專利名稱：病毒載體的制作方法
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本發(fā)明涉及運(yùn)送在體內(nèi)有復(fù)制能力的病毒用于治療目的的領(lǐng)域，尤其是可將所述病毒引入患者或宿主內(nèi)的新方法。
病毒是目前在非人動(dòng)物和人中廣泛使用的對(duì)抗疾病的治療劑。具體而言，利用病毒作為載體用于基因治療。作為替代，已將細(xì)胞裂解型病毒用于靶向和殺死癌或不希望的增殖細(xì)胞，這樣的治療也稱為“病毒療法”。因此，在醫(yī)學(xué)處理中直接使用病毒是一個(gè)廣泛增長(zhǎng)的領(lǐng)域，并且正在開發(fā)在處理和治療中涉及病毒的新技術(shù)和用途。
病毒是高效進(jìn)入其宿主細(xì)胞并利用該細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)器輔助其復(fù)制的高度進(jìn)化的生物學(xué)實(shí)體。正因如此，它們被預(yù)言為理想的基因治療載體，因?yàn)橥庠?異源基因或編碼序列可插入病毒基因組中并進(jìn)行感染，由此使得外源基因可以被運(yùn)送至宿主細(xì)胞的核中?；蛑委熓紫缺辉O(shè)想用于治療其中缺陷是遺傳性單基因缺陷的遺傳疾病，例如重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)。不過，目前的基因治療范圍要廣泛的多，設(shè)想可利用病毒運(yùn)送針對(duì)獲得性疾病的基因，所述獲得性疾病諸如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性病變、炎癥甚至傳染性疾病。
目前有5類主要的臨床可利用病毒載體，它們來源于致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒(oncoretroviruses)、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)和1型單純皰疹病毒(HSV-1)。每類載體的特征在于使之適用于特定應(yīng)用且不適用于其它應(yīng)用的一組不同性質(zhì)。
這五種主要類型的病毒載體可依照它們的基因組是整合入宿主DNA中(致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒)還是主要作為染色體外附加體持續(xù)存在于細(xì)胞核內(nèi)(AAVs、腺病毒和皰疹病毒)而分成兩組。此區(qū)別是各載體對(duì)于特定應(yīng)用的適用性的重要決定因素；非整合性載體，在某些情況下，可在非增殖細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但是如果需要在分裂細(xì)胞中維持穩(wěn)定的遺傳改變，那么當(dāng)前整合型載體是值得選用的工具。
致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是開發(fā)的第一類病毒載體，迄今為止已廣泛用于臨床試驗(yàn)中。它們傳統(tǒng)上是干細(xì)胞離體轉(zhuǎn)導(dǎo)選用的載體。不過，大多數(shù)工作集中于慢病毒載體的研發(fā)，它們可自然侵入完整的核膜并轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞。慢病毒載體可能是未來許多疾病治療中的重要載體系統(tǒng)。它們已被證實(shí)是遞送基因至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效工具，其在沒有炎癥的情況下產(chǎn)生長(zhǎng)期的基因表達(dá)。
至于“病毒療法”技術(shù)，其中的病毒利用其裂解細(xì)胞的能力破壞正在增殖的細(xì)胞，諸如癌細(xì)胞，病毒不必?cái)y帶任何外源編碼序列或運(yùn)送任何序列至靶細(xì)胞。在這樣的策略中使用只靶向于正分裂細(xì)胞的病毒可以是非常理想的，使得只有正在增殖的細(xì)胞被破壞。在這樣的情況下還可在病毒載體中插入核酸序列使得可以通過在系統(tǒng)中添加藥物破壞病毒，從而可以更高程度的調(diào)控。裂解病毒包括腺病毒。
載體向性(即，宿主細(xì)胞靶向)、靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間和載體的免疫原性是影響具體治療應(yīng)用中載體選擇的另外因素。可論證地，腺病毒載體在遞送其核酸序列至細(xì)胞核方面是最有效率的載體類型，并且直接注射腺病毒載體可高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)大部分組織。
重組AAV載體(rAAV)是用于在非增殖組織中長(zhǎng)期安全的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的最有前景的載體系統(tǒng)之一。AAV在正開發(fā)用于基因治療的病毒中是獨(dú)特的，因?yàn)橐吧筒《緩奈达@示出會(huì)引起人類疾病。載體顆粒的小尺寸和簡(jiǎn)單性使其可能系統(tǒng)性地施加高劑量的載體而不會(huì)引起急性炎性反應(yīng)或毒副作用。
載體基因組中適于外源DNA摻入的可利用空間是影響選擇適于具體治療應(yīng)用的載體的另一標(biāo)準(zhǔn)。
基于簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如Moloney白血病病毒(MoMLV)的基因治療載體由于其有效整合入靶細(xì)胞的基因組中而經(jīng)常被選擇。整合被認(rèn)為是轉(zhuǎn)導(dǎo)基因長(zhǎng)期表達(dá)的一個(gè)先決條件。
在感染的早期步驟中，逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送它們的核蛋白核心進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在此，病毒基因組發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)核心成熟為前整合復(fù)合物。該復(fù)合物必須到達(dá)核以完成病毒DNA整合進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體。對(duì)于簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒(致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒)，此步驟需要在細(xì)胞分裂期間核膜解離，這最可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)/核酸復(fù)合物的龐大尺寸阻止了它通過核孔的被動(dòng)擴(kuò)散，因?yàn)闆]有明確的定位信號(hào)來促進(jìn)進(jìn)入核的主動(dòng)運(yùn)輸。
目前用于人基因治療的大部分逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是有復(fù)制缺陷的并且必須在包裝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，它包含已整合的野生型病毒基因組序列并因此提供了組裝病毒必需的所有結(jié)構(gòu)元件，但由于包裝信號(hào)序列(psi)的缺失而不能用殼體包裹它們自身的野生型病毒基因組。
通常，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是以每毫升只有106-7個(gè)集落形成單位(cfu)的滴度級(jí)從包裝細(xì)胞產(chǎn)生，它幾乎不適于體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
然而，本發(fā)明一般地涉及有復(fù)制能力的病毒，并且設(shè)法處理已經(jīng)體外產(chǎn)生的病毒的不足以用于治療的情況。
為了產(chǎn)生足夠臨床級(jí)別引入動(dòng)物包括人在內(nèi)的用于治療的病毒，所述病毒必須依照嚴(yán)格要求生產(chǎn)。為了生產(chǎn)病毒，重組病毒通常最初構(gòu)建成包含病毒序列以及必要時(shí)的治療基因的質(zhì)粒。將此質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，并且收集和純化由轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒，用于治療的病毒應(yīng)當(dāng)具有自我復(fù)制能力。在某些情況下，期望制造不能復(fù)制的病毒，因此它們必須在包裝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。本發(fā)明不涉及不能自我復(fù)制的病毒。
至于臨床級(jí)別的病毒生產(chǎn)，必須培養(yǎng)昂貴并且技術(shù)上要求的大規(guī)模哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。這通常需要持續(xù)維持無菌條件、使用具有大表面面積的生物反應(yīng)器(因?yàn)榇蠖鄶?shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞需要粘附于某一表面上，否則它們會(huì)凋亡)并且進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)期的持續(xù)灌注和補(bǔ)充培養(yǎng)基(因?yàn)榇蠖鄶?shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞平均每24小時(shí)只分裂一次，所以放大過程可能花費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間)。收獲后，所述病毒必須用溫和但低效的方法進(jìn)行純化，尤其是在脂質(zhì)包裹的病毒諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒的情況中，它們相當(dāng)脆弱并且經(jīng)常需要低速離心或通過體積排阻濾器的切向流過濾以減小體積并濃縮病毒制備物。雖然超速離心沉淀逆轉(zhuǎn)錄病毒是可能的，但通常大部分病毒顆粒由于離心而被破壞，導(dǎo)致總產(chǎn)量的顯著凈損失與稍微更濃縮的小體積制備物相交換。由此可見生產(chǎn)臨床級(jí)的病毒以用于治療可以是耗時(shí)的、昂貴的、并且最終導(dǎo)致低產(chǎn)量。
因此，需要克服目前病毒治療方法中采取的漫長(zhǎng)培養(yǎng)和純化步驟所呈現(xiàn)的問題。
本發(fā)明設(shè)法通過完全去除此步驟來克服體外生產(chǎn)臨床級(jí)病毒中的有關(guān)問題。本發(fā)明的發(fā)明人由此提出在體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染中直接應(yīng)用質(zhì)粒，以產(chǎn)生重組的有體內(nèi)復(fù)制能力的病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員過去從未考慮過這樣一種優(yōu)秀的解決方法。
與當(dāng)前實(shí)踐的這種顯著變革構(gòu)成了本發(fā)明的基礎(chǔ)。具體而言，體內(nèi)細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)染應(yīng)考慮到在所選擇的細(xì)胞類型、器官或組織內(nèi)直接生產(chǎn)病毒并允許在低頻率轉(zhuǎn)染事件后定位轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。此外，若體內(nèi)產(chǎn)生的病毒粒子結(jié)合了靶細(xì)胞類型的向性，最初非靶細(xì)胞類型可以用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并且其表現(xiàn)為生產(chǎn)細(xì)胞。這明顯為治療方法提供了很大的靈活性。
