專利名稱：用作哺乳動(dòng)物治療劑的植物pr－5蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物疾病特別是葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂的治療、用于治療所述疾病的治療劑、以及所述治療劑的設(shè)計(jì)和/或鑒定。
背景技術(shù)：
在與植物防御相關(guān)的抗微生物蛋白質(zhì)家族中，致病相關(guān)蛋白家族5(PR-5)在結(jié)構(gòu)上與奇異果甜蛋白相關(guān)(Veronese et al.，2003)。PR-5蛋白因具有以下特征而可被識別(a)由形成該分子的緊湊核心的β桶(結(jié)構(gòu)域I，該結(jié)構(gòu)通常在凝集素中發(fā)現(xiàn)，在下文中稱為“凝集素樣β桶”)、自結(jié)構(gòu)域I延伸并由四對二硫鍵穩(wěn)定的幾個(gè)環(huán)所組成的結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域II)、和同樣自結(jié)構(gòu)域I延伸并由兩對二硫鍵穩(wěn)定的小環(huán)組成的結(jié)構(gòu)域III所組成的三結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)；(b)通常位于N末端前導(dǎo)序列的剪切位點(diǎn)的丙氨酸；(c)在整個(gè)蛋白質(zhì)中具有保守的空間分布并通過二硫鍵連接的多達(dá)16個(gè)半胱氨酸殘基(Min，et al.，2004)；和(d)由結(jié)構(gòu)域I和II形成的可能與生物學(xué)活性相關(guān)的裂口。
滲透蛋白是一種抗真菌性煙草PR-5蛋白。它經(jīng)RAS2/cAMP對細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答進(jìn)行信號抑制從而誘導(dǎo)啤酒酵母(S.cerevisiae)中的程序性細(xì)胞死亡(Narasimhan et at.，2001)。多數(shù)PR-5蛋白(包括滲透蛋白)具有特異性的廣譜抗真菌活性，這表明靶位識別可能通過它們與病原體細(xì)胞表面成分的相互作用確定。就滲透蛋白而言，特定的真菌細(xì)胞壁成分增強(qiáng)或抑制滲透蛋白抗真菌活性(Narasimhan et al.，2003；Veronese et al.，2003)。在啤酒酵母中，細(xì)胞壁糖蛋白的PIR家族是滲透蛋白抗性決定簇(Yun et al.，1997)。已報(bào)道，酵母細(xì)胞壁糖蛋白的磷聚甘露糖可能通過用作滲透蛋白的?？拷Y(jié)構(gòu)(docking structure)而增加其局部濃度和通過細(xì)胞壁的擴(kuò)散性，從而增強(qiáng)了滲透蛋白的毒性(Ibeas et al.，2000)。遺傳分析已揭示SSD1(一種影響細(xì)胞壁形態(tài)發(fā)生和PIR蛋白的沉積的蛋白質(zhì))是針對滲透蛋白的抗性的決定簇(Ibeas et al.，2001)。通過活化經(jīng)促分裂原活化的蛋白激酶級聯(lián)，滲透蛋白誘導(dǎo)酵母細(xì)胞壁中出現(xiàn)使毒性增強(qiáng)的不明改變(Yun et al.，1998)。質(zhì)膜上的特異性相互作用也顯示出是滲透蛋白抗真菌活性所必需的，因?yàn)閷煵轁B透蛋白高度敏感的酵母原生質(zhì)球可以對來自其它植物的PR-5蛋白具有抗性(Yun et al.，1997)。盡管對PR-5蛋白質(zhì)的功能研究最佳的是其抗真菌活性，也已提出了信號或識別功能(Veronese et al.，2003)。
脂聯(lián)素(也稱作30kDa脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān)蛋白-Acrp30)是哺乳動(dòng)物中的一種抗糖尿病和抗動(dòng)脈粥樣硬化蛋白質(zhì)激素，其基于與脂聯(lián)素受體的相互作用而適應(yīng)于對能量狀態(tài)、脂肪酸氧化和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的感知。已知的脂聯(lián)素受體包括人AdipoR1和AdipoR2(Diez and Iglesias，2003；Yamauchi et al.，2003a，b)，和豬脂聯(lián)素受體(genebank NM_001007193)(Ding et al.2004)。其它脂聯(lián)素受體序列可以在Genebank中找到。在肥胖、胰島素抵抗和II型糖尿病的情況下血清脂聯(lián)素水平降低(Yamauchi etal.，2003a)，而在小鼠中施用脂聯(lián)素降低了血清葡萄糖水平并改善胰島素抵抗(Yamauchi et al.，2003a)。預(yù)計(jì)哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的特征性特征)。
發(fā)明概述PR-5家族的蛋白質(zhì)通過包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(GPCR的特征)的受體控制酵母中的程序性細(xì)胞死亡。已發(fā)現(xiàn)與PR-5蛋白特異性結(jié)合的受體與哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素受體同源，且PR-5蛋白可用作脂聯(lián)素的功能性同系物并控制哺乳動(dòng)物中的脂聯(lián)素應(yīng)答。
通過其基于基因過表達(dá)而賦予對滲透蛋白高度敏感的表型的能力而被鑒定之后，分離了酵母細(xì)胞中的滲透蛋白敏感性質(zhì)膜決定簇。基因ORE20/PHO36，編碼7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域受體樣蛋白質(zhì)(PHO36)，其與GPCR具有結(jié)構(gòu)上的同源性，并與哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素受體R1具有顯著的序列相同性(29％)。PHO36調(diào)節(jié)酵母脂質(zhì)和磷酸鹽代謝，并且是酵母中對滲透蛋白的完全敏感性所必需的。在滲透蛋白誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡途徑中，PHO36在RAS2的上游發(fā)揮作用。PHO36的哺乳動(dòng)物同系物是激素脂聯(lián)素的受體，其調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)和糖代謝。盡管滲透蛋白受體PHO36與脂聯(lián)素受體享有顯著的序列同源性；但對應(yīng)的受體結(jié)合蛋白(滲透蛋白和脂聯(lián)素)卻不享有序列相似性(同源性≤10％)。然而，已發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)非常相似并可以重疊。已發(fā)現(xiàn)滲透蛋白可以選擇性地與哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素受體結(jié)合，并在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中用作脂聯(lián)素激動(dòng)劑。
因此，適當(dāng)?shù)嘏渲朴谒帉W(xué)上可接受的載體中的滲透蛋白以及PR-5家族中具有結(jié)構(gòu)上同源的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)蛋白質(zhì)可用作治療其中涉及脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的途徑的多種哺乳動(dòng)物病癥的治療劑。所述病癥包括糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟病。滲透蛋白以及具有結(jié)構(gòu)上同源的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)PR-5蛋白在開發(fā)用于治療其中涉及脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的途徑的哺乳動(dòng)物病癥的治療方法中也可以用作脂聯(lián)素的替代物。滲透蛋白以及具有結(jié)構(gòu)上同源的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)PR-5蛋白也可以用作合理化設(shè)計(jì)用于治療其中涉及脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的途徑的哺乳動(dòng)物病癥的新治療劑的基礎(chǔ)。
可以與滲透蛋白以及具有結(jié)構(gòu)上同源的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)PR-5蛋白特異性結(jié)合的受體(例如酵母受體PHO36)可以用作在治療其中涉及脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的途徑的哺乳動(dòng)物病癥中有用的新治療劑的篩選系統(tǒng)?？梢岳梅蛛x的受體的制劑(所述分離的受體例如存在于溶液中或者是結(jié)合的，用于裝柱、薄層板、微陣列)或利用表達(dá)所述受體的細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物實(shí)施這種篩選方法。
酵母株BWG7a表達(dá)滲透蛋白受體PHO36并對滲透蛋白靈敏。當(dāng)過表達(dá)PHO36時(shí)，發(fā)現(xiàn)該酵母株對滲透蛋白的程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)效應(yīng)高度敏感。因此，可將細(xì)胞(例如酵母株BWG7a或其它任何表達(dá)或過表達(dá)PHO36或相似敏感性的PR-5蛋白質(zhì)受體的適當(dāng)?shù)募?xì)胞系)用作初級篩選以鑒定哺乳動(dòng)物中脂聯(lián)素受體功能的化學(xué)的和蛋白質(zhì)/肽激動(dòng)劑或拮抗劑。這一篩選使得可以鑒定潛在的脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的治療劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是過表達(dá)PHO36或相似敏感性的PR-5受體的細(xì)胞。
