10min，然后變換成30℃，再孵育10min。將溶于100％DMSO的受試化合物加到以緩沖液A配制的RET-S1中，化合物和底物于30℃孵育10min。加一份預(yù)熱的酶儲(chǔ)備液到化合物-底物混合液中，使終濃度為6～12μM RET-S1和0.5nM～4nM HCVNS3蛋白酶，引發(fā)反應(yīng)。檢測(cè)熒光變化4小時(shí)，通過非線性回歸，熒光與相應(yīng)的時(shí)間數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合方程式1[Morrison JF & Walsh CT.Adv Enzymol RelatAreas Mol Biol，1988，61201～301]。從只含DMSO的反應(yīng)確定對(duì)照速率。
方程式1F(t)＝Vs×t+(Vi-Vs)×(1-exp(-Kobs×t))/Kobs+CKobs值與相應(yīng)VX-950濃度的重繪圖通過擬合方程式2可以確定牢固結(jié)合的酶-抑制劑復(fù)合物形成的二級(jí)速率常數(shù)(Kon)和牢固結(jié)合的酶-抑制劑復(fù)合物解離的一級(jí)速率常數(shù)(Koff)。從Koff/Kon之比計(jì)算出抑制常數(shù)[MorrisonJF & Walsh CT.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol，1988，61201～301]。
方程式2Kobs＝Koff+(Kon×x[I])/(1+[S]/Km)

通過分析延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的殘存酶活性，用上述累積曲線測(cè)算VX-950抑制HCV NS3蛋白酶的抑制常數(shù)。根據(jù)反應(yīng)穩(wěn)態(tài)期間的熒光對(duì)時(shí)間數(shù)據(jù)點(diǎn)的線性回歸測(cè)定反應(yīng)速率。用非線性回歸方法使活性對(duì)相應(yīng)的抑制劑濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合描述競(jìng)爭(zhēng)性牢固結(jié)合的酶抑制反應(yīng)的Morrison方程[Sculley MJ &Morrison JF.Biochim Biophys Acta，1986，87444～53]。

實(shí)施例6測(cè)定從酶-抑制劑復(fù)合物的解離速率將以緩沖液A配制的HCVNS3儲(chǔ)備液室溫預(yù)孵10min，然后變換成30℃，再孵育10min。將溶于100％DMSO的受試化合物加到已預(yù)熱的酶儲(chǔ)備液中，使酶濃度為330nM～1600nM、抑制劑濃度為1.0μM～6.4μM。于30℃延長(zhǎng)此溶液孵育時(shí)間，以使酶-抑制劑復(fù)合物達(dá)到平衡。將酶-抑制劑混合物稀釋到30℃的緩沖液A配制的RET-S1溶液中，引發(fā)反應(yīng)。HCV NS3蛋白酶的終濃度為0.5nM～8nM，RET-S1的終濃度為12μM，抑制劑的終濃度為2nM～32nM。監(jiān)測(cè)熒光變化4小時(shí)，經(jīng)非線性回歸，熒光對(duì)相應(yīng)時(shí)間數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合方程式2。從只含DMSO的反應(yīng)測(cè)得對(duì)照速率。用方程式3測(cè)算牢固結(jié)合的VX-950/HCV NS3蛋白酶復(fù)合物的半衰期[Segel IH.BiochemicalCalculations，第二版，Wiley & SonsNew York，1976228]。
方程式3t1/2＝0.693/Koff

實(shí)施例7HCV復(fù)制子細(xì)胞測(cè)定方案按Lohmannn等[Lohmannn等，Science，1999，285110～113]的方法獲取細(xì)胞。將含HCV復(fù)制子的細(xì)胞保存在補(bǔ)加有適當(dāng)添加物的含10％胎牛血清(FBS)、0.25mg/ml G418的DMEM(培養(yǎng)基A)中。
第一天用胰蛋白酶EDTA混合物處理單層復(fù)制子細(xì)胞，移去(混合物)，然后將培養(yǎng)基A稀釋到終濃度為100,000個(gè)細(xì)胞/ml wit。在96孔組織培養(yǎng)板每孔中鋪10,000個(gè)細(xì)胞/100μL，在37℃組織培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。
第二天將溶于100％DMSO的化合物系列稀釋到補(bǔ)加有適當(dāng)添加物的含有2％FBS、0.5％DMSO的DMEM(培養(yǎng)基B)中。在系列稀釋中，DMSO的最終濃度維持在0.5％。
除去復(fù)制子細(xì)胞單層上的培養(yǎng)基，然后加入含各種濃度化合物的培養(yǎng)基B。其它孔加入不含化合物的培養(yǎng)基B作為空白對(duì)照。
