專利名稱：用糖脂穩(wěn)定基于脂質(zhì)的佐劑制劑的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及物理學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明尤其涉及通過獨特的膜方法立體穩(wěn)定陽離子的脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)體中摻入糖脂。穩(wěn)定的脂質(zhì)體能作為抗原成分的佐劑或作為藥物遞送系統(tǒng)。特別地，當(dāng)終產(chǎn)物是穩(wěn)定的時候，本發(fā)明涉及用于免疫接種在水性介質(zhì)中具有佐劑的疫苗。
背景技術(shù)：
在人類中使用的用于對感染疾病產(chǎn)生免疫性的最初的疫苗由活的、減弱的病原組成。減弱的形式或者是與有機體密切相關(guān)天然發(fā)生的或者是通過在培養(yǎng)中系列傳代獲得的。一個例子是結(jié)核，其通過牛分枝桿菌(BCG疫苗)減弱的但活性的菌株對抗。然而這種方法的有效性并不是在所有的人群中提供對結(jié)核的滿意的抗性。所以需要新的和有效的方法，以對結(jié)核和其它感染疾病產(chǎn)生免疫性。一種特別有希望的進展是分離和使用重組形式的免疫顯性(immunodominant)抗原作為疫苗，例如早期分泌型抗原靶(early secretory antigenic target)(ESAT-6)和抗原85(Ag85)。這些疫苗被很好地限定并且副作用是最小化的。然而，許多高純度的物質(zhì)，例如重組的純化蛋白質(zhì)，不是非常免疫原性的并且不產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答以抵御真正的感染疾病。這種事實是已知的并且做了很多努力以增強免疫性質(zhì)，通過所談?wù)摰奈镔|(zhì)和所謂的佐劑結(jié)合。根據(jù)病原，預(yù)防可能需要或者體液的或者細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答占優(yōu)勢。能通過佐劑的選擇確定免疫應(yīng)答(體液的或細(xì)胞介導(dǎo)的)的特定種類的開發(fā)。
對于抵抗例如M.結(jié)核的細(xì)胞內(nèi)病原的預(yù)防性免疫需要細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，用于針對TB的亞單位疫苗的合適佐劑應(yīng)該增強Th1應(yīng)答(Lindblad等，1997)。一般相信抗體在對TB的免疫中不起重要作用，而細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-γ(干擾素γ)的釋放是預(yù)防中最重要的細(xì)胞因子(Collins &Kaufmann，2001)。
多種誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的佐劑被建議，但是一般沒有任何佐劑對所有的應(yīng)答都適合。
一種對促進細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答特別有效的佐劑類型是季銨化合物，例如二甲基雙十八烷基銨(dimethyldioctadecylammonium)(DDA)(Hilgers和Snippe，1992)。DDA是合成的兩親物，其包括親水的帶正電的二甲基銨頭部基團和兩個長的疏水烷基鏈。在水環(huán)境中，DDA自我裝配形成泡狀雙層，與從天然磷脂制備的脂質(zhì)體相似。已經(jīng)描述了DDA與其它免疫調(diào)節(jié)劑的結(jié)合。在人類給藥包括DDA的Arquad 2HT是有希望的并且不引起明顯的副作用(Stanfield等1973)?