具有滲透蛋白基因組序列(SEQ ID NO.1)或cDNA序列(SEQ IDNO.2)的核酸、或其蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其衍生的治療性產(chǎn)物、或其衍生物和功能性同系物可用于脂聯(lián)素受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)/功能分析中以提高脂聯(lián)素、PR-5蛋白、或其衍生物或功能性同系物作為治療劑的效能。這種結(jié)構(gòu)/功能分析可以包括利用體外分子進(jìn)化方法(例如DNA重排或增強(qiáng)的選擇性誘變、和噬菌體展示或其它用于提高的肽功能的選擇方法)和開發(fā)改良的治療劑(包括是人類細(xì)胞中的全部或部分的脂聯(lián)素靶的激動(dòng)劑或拮抗劑的藥物)的合理化設(shè)計(jì)方法進(jìn)行比較分析。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種藥物組合物，其包含具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR-5蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PR-5蛋白是滲透蛋白(SEQ ID NO.3)或其具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的同系物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種用于治療患有由于脂聯(lián)素或脂聯(lián)素樣蛋白質(zhì)介導(dǎo)的代謝途徑的激活或抑制所引起的病癥的哺乳動(dòng)物的方法，包括施用具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR-5蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述病癥選自II型糖尿病、胰島素抵抗、高脂血、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟病。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法包括施用滲透蛋白(SEQ ID NO.3)或具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的滲透蛋白同系物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是PR-5蛋白在治療劑的合理化設(shè)計(jì)中的用途，所述治療劑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的全部或部分的脂聯(lián)素靶的激動(dòng)劑或拮抗劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述治療劑是激動(dòng)劑。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述治療劑是拮抗劑。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述合理化設(shè)計(jì)包括結(jié)構(gòu)/功能分析。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PR-5蛋白是滲透蛋白(SEQ ID NO.3)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是編碼具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR-5蛋白的核酸序列在治療劑的合理化設(shè)計(jì)中的用途，所述治療劑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的全部或部分的脂聯(lián)素靶的激動(dòng)劑或拮抗劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述治療劑是激動(dòng)劑。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述治療劑是拮抗劑。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述合理化設(shè)計(jì)包括結(jié)構(gòu)/功能分析，結(jié)構(gòu)/功能分析優(yōu)選包括選自DNA重排、增強(qiáng)的選擇性誘變和噬菌體展示的一或多種技術(shù)。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述核酸序列是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是對具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR-5蛋白具有特異性結(jié)合親和力的受體蛋白質(zhì)作為初級篩鑒定治療劑的用途，所述治療劑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的全部或部分的脂聯(lián)素靶的激動(dòng)劑或拮抗劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用分離形式的受體進(jìn)行篩選。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用表達(dá)所述受體(更優(yōu)選過表達(dá)所述受體)的細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物進(jìn)行篩選。用于該實(shí)施方式中的優(yōu)選細(xì)胞系是酵母細(xì)胞系，最優(yōu)選過表達(dá)所述受體的酵母細(xì)胞系。最優(yōu)選的用于該實(shí)施方式中的PR-5受體是PHO36。


圖1PHO36介導(dǎo)酵母中對滲透蛋白的敏感性。A.將不具有(載體)或具有PHO36t插入物(pPHO36t)的著絲粒質(zhì)粒pRS316轉(zhuǎn)化的酵母株BWG7a的對數(shù)期培養(yǎng)物(A600nm 0.4)的10倍系列稀釋液的等分式樣(2.5μl)點(diǎn)在不添加或添加滲透蛋白(1.6μM)的選擇性SC-半乳糖培養(yǎng)基上，并于28℃生長3天。B.稀釋衍生自野生型株BWG7a(□)或等基因Δpho36突變株(■)的原生質(zhì)球(106ml-1)，并將其置于含有0.8M山梨糖醇和指示濃度的滲透蛋白的YPD瓊脂上。于28℃溫育3天后計(jì)數(shù)存活的原生質(zhì)球。以不添加滲透蛋白時(shí)的值對活細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。值為3個(gè)不同的試驗(yàn)的平均值±SE(組內(nèi))。顯示了以攜帶不具有(o)或具有PHO36t插入物(pPHO36t；●)的質(zhì)粒pRS316的BWG7a株的原生質(zhì)球在添加了0.8M山梨糖醇的選擇性SC-半乳糖培養(yǎng)基中進(jìn)行的類似試驗(yàn)的結(jié)果。
圖2在滲透蛋白誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡中，PHO36經(jīng)RAS2發(fā)揮作用。A.在誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的條件下，于30℃在YPD中以5μM滲透蛋白溫育野生型株(wt)以及等基因的Δpho36、Δras2和Δpho36Δras2突變株的細(xì)胞(108ml-1)。滲透蛋白處理3小時(shí)后洗滌細(xì)胞，并測量能夠存活并形成克隆的總細(xì)胞的百分比。值代表4次測量的平均值±SE。B.在誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的條件下，于30℃在選擇性SC-葡萄糖培養(yǎng)基中以2μM滲透蛋白溫育野生型(wt)以及以不具有(vec)或具有PHO36插入物(pPHO36)的p426GPD轉(zhuǎn)化的Δras2突變株的細(xì)胞(108ml-1)。如同上述，滲透蛋白處理1小時(shí)后測量能夠存活并形成克隆的總細(xì)胞的百分比。值代表2次測量的平均值±SE。C.在不添加(無)或添加所指示的滲透蛋白的選擇性SC-葡萄糖培養(yǎng)基上，通過野生型株BWG7a(wt)和以pAD4M(vec)或pAD4M-RAS2G19V(pRASG19V)轉(zhuǎn)化的Δpho36突變株的培養(yǎng)物(A600nm0.4)的10倍系列稀釋液的檢測等分式樣(2.5μl)檢測滲透蛋白敏感性。于室溫溫育5天后給平板照像。D.在誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的條件下，于30℃在不添加(-)或添加(+)8μM滲透蛋白的YPD中處理野生型株BWG7a(wt)以及以pSTRE-lacZ(LEU2)轉(zhuǎn)化的Δpho36、Δpho36Δras2和Δras2突變株的細(xì)胞(108ml-1)45分鐘。所顯示的是在無細(xì)胞提取物中測量的β-半乳糖苷酶活性的比率。每一直條代表平均值±SD(n＝3)。記錄各組的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較結(jié)果*p＜0.01；無星號，沒有差異。在不存在滲透蛋白的條件下，β-半乳糖苷酶活性分別為152±4、133±3、705±23和139±6單位。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)1次，獲得相似的結(jié)果。E.滲透蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑模型顯示滲透蛋白激活RAS2/cAMP途徑并誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答的抑制(STRE-lαcZ報(bào)道基因)，之后蓄積活性氧類別和細(xì)胞死亡。滲透蛋白與PHO36的相互作用經(jīng)RAS2激活細(xì)胞死亡?？赡艽嬖谖唇?jīng)鑒定的上游元件，其刺激應(yīng)答于滲透蛋白的RAS2細(xì)胞死亡途徑?？刂茟?yīng)激應(yīng)答的途徑更為復(fù)雜(未顯示)，如在Δpho36Δras2遺傳背景中對STRE-lαcZ活性不依賴于滲透蛋白的效應(yīng)所證實(shí)的那樣。符號？，未知成分；↓，活化；⊥，抑制；→，細(xì)胞壁變?nèi)?weakening)；CW，細(xì)胞壁；PM，質(zhì)膜。F.將野生型株BWG7a(wt)和所指示的突變株的培養(yǎng)物(A600nm0.4)的10倍系列稀釋液的等分式樣(2.5μl)點(diǎn)在不添加(無)或添加所指示的滲透蛋白的YPD瓊脂上。于28℃溫育2天后給平板照像。