因此本發(fā)明旨在在體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染中利用編碼重組且有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒。一旦細(xì)胞已成功地用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，將發(fā)生重組的有復(fù)制能力的病毒的表達(dá)，并且這將以預(yù)期進(jìn)程導(dǎo)致病毒從所述細(xì)胞釋放并能轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。因此，從單一的初始質(zhì)粒轉(zhuǎn)染事件開始，很多靶細(xì)胞可被轉(zhuǎn)染。在此首次確認(rèn)了質(zhì)?？梢赃@樣的方式被應(yīng)用。如先前所提及的，現(xiàn)有的基因治療和病毒治療方法集中于遞送病毒自身，而使用編碼病毒的質(zhì)粒則非常簡(jiǎn)單，并克服了前文所論述的一些問題。
因此，本發(fā)明的一方面提供了用于治療的編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒。
在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！北硎灸茉诩?xì)胞內(nèi)染色體外存在的核酸結(jié)構(gòu)。它因此能自主存在并組成獨(dú)立的復(fù)制子。它可以是DNA或RNA結(jié)構(gòu)，優(yōu)選單鏈或者雙鏈形式的DNA結(jié)構(gòu)。通常，質(zhì)粒分子是環(huán)狀核酸分子，其包含編碼序列(基因)和下文所進(jìn)一步描述的調(diào)節(jié)序列。然而，帶缺口的環(huán)狀核酸分子和線性核酸分子也包括在內(nèi)。特別優(yōu)選地是，質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA或其帶缺口的形式(其中一條鏈不是連續(xù)的環(huán)狀)。所述DNA可包含病毒cDNA。此外，修飾或不常見的核酸殘基(例如，摻入肌苷)可用于質(zhì)粒中。
“病毒”是能在適當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖的非細(xì)胞感染劑。感染性顆粒(病毒粒子)在結(jié)構(gòu)上由蛋白質(zhì)衣殼以及在某些情況下還有外包膜包繞的核酸(DNA或RNA)核心組成。
應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒編碼有復(fù)制能力的病毒。根據(jù)在本文中使用的意思，短語(yǔ)“編碼有復(fù)制能力的重組病毒的質(zhì)?！敝赴《?或者DNA病毒或者RNA病毒，如下文所進(jìn)一步論述)編碼序列的質(zhì)粒，所述序列包含在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)體內(nèi)生產(chǎn)病毒所必需的所有序列(諸如編碼序列基因和啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)，導(dǎo)致產(chǎn)生通過從其所產(chǎn)生細(xì)胞中釋放而能體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活病毒。因此，所述質(zhì)粒包含允許產(chǎn)生可體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒必需的所有序列，而不需要輔助病毒或包裝細(xì)胞。有復(fù)制能力的病毒可在體內(nèi)進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染，因?yàn)樗霾《灸芨腥景屑?xì)胞。
用于本發(fā)明的質(zhì)粒包含以下事件所需要的病毒核酸序列(i)病毒粒子顆粒的產(chǎn)生、裝配和釋放，(ii)所述病毒序列(在本文中被稱為“病毒基因組”)在所述顆粒內(nèi)的包裝，(iii)所述顆粒進(jìn)入細(xì)胞并建立感染，以及(iv)病毒基因組序列在感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
這些序列包括但不限于末端重復(fù)序列和包裝信號(hào)序列，以及編碼野生型或異源病毒轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶和結(jié)構(gòu)衣殼和/或包膜蛋白的序列，其可操作性連接至調(diào)節(jié)序列，如野生型或異源啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。本發(fā)明中所用質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)在下文有進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
任何適當(dāng)?shù)牟《径伎蓱?yīng)用于本發(fā)明中。所述病毒是如先前所提及的有復(fù)制能力的病毒，并因此可原位擴(kuò)增。合適的病毒包括RNA病毒，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及DNA病毒。合適的DNA病毒的實(shí)例包括細(xì)小病毒、多瘤病毒、腺病毒，較少優(yōu)選地使用較大的DNA病毒，諸如皰疹病毒，因?yàn)樗鼈兊幕蚪M跨度有150kb。
優(yōu)選克隆入質(zhì)粒的病毒序列小于50kb，通常在4kb(例如，parovins)至約36kb(例如，腺病毒)范圍內(nèi)。適于本發(fā)明應(yīng)用的RNA病毒包括，但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如那些逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒(泡沫病毒(spumaviruses)或泡沫病毒(foamy viruses)、慢病毒和致癌病毒)。慢病毒包括“免疫缺陷病毒”，它包括1型和2型人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。致癌病毒不是必定致癌的，并且包括小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、鼠白血病病毒(MLV)、牛白血病病毒(BLV)以及I型和II型人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-I/II)。另外的合適的RNA病毒包括小核糖核酸病毒、鼻病毒、冠狀病毒、披膜病毒、肝炎病毒和流感病毒。
當(dāng)然應(yīng)理解本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展至修飾病毒，諸如利用來自不同病毒的組分產(chǎn)生具有特殊期望特征的病毒的雜合病毒。所述雜合病毒包括腺病毒-逆轉(zhuǎn)錄病毒雜合體和腺病毒-逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子雜合體，但任一合適的雜合體都可使用。
此外，可以通過對(duì)來自許多病毒的各種編碼序列和調(diào)控序列的重組產(chǎn)生“設(shè)計(jì)”病毒。
所述病毒通常是重組的，因?yàn)樗幕蚪M是重組核酸技術(shù)操作的產(chǎn)物并且與野生型基因組不同。因此所述基因組通常將并入異源核酸區(qū)域，即，不是在野生型病毒中正常存在的區(qū)域，包括已被修飾以改變其功能的天然區(qū)域。優(yōu)選異源區(qū)編碼治療性分子，諸如自殺基因(例如，PNP)，或治療性蛋白質(zhì)(例如免疫刺激或抗炎細(xì)胞因子)或顯性-負(fù)性(dominant-negative)分子、siRNA、反義分子等。
本發(fā)明的質(zhì)粒因此包含編碼有復(fù)制能力的病毒的序列。包含所述質(zhì)粒的元件將隨由此所編碼病毒的身份而變化。如前文所述的，所述質(zhì)粒包含以下元件以下各項(xiàng)需要的病毒核酸序列；(i)病毒粒子顆粒的產(chǎn)生、裝配和釋放，諸如腺病毒的E1B-19KD基因異形體(isoform)，它在感染的晚期階段幫助關(guān)閉宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，由此促進(jìn)病毒釋放；以及結(jié)構(gòu)基因，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒的env(包膜蛋白)基因和腺病毒的“晚期”基因L1、L2、L3和L4，它們編碼病毒衣殼的結(jié)構(gòu)組分，諸如六鄰體、五鄰體和纖維單元；(ii)所述病毒序列(在此稱為“病毒基因組”)在所述顆粒內(nèi)的包裝，諸如Psi逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝序列；(iii)通過所述顆粒進(jìn)入細(xì)胞和確立感染，諸如腺病毒的E1B-55KD異形體，它編碼抑制細(xì)胞防御蛋白p53的蛋白質(zhì)，否則其將抑制DNA復(fù)制，停止病毒感染；以及(iv)病毒基因組序列在感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，諸如腺病毒的“早期”基因E1A，它是病毒復(fù)制的主要轉(zhuǎn)錄激活物，或者逆轉(zhuǎn)錄病毒的編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶蛋白質(zhì)的pol基因。
應(yīng)當(dāng)理解質(zhì)粒因此至少包含為了在受轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生有完全復(fù)制能力的重組病毒所需要的最小序列。質(zhì)粒中存在的一些序列可以執(zhí)行一種以上的功能，即，完成(i)至(iv)中所確定的一種以上的任務(wù)。另外還應(yīng)理解執(zhí)行上述任務(wù)的序列不必一定是編碼肽的“基因或編碼序列”，還可以是核酸序列內(nèi)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)。質(zhì)粒中所包含的序列包括但不局限于末端重復(fù)序列和包裝信號(hào)序列，以及編碼野生型或異源病毒轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶和結(jié)構(gòu)衣殼和/或包膜蛋白的序列，其具有可操作性連接的調(diào)控序列，諸如野生型或異源啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。
逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組相當(dāng)簡(jiǎn)單，并且它或它的變體特別優(yōu)選用于并入本發(fā)明所用的質(zhì)粒中。它只包含3個(gè)基因座；gag(編碼衣殼和基質(zhì)蛋白)、pol(編碼逆轉(zhuǎn)錄酶)和env(編碼病毒包膜糖蛋白)。這些結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)是用于提供病毒粒子RNA轉(zhuǎn)錄和聚腺苷化的兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列，還包含病毒繁殖所必需的所有其它順式作用序列，包括包裝信號(hào)序列。
若期望經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將重組病毒引入細(xì)胞是為了遞送治療性基因至靶細(xì)胞，這樣的治療性基因(或編碼序列)則包括在質(zhì)粒內(nèi)，作為病毒基因組的一部分。然而，在一些實(shí)施方案中，將不期望遞送任何治療性基因至靶細(xì)胞。取而代之的是，裂解病毒可由所述質(zhì)粒編碼，一旦此病毒在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，它通過促進(jìn)凋亡破壞細(xì)胞以釋放后代病毒，例如腺病毒就是一種裂解病毒。此策略可用于，例如，處理癌細(xì)胞。一旦所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入癌細(xì)胞，并且裂解病毒表達(dá)，然后癌細(xì)胞死亡同時(shí)釋放后代病毒。這樣的病毒被稱為“細(xì)胞裂解”病毒，其在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如下文所進(jìn)一步論述的，這樣的病毒可以靶向癌細(xì)胞。