；趤碜訫.結(jié)核的培養(yǎng)濾液的蛋白質(zhì)和DDA的實驗性疫苗在小鼠中對TB產(chǎn)生免疫應(yīng)答(Andersen，1994)。用M.結(jié)核蛋白質(zhì)ESAT-6和Ag85B的融合蛋白以及DDA/MPL作為佐劑對小鼠接種疫苗提供的預(yù)防作用與通過BCG接種疫苗獲得的相似(Olsen等2001)。這些研究顯示，與例如鋁相反，基于DDA的佐劑在小鼠中能誘導(dǎo)針對TB的免疫應(yīng)答。而且，DDA已經(jīng)被用于佐劑用于針對偽狂犬病病毒的DNA疫苗，以增強T細(xì)胞應(yīng)答和抗病毒免疫(van Rooij等2002)。
Woodard等研究(1980)加入TDM(α，α’-海藻糖6，6′-二霉菌酸酯)油乳劑到DDA溶液作為佐劑用于基于加熱殺死的細(xì)菌的流產(chǎn)桿菌(Brucellaabortus)疫苗。單獨DDA或DDA和TDM的混合物都不能誘導(dǎo)預(yù)防。在另一個基于溶解性蛋白質(zhì)提取物的流產(chǎn)桿菌的亞單元疫苗的研究中，DDA和TDM也聯(lián)合作為佐劑(Dzata等1991)，發(fā)現(xiàn)混合物增強免疫應(yīng)答(抗體水平、皮膚測試應(yīng)答、和IL-2水平)，與觀察到的單獨使用DDA相比。Holten-Andersen等(2004)研究DDA脂質(zhì)體和TDB(α，α′-海藻糖6，6′-二山萮酸酯(dibehenate))懸浮液結(jié)合，并且ESAT-6抗原與這樣的佐劑混合物一起給藥，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)對結(jié)核強的預(yù)防性免疫應(yīng)答，其比在DDA脂質(zhì)體中給藥ESAT-6顯著提高。
不幸地，如上所述的兩親季銨化合物的懸浮液，例如單獨DDA或DDA和MPL的混合物、TDM或TDB是物理學(xué)不穩(wěn)定的，并且在4℃長期的儲存中沒有聚集和沉淀的發(fā)生是不可能的。因為沉淀會妨礙制劑的臨床使用，DDA制劑穩(wěn)定性的缺乏目前是在人類進行任何應(yīng)用的主要障礙。
在英國專利No.2147263-A中，Takahashi和Tsujii描述來自季銨化合物的小囊泡的穩(wěn)定，通過將兩種季銨化合物混合在一起或向季銨化合物加入多種去污劑。
在美國專利No.5,026,546，Hilgers和Weststrate描述了DDA佐劑懸浮液的穩(wěn)定，通過用丙烯酸和聚al-lyl-蔗糖的交聯(lián)聚合物。
Li等(2000)描述了用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的陽離子的脂質(zhì)-魚精蛋白-DNA復(fù)合物的凍干法。評價了添加例如單糖和雙糖的常用的冷凍保護劑的作用，發(fā)現(xiàn)雙糖比單糖更好地保護粒度。并且具有10％蔗糖的非凍干的脂質(zhì)-魚精蛋白-DNA復(fù)合物在4℃儲存8周后維持穩(wěn)定的粒度，但是轉(zhuǎn)染效率凍干的高于非凍干的樣品。
美國專利No.5922350描述了長期儲存脂質(zhì)體的方法，例如基于磷脂通過在脂質(zhì)體脫水之前加入例如海藻糖和蔗糖等糖類。另外，專利描述了預(yù)形成的和儲存的脂質(zhì)體的延遲負(fù)載通過濃度梯度和脫水-再水合的過程的結(jié)合是可行的。
用聚乙二醇衍生物穩(wěn)定的用于藥物遞送的磷脂脂質(zhì)體(致融脂質(zhì)體)描述于WO 96/10392中。描述于WO 02/03959中的另外的藥物遞送制劑公布了一種制劑，其包括陽離子的脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體，其中每個脂質(zhì)體基團負(fù)載相同或不同的治療劑。