圖3PHO36位于質(zhì)膜上。A.顯示了PHO36MH結(jié)構(gòu)序列。EcoRl-Xhol片段含有PHO36基因起始密碼子之前的46nt，天然PHO36 ORF(細(xì))在讀框內(nèi)靠近其C末端處與c-myc-標(biāo)簽(粗)和His標(biāo)簽(點(diǎn)劃線)融合。B-C.對標(biāo)記的PHO36MH蛋白進(jìn)行免疫金標(biāo)記定位。顯示了攜帶不具有(B)或具有PHO36MH插入物(pPHO36MHS[C])的單拷貝質(zhì)粒p416GPD的BWG7a的原生質(zhì)球的極細(xì)部分。看起來呈小黑點(diǎn)的20nm金顆粒指示PHO36MH蛋白的位置。D-F.PHO36MH蛋白在細(xì)胞膜中的分布。對攜帶pPHO36MHS的細(xì)胞的提取物進(jìn)行分餾，并對蛋白質(zhì)在無膜的上清液級分(泳道1)、總的膜級分(泳道2)和蔗糖密度梯度膜級分(從低至高分別為泳道3-7)中的分布進(jìn)行分析。在分別用mycl-9E10單克隆抗體和PMA1抗體通過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)的印跡上檢測PHO36MH(D)和質(zhì)膜H+-ATP酶標(biāo)記(E)。在這些級分中測量空泡α-甘露糖苷酶標(biāo)記的活性(F)，并以任意單位表示A400nm的增量/min/mg蛋白質(zhì)。
圖4PHO36與滲透蛋白在體外和體內(nèi)特異性地相互作用。A.在不存在(泳道1、2和5)或存在競爭蛋白A9(100μg，泳道3；或10μg，泳道7)、滲透蛋白(Osm；100μg，泳道4；或10μg，泳道6)或BSA(100μg，泳道8)的條件下，用表達(dá)融合蛋白STE7-Myc的株BWG7a的細(xì)胞提取物(泳道1)、純化自株ΔPHO36的總膜級分(泳道2)或純化自表達(dá)來自質(zhì)粒pPHO36MH的c-myc標(biāo)記的PHO36的株BWG7a的總膜級分(泳道3-8)溫育滲透蛋白-瓊脂糖4B。充分洗滌后，解離結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE進(jìn)行分離，用mycl-9E10抗體對c-Myc標(biāo)簽進(jìn)行免疫測定。B.在不存在(無)或存在超過10倍摩爾的A9、BSA或滲透蛋白作為競爭劑的條件下，用35S-滲透蛋白(0.4μM，0.16μCi)溫育衍生自Δpho36突變株(Δpho36)和攜帶質(zhì)粒pPHO36MH(pPHO36)的野生型株BWG7a的原生質(zhì)球(109ml-1)1小時(shí)。充分洗滌后，計(jì)數(shù)保留在原生質(zhì)球上的35S-滲透蛋白。
圖5滲透蛋白和脂聯(lián)素的結(jié)構(gòu)的比較。A.顯示的是兩次不同地觀察(90°旋轉(zhuǎn))滲透蛋白(黃-綠、藍(lán)和絳紅)和脂聯(lián)素(綠)的Cα痕跡的重疊圖。滲透蛋白的3個(gè)結(jié)構(gòu)域被涂成藍(lán)色(結(jié)構(gòu)域I或凝集素樣結(jié)構(gòu)域)、絳紅色(結(jié)構(gòu)域II，氨基酸第121-177位)和黃-綠色(結(jié)構(gòu)域III，氨基酸第55-82位)。將在滲透蛋白家族(Glu84、Asp97和Asp102)的酸性裂口中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)保守的殘基繪制成紅色棒狀圖。表示表明靜電勢的滲透蛋白(左)和脂聯(lián)素(右)的表面積拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的視圖。根據(jù)靜電勢從藍(lán)色(最正)至白色(中性)再至紅色(最負(fù))給蛋白質(zhì)表面涂色。蛋白質(zhì)取向與(A)(左)中所示相同。利用GRASP繪圖(Nicholls et al.，1991)。C.顯示了C2C12肌細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物(10μg蛋白質(zhì)/泳道)的免疫印跡，所述C2C12肌細(xì)胞以所指示的siRNA轉(zhuǎn)染并不用(無)或用所指示濃度的全長脂聯(lián)素(Ad)、滲透蛋白(Osm)和A9(A9)處理10分鐘并以phosphoAMP激酶特異性抗體探測。D.對(C)中的數(shù)據(jù)的定量分析。與相同siRNA組中不添加蛋白質(zhì)(無)的值相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(**)和非顯著性(N.S.)差異被標(biāo)出。
發(fā)明詳述PR-5和脂聯(lián)素受體-配體系統(tǒng)的同源性。PHO36的基因組序列編碼具有7個(gè)推定的位于細(xì)胞質(zhì)膜的跨膜結(jié)構(gòu)域的多肽，該跨膜結(jié)構(gòu)域是GPCR中唯一保守的特征。已推斷PHO36在脂質(zhì)、磷酸鹽和鋅代謝中具有調(diào)節(jié)功能，因?yàn)?a)PHO36表達(dá)通過磷酸鹽、C14:0脂肪酸、豆蔻酸和油酸依賴型轉(zhuǎn)錄因子OAF1和PIP2誘導(dǎo)；(b)在pho36突變株中，各種涉及酵母中脂肪酸代謝和磷酸鹽信號的基因被誘導(dǎo)；(c)該pho36突變株具有高水平的酸性磷酸酶和蓄積在空泡中的聚磷酸鹽；(d)該Δpho36突變株對結(jié)合固醇的抗生素制霉菌素具有抗性；(e)該Δpho36突變株在添加豆蔻酸作為碳源的甘油上生長不良(Karpichev et al.，2002)；和(f)PHO36表達(dá)通過生長培養(yǎng)基中的鋅水平和感應(yīng)鋅缺乏的轉(zhuǎn)錄因子ZAP1控制(Lyons et al.，2004)。已發(fā)現(xiàn)，滲透蛋白與PHO36相互作用并影響其天然功能(a)PHO36在溶液中與滲透蛋白特異性地相互作用；(b)放射性同位素標(biāo)記的滲透蛋白與質(zhì)膜的結(jié)合以及對滲透蛋白的高度敏感性與PHO36的豐度相關(guān)；和(c)脂聯(lián)素和滲透蛋白(這兩種蛋白質(zhì)的主要鏈折疊可以重疊)在C2C12肌細(xì)胞中經(jīng)脂聯(lián)素受體(即，經(jīng)PHO36的哺乳動(dòng)物同系物)參與相同的細(xì)胞內(nèi)信號途徑。
PHO36和RAS2在相同的途徑中發(fā)揮功能的事實(shí)與PHO36在營養(yǎng)感應(yīng)中的作用是一致的。酵母中的RAS蛋白與細(xì)胞的分裂、分化、程序性死亡、存活力、碳和氮營養(yǎng)相關(guān)(Jazwinski，1999；Narasimhan et al.，2001；Forsberg and Ljungdahl，2001)。脂聯(lián)素受體調(diào)節(jié)葡萄糖攝取、脂肪酸β氧化、以及一些感應(yīng)細(xì)胞的能量狀態(tài)的蛋白質(zhì)的活化(Yamauchi etal.，2003a)。最近的報(bào)道表明脂聯(lián)素也在上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡(Brakenheilm et al.，2004)。因?yàn)榕c程序性細(xì)胞死亡的聯(lián)系，PHO36可以與調(diào)節(jié)養(yǎng)分獲得以及用以應(yīng)答細(xì)胞能量狀態(tài)或線粒體功能障礙聯(lián)系起來。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)證明了PHO36受體配體與脂聯(lián)素之間的功能相似性。
基于結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測PHO36滲透蛋白受體包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這是GPCR受體家族的特征性特征。奇異果甜蛋白(滲透蛋白的甜味結(jié)構(gòu)型同系物)與甜味受體GPCR結(jié)合(Li et al.，2002；http://www.cmbi.kun.nl/7tm/)。因此，與GPCR結(jié)合的能力可能是PR-5蛋白的保守性特征，該特征使得它們對真菌種靶的亞群具有特異性。脂聯(lián)素受體，與PHO36具有顯著(29％)的序列同源性的AdipoR2和AdipoR1，也被預(yù)測具有GPCR的7個(gè)特征性跨膜結(jié)構(gòu)域并激活不同的信號分子。然而，與典型的GPCR不同，AdipoR1和AdipoR2不與G蛋白偶聯(lián)(Yamauchi et al.，2003a)。
沒有證據(jù)表明酵母Gα亞單位，GPA1或GPA2，參與了滲透蛋白誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡。STE4和STE18(Gβ和Gy亞單位)也不與PHO36偶聯(lián)(圖2F)。因此，PHO36或者可以不與異三聚體G蛋白(如脂聯(lián)素受體)偶聯(lián)(參見Yamauchi et at，2003a)或可以和與GPA2結(jié)合的非常規(guī)蛋白質(zhì)相偶聯(lián)(參見Harashima and Heitman，2002)。遺傳證據(jù)表明，在滲透蛋白誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡途徑中，PHO36在RAS2的上游發(fā)揮功能(圖2)，這與其質(zhì)膜定位相一致(圖3)。由于PHO36對滲透蛋白敏感性的影響小于RAS2，其它“受體”也可以與RAS2途徑聯(lián)系起來。PHO36在酵母中的另一功能可能是作為滲透蛋白的停靠受體促進(jìn)膜透化作用，該活性在體外已在PR-5蛋白上得到證實(shí)(Anzlovar et al.，1998；Veronese et al.，2003)。這一假設(shè)極具吸引力，因?yàn)镽AS蛋白還未知在酵母中通過GPCR激活(Rolland et at.，2002)，因此增強(qiáng)的膜透化作用具有成為RAS2與PHO36之間的間接信號連接的潛力。
滲透蛋白的作用的毒性機(jī)制是多因素的，各個(gè)因素對該蛋白質(zhì)的總毒性作出部分貢獻(xiàn)(圖2E)。防御性抗菌肽的抗菌活性(是所有生物體中的天然免疫性的成分)也同樣歸因于作用的多次擊中機(jī)制(Hancock andScott，2000)?？咕鞍踪|(zhì)和肽的多次擊中機(jī)制在種間的保守性很可能反映出宿主-病原體共進(jìn)化。這還給宿主提供了選擇優(yōu)勢，因?yàn)樗霾≡w不能通過信號突變很大程度地改變其對該宿主防御性蛋白/肽的高度敏感性。