將細(xì)胞與培養(yǎng)基B配制的化合物或0.5％DMSO在37℃組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。48小時(shí)孵育結(jié)束時(shí)，除去培養(yǎng)基，復(fù)制子細(xì)胞單層用PBS洗滌一次，在提取RNA前儲(chǔ)存于-80℃。
將含有處理過的復(fù)制子細(xì)胞單層的培養(yǎng)板融化，每孔細(xì)胞中加入固定量的另一種RNA病毒如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。立即向細(xì)胞加入RNA提取試劑(如RNeasy試劑盒提供的試劑)，以避免RNA降解。依照制造商的使用說明提取總RNA，并改進(jìn)了提取效率和一致性。最后，洗提細(xì)胞總RNA(包括HCV復(fù)制子RNA)，-80℃儲(chǔ)存至進(jìn)一步處理時(shí)。
用兩套特異引物和探針的進(jìn)行Taqman實(shí)時(shí)RT-PCR定量。一套針對(duì)HCV，另一套針對(duì)BVDV。將處理過的HCV復(fù)制子細(xì)胞總RNA提取物加到PCR反應(yīng)液中，在同一PCR孔中定量測(cè)定HCV和BVDV的RNA。以每孔中的BVDV RNA水平為根據(jù)，可以減少和阻止實(shí)驗(yàn)性失敗。根據(jù)在同一PCR板中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每孔中HCV RNA水平。以DMSO或無(wú)化合物對(duì)照組的抑制為0％，計(jì)算化合物處理組HCV RNA水平的抑制或降低百分率。從任一給定化合物的滴定曲線計(jì)算IC50(HCV RNA水平抑制50％的濃度)。
在這種復(fù)制子測(cè)定法中VX-950的IC50為354nM。
實(shí)施例8基因2a、2b、3a或3b型HCV NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域和NS4A輔助因子肽的共有序列從GenBank獲得，使用DNAstar軟件比對(duì)，得到覆蓋許多HCV分離株的NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域和NS4A輔助因子肽的cDNA片段的核苷酸序列。這些基因2型分離株包括基因2a型8株(GenBank登錄號(hào)為P26660、AF177036、AB031663、D50409、AF169002、AF169003、AF238481、AF238482)和基因2b型3株(GenBank登錄號(hào)為P26661、FA238486、AB030907)。圖1為這11株基因2型HCVNS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的氨基酸順序的比對(duì)。圖2為基因2a型NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的共有氨基酸和核苷酸序列。這些基因3型分離株包括基因3a型4株(GenBank登錄號(hào)為AF046866、D17763、D28917、X76918)和基因3b型2株(GenBank登錄號(hào)為D49374和D63821)。圖3為這6株基因3型HCV NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的氨基酸序列比對(duì)。圖4為基因3a型NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的共有氨基酸和核苷酸序列。最后，圖5為各種基因型或亞基因型1a，1b，2a，2b，3a和3b的共有氨基酸序列比對(duì)。
質(zhì)粒構(gòu)建.從GenBank獲得基因型2a或2b的幾種分離株的氨基酸序列和編碼Ala1～Ser酸181殘基的DNA片段的核苷酸序列，經(jīng)比對(duì)鑒定出基因2a或2b型NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的共有序列。同樣方法應(yīng)用于基因3a或3b型，鑒定出了基因3a或3b型HCV NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的共有序列。用大腸桿菌最適密碼子選擇，通過寡核苷酸合成(Genscript)建立這些共有序列的cDNA片段，然后通過PCR擴(kuò)增并亞克隆到pBEV11中，用于在大腸桿菌中表達(dá)C-末端帶6個(gè)組氨酸標(biāo)記的HCV蛋白。用賴氨酸取代HCVNS3絲氨酸蛋白酶的#13氨基酸亮氨酸，成為增溶性變異體。通過測(cè)序來確定所有構(gòu)建物。