作為替代，所述質(zhì)?？梢园谕氚屑?xì)胞的治療性基因或編碼序列。這可以是編碼任何期望治療劑的基因，諸如正常宿主蛋白質(zhì)的非突變形式，諸如胰島素、生長(zhǎng)激素、凝血因子、細(xì)胞因子(諸如白介素)，或者作為替代，編碼自殺基因的基因，諸如能轉(zhuǎn)化前藥的酶、核酶、反義RNA、siRNA(用于基因沉默的小的抑制性RNA)以及基因表達(dá)的修飾子/增強(qiáng)子/阻遏子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道適于包含在質(zhì)粒內(nèi)的適當(dāng)基因。治療性基因/編碼序列通常將與啟動(dòng)子可操作性的連接，這使得基因一旦進(jìn)入細(xì)胞就轉(zhuǎn)錄。任選地，治療性基因還與增強(qiáng)子連接。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子二者都可以是天然存在于病毒內(nèi)的，與天然形式基因或編碼序列正常相連的，或者可以是由任何適當(dāng)來源提供的外源性元件。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，控制治療性基因表達(dá)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子序列對(duì)該療法靶向的細(xì)胞(靶細(xì)胞)具有特異性，由此使得治療性基因或編碼序列只在靶細(xì)胞群體中表達(dá)。這樣的靶向在下文將有進(jìn)一步的論述。
在本文所述的用途中，質(zhì)?？刹话?、包含一種或更多種(例如，1、2、3、4或5)用于遞送至靶細(xì)胞的治療性基因。
本發(fā)明中利用的質(zhì)粒包含允許病毒基因/編碼序列發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的序列，以及可能存在的治療性編碼序列。在下文中，這樣的序列被描述為“調(diào)節(jié)性核酸序列”并且包括啟動(dòng)子序列、聚腺苷化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、復(fù)制起點(diǎn)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、增強(qiáng)子，等等，其共同提供細(xì)胞內(nèi)編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。可以使用天然病毒序列。為了復(fù)制、翻譯和轉(zhuǎn)錄編碼序列，不必所有這些元件都存在。然而，為了提高靶細(xì)胞特異性，可能使用非異源序列指導(dǎo)來自質(zhì)粒的編碼序列表達(dá)。例如，可能使用組織特異性啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或改進(jìn)質(zhì)粒內(nèi)所含基因表達(dá)水平的任何其它序列。因此，可提及的有腫瘤相關(guān)性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，諸如MUC-1、PSA和酪氨酸酶，以及組織特異性啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，諸如胰高血糖素基因啟動(dòng)子，其將基因表達(dá)限制于腸(gut)的內(nèi)分泌細(xì)胞。
從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的后代病毒可依靠其天然的細(xì)胞結(jié)合能力(向性)感染靶細(xì)胞。更優(yōu)選的，可以通過修飾負(fù)責(zé)靶細(xì)胞結(jié)合和進(jìn)入的蛋白質(zhì)的基因/編碼序列來增強(qiáng)或改變病毒的向性。這樣的再靶向病毒是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可改變逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白質(zhì)以改變向性。由此，負(fù)責(zé)任何病毒之細(xì)胞靶向的衣殼或包膜蛋白質(zhì)的編碼序列可以被修飾，優(yōu)選通過添加靶向核酸序列加以修飾。靶向核酸序列編碼靶向配體，諸如抗體及其衍生物(諸如單鏈抗體)、抗原、凝集素、糖肽、諸如調(diào)蛋白等的肽類激素、受體或受體的配體(諸如結(jié)合對(duì)生物素和親合素)。然而，任何靶向結(jié)構(gòu)都可使用。
最初的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟可在任何細(xì)胞中發(fā)生，它不必是如下所進(jìn)一步論述的關(guān)于病毒治療的靶細(xì)胞?！俺跏技?xì)胞”是被所施加質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。因此初始轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，但優(yōu)選是靶細(xì)胞，或者與靶細(xì)胞在同一器官或組織內(nèi)，以使病毒療法定向于所需要的區(qū)域。因此，初始細(xì)胞可以是，例如，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染易于到達(dá)的位置，即，在諸如肝臟等器官的表面，其中靶細(xì)胞較不易接近，即在肝臟核心。然而優(yōu)選待轉(zhuǎn)染的初始細(xì)胞是靶細(xì)胞，或者與其非常接近的。
質(zhì)粒可以優(yōu)選結(jié)合，例如綴合至將質(zhì)粒導(dǎo)向至特異類型組織或細(xì)胞并因此促進(jìn)所述特異組織或細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染的靶向結(jié)構(gòu)或配體。例如，靶向結(jié)構(gòu)可用于特異性地靶向腫瘤細(xì)胞。
“靶細(xì)胞”是病毒療法所指向的細(xì)胞。細(xì)胞可以是純粹以細(xì)胞類型為基礎(chǔ)的靶細(xì)胞，例如，肝細(xì)胞，和/或以位置為基礎(chǔ)的靶細(xì)胞，例如，腿的平滑肌細(xì)胞。靶細(xì)胞可以是癌細(xì)胞。作為替代，靶細(xì)胞可以是患諸如丙型肝炎等感染的細(xì)胞、參與炎癥過程的細(xì)胞、或者需要提供外部提供基因的細(xì)胞，諸如糖尿病患者的胰腺細(xì)胞可以提供針對(duì)胰島素的功能編碼序列。因此，靶細(xì)胞可以是期望破壞或期望改變其中指定特性的細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)移編碼序列至該細(xì)胞將直接或間接地減少、改善或治療與該細(xì)胞相關(guān)的狀況。
編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)?？捎糜谥委熑魏渭膊?、病況、障礙、感染或炎癥。特別是，本發(fā)明可用于治療任何細(xì)胞增殖性疾病，諸如癌癥；免疫學(xué)疾病，諸如SCID；神經(jīng)細(xì)胞紊亂，諸如帕金森??；獲得性傳染病，諸如丙型肝炎感染和炎癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可以用基因、特別是基于病毒的療法治療的病況和疾病的范圍。
此外，本發(fā)明可用于免疫接種的目的，例如，質(zhì)粒編碼有復(fù)制能力的病毒，并期望產(chǎn)生針對(duì)所述病毒的抗體。
除了有復(fù)制能力的病毒序列之外，本發(fā)明的質(zhì)?？梢园|(zhì)粒骨架。適合的質(zhì)粒骨架對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并且在常規(guī)教科書中有描述，諸如Sambrook et al.(Molecular Cloning，A laboratory Manual，second edition，Cold Spring Harbor laboratory Press)。質(zhì)粒骨架優(yōu)選具有復(fù)制起點(diǎn)以允許質(zhì)粒在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制。在此上下文中，“細(xì)胞培養(yǎng)物”意指其中質(zhì)粒可增殖和維持的體外細(xì)胞培養(yǎng)物，而不是指為治療意圖而對(duì)其施用本發(fā)明質(zhì)粒的對(duì)象的細(xì)胞。通常，細(xì)胞培養(yǎng)物是細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物，例如，合適的大腸桿菌菌株，但也可使用包括酵母在內(nèi)的其它細(xì)胞培養(yǎng)物。質(zhì)粒的復(fù)制啟點(diǎn)必須是與細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞相容的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道如何選擇適當(dāng)?shù)慕M合。
合適的質(zhì)粒骨架的例子包括ColE1型質(zhì)粒，諸如pBR322(可獲自，例如TopoGEN，Inc.108Aces Alley Port Orange，F(xiàn)L，USA 32128)，它包含ColE1復(fù)制起點(diǎn)；pUC18(GenBank/EMBL登記號(hào)L09136)；pUC19(GenBank/EMBL登記號(hào)L09137)；包含oriR復(fù)制起點(diǎn)的R1質(zhì)粒(Nordstrm K，Molin S，Light J.Control of replication of bacterialplasmidsgenetics，molecular biology，and physiology of the plasmid R1system.Plasmid.1984 Sep；12(2)71-90.)以及包含pMB1和/或p15A復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒。
另一合適質(zhì)粒骨架的例子是R6K，可獲自，例如DSMZ-DeutscheSammlung yon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany。R6K具有α、β和γ三個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以及編碼R6K復(fù)制所需pi蛋白的pir基因。
依照本發(fā)明的質(zhì)?？赏ㄟ^將來自合適的有復(fù)制能力病毒的序列和來自合適質(zhì)粒的序列加以組合而構(gòu)建。作為替代，期望質(zhì)粒和/或病毒序列可全新合成。
優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)是在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生高拷貝數(shù)目質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，例如，ColE1，以允許在每個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)回收大量的質(zhì)粒，但在一些情況下，低拷貝數(shù)復(fù)制起點(diǎn)可能是優(yōu)選的。
質(zhì)粒骨架還優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記以便于那些已經(jīng)用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的鑒定/選擇。適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記是技術(shù)人員公知的。優(yōu)選的，所述標(biāo)記是抗生素抗性基因，其賦予針對(duì)例如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、博來霉素等的抗性。適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記的其它例子包括重金屬抗性基因和氨基酸生物合成標(biāo)記物。