滲透蛋白和脂聯(lián)素分子呈現(xiàn)相似的整體折疊和生物學(xué)活性。AdipoR1和AdipoR2，PHO36的哺乳動(dòng)物同系物，是脂聯(lián)素受體(由脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)激素)。小鼠和人類的脂聯(lián)素缺乏與胰島素抵抗以及葡萄糖耐量異常有關(guān)(Yamauchi et al.，2001a，b；Kubota et al.，2002；Diezand Iglesias，2003)。通過注射增加的脂聯(lián)素水平，過表達(dá)或結(jié)合體重?fù)p失和噻唑烷二酮處理保護(hù)小鼠和人類免于肥胖和糖尿病，減輕胰島素抵抗(Yamauchi et at.，2001a，b；2003b)并減少血清自由脂肪酸、葡萄糖和甘油三酸酯水平(Fruebis et al.，2001；Diez and Iglesias，2003)。給定脂聯(lián)素的治療潛力以及PHO36和脂聯(lián)素受體之間的同源性，比較滲透蛋白和脂聯(lián)素之間的三維結(jié)構(gòu)。脂聯(lián)素是一種30kDa的蛋白質(zhì)，其具有膠原樣的N末端結(jié)構(gòu)域和補(bǔ)體1q-樣的C-末端球形結(jié)構(gòu)域(Scherer at al.，1995)。該C-末端球形結(jié)構(gòu)域(17kDa)通常被稱做球形脂聯(lián)素，已報(bào)道少量的球形脂聯(lián)素在人類血漿中是可檢測的。已報(bào)道球形脂聯(lián)素具有與全長的脂聯(lián)素相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)活性，例如在肌細(xì)胞或骨骼肌中的AMP激酶活化、葡萄糖攝取和脂肪酸氧化(Freubis et al.，2001；Yamauchi et al.，2001a，2003a，2003b)。滲透蛋白是一種球形蛋白質(zhì)(26kDa)，其與全長的或球形脂聯(lián)素沒有顯著的序列相似性(≤10％)。X-射線晶形研究已表明球形脂聯(lián)素和滲透蛋白包含反平行的以β桶的形式排列的β鏈(Shapiroand Scherer，1998；Min et al.，2004)。滲透蛋白的結(jié)構(gòu)域I(凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域)可以與脂聯(lián)素重疊，其中對于121Cα原子的rmsd為3.1，這表明兩種蛋白質(zhì)共享凝集素樣結(jié)構(gòu)域(圖5)。奇異果甜蛋白的甜味所必需的氨基酸繪制于其表面積上的裂口，該裂口對應(yīng)于通過抗真菌PR-5蛋白的結(jié)構(gòu)域I和II形成的酸性裂口并被預(yù)測對于其抗真菌活性是重要的(圖5；Kaneko and Kitabatake 2001；Min et al.，2004)。這一區(qū)域被定位于脂聯(lián)素三聚體的外表面，表明其參與與受體的相互作用，且本研究的結(jié)果證明其是控制與脂聯(lián)素受體的結(jié)合的重要因子。
脂聯(lián)素與脂聯(lián)素受體的結(jié)合通過磷酸化作用導(dǎo)致AMP激酶的活化(Yamauchi et al.，2003a)。脂聯(lián)素和滲透蛋白能夠誘導(dǎo)AMP激酶在C2C12肌細(xì)胞中的磷酸化(圖5C，泳道4-8。第1行)；而如所預(yù)期的那樣，A9(缺乏抗酵母的殺真菌活性的植物同系物)不能誘導(dǎo)AMP激酶在C2C12肌細(xì)胞中的磷酸化(圖5C，泳道9-11，第1行)。AMP激酶的磷酸化要求表達(dá)脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2(圖5C，第2和3行)。因此，脂聯(lián)素和滲透蛋白在C2C12肌細(xì)胞中的保守的生物學(xué)活性必然歸因于涉及與脂聯(lián)素受體的相互作用的β桶結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1)中的共有結(jié)構(gòu)。
植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的24個(gè)位點(diǎn)編碼具有奇異果甜蛋白家族結(jié)構(gòu)域的ORF(其中幾個(gè)具有推定的膜錨定序列，3個(gè)經(jīng)跨膜結(jié)構(gòu)域與Ser/Thr激酶連接)。至少2個(gè)位點(diǎn)編碼與PHO36具有同源性的序列。這表明奇異果甜蛋白樣蛋白質(zhì)可能在植物中具有通訊功能。涉及動(dòng)物的細(xì)胞間通訊、免疫性和/或能量動(dòng)態(tài)平衡的蛋白質(zhì)的C-末端結(jié)構(gòu)域，例如腫瘤壞死因子α(TNFα)、CD40配體和冬眠調(diào)節(jié)蛋白，具有與滲透蛋白和脂聯(lián)素相似的β桶折疊。這些蛋白質(zhì)的功能跨越脂聯(lián)素的能量動(dòng)態(tài)平衡功能以及滲透蛋白的誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡和與免疫性相關(guān)的功能。TNFα和CD40配體以可溶的H型膜錨定形式存在(表明與預(yù)測的擬南芥奇異果甜蛋白樣蛋白質(zhì)相似)。與滲透蛋白不同，這些蛋白質(zhì)的全長分子具有N-末端交聯(lián)(″talks″)，其可以膠原結(jié)構(gòu)域(脂聯(lián)素、補(bǔ)體1q、mbernation-誘導(dǎo)的蛋白質(zhì))或不以這種形式出現(xiàn)(TNFα、CD40配體)。球形C-末端脂聯(lián)素樣結(jié)構(gòu)域均形成三聚體。然而，滲透蛋白以二聚體的形式結(jié)晶(Min et al.，2004)。溶液中主要是單體，盡管在某些條件下可以在滲透蛋白和奇異果甜蛋白溶液中觀察到少量更高次序的結(jié)構(gòu)。據(jù)信，球形脂聯(lián)素樣結(jié)構(gòu)域的三聚化，及隨后經(jīng)N-末端膠原結(jié)構(gòu)域裝配成更高次序的多聚體，通過誘導(dǎo)受體聚類而對于信號很重要(Jones et at，1989；Shapiro and Scherer，1998；Karpusas et al.，1995；Eck andSprang，1989)。然而，綜合考慮滲透蛋白和脂聯(lián)素共享的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域、在其它結(jié)構(gòu)域缺乏顯著的同源性、以及它們的受體間的高度同源性，發(fā)現(xiàn)保守的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域是這些蛋白質(zhì)的受體結(jié)合特異性的主要決定性因素。
藥理學(xué)意義。PR-5家族的植物蛋白質(zhì)可以用做哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素受體結(jié)合的激動(dòng)劑/拮抗劑。滲透蛋白能夠誘導(dǎo)脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的C2C12肌細(xì)胞中的AMP激酶磷酸化(圖5C)。PR-5蛋白是一個(gè)在植物中普遍存在(已報(bào)道所有篩選的種都含有PR-5蛋白)的大家族(僅在擬南芥中就有24個(gè)成員)。PR-5蛋白也極其穩(wěn)定，因此當(dāng)與人類消化或呼吸系統(tǒng)接觸時(shí)將保留活性，其中一些已知是過敏原(Breiteneder and Ebner，2000)。來自PR-5蛋白和脂聯(lián)素上相似的受體結(jié)合位點(diǎn)(即凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域)以及它們各自的受體之間的高度同源性所導(dǎo)致的功能上的同源性使得藥理學(xué)家可以使用大量的植物產(chǎn)品，這些產(chǎn)品具有真實(shí)的或潛在的在人類中的治療用途，包括用于治療糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟病或其它由于脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的代謝途徑的激活或抑制所引起的疾病。
結(jié)構(gòu)域II(參見圖5A和5B)在一些奇異果甜蛋白樣蛋白質(zhì)(Genbank登錄號X68197，水稻；AF389884，小麥；X97687，小麥)是高度截短的。這一截短增加了這些蛋白質(zhì)的β桶結(jié)構(gòu)域的暴露，使得與脂聯(lián)素的β桶結(jié)構(gòu)域有更多的重疊。因?yàn)檫@些截短的奇異果甜蛋白樣蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)將因此也與脂聯(lián)素的結(jié)構(gòu)相似(在有些情況中相似程度可能甚至超過滲透蛋白)，這些蛋白質(zhì)可能與脂聯(lián)素受體發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合。
滲透蛋白以及在PR-5家族中具有結(jié)構(gòu)上同源的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)蛋白質(zhì)可以配制在本領(lǐng)域中已知的多種合適的藥學(xué)上可接受的載體中，并被直接用做治療劑治療多種哺乳動(dòng)物病癥。根據(jù)與脂聯(lián)素受體相互作用的性質(zhì)(例如同時(shí)具有結(jié)合和活化活性、具有結(jié)合活性但不具有活化活性、不具有結(jié)合活性但具有抑制活性等等)，這些蛋白質(zhì)可以用做脂聯(lián)素活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。已知脂聯(lián)素介導(dǎo)多種代謝途徑，所述代謝途徑的破壞會(huì)導(dǎo)致高脂血癥、葡萄糖代謝不平衡、胰島素抵抗的情形并導(dǎo)致疾病(例如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖和心臟病)。開發(fā)合適的制劑和這種藥物組合物的施用方法(包括施用路徑和劑量水平)是藥學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)程序。
此外，滲透蛋白以及具有結(jié)構(gòu)上同源的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)PR-5蛋白在開發(fā)用于治療哺乳動(dòng)物病癥的治療方法中可以用做脂聯(lián)素的替代物，所述病癥涉及脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的途徑。在所述方法中，將替代物用于初級檢測和劑量方案、施用路徑(例如，注射、口服施用或植入)的開發(fā)中。利用來源豐富的植物蛋白質(zhì)(例如，滲透蛋白及相關(guān)蛋白質(zhì))可以明顯節(jié)約此類治療方法的研發(fā)階段的費(fèi)用。
一個(gè)重要的且非常有效的藥物開發(fā)方法是“合理化設(shè)計(jì)(rationaldesign)”方法。新藥物的合理化設(shè)計(jì)利用了具有所需的已知活性的化合物作為設(shè)計(jì)的起點(diǎn)設(shè)計(jì)出從本質(zhì)上得到改良的該化合物的形式。通過對起始化合物的結(jié)構(gòu)/功能分析，可以測定對所需藥物性質(zhì)(例如，溶解性、穩(wěn)定性、結(jié)合活性或特異性、降低的毒性和副作用)作出貢獻(xiàn)的物理特性。之后，便可以開發(fā)對起始化合物進(jìn)行修飾的構(gòu)造方法，該方法可以更有效和更可預(yù)知地產(chǎn)生所需要的改善。具有脂聯(lián)素激動(dòng)活性的PR-5蛋白和/或具有脂聯(lián)素拮抗活性的PR-5蛋白在所述的藥物的合理化設(shè)計(jì)中是有價(jià)值的工具。