用于做脂質(zhì)體制備的優(yōu)選的方法由Bangham(Bangham等1965)描述。這種制備包括在有機溶劑中溶解磷脂，其然后被蒸發(fā)以干燥，在試管內(nèi)部留下薄的脂質(zhì)膜。干的脂質(zhì)膜然后在合適量的水相中水化并且混合物被加熱到脂質(zhì)相轉(zhuǎn)變溫度以上以允許“膨脹”。得到的由多層的小囊泡(MLV)組成的脂質(zhì)體通過振蕩試管分散。組成包括泡狀的雙層膜的脂質(zhì)被組織，以至疏水的碳?xì)浠衔铩拔膊俊倍ㄏ螂p層的中心，而親水的“頭部”分別定向水相的內(nèi)部和外部。這種制備提供通過例如超聲處理(Papahadjopoulos等1967)或由Cullis等描述在美國專利No.5,008,050的擠出的方法生產(chǎn)單層小囊泡(UV)的基礎(chǔ)。
用于制備小囊泡的其它技術(shù)是由Szoka和Papahadjopoulos(Szoka和Papahadjopoulos，1978；美國專利No.4,235,871)介紹的反相蒸發(fā)法。這樣的方法包括在有機溶劑中形成脂質(zhì)的油包水乳劑以及包括被膠囊化物質(zhì)的緩沖水溶液。在減壓的條件下去除有機溶劑產(chǎn)生粘稠的膠。當(dāng)這樣的膠崩潰，形成脂質(zhì)小囊泡的水性懸浮物。
由Carmona-Ribeiro和Chaimovich(Carmona-Ribeiro and Chaimovich，1983)描述的另一種方法包括向緩沖水溶液注入期望脂質(zhì)的例如氯仿、甲醇、乙醇的有機溶液，其中當(dāng)溶劑蒸發(fā)時脂質(zhì)自發(fā)形成脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體也能通過液體加熱方法制備，如由Holten-Andersen等(2004)為DDA描述的，通過其在水緩沖液中的形成脂質(zhì)體化合物的懸浮物被加熱到例如80℃，通過間歇振蕩20分鐘然后冷卻到室溫。
以上提到的由Woodard等(1980)、Dzata等(1991)和Holten-Andersen等(2004)使用和描述的“水性加熱方法”不穩(wěn)定DDA和TDB的溶液。
在一個特別優(yōu)選的方法中，蛋白質(zhì)抗原被捕獲在預(yù)形成的小囊泡中，通過脫水-再水化的方法(Kirby和Gregoriadis，1984)，在其中在水相中存在的寡核苷酸、肽或蛋白質(zhì)通過冷凍干燥捕獲，然后凍干的脂質(zhì)體被再水化。
替代地，抗原通過使用由Pick(Pick，1981)和由Bally等在美國專利No.4,975,282描述的冷凍和融解技術(shù)摻入。在此技術(shù)中，小囊泡與蛋白質(zhì)抗原混合，并且反復(fù)迅速在液氮中冷凍和加熱到相關(guān)脂質(zhì)主相轉(zhuǎn)變溫度以上。小囊泡可通過進一步的處理以除去任何未捕獲的抗原，例如通過洗和離心。
已經(jīng)顯示例如TDB和從分枝桿菌細(xì)胞壁分離的索狀因子TDM抑制磷脂小囊泡的融合(Spargo等1991和Crowe等1994)。親水的海藻糖部分可能固化在小囊泡的表面，因此，增加水合力，其是對于融合主要的障礙。替代地，固化的海藻糖部分可作為融合的立體障礙(Spargo等1991)。
來自磷脂的脂質(zhì)體(無TDB)現(xiàn)在實驗上作為例如流感疫苗的佐劑(Ben-Yehuda等2003)。另一個例子是對抗流感的IMUXENTM脂質(zhì)體疫苗(Lipoxen Technologies Ltd.；Gregoriadis等1999)。
因為季銨化合物特別是DDA是用于有效疫苗佐劑的非常有期望的候選，但有主要的不利，在水溶液中物理學(xué)不穩(wěn)定，在儲存的過程中形成聚集和沉淀，所以需要穩(wěn)定形成的小囊泡。本發(fā)明描述了穩(wěn)定包括例如DDA的陽離子脂質(zhì)的佐劑制劑的新的方法。另外，通過這樣方法，制劑的佐劑作用被增強。