質(zhì)?？捎贸Ｒ?guī)重組核酸技術(shù)構(gòu)建，諸如用限制性內(nèi)切酶切割期望的核酸片段，并用例如DNA連接酶連接核酸片段。當(dāng)原本的病毒序列是RNA而希望使用DNA質(zhì)粒時(shí)，能夠利用逆轉(zhuǎn)錄酶以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于該RNA序列的DNA序列用于載體中。在一些RNA病毒的情況中，可以在質(zhì)粒構(gòu)建中使用cDNA序列。質(zhì)粒構(gòu)建方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且可參閱Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis，Molecular Cloning，Cold SpringHarbour Laboratory Press。
所述質(zhì)粒在本發(fā)明中直接在體內(nèi)使用。因此，編碼重組的有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒自身被引入靶生物體內(nèi)。對(duì)上述質(zhì)粒是“用于治療”的理解上必須依此解釋。其中如本文所述質(zhì)粒在治療的背景下產(chǎn)生但不施用于患者的任何方法或用途，例如由于改為施用由所述質(zhì)粒編碼的病毒，這不在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的編碼病毒的質(zhì)粒的遞送先前還未設(shè)想過，并且勝過先前領(lǐng)域在培養(yǎng)足夠滴度病毒用于初始轉(zhuǎn)染事件的繁瑣方法。
從另一方面看，本發(fā)明提供了編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒，用于在體內(nèi)生產(chǎn)復(fù)制性病毒。
而且，本發(fā)明提供了編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒，用于遞送治療性基因至靶細(xì)胞/組織/器官。
如先前所提及的，本發(fā)明不需要繁瑣的病毒顆粒純化；取而代之的是，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化需要所述治療的對(duì)象的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過以下來生產(chǎn)質(zhì)粒用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，通常是細(xì)菌細(xì)胞；在利于質(zhì)粒維持和/或復(fù)制的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并用標(biāo)準(zhǔn)方法從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒。然后可以直接使用所述質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化需要治療的對(duì)象的細(xì)胞。此實(shí)施方案優(yōu)選適于RNA病毒。
在本發(fā)明的優(yōu)選適于DNA病毒的另一實(shí)施方案中，病毒序列最初插入合適的載體諸如質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、或酵母人工染色體(YAC)中。然后可通過轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞(通常是細(xì)菌細(xì)胞，但在YAC的情況中是酵母)并培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生期望量的這種載體加病毒序列構(gòu)建體。然后可從細(xì)胞中純化載體加病毒序列構(gòu)建體并將病毒序列與部分或整個(gè)載體分開，例如，通過限制性酶消化或通過使用重組酶。然后可用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如凝膠電泳或?qū)游黾兓《拘蛄械钠谕暮怂岱肿?。然后可將以此方式獲得的包含病毒序列的核酸分子用作本發(fā)明的質(zhì)粒。此質(zhì)?？梢允蔷€性的或環(huán)狀的。在一些情況下，線性質(zhì)?？梢允莾?yōu)選的，例如，當(dāng)病毒天然作為線性核酸分子存在時(shí)，例如，腺病毒。優(yōu)選的，線性核酸分子的末端可以受到保護(hù)，例如，通過在轉(zhuǎn)染入對(duì)象之前將它們與重組形式病毒的末端結(jié)合蛋白TBP偶聯(lián)。
在另一些情況下，環(huán)狀質(zhì)?？赡苁莾?yōu)選的，并且任何線性核酸分子可經(jīng)過處理環(huán)化。在這種實(shí)施方案中，最初的構(gòu)建體優(yōu)選在插入病毒線性序列的末端包含特異性且獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶或重組酶識(shí)別序列(例如，稀有切割的限制性酶，諸如Pme I，或者CRE重組酶的loxP位點(diǎn))。
因此在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)用于治療的編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒的方法，所述方法包括(a)在宿主細(xì)胞中提供包含編碼有復(fù)制能力的病毒之核酸的載體；(b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)回收所述質(zhì)粒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括(d)切下編碼所述有復(fù)制能力的病毒的核酸片段；(e)純化所述片段。
優(yōu)選的，用于以上方法中的宿主細(xì)胞不是包裝細(xì)胞(包含已整合的野生型病毒基因組序列并且由此提供裝配病毒所必需的全部結(jié)構(gòu)元件，但由于缺失包裝信號(hào)序列psi而不能用衣殼包裹其自身野生型病毒基因組的細(xì)胞)。
目標(biāo)生物可以是非人動(dòng)物，諸如哺乳動(dòng)物、鳥、爬行動(dòng)物或魚。優(yōu)選將所述質(zhì)粒直接用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，諸如伴友動(dòng)物(狗和貓)、牲畜(諸如牛、馬、綿羊和山羊)，或者非人靈長(zhǎng)類諸如猴和大猩猩。不過最優(yōu)選的目標(biāo)生物是人。
利用任何合適的方法將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)(如上所討論的，它們自身可以是或者可以不是靶細(xì)胞)。因此，所述質(zhì)?？赏ㄟ^，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔或彈道式基因轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)染入最初細(xì)胞內(nèi)。此外，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染的化學(xué)劑也可與質(zhì)粒一起體內(nèi)引入。通常轉(zhuǎn)染劑將包括在包含質(zhì)粒的組合制備物中或者可同時(shí)或順序施加。
因此，本發(fā)明另外的方面提供了包含編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)染劑的配制物。如下文所進(jìn)一步詳細(xì)討論的，作為化學(xué)品，當(dāng)使用彈道式基因轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染劑可以是丸狀的(例如，鎢微球)。轉(zhuǎn)染劑包括適于轉(zhuǎn)染使用的載體。合適的轉(zhuǎn)染劑的實(shí)例包括可與DNA混合促進(jìn)其被哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取的脂類化合物配制物，例如Lipofectin、Lipofectamine、Fugene、DOTAP、DMRIE、DC-Chol。這些是技術(shù)人員所公知的，并且許多是商品化的。還可使用聚合物諸如聚乙烯亞胺(PEI)、或者含有多陽(yáng)離子序列適于與DNA靜電偶聯(lián)形成“聚合復(fù)合物(polyplexes)”的肽配體。
在通過電穿孔方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染的情況下(其中組織或器官浸于電解液/質(zhì)粒溶液中并施加約2000伏的電壓，在細(xì)胞和核膜上打開大孔，然后質(zhì)粒可通過)，當(dāng)然更期望參與起始轉(zhuǎn)染事件的細(xì)胞是容易進(jìn)入的。
顆粒轟擊方法(又稱為“彈道式基因轉(zhuǎn)移”)也可用于以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染初始細(xì)胞，其中利用所謂的“基因槍”將質(zhì)粒偶聯(lián)的鎢微球高速射入細(xì)胞和組織內(nèi)。這樣的技術(shù)可以容易地體內(nèi)使用。
作為替代，可通過生理學(xué)上可接受的化學(xué)轉(zhuǎn)染劑諸如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑將質(zhì)粒引入體內(nèi)，所述轉(zhuǎn)染劑可以是以陽(yáng)離子或胺為基礎(chǔ)的。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染涉及質(zhì)粒和脂質(zhì)體復(fù)合物經(jīng)過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。由于進(jìn)入細(xì)胞的大部分復(fù)合物將在溶酶體內(nèi)降解，因此通常需要轉(zhuǎn)染眾多(即，1千，1萬，10萬)拷貝的質(zhì)粒，使得有些逃脫溶酶體降解作用并且即使在沒有任何主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制的情況下通過總體流動(dòng)進(jìn)入核。其它可使用的化學(xué)物包括磷酸鈣。
此外，還有一種被稱為“流體力學(xué)轉(zhuǎn)染(hydrodynamictransfection)”的方法，其中大流體體積的質(zhì)粒溶液高壓遞送入脈管系統(tǒng)，氣壓性損傷和質(zhì)粒與初始細(xì)胞較長(zhǎng)的接觸時(shí)間(因?yàn)榫薮蟮牧黧w體積需要較長(zhǎng)時(shí)間流出)的可能組合導(dǎo)致轉(zhuǎn)染水平相對(duì)較高。小鼠內(nèi)適當(dāng)?shù)牧黧w力學(xué)基因遞送方法已由Zhang等人于1997年報(bào)道。這包括通過27號(hào)針從尾靜脈輸注質(zhì)粒溶液。在較大的動(dòng)物和人中，用于流體力學(xué)遞送質(zhì)粒至肝的注射還可(a)通過門靜脈注射，在此情況下在輸注過程期間或之后即刻通過堵塞肝靜脈和下腔靜脈瞬時(shí)阻斷出流，或者(b)通過肝靜脈注射(通過下腔靜脈)，在此情況下在輸注過程期間或之后即刻通過堵塞門靜脈、腔靜脈和肝動(dòng)脈瞬時(shí)阻斷出流，或者(c)通過肝動(dòng)脈注射(通過股動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈)，在此情況下在輸注過程期間或之后即刻通過堵塞肝靜脈和門靜脈瞬時(shí)阻斷出流。盡管流體力學(xué)轉(zhuǎn)染在上文是關(guān)于肝進(jìn)行描述的，但技術(shù)人員應(yīng)理解同等方法可用于轉(zhuǎn)染身體的其它器官或部分。
此外可包括在配制物中的適當(dāng)生理學(xué)可接受載體或稀釋劑是技術(shù)人員所公知的。
有可能通過質(zhì)粒的直接靶向提高轉(zhuǎn)染率和入核率。通?？梢栽谫|(zhì)粒靶向策略中使用質(zhì)粒-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，例如聚賴氨酸。許多研究組已報(bào)道了當(dāng)含有核定位序列的蛋白質(zhì)與質(zhì)粒DNA預(yù)結(jié)合時(shí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率提高(例如，已利用高遷移組(HMG)非組蛋白蛋白和轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)質(zhì)粒進(jìn)入核)。