相反地，或補(bǔ)充地，滲透蛋白以及具有結(jié)構(gòu)上的同源的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)PR-5蛋白能夠特異性結(jié)合的受體(例如酵母受體PHO36)可以用做篩選系統(tǒng)用于篩選在治療其中涉及脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的途徑的哺乳動(dòng)物病癥中有用的新治療劑或用于合理化藥物設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)/功能分析。此外，這些受體豐富的植物來源允許使用高通量篩選方法快速鑒定和選擇出潛在的治療劑?？梢岳梅蛛x的受體的制劑(所述分離的受體例如存在于溶液中或者是結(jié)合的，用于裝柱、薄層板或微陣列)或利用表達(dá)所述受體的細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物實(shí)施這種篩選方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，過表達(dá)滲透蛋白受體PHO36并對滲透蛋白誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的效應(yīng)高度敏感的酵母株，可作為進(jìn)行所述篩選的有效的方式。因?yàn)檫@種細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物對滲透蛋白和同源蛋白質(zhì)的作用高度敏感，可以利用相對小的量的藥物候選組合物可靠地進(jìn)行篩選。因此，所述過表達(dá)PHO36或相似敏感性的PR-5蛋白受體的細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物可用做初級篩選以鑒定在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮功能的脂聯(lián)素受體的化學(xué)的和蛋白質(zhì)/肽激動(dòng)劑和/或拮抗劑。由于植物PR-5受體(例如PHO36)與哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素受體間的高度的(結(jié)構(gòu)上的和功能上的)同源性，這種激動(dòng)劑和/或拮抗劑是用于治療其中涉及脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的途徑的哺乳動(dòng)物病癥的治療劑的優(yōu)良候選者。結(jié)合并影響植物PR-5受體的能力強(qiáng)烈地指示存在一種擁有與哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素受體相似的活性的化合物。
同樣，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與編碼它的核酸序列間的嚴(yán)格關(guān)聯(lián)，編碼滲透蛋白以及具有結(jié)構(gòu)上同源的凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的相關(guān)PR-5蛋白的DNA和/或RNA序列(例如，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，也同樣可以用做合理化藥物設(shè)計(jì)的手段。通過鑒定與編碼的產(chǎn)物中所期望的特性相關(guān)的編碼序列的特征，可以直接對編碼序列進(jìn)行修飾以制備由其表達(dá)的經(jīng)修飾的或改良的藥物產(chǎn)品。這種結(jié)構(gòu)/功能分析可以包括利用體外分子進(jìn)化方法(例如，DNA重排或增強(qiáng)的選擇性誘變、和噬菌體展示或其它用于提高的肽功能的選擇方法)進(jìn)行比較分析。
實(shí)施例1材料和方法。用于后面實(shí)施例2-6中的材料和方法如下。
菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基。將大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α用于質(zhì)粒繁殖和分離。所有的啤酒酵母株都是Becker和Guarante(1991)所述的可以公開獲得的BWG7a株的等基因的衍生物。通過HO基因轉(zhuǎn)換交配型獲得BWG7a株(Herskowitz and Jensen，1991)。Δste、Δras2和Δmnn6突變株和用于破壞這些位點(diǎn)的方法已在別處有記載(Yun et al.，1998；Narasimhan et al.，2001)。如Wach et al.，1997中所述，通過用URA3(相對于被預(yù)測為起始密碼子的第2個(gè)ATG的+192bp至+680bp)或kanMX(+72bp至+740bp)取代內(nèi)源編碼序列檢測PHO36位點(diǎn)。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過用LEU2取代內(nèi)源編碼序列(+244bp至+724bp)產(chǎn)生Δydr492突變。通過PCR和Southern印跡確認(rèn)精確的基因裂解。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過交叉相反交配型的單倍體株制備Δpho36/Δpho36二倍體突變株。
對于組成型過表達(dá)，通過PCR從BWG7a株分離PHO36的編碼區(qū)(-46bp至+957bp)并克隆到多拷貝質(zhì)粒p426GPD中構(gòu)建pPHO36(Mumberg et al.，1995)。通過PCR，在PHO36的C末端讀框內(nèi)引入c-myc和六組氨酸標(biāo)簽從pPHO36構(gòu)建質(zhì)粒pPHO36MH。對構(gòu)建體PHO36MH進(jìn)行測序以確認(rèn)適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽的融合。對于標(biāo)記的PHO36的低水平表達(dá)，通過利用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)將PHO36MH構(gòu)建體克隆到單拷貝質(zhì)粒p416GPD中制備質(zhì)粒pPHO36MHS。含有STE7-Myc翻譯融合的質(zhì)粒pNC267已有記載(Zhou et al.，1993)。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將RAS2G19V克隆到pAD4M中。
為了構(gòu)建STRE-lαcZ(LEU2)，通過PCR，利用正向引物5′-CCCAAGCTTCAGTTATTACCCTCGAC-3′和反向引物5′-CCCGGGTTATTTTTGACACCAGACCAA-3′從pSTRE-lacZ(TRP)分離嵌合的STRE-lacZ基因(Stanhill et al.，1999)。將插入物亞克隆到pGEM-Teasy中，測序，用Apall和Xmal酶切，并亞克隆到pRS315的相應(yīng)位點(diǎn)。
將標(biāo)準(zhǔn)程序用于酵母培養(yǎng)基制備和遺傳分析(Becker and Guarante，1991；Sherman，1991)。通過Elble，1992所記載的醋酸鋰方法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(Hampsey，1997)進(jìn)行酵母株表型的分析。
cDNA文庫和克隆。利用Liu et al.(1992)中所記載的方法，用GAL1-調(diào)節(jié)的酵母cDNA表達(dá)文庫轉(zhuǎn)化BWG7a株。在SC-葡萄糖培養(yǎng)基上選擇的大約50,000個(gè)初級轉(zhuǎn)化體順序重復(fù)放置于含有0.003％亞甲基藍(lán)的選擇性SC-半乳糖培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基不具有或具有滲透蛋白(0.2μM)，在這些情況下是亞致死濃度。然后，選擇變藍(lán)的轉(zhuǎn)化體或在滲透蛋白存在的條件不能生長的轉(zhuǎn)化體。通過在添加了合理范圍的滲透蛋白的選擇性SC-半乳糖與SC-葡萄糖介質(zhì)中的斑點(diǎn)檢測確認(rèn)這些轉(zhuǎn)化體的依賴于半乳糖的滲透蛋白高度敏感表型。利用Robzyk and Kassir(1992)中記載的方法分離通過這些轉(zhuǎn)化體所攜帶的質(zhì)粒，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對它們的cDNA插入物進(jìn)行測序。
總膜的純化及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離。如David et al.(1997)中所記載的那樣，從來自單拷貝質(zhì)粒pPHO36MHS的表達(dá)PHO36MH的酵母細(xì)胞的1L培養(yǎng)物(A600nm1.0)分離總膜級分。將其重懸于于緩沖液A(50mMHEPES，pH7.5/5mM EDTA/2μg.ml+1抑酶肽/2μg.ml-1胰凝乳蛋白酶抑制劑/2μg.ml-1抑胃肽/1μg.ml-1亮抑酶肽/2mM苯甲脒/1mM PMSF)中的3ml 10％(w/w)蔗糖中，并分層于緩沖液A中的5-級蔗糖梯度(15、28、35、43和53％w/w)(每級2ml)。于4℃，在Beckman SW40轉(zhuǎn)子中以20,000rpm離心12小時(shí)后，從頂部至底部收集級分(2ml)。用3倍體積的水稀釋，并于186,000×g離心30分鐘。將沉淀重懸于200μl緩沖液(10mM Mes.KOH[pH 6.5]，10％甘油，如緩沖液A中的蛋白酶抑制劑)中。
蛋白質(zhì)方法和酶檢測。如先前Yun et al.(1997)，Ibeas et al.(2000)和Narasimhan et al.(2001)中所記載的那樣進(jìn)行滲透蛋白純化以及滲透蛋白細(xì)胞毒性的檢測。利用鄰硝基苯-a-D-吡喃甘露糖苷(Sigma)作為底物測量α-甘露糖苷酶活性。用Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Bio-Rad)測定蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE，在10％聚丙烯酰胺凝膠上對蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜。通過ECL方法(AmershamBiosciences)，在分離的蛋白質(zhì)的免疫印跡上檢測PHO36MH和質(zhì)膜H+-ATP酶。將Mycl-9E10單克隆抗體(2μg/ml；CalBiochem)和兔PMA1多克隆抗體(1∶10000稀釋)(Monk et al.，1991)用做初級抗體，將與辣根過氧化物酶結(jié)合的抗-小鼠或抗-兔免疫球蛋白G(1∶5000稀釋；Promega)用做次級抗體。
用于這一目的的β-半乳糖苷酶檢測方法、細(xì)胞生長條件、滲透蛋白處理和細(xì)胞提取物的制備在先前已有記載(Narasimhan et al.，2001)。以任意單位表示β-半乳糖苷酶活性，即A400nm的增量/min/mg蛋白質(zhì)。用于純化重組鼠脂聯(lián)素和測量AMP激酶在鼠C2C12肌細(xì)胞中的活化的方案如Yamauchi，et al.(2003a)中所述。