發(fā)明概述本發(fā)明公布用于穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體懸浮物的組合物和方法，通過摻入糖脂例如酰化糖苷如α，α′-海藻糖6，6′-二山萮酸酯(TDB)或α，α′-海藻糖6，6′-二霉菌酸酯(TDM)進入脂質(zhì)體雙層，其從兩親季銨化合物例如DDA、DODA、DOTAP、DODAP或DOTMA制備。糖脂的高度水化的糖類頭部基團增加整個脂質(zhì)體雙層的水化，其防止由于陽離子小囊泡減低的電荷排斥引起的季銨頭部基團的脫水和聚集。DDA的這種穩(wěn)定作用不單單通過加入糖類如海藻糖或蔗糖或季銨化合物和糖脂的簡單的混合而獲得。本發(fā)明也公布這些穩(wěn)定化的脂質(zhì)體作為疫苗佐劑的用途。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了一種在水制劑中用糖脂穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體的新方法。例如由兩親季銨化合物制得的陽離子脂質(zhì)體是用在脂質(zhì)體膜里摻入糖脂來穩(wěn)定的。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是當(dāng)季銨化合物是二甲基雙十八烷基銨(DDA)或者二甲基雙十八烯基銨(DODA)的溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或者乙酸鹽化合物。
其它優(yōu)選的季銨化合物是1，2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1，2-二肉豆蔻?；?3-三甲基銨丙烷、1，2-二棕櫚?；?3-三甲基銨丙烷、1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷、和二油?；?3-二甲基銨丙烷(DODAP)和N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)。
用于穩(wěn)定脂質(zhì)體的糖脂優(yōu)選α，α′-海藻糖6，6′二山萮酸酯(TDB)或者α，α′-海藻糖6，6′-二霉菌酸酯(TDM)。制劑中糖脂的摩爾百分?jǐn)?shù)可從0.5到95摩爾％，但優(yōu)選2.5到大約20摩爾％，更優(yōu)選從大約5到大約18摩爾％。
本發(fā)明還公開了這些被穩(wěn)定的脂質(zhì)體作為佐劑的應(yīng)用，例如用于疫苗組合物。尤其是當(dāng)終產(chǎn)物是穩(wěn)定的時候，本發(fā)明涉及在水性介質(zhì)中具有佐劑的用于免疫接種的疫苗。
本發(fā)明還公開了依照上述方法穩(wěn)定的用作疫苗佐劑的脂質(zhì)體產(chǎn)物，其中的疫苗可以對抗任何疾病，例如結(jié)核、瘧疾、衣原體等。
″脂質(zhì)體″是封閉的小囊泡結(jié)構(gòu)，由一個或多個脂質(zhì)雙層體圍繞著水性核心而構(gòu)成。每個脂質(zhì)雙層體由兩個脂質(zhì)單層體組成，其中每個單層體有一個疏水的“尾部”區(qū)域和一個親水的“頭部”區(qū)域。在雙層體中，脂質(zhì)單層體的疏水“尾部”指向雙層體內(nèi)部，親水“頭部”朝向雙層體外部。脂質(zhì)體可具有多種物理化學(xué)性質(zhì)，例如大小、脂質(zhì)組成、表面電荷、流動性、雙分子膜的數(shù)量。根據(jù)脂質(zhì)雙層體的數(shù)量，脂質(zhì)體可歸類為單層小囊泡(UV)或者多層小囊泡(MLV)，單層小囊泡是由單一脂質(zhì)雙層體構(gòu)成，多層小囊泡是由兩個或多個同心的雙層體構(gòu)成且雙層體彼此被水層間隔分離。水溶性化合物被捕獲入脂質(zhì)體的水相/核，相反的，親脂性化合物被捕獲入脂質(zhì)雙層膜的核心。