HCV NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的表達(dá)和純化。將每種基因2a或3a型的HCV NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到BL21/DE3 pLysS大腸桿菌細(xì)胞(Stratagene)中。新鮮轉(zhuǎn)化的細(xì)胞放在添加100μg/ml羧芐青霉素和35μg/ml氯霉素的BHI培養(yǎng)基(Difco Laboratories)中，于37℃生長(zhǎng)至600nm處光密度為0.75。用1mM IPTG于24℃誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收獲細(xì)胞糊狀物，于-80℃快速冰凍直至蛋白純化。所有純化步驟都在4℃進(jìn)行。對(duì)于各種HCVNS3蛋白酶，將100g細(xì)胞糊狀物裂解(lyse)于1.5L緩沖液A[50mMHEPES(pH8.0)，300mM NaCl，0.1％正-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，5mM β-巰基乙醇，10％(v/v)甘油]中，攪拌30min。用微流化器(Microfluidics，Newton，MA)將細(xì)胞裂解物勻漿，隨后于54,000×g超速離心45min。上清液中加入咪唑至終濃度為5mM，同時(shí)加入用含5mM咪唑的緩沖液A預(yù)先平衡過的2ml Ni-NTA樹脂。將此混合液振搖3小時(shí)，用20柱容積的加有5mM咪唑的緩沖液A洗滌。用含300mM咪唑的緩沖液A洗脫HCV NS3蛋白。洗脫液濃縮后上Hi-Load 16/60 Superdex 200柱，該柱用緩沖液A預(yù)先平衡過。收集純化HCV蛋白的相應(yīng)組分，于-80℃儲(chǔ)存。
實(shí)施例9將已被確認(rèn)為HCV基因型的共有區(qū)域的NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域，在大腸桿菌中表達(dá)并純化成同質(zhì)。用KK-4A肽(Landro等.Biochemistry，1997)和FRET底物(Taliani等.Anal Biochem，1997)進(jìn)行VX-950的酶測(cè)定。用穩(wěn)態(tài)方法測(cè)定VX-950的Ki*，并用2種其它方法(延時(shí)孵育法和累積曲線法)確認(rèn)。
分離共有區(qū)域，可測(cè)定VX-950與HCV-1區(qū)域的結(jié)合特征，并可與HCV-2相比較。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)VX-950活性是本領(lǐng)域技術(shù)人員描述的其它抑制劑的幾倍。本發(fā)明人獲得的數(shù)據(jù)顯示VX-950與NS3-4A絲氨酸蛋白酶的結(jié)合是可逆的、共價(jià)的、競(jìng)爭(zhēng)性的、牢固和緩慢的結(jié)合。因而，VX-950的抑制作用機(jī)制不同于目前開發(fā)的其它藥劑。例如，其它藥劑與蛋白酶結(jié)合是可逆的、非共價(jià)的、競(jìng)爭(zhēng)性的和牢固的。更重要的是確定了在基因1型的結(jié)合位點(diǎn)上有殘基78～80(Val-Asp-Gln)和56位氨基酸，而在基因2型中有Ala-Glu-Gly。那些殘基上的氨基酸差異意味著在HCV基因型的絲氨酸蛋白酶中存在的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性低于HCV基因1型中的這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而較低的構(gòu)象穩(wěn)定性會(huì)減少某些抑制劑的結(jié)合，預(yù)期這種構(gòu)象穩(wěn)定性的降低對(duì)結(jié)合VX-950影響很小，使此抑制劑成為基因2型HCV的絲氨酸蛋白酶的較強(qiáng)抑制劑。類似結(jié)果也見于基因3型HCV，在基因3型中，存在于基因1型HCV中的Asp168被Gln取代。
上面描述了本發(fā)明的若干實(shí)施方案，顯然可利用本發(fā)明的化合物和方法更改基本實(shí)施例，以提供其它具體實(shí)施例。因此意識(shí)到本發(fā)明范圍是受所附權(quán)利要求的限定而不是受上述實(shí)施例給出的具體實(shí)施方式
所限定。所有引用的文獻(xiàn)均納入本說明書作為參考。
權(quán)利要求
1.抑制基因型-2丙型肝炎病毒(HCV)NS3-NS4A蛋白酶的方法，該方法包括將該蛋白酶與有效量的VX-950或其藥學(xué)上可接受的鹽接觸以抑制該蛋白酶的活性。
2.抑制HCV基因型-3 NS3-NS4A蛋白酶的方法，該方法包括將該蛋白酶與有效量的VX-950或其藥學(xué)上可接受的鹽接觸以抑制該蛋白酶的活性。
3.治療患者HCV基因型-2感染的方法，該方法包括給予患者VX-950或其藥學(xué)上可接受的鹽。