免疫金定位。如Yun et al.(1997)中所述固定和植入酵母原生質(zhì)球，不同之處為添加1M山梨糖醇至定影液中作為滲透性穩(wěn)定劑并省略sodium metaperiodate處理。超薄切片相繼與mycl-9E10單克隆抗體(5μg/ml)和結(jié)合至20nm金顆粒(1∶50稀釋；Ted Pella，Inc.，Redding，CA)的山羊抗小鼠IgG反應(yīng)。用透射電子顯微鏡EM200(Philips ElectronicInstruments Co.，Mahwah，NJ)觀察切片。
35S-滲透蛋白結(jié)合檢測。根據(jù)廠商說明，利用35SLR試劑(Amersham)將滲透蛋白進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記至12Ci mmol-1的特定活性。在YPD培養(yǎng)基中生長酵母細(xì)胞直至A600nm0.6，然后通過離心進(jìn)行收獲。將沉淀重懸于1M山梨糖醇中(A600nm6)并用細(xì)胞溶解酶(100U/ml)進(jìn)行處理。完成細(xì)胞壁的消化后，通過離心收集原生質(zhì)球，用1M山梨糖醇洗滌兩遍，并重懸于1M山梨糖醇(109/ml)中。通過將2μl的35S-滲透蛋白(1μCi，3μg)添加至300μl的原生質(zhì)球中(0.3×109)開始結(jié)合反應(yīng)。于30℃溫育60分鐘后，將一式三份的反應(yīng)混合物的等分試樣(50μl)稀釋到冰冷卻的1M山梨糖醇(1.5ml)中。通過離心收集原生質(zhì)球，洗滌兩遍，重懸于1M山梨糖醇(50μl)中，并在5ml的EcoLumeTM(ICNBiomedicals)中的液體閃爍計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。對于競爭性實(shí)驗(yàn)，在添加用35S-滲透蛋白之前，用A9、滲透蛋白或BSA預(yù)溫育原生質(zhì)球30分鐘。
在溶液中檢測蛋白質(zhì)相互作用。根據(jù)廠商說明，將滲透蛋白與CNBr-激活的瓊脂糖4B(Pharmacia Biotech)結(jié)合。如上述，(從50ml培養(yǎng)物)分離總膜級分，并重懸于200μl的緩沖液(1％n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷，10％甘油，50mM Tris.HCl[pH 7.6]，100mM NaCl，1mM PMSF)中。在不存在或存在競爭性蛋白質(zhì)(100μg)的條件下，在50mMTris.HCl[pH 7.6]，1mM PMSF(1ml)中，用滲透蛋白瓊脂糖4B(200μl)于室溫輕微攪動(dòng)的情況下溫育總膜級分(50μl)4小時(shí)。用50mM Tris.HCl[pH 7.6]、0.1％Triton X-100洗滌5遍后，通過于室溫在樣本緩沖液(1％SDS，50mM Tris.HCl[pH 7.6]，10％甘油)中溫育30分鐘解離復(fù)合物并通過10％SDS-PAGE進(jìn)行分離。利用mycl-9E10單克隆抗體在印跡上對PHO36MH蛋白進(jìn)行免疫檢測。
實(shí)施例2PHO36介導(dǎo)對滲透蛋白的敏感性。
利用GAL1-調(diào)節(jié)的cDNA表達(dá)文庫分離賦予對酵母株BWG7a的滲透蛋白高度敏感表型的基因(Liu et al.，1992)。從在SC-葡萄糖培養(yǎng)基中選擇的約50,000個(gè)初級轉(zhuǎn)化體中，選擇在SC-半乳糖培養(yǎng)基中對滲透蛋白展示一致高度敏感性而在葡萄糖培養(yǎng)基中呈現(xiàn)對滲透蛋白的正常敏感性的總共12個(gè)轉(zhuǎn)化體作為推定的滲透蛋白高度敏感性克隆。分離由這些轉(zhuǎn)化體所攜帶的質(zhì)粒，重新導(dǎo)入BWG7a中以確認(rèn)它們能夠賦予依賴于半乳糖的滲透蛋白高度敏感性表型，并對它們的cDNA插入物進(jìn)行測序。選擇對應(yīng)于位點(diǎn)YOL002c/PHO36(Karpichev et al.，2002)的ORE20基因(就滲透蛋白抵抗而言)用于進(jìn)一步研究。發(fā)現(xiàn)該基因編碼一317個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(36.3kDa)，該蛋白質(zhì)被預(yù)測含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(酵母基因組數(shù)據(jù)庫)，即GPCR的特征性特征。
最初分離自篩選的(PHO36t)的cDNA被截短，缺失其假定的起始密碼子下游的頭19個(gè)核苷酸。過表達(dá)來自GAL1啟動(dòng)子的PHO36t的BWG7a株的細(xì)胞相對于用空載體轉(zhuǎn)化的對照組細(xì)胞對滲透蛋白敏感性更高，且在含有滲透蛋白的培養(yǎng)基中未形成菌落(圖1A)。滲透蛋白處理1小時(shí)后測定存活力計(jì)數(shù)證實(shí)由于對滲透蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的高度敏感性增強(qiáng)所引起的生長抑制。在半乳糖培養(yǎng)基中，過表達(dá)PHO36t的細(xì)胞的對滲透蛋白的IC50相對于以空載體(分別為0.2μM和0.6μM)轉(zhuǎn)化的對照組細(xì)胞要低3倍。在葡萄糖培養(yǎng)基中，對于過表達(dá)來自多拷貝質(zhì)粒中的組成型GPD啟動(dòng)子的全長PHO36的細(xì)胞觀察到相同的表型。相反，PHO36的裂解增加了滲透蛋白抵抗(圖2F)，與野生型株(分別為1.6μM和0.6μM)相比較預(yù)測其對滲透蛋白的IC50增加了3倍。
PHO36在BWG7a株中的過表達(dá)增加了原生質(zhì)球的滲透蛋白敏感性(圖1B，組內(nèi))。相反，Δpho36突變株的原生質(zhì)球相對于野生型株的原生質(zhì)球，其對滲透蛋白的抗性更強(qiáng)(圖1B)。這些結(jié)果表明PHO36在質(zhì)膜水平介導(dǎo)了對滲透蛋白的敏感性，這與先前鑒定的細(xì)胞壁介導(dǎo)的滲透蛋白抗性決定簇不同(Yun et al.，1997；Ibeas et al.，2000，2001)。
實(shí)施例3與PHO36的表達(dá)水平有關(guān)的表型。
已報(bào)道，啤酒酵母株W3031A中的Δpho36突變株(Δyol002c)在豆蔻酸和非可發(fā)酵碳源上生長不佳(Karpichev et al.，2002)。然而，等基因野生型株BWG7a、pho36和過表達(dá)PHO36的細(xì)胞的生長在菌落形成時(shí)，或以不同的碳源(2％葡萄糖、2％半乳糖、2％乙醇、2％乳酸、2％乙酸鉀、3％甘油、或3％甘油和0.1％油酸)、氮源(無、尿素、天冬酰胺或脯氨酸)、溫度(16、28和37℃)以及pH(3、6.6和8)測量細(xì)胞生長率時(shí)是不可區(qū)分的。
當(dāng)通過山梨糖醇(2M)、NaCl、KCl或NH4Cl(0.75和1.5M)處理測量時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)野生型、Δpho36和過表達(dá)PHO36的細(xì)胞對滲透蛋白或離子應(yīng)激的敏感性有差別。PHO36不是侵襲性生長所必需的，因?yàn)樵凇?278株中PHO36的缺失(Gimeno et al.，1992)沒有消除其穿透瓊脂的能力。決定二倍體PHO36/PHO36細(xì)胞(21.33±5.89)和二倍體Δpho36/Δpho36細(xì)胞(26.33±3.36)的孢子形成的百分比沒有顯著差異。所發(fā)現(xiàn)的細(xì)微差別包括在交配效率(Δpho36，6.9％；野生型，2.7％)、對熱激的敏感性(50℃、20分鐘后，Δpho36細(xì)胞的存活率為46±10％，野生型細(xì)胞的存活率為78.3±3.38％)、和對細(xì)胞壁破壞劑calcofluor white和潮霉素B的抗性(Δpho36細(xì)胞更具抗性)上的差別。先前已顯示，Δpho36細(xì)胞較野生型細(xì)胞對細(xì)胞膜破壞性抗生素制霉菌素的抗性更強(qiáng)(Karpichev et al.，2002)。
實(shí)施例4RAS2信號途徑中的PHO36功能通過滲透蛋白被激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
滲透蛋白經(jīng)RAS2/cAMP途徑抑制細(xì)胞應(yīng)激信號從而促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡(Narasimhan et al.，2001)。因此，滲透蛋白抗性通過RAS2的無效突變被增強(qiáng)，通過在野生型株中表達(dá)顯性活性的RAS2G19V等位基因而降低(Narasimhan et al.，2001)。在誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的條件下，Δras2突變株中PHO36的突變不增加該Δras2突變株的滲透蛋白抗性(Narasimhan et al.，2001)，這表明PHO36在RAS2-介導(dǎo)的滲透蛋白誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡途徑中發(fā)揮了功能(圖2A)。來自Δras2突變株中的多拷貝質(zhì)粒的PHO36的過表達(dá)不顯著增加滲透蛋白敏感性，而PHO36在野生型株中的過表達(dá)使得其對滲透蛋白更具敏感性(圖2B)。同樣，如所預(yù)期的那樣，如果PHO36在細(xì)胞死亡途徑中在RAS2的上游發(fā)揮功能，則顯性活性的RAS2G19V等位基因在Δpho36突變株中的表達(dá)增強(qiáng)了對滲透蛋白的敏感性(圖2C)。
已顯示，與lacZ報(bào)道基因融合的STRE(應(yīng)激應(yīng)答性)報(bào)道元件應(yīng)答于RAS2/cAMP途徑依賴型應(yīng)激信號(Stanhill et al.，1999)。也已將嵌合的STRE-lacZ構(gòu)建體用于證明，滲透蛋白經(jīng)RAS2/cAMP途徑抑制細(xì)胞應(yīng)激信號從而促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡(Narasimhan et al.，2001)，并在此用于檢測PHO36在滲透蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞信號中的功能(圖2D)。與早前的報(bào)道相一致，在滲透蛋白處理的酵母細(xì)胞群中細(xì)胞死亡的程度與STRE-lacZ報(bào)道基因活性的抑制成比例(Narasimhan et al.，2001)；對β-半乳糖苷酶活性的抑制在野生型細(xì)胞中最大，在Δpho36突變株中較小，在Δras2和Δpho36Δras2雙突變株中最小(圖2A和2D)。這些結(jié)果表明，PHO36在細(xì)胞死亡信號途徑中在RAS2的上游發(fā)揮功能。應(yīng)注意到，在不用滲透蛋白處理的情況下，Δpho36Δras2雙突變株中的STRE-lacZ活性要低于在Δras2突變株中的活性(圖2D，圖例)，表明存在控制應(yīng)激應(yīng)答的不依賴于RAS2和不依賴于滲透蛋白的途徑，所述應(yīng)激應(yīng)答僅在不存在PHO36的條件下變得明顯。