“微?！笔窃诮缦廾鞔_的濃度即臨界微粒濃度(CMC)下產(chǎn)生的兩親分子的膠態(tài)集合體。微粒中聚集分子的典型數(shù)目(聚集數(shù))是50到100。微粒在含有表面活性劑分子作用下可能是球形的，碳?xì)浠衔锏奈仓赶蛑行?，極性的頭部指向外部水環(huán)境。其它可能的結(jié)構(gòu)包括反相微粒和柱型微粒。
術(shù)語″陽離子脂質(zhì)″是指包括任何兩親脂質(zhì)，包括合成的脂質(zhì)和脂質(zhì)類似物，具有疏水和極性頭部基團部分，在生理PH具有凈正電荷，并且本身在水中能自發(fā)地形成雙分子層小囊泡或者微粒。
本發(fā)明中用的陽離子脂質(zhì)特別優(yōu)選的是通式NR1R2R3R4-X的季銨化合物，其中R1和R2分別獨立地是具有1至3個碳原子的短鏈烷基基團，R3獨立地是氫或者甲基或者具有12至20個碳原子的烷基基團，優(yōu)選14至18個碳原子，R4獨立地是具有12至20個碳原子的碳?xì)浠衔锘鶊F，優(yōu)選具有14至18個碳原子。X是藥物上允許的陰離子，本身無毒性。這樣陰離子的例子是鹵素陰離子，氯化物、溴化物和碘化物。也可使用無機陰離子例如硫酸鹽和磷酸鹽，或者由簡單有機酸如乙酸衍生而來的有機陰離子。R1和R2基團可以是甲基、乙基、丙基和異丙基，而R3可以是氫、甲基或者十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基(eicocyl)基團，R4可以是十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基基團。然而其它C12-C20碳?xì)浠衔锘鶊F也是可能的，因為盡管R3和R4基團優(yōu)選無分支側(cè)鏈的飽和基團，但是它們在較少程度上可能帶有支鏈，例如甲基和乙基側(cè)鏈。R3和R4也可能有較少量的不飽和，例如每個含有1至3個雙鍵，但是優(yōu)選飽和烷基基團。陽離子脂質(zhì)最優(yōu)選二甲基雙十八烷基溴化銨或氯化銨(DDA-B或DDA-C)，或者其硫酸鹽、磷酸鹽或者乙酸鹽(DDA-X)，或者二甲基雙十八烯基溴化銨或氯化銨(DODA-B或DODA-C)，或者其硫酸鹽、磷酸鹽或者乙酸鹽(DODA-X)。應(yīng)用于本發(fā)明的其它優(yōu)選的陽離子脂質(zhì)包括但不局限于1，2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基銨丙烷、1，2-二棕櫚酰基-3-三甲基銨丙烷、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基銨丙烷、二油?；?3-二甲基銨丙烷(DODAP)和N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)。
通過結(jié)合糖脂到脂質(zhì)體膜來穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體。通過結(jié)合是指將分子的疏水片段和親水片段嵌入到膜、微粒、脂質(zhì)體或雙層體的相應(yīng)的疏水和親水的片段或部分的步驟方法。結(jié)合糖脂到脂質(zhì)體的步驟方法可以是“薄膜方法”、“反相蒸發(fā)方法”和“有機溶液注射方法”，以及將來和目前未知的具有結(jié)合糖脂到脂質(zhì)體膜同樣效果的方法。所有目前已知的方法在發(fā)明的背景技術(shù)中介紹。本發(fā)明最優(yōu)選的方法是薄膜方法。
糖脂是指含有一個或多個單糖殘基的任何化合物，其中的單糖殘基通過一個糖苷鍵與例如長鏈脂肪酸、?；视?、鞘氨基醇、神經(jīng)酰胺、異戊烯基磷酸酯等疏水部分結(jié)合。本發(fā)明的糖脂可來源于合成、植物或源于例如分枝桿菌的微生物。