本發(fā)明因此涉及在體內(nèi)直接使用質(zhì)粒向細(xì)胞遞送重組的有復(fù)制能力的病毒的編碼序列，所述質(zhì)粒任選地?fù)饺肓酥委熜曰?編碼序列。
本發(fā)明因此擴(kuò)及人或動(dòng)物患者的治療方法，包括用編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒在體內(nèi)轉(zhuǎn)染所述患者的細(xì)胞。通常病毒基因組將摻入適于治療患者所患疾病的治療基因，但作為替代所述病毒自身可以“治療”患者，例如其中病毒引起轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解并由此破壞實(shí)體瘤。優(yōu)選地患者是人?！爸委煛卑ɑ颊呒膊』蚱湟环N或多種癥狀的部分或全部改善。
一旦質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并且質(zhì)粒進(jìn)入核，細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯體系應(yīng)開始質(zhì)粒內(nèi)所包含編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。一旦質(zhì)粒進(jìn)入核，該細(xì)胞受到所述質(zhì)粒編碼的病毒的有效感染，當(dāng)質(zhì)粒編碼序列被宿主細(xì)胞體系翻譯和轉(zhuǎn)錄時(shí)病毒生活周期開始。
由于所述質(zhì)粒編碼的病毒是有復(fù)制能力的，在生活周期的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)，重組的有復(fù)制能力的病毒將從初始轉(zhuǎn)染細(xì)胞中釋放。在后代病毒釋放期間初始轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否裂解取決于病毒的特性。若病毒是溶胞性的，諸如腺病毒，那么后代病毒的釋放將伴隨著細(xì)胞的裂解。不過，一些病毒無害地在細(xì)胞表面出芽，諸如MLV，因此初始轉(zhuǎn)染細(xì)胞將繼續(xù)存活。
因此，初始轉(zhuǎn)染細(xì)胞基本上充當(dāng)體內(nèi)病毒產(chǎn)生細(xì)胞，然后所述病毒被釋放以感染其靶細(xì)胞，這樣這些靶細(xì)胞也變成產(chǎn)病毒的。因此，從利用質(zhì)粒進(jìn)行的初始轉(zhuǎn)染事件開始，可實(shí)現(xiàn)多重轉(zhuǎn)染事件。
可以期望利用控制機(jī)制以阻止病毒載體的擴(kuò)散?？墒褂帽粍?dòng)或主動(dòng)免疫作為質(zhì)粒介導(dǎo)病毒治療的隨后步驟，這包括對(duì)所涉及的患者提供抗體或病毒疫苗。這樣的療法應(yīng)終止病毒擴(kuò)散并提供使對(duì)非靶細(xì)胞的任何風(fēng)險(xiǎn)最小化的安全保障?？共《舅幬铮T如抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物AZT(疊氮基-3′-脫氧胸苷)可容易地終止病毒復(fù)制和擴(kuò)散。如果期望，可將另外的“自殺”基因，諸如那些有關(guān)治療已提及的基因，插入病毒基因組中。作為替代，可依賴外源供給的物質(zhì)如四環(huán)素通過使用四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子制備關(guān)鍵結(jié)構(gòu)性病毒組分的調(diào)節(jié)核酸序列。其它這樣的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括雷帕霉素/FK 506-結(jié)合蛋白誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。因此，一旦外源供給的誘導(dǎo)劑撤消，則病毒擴(kuò)散被阻止。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒編碼(重組的)有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選摻入靶向某些細(xì)胞類型的核酸序列，因?yàn)檫@會(huì)降低或消除天然致病性同時(shí)提高靶向特異性。特別優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體論述于作為參考并入本文中的美國(guó)專利US 6,410,313中。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明因此提供了編碼有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)粒，其包含逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG編碼序列；逆轉(zhuǎn)錄病毒POL編碼序列；逆轉(zhuǎn)錄病毒ENV編碼序列；逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列；和任選地一個(gè)或多個(gè)以下元件；可操作性連接于調(diào)節(jié)核酸序列的異源編碼序列；用于逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞或組織特異性靶向的一個(gè)或多個(gè)靶向序列。
如前所述的靶特異性核酸序列可以是組織或細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列，諸如調(diào)蛋白(heregulin)啟動(dòng)子序列。它通常放置于病毒基因組的5′和/或3′末端。為了使逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向特異的靶細(xì)胞或組織，可修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒ENV編碼序列以使其進(jìn)一步包含如前所述的靶特異性配體或結(jié)合結(jié)構(gòu)。
由于質(zhì)粒中提供了衣殼化所需的序列，所以形成的病毒是有復(fù)制能力的。
所述質(zhì)粒因此具有至少三個(gè)基因gag、pol和env基因，其側(cè)翼是含順式作用序列諸如Psi的兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列，Psi負(fù)責(zé)高效地用衣殼包裹病毒RNA，以及基因組逆轉(zhuǎn)錄所必需的序列諸如tRNA引物結(jié)合位點(diǎn)。
gag基因編碼內(nèi)部結(jié)構(gòu)(基質(zhì)、衣殼和核衣殼)蛋白質(zhì)；pol基因編碼RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)、蛋白酶和整合酶；env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5′和3′LTR用于啟動(dòng)病毒粒子RNA的轉(zhuǎn)錄和聚腺苷酸化。LTR還包含病毒復(fù)制所必需的其它順式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。
組織或細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件(即增強(qiáng)子/啟動(dòng)子)，如果存在的話，優(yōu)選與5′和/或3′LTR連接，產(chǎn)生嵌合LTR。
在本文所述的質(zhì)粒中，異源(通常是治療性的)編碼序列優(yōu)選處于病毒LTR啟動(dòng)子-增強(qiáng)子信號(hào)或內(nèi)部啟動(dòng)子的調(diào)控下。因此，期望的序列可在數(shù)個(gè)位點(diǎn)插入并服從不同的調(diào)節(jié)區(qū)。例如，插入位點(diǎn)可以是病毒增強(qiáng)子/啟動(dòng)子位點(diǎn)(即5′LTR-驅(qū)動(dòng)的基因座位)。作為替代，期望的序列可插入調(diào)節(jié)遠(yuǎn)端位點(diǎn)，例如env基因3′的IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明所用的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒包含IRES，所述IRES含有用于所期望核酸序列諸如異源序列的插入位點(diǎn)，優(yōu)選IRES在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體內(nèi)env基因的3′端。因此，異源核酸序列，例如，編碼異源多肽的異源核酸序列，可以可操作性的與IRES連接。可以可操作性的與IRES聯(lián)接的核酸序列的例子是自殺基因，諸如PNP和HSV-胸苷激酶，編碼反義分子的序列或編碼核酶的序列。
病毒gag、pol和env基因或編碼序列可來自任何合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如來源于MLV或慢病毒，即HIV或MoMLV)。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，病毒ENV基因是非逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的(例如，CMV或VSV)。env基因可來源于任何逆轉(zhuǎn)錄病毒。env可以是允許轉(zhuǎn)導(dǎo)人和其它物種細(xì)胞的兼嗜性包膜蛋白，或者可以是只能轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠和大鼠細(xì)胞的親嗜性包膜蛋白。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的質(zhì)粒包含有復(fù)制能力的兼嗜性小鼠白血病病毒(MLV)載體構(gòu)建體的全部序列。更優(yōu)選的，它包含有復(fù)制能力的兼嗜性小鼠白血病病毒(MLV)載體構(gòu)建體的全部序列，其中用細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子置換5’長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)U3區(qū)，并且將腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)-治療性基因表達(dá)盒插入在env基因和3’LTR之間。
此外，可以期望通過將包膜蛋白與抗體或用于靶向特定細(xì)胞類型的受體的特定配體相連接使重組病毒靶向目標(biāo)。如上所提及的，可通過插入例如糖脂或蛋白質(zhì)使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有靶特異性。靶向經(jīng)常通過使用抗體使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶向特定細(xì)胞類型(例如，在某些組織中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類型，或者癌細(xì)胞類型)上的抗原來實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道，或無需過度實(shí)驗(yàn)就可容易地確定，完成遞送逆轉(zhuǎn)錄病毒載體至特異靶標(biāo)的具體方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，env基因來源于非逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，CMV或VSV)。逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的env基因的例子包括，但不局限于Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GaLV)、人免疫缺陷性病毒(HIV)和勞斯肉瘤病毒(RSV)。其它env基因諸如水泡性口炎病毒(VSV)(蛋白G)、細(xì)胞巨化病毒包膜(CMV)或流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)也可使用。由此，技術(shù)人員在設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的質(zhì)粒中可利用來自不同病毒的不同基因來構(gòu)建雜合載體。類似的靶向方法適于不同的病毒。