這些數(shù)據(jù)以及更早的數(shù)據(jù)(Yun et al.，1998；Ibeas et al.，2000；Narasimhan et al.，2001)與存在控制滲透蛋白毒性的途徑相一致(圖2E)。例如，相對于Δras2突變株的滲透蛋白抗性而言，Δpho36突變株的部分滲透蛋白抗性可以通過PHO36與其它蛋白質(zhì)之間的功能豐余性(redundancy)得以解釋。推定的由YDR492w基因座編碼的蛋白質(zhì)與PHO36享有最大的相同性(44％)。因此，檢測了攜帶Δydr492和Δpho36Δydr492的突變株的滲透蛋白敏感性，但卻發(fā)現(xiàn)其分別與野生型和Δpho36株的滲透蛋白敏感性是不可區(qū)分的。早先的遺傳研究已經(jīng)揭示滲透蛋白也破壞酵母中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以削弱防御性細(xì)胞壁屏障并提高其細(xì)胞毒性效力(Yun et al.，1998)。該途徑的成分包括異三聚體G蛋白的β(STE4)和γ(STE 18)亞單位、蛋白激酶STE20、由STE5、STE11、STE7、FUS3、KSS1組成的MAP激酶分子和轉(zhuǎn)錄因子STE12，也享有信息素應(yīng)答和非侵襲性生長信號途徑。然而，G-蛋白偶聯(lián)的信息素受體STE2和STE3不是滲透蛋白誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。由于PHO36具有G-蛋白偶合受體的結(jié)構(gòu)特征卻介導(dǎo)滲透蛋白敏感性，因此檢測了PHO36可能用作與MAP激酶途徑連接的受體的可能性。Δste18、Δste20、Δste7和Δste12突變株中的PHO36的同時(shí)中斷相對于單獨(dú)中斷各基因產(chǎn)生了更高的滲透蛋白抗性(圖2F)，這表明STE基因和PHO36在不同的過程中發(fā)揮功能產(chǎn)生了滲透蛋白敏感性。這與將PHO36置于RAS2信號途徑中的結(jié)果相一致，因?yàn)橄惹暗挠^察表明RAS2和STE基因在具有遺傳差異的途徑中發(fā)揮功能，產(chǎn)生了滲透蛋白敏感性(Narasimhan et al.，2001)。對滲透蛋白的完全敏感性要求在細(xì)胞壁糖蛋白上存在磷酸甘露糖(mannosylphosphate)殘基(Ibeas et al.，2000)。磷酸甘露糖的添加取決于磷酸甘露糖轉(zhuǎn)移酶MNN6。如預(yù)期它們是否在不同的調(diào)節(jié)滲透蛋白抗性的過程中發(fā)揮功能那樣，PHO36的突變提高了Δmmn6突變株的滲透蛋白抗性，PHO36的過表達(dá)提高了Δmmn6突變株的滲透蛋白敏感性。
這些數(shù)據(jù)共同地且一致地表明，PHO36在通過滲透蛋白激活的細(xì)胞死亡信號途徑中在RAS2的上游發(fā)揮功能。
實(shí)施例5PHO36是一種質(zhì)膜蛋白質(zhì)。
PHO36具有GPCR的結(jié)構(gòu)性特征。典型地，這些蛋白質(zhì)是完整的質(zhì)膜蛋白質(zhì)。因此，利用用于電子顯微鏡的免疫細(xì)胞化學(xué)法測定PHO36的亞細(xì)胞定位。為了這一目的，在BWG7a細(xì)胞中從組成型GPD啟動(dòng)子表達(dá)重組PHO36MH蛋白，該重組蛋白中c-myc表位和六組氨酸標(biāo)簽在讀框內(nèi)與PHO36的C末端相融合(圖3A)。從一個(gè)多拷貝質(zhì)粒過表達(dá)PHO36MH增強(qiáng)了滲透蛋白敏感性，這表明PHO36MH是功能性的。在原生質(zhì)球的極細(xì)部分上用mycl-9E10單克隆抗體檢測PHO36MH，所述原生質(zhì)球產(chǎn)生自從單拷貝質(zhì)粒pPHO36MHS表達(dá)低水平PHO36MH的細(xì)胞。金顆粒標(biāo)記指示PHO36MH的質(zhì)膜定位(圖3B和3C)。因此，在蔗糖梯度(圖3D)上分級的總膜的較厚的級分中進(jìn)行免疫檢測，與質(zhì)膜H+-ATP酶共分級(圖3E)，但不與空泡α-甘露糖苷酶共分級(圖3F)。
實(shí)施例6PHO36與活性PR-5同種型特異性結(jié)合。
將純化自PHO36MH-過表達(dá)株和Δpho36突變株的細(xì)胞裂解產(chǎn)物的膜級分用滲透蛋白瓊脂糖4B進(jìn)行溫育。充分洗滌后，通過SDS-PAGE解離開、分離結(jié)合的蛋白質(zhì)，用mycl-9E10單克隆抗體對PHO36MH進(jìn)行免疫檢測。在PHO36MH-過表達(dá)株的膜級分中檢測到兩個(gè)代表PHO36MH單聚體和二聚體的條帶，其表觀分子量分別為36和72kDa(圖4A，泳道3-8)；但在Δpho36突變株的膜級分中沒有檢測到(圖4A，泳道2)。在表達(dá)c-myc標(biāo)記的STE7的酵母株的細(xì)胞提取物中未檢測到條帶，這表明對于PHO36而非c-myc標(biāo)簽而言重組體PHO36MH與滲透蛋白的結(jié)合是特異性的(圖4A，泳道1)。在結(jié)合反應(yīng)中包括游離的滲透蛋白降低了結(jié)合，而包括A9或BSA則沒有影響(圖4A，泳道3-8)，這證明了滲透蛋白與PHO36的相互作用的特異性。純化自植物濱藜(Atriplex nummularia)的A9是一種PR-5蛋白，其抗酵母細(xì)胞和原生質(zhì)球的活性較滲透蛋白更低，但對其它真菌種具有活性(Yun et at.，1997)，因此被用作結(jié)合選擇性的對照。
PHO36MH過表達(dá)株、Δpho36突變株(圖4B)和用空載體轉(zhuǎn)化的野生型株的原生質(zhì)球菌在體內(nèi)結(jié)合35S-滲透蛋白。在溫育過程中與Δpho36突變株的原生質(zhì)球結(jié)合且不能通過加入10倍過量的冷滲透蛋白而解離的35S-滲透蛋白的量代表非特異性結(jié)合的程度(圖4B，左)。剔除這一非特異性結(jié)合后，估計(jì)35S-滲透蛋白與PHO36MH-過表達(dá)株的原生質(zhì)球的結(jié)合在60分鐘內(nèi)是線性的，不喪失原生質(zhì)球存活力。PHO36MH-過表達(dá)株的原生質(zhì)球較以空載體轉(zhuǎn)化的野生型株的原生質(zhì)球結(jié)合超過約3倍的35S-滲透蛋白。通過在反應(yīng)中加入10倍過量的冷滲透蛋白可對35S-滲透蛋白與PHO36MH過表達(dá)株的原生質(zhì)球的結(jié)合形成部分競爭(圖4B，右)，但加入A9(其是一種在酵母中無活性的滲透蛋白同系物)或BSA不能對其形成競爭。因此，PHO36(對滲透蛋白的最大敏感性所需的質(zhì)膜蛋白質(zhì))也參與了細(xì)胞死亡之前滲透蛋白與酵母原生質(zhì)球的特異性結(jié)合。
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序列表<110>普渡研究基金會(huì)<120>用作哺乳動(dòng)物治療劑的植物PR-5蛋白<130>13421/460076<140>
<141>
<150>60/657,335<151>2005-02-28<150>60/613,647<151>2004-09-27<160>3<170>PatentIn Ver.3.3<210>1<211>3033<212>DNA<213>Nicotiana tabacum<400>1gtcgactttt gtatcagttg atgttctggt agtattacac tagacttagt ttcgtaactg 60attgttttat aaattttccg gtaacgtcca aatatgtcct taccgtcaca tagttggtct 120atatatccct ttttgaaata gaatccatcc aaattattta gctcttccgt taattatact 180aaaatgtatg acaaacacta tttccttttt attcagtact tttttttctt tatcaattta 240acttgacaaa actcatgaat tcctgttaat tttactatta caggccccac aggttccttc 300ctgacctgaa ggagatgaaa attatcggag aaattttttc ggtggtgtta attgggtgaa 360ggtaggatat gattattcaa attttgaaga tcttgttcct ttcagatctg aagctccaca 420gtgaacaact ccttcaaaat ctgaataatt atatcctacc ttcaccaaat taacaccacc 480aaaaaaattt ctccgacaat ttttatctcc ttcttttcag aagaactaga gccttctcgg 540ttggaaggtt ttggtggtgc aagtttgatt tttaggaata aaatcacgtc aaattggtaa 600cgaaaatgga gaaggcaccg gaaatggagg aaaccggata tgggagaatg aaaaagggaa 660aaaaagataa gaaaagaaaa aagaagaaag aaaagagaaa ggtaaagaaa aaaagtacta 720ataaaaagta gatagtgttt gtaatacact ttaatacaat taaagaaaga gctaattagt 780ttgggtggat tcatttttaa aaagggcaac tatgtgacgg taaggacata tatggaccaa 840ctatgtgtat ggtaagggca tatatggacc aattatgtga cggtacgagt atatatgagc 900taaagtatta acaaagggta aatgtgctca atttcgtata ttacaaagcc atatttggac 960ctttttccgt aaattttatg tagatttaga aaaaagcaac aacctataag gggttggtct 1020ttaaatattg tcttcatttt ttaatgtact taaagaatga gctctggacc tatatagttc 1080ttcagagatc tttctattgg atcgctagaa tttatgttat atttattcta cttttattgt 1140taagtgttca caaattttat tcgattagca tgattttgtg ctagttttat tgttaaacaa 1200atttcacaga atcggcgtaa ctttatttta tctgcaatcg atgtacttct taaattgttc 1260attaaatcta cctgactggt ataatttttc tgtgttcttc tctgcgctta ttctacatcc 1320agaataacga tatctaatta atgagctgct atataaatcg atgtaatagt tctcaaaaag 1380aaaatgaagg aagaaaaaac tatgtggtgg gacaatataa catcatctat atataaaaat 1440taaagtgaaa tccaggattt cagtattaaa actacaggaa aaatttatga tcggtgcaaa 1500ctccataaaa aatttcggaa gtacaaaatg tggagttcaaa ctgataaac aaactctaat 1560aaatttctta taattttttt atatttttgt gacgaatatt attgtttgag ctttattttc 1620acattaaaaa ctaaatattg aatagcttta aaatgatggc tatctgccaa aaagtggcta 1680tctgtcaatt tcttgcgaat taaaaaatgg tatagataaa agaaagcaag aaattgacta 1740aaagagatat tgttacaagt gtcacgttac agagattata ggtcagcgtt attaccaaat 1800aaatcgactt ctatattcat aaaataatta attattaggc ggctcttatg tttaagcgcc 1860