4.治療患者HCV基因型-3感染的方法，該方法包括給予患者VX-950或其藥學(xué)上可接受的鹽。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，包括給予所述患者另一種物質(zhì)的附加步驟，所述物質(zhì)選自免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞色素p45抑制劑、抗病毒劑、HCV蛋白酶的第二抑制劑、HCV生命周期另一靶點(diǎn)的抑制劑、或它們的組合；其中所述另一種物質(zhì)是作為VX-950的同一劑型的一部分或作為分開的劑型給予的。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑為α-、β-或γ-干擾素或胸腺素；所述抗病毒劑為利巴韋林、金剛烷胺或替比夫定；或所述HCV生命周期另一靶點(diǎn)的抑制劑是HCV螺旋酶、聚合酶或金屬蛋白酶的抑制劑。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞色素p450抑制劑是利托那韋。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述另一種物質(zhì)是VX-497。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述另一種物質(zhì)是干擾素。
10.消除或減少生物樣品或醫(yī)藥或?qū)嶒?yàn)室設(shè)備基因型-2或基因型-3HCV污染的方法，該方法包括將所述生物樣品或醫(yī)藥或?qū)嶒?yàn)室設(shè)備與VX-950接觸的步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述樣品或設(shè)備選自體液、生物組織、外科設(shè)備、外科服裝、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室服裝、血液或其他體液收集器具、血液或其他體液儲(chǔ)備材料。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述體液為血液。
13.抑制HCV基因型-2 NS3-NS4A蛋白酶的組合物，包括i)抑制HCV基因型-2 NS3-NS4A蛋白酶有效量的VX-950或其藥學(xué)上可接受的鹽；和ii)可接受的載體、佐劑或賦形劑。
14.抑制HCV基因型-3 NS3-NS4A蛋白酶的組合物，包括i)抑制HCV基因型-3 NS3-NS4A蛋白酶有效量的VX-950或其藥學(xué)上可接受的鹽；和ii)可接受的載體、佐劑或賦形劑。
15.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其特征在于，所述組合物配制成用于對(duì)患者給藥的形式。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述載體、佐劑或賦形劑是藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或賦形劑。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括另一種物質(zhì)，所述物質(zhì)選自免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞色素p450抑制劑、抗病毒劑、HCV蛋白酶的第二抑制劑、HCV生命周期另一靶點(diǎn)的抑制劑、細(xì)胞色素p450抑制劑、或它們的組合。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑為α-、β-或γ-干擾素或胸腺素；所述抗病毒劑為利巴韋林、金剛烷胺或替比夫定；或所述HCV生命周期另一靶點(diǎn)的抑制劑是HCV螺旋酶、聚合酶或金屬蛋白酶的抑制劑。
19.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞色素p450抑制劑是利托那韋。
20.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述另一種物質(zhì)是VX-497。
21.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述另一種物質(zhì)是干擾素。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制非基因型1丙型肝炎病毒(HCV)NS3－NS4A蛋白酶的活性。更具體地涉及抑制HCV基因型－2或HCV基因型－3中該蛋白酶的活性。本發(fā)明的方法采用的抑制劑通過干擾HCV生命周期而起作用，并且也是有用的抗病毒劑。本發(fā)明還涉及包含這種化合物的組合物，這種化合物既可離體使用，也可給予罹患基因型－2或基因型－3HCV感染的患者。本發(fā)明還涉及通過給予包含本發(fā)明化合物的組合物對(duì)患者的HCV感染進(jìn)行治療。
文檔編號(hào)A61K31/4965GK101072575SQ200580041231
公開日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月1日
發(fā)明者C·林, W·P·泰勒 申請(qǐng)人:威特克斯醫(yī)藥股份有限公司