可利用細(xì)胞或組織特異性調(diào)節(jié)核酸序列(例如，啟動(dòng)子)在特異性靶細(xì)胞群中靶向表達(dá)基因序列。適用于本發(fā)明的適當(dāng)哺乳動(dòng)物和病毒啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在病毒基因組的5′和/或3′末端具有組織特異性啟動(dòng)子元件的質(zhì)粒。優(yōu)選地，組織特異性調(diào)節(jié)元件/序列是在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組LTR的U3區(qū)內(nèi)，包括例如針對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞或組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(例如，腫瘤細(xì)胞特異性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子)，以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如，四環(huán)素)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列還可包括天然與異源基因相連的天然轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
一旦質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入初始細(xì)胞，且后代病毒釋放，重組的有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒就能進(jìn)一步感染細(xì)胞，優(yōu)選它們的靶細(xì)胞。在細(xì)胞被病毒感染后，病毒將其核酸注入細(xì)胞且遺傳物質(zhì)可整合入靶細(xì)胞基因組內(nèi)。然后轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)。質(zhì)粒中插入的異源(例如，治療性)編碼序列將轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞核并可以整合入靶細(xì)胞DNA。
一些種類的逆轉(zhuǎn)錄病毒只具有感染分裂細(xì)胞的能力，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙僭谌我鈺r(shí)間轉(zhuǎn)移其遺傳物質(zhì)通過核膜所必需的信號(hào)，因此必須等待核膜在有絲分裂期間溶解。C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如脾壞死病毒(SNV)是所述病毒的例子。因此，這些是用于遞送基因至具有細(xì)胞增殖紊亂的靶細(xì)胞的優(yōu)選病毒。這樣的紊亂包括任何以異常的細(xì)胞數(shù)目和活躍的細(xì)胞分裂為特征的任何病況。因此，這樣的病況包括任何類型的癌癥，但該細(xì)胞群不必是受到轉(zhuǎn)化的、致腫瘤的或惡性的，而是也可包括正常細(xì)胞。細(xì)胞增殖可以發(fā)生在炎癥和感染期間，或者在疾病諸如肝硬化期間發(fā)生。某些細(xì)胞群體諸如皮膚細(xì)胞，持續(xù)再生并因此可用只轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向所述細(xì)胞群體。
在不期望增殖事件的情況中，諸如癌癥，病毒可遞送自殺基因，諸如單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因和大腸桿菌嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)基因。作為替代，病毒可遞送細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子、抗炎細(xì)胞因子諸如白介素、用于識(shí)別特定惡性腫瘤相關(guān)RNA并將其切割的核酶或者抗血管發(fā)生因子。許多合適的治療性編碼序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這樣的異源編碼序列還可通過本文提及的任何病毒運(yùn)送。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有用作病毒DNA產(chǎn)生之模板的RNA基因組。這是通過與RNA基因組一起包裝的RNA依賴型DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)完成的。產(chǎn)生的病毒DNA整合入宿主細(xì)胞基因組以提供模板用于經(jīng)由宿主來源機(jī)制的病毒RNA合成。因此，為了產(chǎn)生編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA質(zhì)粒，可使用逆轉(zhuǎn)錄酶來產(chǎn)生病毒RNA序列的病毒DNA拷貝。這樣的DNA序列如果需要可以進(jìn)行修飾。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，質(zhì)粒編碼重組的有復(fù)制能力的鼠白血病病毒(MLV)，其包含MLV gag編碼序列；MLV env編碼序列；MLV pol編碼序列；包含逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組5′和3′末端LTR序列的MLV核酸序列；對(duì)于在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄、包裝和整合所必需的順式作用核酸序列，以及任選地與調(diào)節(jié)核酸序列可操作性連接的異源編碼序列。
基于MLV的基因治療載體在本領(lǐng)域中已有描述(Logg et al，Journal of Virology，Dec 2002，12738-12791；Logg et al，Journal ofVirology，Aug 2001，6989-6998和Tai et al，Human Gene Therapy14789-802，May 2003)。
現(xiàn)在以以下非限制性的實(shí)施例并參考附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，所述附圖中


圖1是編碼有復(fù)制能力的MoMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸分子的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是編碼有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)粒。有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細(xì)胞是前列腺癌細(xì)胞；圖3圖3A顯示編碼有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸的一般結(jié)構(gòu)，而圖3B顯示特定的質(zhì)粒載體，其指出轉(zhuǎn)基因插入片段的身份與轉(zhuǎn)基因插入片段兩端的序列。粗體顯示的核苷酸表示env終止密碼子的位置。
圖4顯示質(zhì)粒pACE-GFP衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別在人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系WiDr和鼠結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系CT26.WT中以不同劑量接種后的復(fù)制曲線。上部組圖中的曲線顯示在以感染復(fù)數(shù)(MOI)0.1和0.01(即分別是每10個(gè)細(xì)胞或每100個(gè)細(xì)胞有一個(gè)感染性納級(jí)載體)起始接種后每三天通過流式細(xì)胞儀分析測(cè)定的GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。下部組圖顯示在接種后指定天數(shù)用熒光顯微鏡獲取的感染細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)的代表性圖象。
圖5顯示流體力學(xué)注射質(zhì)粒pACE-GFP(實(shí)施例6)后48小時(shí)分離的肝臟的GFP熒光經(jīng)光學(xué)成像后的代表性合成圖象。左側(cè)顯示對(duì)照，右側(cè)顯示GFP表達(dá)。
圖6顯示如實(shí)施例6中所述在第21天(中間圖)和第28天(右側(cè)圖)分離的肝的GFP熒光經(jīng)光學(xué)成像后的代表性合成圖象。左圖顯示陰性對(duì)照。
圖7顯示pACE-GFP-衍生病毒納級(jí)載體體內(nèi)復(fù)制期間在一系列時(shí)間點(diǎn)解剖后對(duì)立即收獲的分散腫瘤細(xì)胞經(jīng)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析的結(jié)果。將每只小鼠最大的肝腫瘤切下，用膠原酶/分散酶(dispase)消化，并立即通過FACS進(jìn)行分析(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的n＝4)。曲線圖顯示了在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(X軸)腫瘤樣品中檢測(cè)到的GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分率(Y軸)。
圖8顯示對(duì)于pACE-GFP-衍生復(fù)制病毒整合GFP轉(zhuǎn)基因的PCR分析結(jié)果。
實(shí)施例實(shí)施例1編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)粒的構(gòu)建從質(zhì)粒pZAP(Soneoka et al，Nucleic Acid Research，23，628-633)(由University of Wisconsin的John A.Young提供)中用NheI切下傳染性Moloney MLV前病毒克隆，其中NheI在每個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)內(nèi)切割一次，以消除兩側(cè)的大鼠基因組序列，然后再克隆入MLV載體g1ZIN的質(zhì)粒骨架中以產(chǎn)生質(zhì)粒pZAP2。用PCR擴(kuò)增從唯一NsiI位點(diǎn)至終止密碼子的env基因區(qū)域并與通過重疊延伸PCR(Horton et al，Gene；77，6028 to 6036)擴(kuò)增自質(zhì)粒pEMCF的腦心肌炎病毒IRES(Jang et al，J.Virol，62；2636 to 2643，1988)融合，在3′末端引入限制性位點(diǎn)BstBI和NotI。質(zhì)粒g1ZIN和pEMCF可獲自南加州大學(xué)的W.French Anderson。
此外還通過PCR擴(kuò)增了從env終止密碼子至3′LTR的3′末端的區(qū)域，分別在擴(kuò)增產(chǎn)物的5′和3′末端引入了NotI和AflIII位點(diǎn)。用三步(three-way)連接將此PCR產(chǎn)物和重疊延伸PCR產(chǎn)物在質(zhì)粒骨架的的NsiI位點(diǎn)和AflIII位點(diǎn)插入pZAP2中，產(chǎn)生質(zhì)粒pZAPd。來自質(zhì)粒pPUR(Clontech)的嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(pac)、來自質(zhì)粒pTK-hygro(Clontech)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)和質(zhì)粒pEGFP(Clontech)的綠色熒光蛋白GFP)cDNA(Cormack et al，Gene 173，33 to38，1996)各自通過PCR擴(kuò)增并插入pZAPd的BstBI和NotI位點(diǎn)，在與IRES可靠起始密碼子相同讀碼框內(nèi)，分別生成pZAPdpuro、pZAPd-hygro和pZAPd-GFP。測(cè)序驗(yàn)證了PCR產(chǎn)生的所有區(qū)域。此外還通過定點(diǎn)誘變產(chǎn)生其中消除IRES-GFP插入片段兩側(cè)11-bp重復(fù)序列并以MluI位點(diǎn)替換的基于pZAPd-GFP的構(gòu)建體，并命名為pZAPm-GFP。通過重疊延伸PCR產(chǎn)生其中用來自4070A的兼嗜性包膜替代Moloney MLV親嗜性包膜的另一構(gòu)建體，并命名為pAZE-GFP。