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Arg Gly Gln Thr Trp Val Ile Asn Ala Pro Arg Gly Thr Lys Met Ala50 55 60Arg Val Trp Gly Arg Thr Asn Cys Asn Phe Asn Ala Ala Gly Arg Gly65 70 75 80Thr Cys Gln Thr Gly Asp Cys Gly Gly Val Leu Gln Cys Thr Gly Trp85 90 95Gly Lys Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asp Gln Phe Ser100 105 110Gly Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Ile Pro115 120 125Met Thr Phe Ala Pro Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys Cys His Ala Ile130 135 140His Cys Thr Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys Pro Arg Glu Leu Arg Val145 150 155 160Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys Thr Thr Phe Gly Gly Gln Gln Tyr165 170 175Cys Cys Thr Gln Gly Pro Cys Gly Pro Thr Phe Phe Ser Lys Phe Phe180 185 190Lys Gln Arg Cys Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gln Asp Asp Pro Thr195 200 205Ser Thr Phe Thr Cys Pro Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Arg Val Ile Phe210 215 220Cys Pro Asn Gly Gln Ala His Pro Asn Phe Pro Leu Glu Met Pro Gly225 230 235 240Ser Asp Glu Val Ala Lys24權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其包含具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR-5蛋白。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述PR-5蛋白為滲透蛋白(SEQID NO.3)，或其具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的同系物。
3.一種用于治療患有由脂聯(lián)素或脂聯(lián)素樣蛋白介導(dǎo)的代謝途徑的激活或抑制所引起的病癥的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括施用具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR-5蛋白。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述病癥選自如下一組II型糖尿病、胰島素抵抗、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟病。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述病癥為II型糖尿病。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述病癥為胰島素抵抗。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述病癥為高脂血癥。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述病癥為動(dòng)脈粥樣硬化。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述病癥為心臟病。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所述PR-5蛋白為滲透蛋白(SEQ IDNO.3)，或其具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的同系物。
11.權(quán)利要求4的方法，其中所述PR-5蛋白為滲透蛋白(SEQ IDNO.3)，或其具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的同系物。
12.PR-5蛋白在治療劑的合理化設(shè)計(jì)中的應(yīng)用，其中所述治療劑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的全部或部分脂聯(lián)素靶的激動(dòng)劑或拮抗劑。
13.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述治療劑是激動(dòng)劑。
14.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述治療劑是拮抗劑。
15.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述PR-5蛋白為滲透蛋白(SEQ IDNO.3)。
16.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述合理化設(shè)計(jì)包括結(jié)構(gòu)/功能分析。
17.編碼具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR-5蛋白的核酸序列在治療劑的合理化設(shè)計(jì)中的應(yīng)用，其中所述治療劑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的全部或部分脂聯(lián)素靶的激動(dòng)劑或拮抗劑。
18.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述所述治療劑是激動(dòng)劑。
19.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述所述治療劑是拮抗劑。
20.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述核酸序列為SEQ ID NO.1。
21.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述核酸序列為SEQ ID NO.2。
22.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述合理化設(shè)計(jì)包括結(jié)構(gòu)/功能分析。
23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述結(jié)構(gòu)/功能分析包括選自以下的一或多種技術(shù)DNA重排、增強(qiáng)的選擇性誘變和噬菌體展示。
24.一種受體蛋白質(zhì)用作初級篩選以鑒定治療劑的應(yīng)用，所述受體蛋白質(zhì)對具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR-5蛋白具有特異性結(jié)合親和力，所述治療劑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的全部或部分脂聯(lián)素靶的激動(dòng)劑或拮抗劑。
25.權(quán)利要求24的應(yīng)用，其中所述PR-5受體為PHO36。
26.權(quán)利要求24的應(yīng)用，其中利用分離形式的受體進(jìn)行所述篩選。
27.權(quán)利要求24的應(yīng)用，其中利用表達(dá)所述受體的細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物進(jìn)行所述篩選。
28.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞系或組織培養(yǎng)物過表達(dá)所述受體。
29.權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中利用酵母細(xì)胞系進(jìn)行所述篩選。
30.權(quán)利要求29的應(yīng)用，其中所述酵母過表達(dá)所述受體。
全文摘要
具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR－5家族的蛋白質(zhì)通過受體結(jié)合控制酵母中的程序性細(xì)胞死亡。已發(fā)現(xiàn)與具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR－5蛋白特異性結(jié)合的受體與哺乳動(dòng)物脂聯(lián)素受體同源，這種PR－5蛋白可用作脂聯(lián)素的功能性同系物并控制哺乳動(dòng)物中的脂聯(lián)素應(yīng)答。具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR－5蛋白，例如滲透蛋白，可用于治療哺乳動(dòng)物中由于脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的代謝途徑的激活或抑制所引起的病癥。具有凝集素樣β桶結(jié)構(gòu)域的PR－5蛋白、編碼該蛋白質(zhì)的核酸和與所述蛋白特異性結(jié)合的受體也同樣可用于用于哺乳動(dòng)物中的新治療劑的篩選和合理化設(shè)計(jì)。
文檔編號A61P3/10GK101065141SQ200580040277
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者R·A·布雷桑, M·L·納拉辛漢 申請人:普渡研究基金會(huì)