實(shí)施例2良好制造規(guī)范(GMP)級(jí)質(zhì)粒的生產(chǎn)針對(duì)臨床用途的DNA質(zhì)粒通常需要以下步驟
-提交關(guān)于GMP質(zhì)粒生產(chǎn)的生物制品主文件供有關(guān)管理機(jī)構(gòu)(例如FDA)審閱和批準(zhǔn)。
-針對(duì)所有的GMP操作設(shè)計(jì)遵從CFR21(聯(lián)邦管理法規(guī))和ICH(國(guó)際協(xié)調(diào)委員會(huì))關(guān)于活性藥物成分之良好制造規(guī)范的三聯(lián)方針的綜合標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)。
-執(zhí)行SOP，包括主要計(jì)劃的確認(rèn)和關(guān)于所有關(guān)鍵設(shè)備的確認(rèn)手續(xù)，嚴(yán)格的記錄和追蹤程序以及對(duì)所有引入原材料的全面質(zhì)量檢驗(yàn)(U.S.Pharmacopoiea(USP)或同等級(jí)別的成分和試劑)，審核對(duì)所有供應(yīng)商的查賬清單，參與GMP過程的所有員工的全面培訓(xùn)程序，等等。
-Per SOP，主細(xì)胞庫(kù)(Master Cell Bank)和制造工作細(xì)胞庫(kù)(Manufacturers Working Cell Bank)的生產(chǎn)(這由以下組成，生成已用目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并證實(shí)復(fù)制該質(zhì)粒且將其穩(wěn)定保持的克隆化大腸桿菌細(xì)菌儲(chǔ)備物；主細(xì)胞庫(kù)是初始儲(chǔ)備物，它隨后被冷凍保存，而工作細(xì)胞庫(kù)則由來自主庫(kù)用于實(shí)際生產(chǎn)的等分試樣組成)。
-GMP生產(chǎn)前專門設(shè)計(jì)用于放大和法規(guī)遵從的的定制純化方法的工藝優(yōu)化和開發(fā)。
-放大生產(chǎn)工藝包括以逐漸增大的培養(yǎng)規(guī)模擴(kuò)增工作細(xì)胞儲(chǔ)備物(它已被證實(shí)產(chǎn)生所述質(zhì)粒)，直至達(dá)到期望的合成規(guī)模。
-對(duì)于質(zhì)粒純化，離心沉淀細(xì)菌，去除上清培養(yǎng)基，用化學(xué)物/去垢劑裂解破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，分離并純化質(zhì)粒組分，通常通過溶劑分級(jí)分離和差速離心，或者更通常是通過樹脂吸附并洗脫或柱層析來實(shí)施。
-終產(chǎn)物應(yīng)進(jìn)行QC檢驗(yàn)并至少符合以下標(biāo)準(zhǔn)，每一批次都記錄有分析證書低水平的殘留內(nèi)毒素(＜1EU/mg質(zhì)粒)低水平的宿主細(xì)胞染色體DNA(＜1％)低水平的RNA低殘留蛋白質(zhì)低殘留溶劑主要是共價(jià)閉合環(huán)狀(超螺旋)質(zhì)粒(＞95％)(在此具體實(shí)驗(yàn)中)實(shí)施例3經(jīng)電穿孔的質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染利用電極陣列的腫瘤電穿孔將B16細(xì)胞皮下注射入小鼠(雌性，5-6周齡)側(cè)腹。除非另外指定，注射106個(gè)細(xì)胞，4天后，生成平均體積75mm3的腫瘤。將質(zhì)粒DNA(5.5pmol)稀釋于50微升K-PBS(30mM NaCl，120mM KCl，3mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，5mM MgCl2)中并使用27號(hào)針的注射器經(jīng)皮膚注射入腫瘤。用裝備0.5cm直徑陣列7針電極的電穿孔儀CUY21(Tokiwa Science，Tokyo，Japan)對(duì)腫瘤進(jìn)行脈沖。在針陣列電極中，一個(gè)中央針被6個(gè)針環(huán)繞。電流經(jīng)過位于正中的針向周圍的針傳遞，或者以相反方向傳遞。6個(gè)方波脈沖以1s-1的頻率遞送，脈沖時(shí)長(zhǎng)100ms，電壓50V。三個(gè)脈沖后進(jìn)行相反極性的另外三個(gè)脈沖。
用于在轉(zhuǎn)基因小鼠生成中產(chǎn)生基因修飾精子的睪丸電穿孔ICR品系和[C57BL/6□DBA/2]F1小鼠購(gòu)自SLC，Japan。出生后14天的ICR品系小鼠用戊巴比妥鈉溶液麻醉，并將睪丸放于解剖顯微鏡下。將微量吸管插入睪丸網(wǎng)中用于向生精小管中注射。在每個(gè)睪丸中注入約6-10μl的DNA/HBS溶液(100-120μg/ml)。用電脈沖發(fā)生器(Electrosquare Porator T820，BTX，USA)輸送電脈沖。將睪丸保持在一對(duì)鑷狀電極之間，施加四次方形電脈沖，然后再以相反方向施加四次。每個(gè)脈沖在30-50V持續(xù)50ms。
實(shí)施例4用彈道式基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用于DNA疫苗接種的皮膚基因轉(zhuǎn)移用氦驅(qū)動(dòng)的基因槍(Bio-Rad，Hercules，CA)依照制造商提供的方案實(shí)施基因槍顆粒介導(dǎo)的DNA疫苗接種。簡(jiǎn)而言之，通過將25mg的1.6μm金微載體(Bio-Rad，Hercules，CA)和100μl的0.05M亞精胺(Sigma，St，Louis，MO)結(jié)合制備DNA包裹的金顆粒。在用渦漩混合的同時(shí)順序加入質(zhì)粒DNA(50μg)和1.0M CaCl2(100μl)。讓該混合物在室溫沉淀10分鐘。然后將微載體/DNA懸液離心(10,000rpm 5s)并用新鮮無水酒精洗三次，接著重懸于3ml溶于無水酒精的聚乙烯吡咯烷酮(0.1mg/ml；Bio-Rad，Hercules，CA)中。然后將溶液加到管子中使其靜置4分鐘。輕輕去除乙醇，通過旋轉(zhuǎn)管子使微載體/DNA懸液均勻附著于管子的內(nèi)表面。然后通過0.4升/分鐘的流動(dòng)氮?dú)獯蹈晒堋Ｈ缓髮晃⑤d體/DNA的干燥管子切成0.5-英寸模塊(cartridge)并在4℃貯存于加帽的干燥瓶中。結(jié)果，每個(gè)模塊包含1μg質(zhì)粒DNA和0.5mg的金。用氦驅(qū)動(dòng)的基因槍(Bio-Rad，Hercules，CA)以400p.s.i的排出壓力將DNA包裹的金顆粒(1μg DNA/彈)遞送至小鼠的去毛腹部區(qū)域。
實(shí)施例5流體力學(xué)基因轉(zhuǎn)移流體力學(xué)轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠肝臟在如早前所報(bào)道(Zhang et al.，1997)的最優(yōu)表達(dá)條件下通過門靜脈或肝靜脈(通過下腔靜脈)進(jìn)行肝臟的直接注射。最優(yōu)條件需要注射溶于含15％甘露醇(Sigma，St.Louis，MO)和肝素(2.5單位/ml；Lypho-Med，Chicago，IL)的1ml生理鹽水(0.9％NaCl)中的pDNA(質(zhì)粒DNA)。對(duì)于門靜脈注射，通過堵塞肝靜脈和下腔靜脈來阻斷流出。對(duì)于肝靜脈注射，通過堵塞門靜脈、腔靜脈和肝動(dòng)脈來阻斷流出。在7-120秒內(nèi)通過用27號(hào)針注射溶于1-3ml Ringer溶液(147mM NaCl，4mM KCl，1.13mM CaCl2)的10-250微克pDNA進(jìn)行尾靜脈的注射。
實(shí)施例6.通過流體力學(xué)注射入小鼠肝臟的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染引發(fā)的納級(jí)載體傳播(TNT)6.1質(zhì)粒pACE-GFP質(zhì)粒pACE-GFP包含有復(fù)制能力的兼性小鼠白血病病毒(MLV)載體構(gòu)建體的全序列，其中已經(jīng)用細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子替換了5’長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)U3區(qū)，并且在env基因和3’LTR之間插入腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)-綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)盒。質(zhì)粒骨架包含大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因。下文給出了pACE-GFP的全序列，其中G＝病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)。這代表Moloney小鼠白血病病毒(MLV)序列的開始。
TSS定為MLV基因組序列的位置1，那么5′長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)R/U5區(qū)＝1至145gag多蛋白序列＝621至2237pol多蛋白序列＝2238至5837加下劃線＝兼性MLV 4070A包膜編碼序列3’LTR＝7816至8332A＝MLV序列的末端剩余序列包含大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒骨架TTTGAAAGACCCCACCCGTAGGTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGATTGTCTAGTGTCTATGACTGATTTTATGCGCCTGCGTCGGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCGGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTCGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGTCCAAAAATCCCGATCGTTTTGGACTCTTTGGTGCACCCCCCTTAGAGGAGGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAGAATATGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGA
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6.2體外測(cè)試圖4顯示了在以不同劑量接種后質(zhì)粒pACE-GFP-來源逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別在WiDr人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系和CT26.WT小鼠結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中的復(fù)制曲線。上方圖中曲線顯示了以0.1和0.01(即，分別是每10個(gè)細(xì)胞或每100個(gè)細(xì)胞一個(gè)感染性納級(jí)載體)的感染復(fù)數(shù)(MOI)初始接種后每三天用流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定的GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分率。下方圖顯示了在接種后指定天數(shù)用熒光顯微鏡獲取的感染細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)的代表性圖像。
6.3結(jié)腸直腸癌向肝臟轉(zhuǎn)移的小鼠模型的建立為了證明使用流體力學(xué)轉(zhuǎn)染作為遞送質(zhì)粒至體內(nèi)腫瘤用于起始復(fù)制性病毒傳播的方法，通過脾內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞來建立結(jié)腸直腸癌向肝臟轉(zhuǎn)移的小鼠模型。小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系CT26，最初來源于Balb/c小鼠，可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA，USA)，在含5％CO2的潮濕空氣中保持于含10％胎牛血清和1％青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。為了建立腫瘤，在經(jīng)異氟烷麻醉并進(jìn)行左肋骨下切開后，將配制于200μl PBS中的CT26腫瘤細(xì)胞(5×10e4個(gè)細(xì)胞)通過30號(hào)針注射入6周齡的雌性Balb/c小鼠的脾。止血5分鐘后，進(jìn)行脾切除并用創(chuàng)緣夾閉合切口。
當(dāng)然，其它合適的細(xì)胞系也可應(yīng)用于適當(dāng)宿主(適于來自相同株系和物種之腫瘤的有免疫能力的同源宿主，或適于來源于異源株系或異種物種之腫瘤的無胸腺免疫缺陷宿主)的此類型腫瘤模型中。
6.4體內(nèi)轉(zhuǎn)染腫瘤接種兩周后，將30μg pACE-GFP質(zhì)粒與TransIT-QR(QuickRecovery)流體力學(xué)遞送溶液(Mirus Bio Corp.，Madison，WI，USA)混合，每只小鼠每克體重總體積為0.1ml(例如，對(duì)于體重20g的小鼠，每只小鼠總體積為2.0ml)。在如前所報(bào)道(Zhang et al.，1997)的基因表達(dá)最優(yōu)條件下進(jìn)行此質(zhì)粒DNA溶液的流體力學(xué)注射，要求總體積通過置于尾靜脈的27號(hào)針在4至7秒內(nèi)以恒定速率輸注。
轉(zhuǎn)染引發(fā)病毒復(fù)制后GFP表達(dá)的分析在施用質(zhì)粒后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在無菌條件下切下肝臟并用Xenogen-IVIS冷CCD光學(xué)成像系統(tǒng)(Xenogen IVIS，Alameda，CA，USA)顯現(xiàn)腫瘤中的GFP熒光。用Living成像軟件(Living Image Software)(Xenogen)和IGOR-PRO成像分析軟件(Wave Metrics，Lake Oswego，OR，USA)生成由所分離器官的灰度背景攝影圖像和發(fā)射熒光的顏色重疊圖像組成的合成圖像。
圖5顯示在上述右圖有關(guān)pACE-GFP的條件下流體力學(xué)注射質(zhì)粒pACE-GFP后48小時(shí)來自分離肝臟的GFP熒光經(jīng)光學(xué)成像后的代表性合成圖像。有趣的是，流體力學(xué)注射似乎導(dǎo)致了相較于正常肝實(shí)質(zhì)而言多病灶CT26腫瘤的優(yōu)先轉(zhuǎn)染(顯現(xiàn)為包埋于暗色正常肝組織背景中的白色區(qū))，可能是由于新形成的腫瘤新脈管系統(tǒng)中存在較大的并且更易“泄漏的”縫隙。作為介質(zhì)對(duì)照，還平行進(jìn)行了未添加質(zhì)粒DNA的TransIT-QR溶液的流體力學(xué)注射；此轉(zhuǎn)染顯示出沒有可檢測(cè)到的GFP熒光信號(hào)(左圖，對(duì)照)。右邊的色標(biāo)顯示在每秒每cm2的熒光信號(hào)光通量的相對(duì)強(qiáng)度。
圖6顯示來自第21天和第28天所分離肝臟的GFP熒光光學(xué)成像后的代表性合成圖像，在此時(shí)間點(diǎn)來自轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的GFP直接表達(dá)應(yīng)完全受到抑制；因此，所有的GFP熒光應(yīng)來自正復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒納級(jí)載體(中間和右側(cè)圖，分別是第21天和第28天的ACE-GFP)?？梢杂^察到，隨著時(shí)間增加在很多腫瘤團(tuán)塊中由于復(fù)制病毒載體傳播GFP轉(zhuǎn)基因所造成的GFP擴(kuò)散增加。右側(cè)色標(biāo)顯示每秒每cm2熒光信號(hào)光通量的相對(duì)強(qiáng)度，它比前圖中的高10倍；這表明相比較于初始質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，不只是區(qū)域，而且GFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)的總強(qiáng)度也隨時(shí)間增加。作為介質(zhì)對(duì)照，如上進(jìn)行流體力學(xué)注射未添加質(zhì)粒DNA的單獨(dú)TransIT-QR溶液后所分離肝臟的光學(xué)成像；仍然沒有可檢測(cè)到的GFP熒光信號(hào)(左圖，對(duì)照)。
圖7顯示在體內(nèi)pACE-GFP來源病毒納級(jí)載體復(fù)制期間一系列時(shí)間點(diǎn)解剖后立即收獲的分散腫瘤細(xì)胞的熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)的分析結(jié)果。切下每只小鼠最大的肝腫瘤，用膠原酶/分散酶消化，然后立即用FACS分析(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的n＝4)。曲線圖顯示，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(X軸)檢測(cè)到的腫瘤樣品中GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率(Y軸)。同樣，結(jié)果證明了GFP轉(zhuǎn)基因隨時(shí)間增加通過復(fù)制病毒在腫瘤實(shí)體中被有效傳播。
圖8顯示pACE-GFP-來源的復(fù)制病毒整合GFP轉(zhuǎn)基因的PCR分析結(jié)果。對(duì)于GFP轉(zhuǎn)基因的特異性引物，其序列正常不存在于小鼠基因組中，用于PCR擴(kuò)增分離自小鼠肝臟的CT26腫瘤或荷瘤小鼠中各種正常組織(如所標(biāo)記)的基因組DNA。未轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤也作為陰性對(duì)照(標(biāo)記為“腫瘤(陰性)”進(jìn)行擴(kuò)增。上圖顯示直接從以不同拷貝數(shù)(如所示)與基因組DNA混合的pACE-GFP質(zhì)粒來PCR擴(kuò)增GFP序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線。下圖顯示用另一套特異性引物作為內(nèi)部對(duì)照擴(kuò)增內(nèi)源小鼠β-肌動(dòng)蛋白基因序列(500bp帶)，以確認(rèn)基因組DNA樣品和PCR流程的完整性。結(jié)果顯示只在來自于正發(fā)生pACE-GFP-來源病毒復(fù)制的腫瘤基因組DNA中可擴(kuò)增到GFP特異性的強(qiáng)而可靠(robust)的信號(hào)(700bp帶)；相比之下，初始質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染自身只是短暫性的并且從未導(dǎo)致如此高水平的整合入基因組DNA中。
權(quán)利要求
1.用于治療的編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的質(zhì)粒，其用于治療細(xì)胞增殖性疾病、免疫學(xué)疾病、神經(jīng)紊亂、獲得性感染和/或炎癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的質(zhì)粒，其中所述疾病選自癌癥、SCID、帕金森病、丙型肝炎感染和/或糖尿病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的質(zhì)粒，其中所述有復(fù)制能力的病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的質(zhì)粒，其中所述有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒包含逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG編碼序列；逆轉(zhuǎn)錄病毒POL編碼序列；逆轉(zhuǎn)錄病毒ENV編碼序列；逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列；和任選地以下元件的一種或多種與調(diào)控核酸序列可操作性連接的異源編碼序列；用于逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞或組織特異性靶向的一個(gè)或多個(gè)靶向序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包含治療性基因和/或編碼序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的質(zhì)粒，其中所述治療性基因和/或編碼序列可操作性連接至對(duì)所述治療所靶向的細(xì)胞具有特異性的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的質(zhì)粒，其中所述有復(fù)制能力的病毒是裂解病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的質(zhì)粒，其中所述裂解病毒是腺病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的質(zhì)粒，其中所述病毒的向性被增強(qiáng)或改變。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的質(zhì)粒，其中用于將所述質(zhì)粒遞送至需要治療的對(duì)象的方法是流體力學(xué)轉(zhuǎn)染。
12.一種包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)染劑的配制物。
13.一種生產(chǎn)用于治療的編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒的方法，所述方法包括(a)在宿主細(xì)胞中提供包含核酸的載體，所述核酸編碼有復(fù)制能力的病毒；(b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(c)回收所述質(zhì)粒。
14.一種治療人或動(dòng)物患者的方法，其包括用編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒對(duì)所述患者的細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)轉(zhuǎn)染。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述病毒基因組中并入適于治療患者所患病況的治療性基因或編碼序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述病況選自包含以下的組細(xì)胞增殖性疾病、免疫學(xué)疾病、神經(jīng)紊亂、獲得性感染和炎癥。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼有復(fù)制能力的病毒的質(zhì)粒，其用于治療的用途，更具體地用于治療細(xì)胞增殖性疾病、免疫學(xué)疾病、神經(jīng)紊亂、獲得性感染和炎癥的用途，以及包含這種質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染劑的配制物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101065492SQ200580040285
公開日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月24日
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