本發(fā)明用的一類糖脂是?；?或烷基化)的糖苷，它們帶有一個或兩個糖殘基與一個、兩個甚至三個脂肪酸酯化。這些脂肪酸既可以是直鏈的包括飽和脂肪酸例如肉豆蔻酸C14:0、十五烷酸C:15、棕櫚酸C16:0、十七烷酸C17:0、硬脂酸(steric acid)C18:0、十九烷酸C:19、二十烷酸C:20、二十一烷酸C21:0、二十二烷酸C:22，以及不飽和脂肪酸例如油酸C18:1n-9、亞油酸18:2n-6；又可以是復(fù)雜的支鏈脂肪酸例如霉菌酸、甲氧基霉菌酸、酮基霉菌酸、環(huán)氧霉菌酸和白喉菌酸。糖殘基既可以是簡單單糖例如葡萄糖和果糖，也可以是含有共價鍵接的兩個單糖的二糖，例如含有葡萄糖和果糖的蔗糖，和海藻糖，其中的兩個葡萄糖單元通過糖苷鍵連接。本發(fā)明用的一類糖脂是由分枝桿菌分離出的細(xì)胞壁糖脂，其帶有的一個二糖，其或者與一個、兩個或三個正十六烷酸C16:0、油酸C18:1n-9、亞油酸18:2n-6酯化，或者與鏈長是60至90個碳原子的復(fù)雜的羥基支鏈脂肪酸如霉菌酸殘基酯化。本發(fā)明用的其它細(xì)菌糖脂具有更短的脂肪酸鏈，例如由Corynobacterium、諾卡氏菌分離出的白喉菌酸(22-36個碳原子)或者諾卡氏分枝霉菌酸(nocardomycolic acid)(44-60個碳原子)。優(yōu)選的分枝桿菌糖脂是α，α′-海藻糖6，6′-二霉菌酸酯(TDM)，常稱作索狀因子，它是分枝桿菌細(xì)胞壁最重要的免疫調(diào)節(jié)組分之一。在特別優(yōu)選的實施方案中，糖脂包括與二個二十二烷脂肪酸(山萮酸)酯化的二糖α，α′-海藻糖，例如α，α′-海藻糖6，6′-二山萮酸酯(TDB)，其是純合成的TDM類似物。
本發(fā)明用的其它類糖脂包括但不局限于基于甘油的糖脂這些脂包括單糖或低聚糖部分，其與甘油的羥基基團糖苷鍵接，其中甘油可與一個或二個脂肪酸酰化(或者烷基化)。另外，這些糖脂可以是不帶電荷的，因此通常稱為中性甘油糖脂，或者可以含有硫酸或磷酸基團。
基于神經(jīng)酰胺的糖脂根據(jù)糖部分的結(jié)構(gòu)，鞘糖脂分為中性鞘糖脂和酸性鞘糖脂，中性鞘糖脂含有未取代的糖基基團，酸性鞘糖脂含有帶有酸性的羧基、硫酸或磷酸基團的糖基基團。
脂多糖(LPS)這些復(fù)雜的化合物是內(nèi)毒素的抗原，發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陰性細(xì)菌(S-脂多糖)的細(xì)胞壁中。脂部分(脂A)與多糖通過糖苷鍵形成絡(luò)合物。脂A包括b-1，6-氨基葡萄糖-氨基葡萄糖主鏈，其在氨基葡萄糖I的1位和氨基葡萄糖II的4位具有2個磷脂基團。氨基葡萄糖II的3位與長鏈多糖形成易于酸化的糖苷鍵。如其它羥基化的脂肪酸例如羥基肉豆蔻酸酯(兩個酯鍵和兩個酰胺鍵)和正常脂肪酸(月桂酸酯)，其它基團被羥基化的脂肪酸取代(在大腸桿菌中)。本發(fā)明特別優(yōu)選的脂多糖是脂A的單磷酸衍生物(MPL)，其是無毒的并且具有出色的佐劑性能。
甾醇的糖苷此家族包括一種糖類單元與一種甾醇分子的羥基基團鍵接。確定甾醇部分包括多種甾醇膽固醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、菜子甾醇和二氫谷甾醇。糖部分包括葡萄糖、木糖和甚至阿拉伯糖。
脂肪酸或脂肪醇的糖苷許多的簡單糖脂發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、酵母菌和低等生物體(海綿)內(nèi)。這些化合物由與脂肪醇或羥基脂肪酸的羥基基團鍵接的或者與脂肪酸的羧基基團鍵接(酯鍵)的糖基部分(一個或幾個單元)而組成的。這些化合物常常具有值得注意的物理或生物學(xué)性質(zhì)。他們中的一些(烷基糖苷)因為具有清潔性能而工業(yè)化生產(chǎn)。
烷基鏈?zhǔn)侵钢咀逄細(xì)浠衔镦?，它可以是直鏈的或者支鏈的。該鏈可以是飽和的，或者可以是不飽和的例如含有一個或多個雙鍵。
?；?zhǔn)侵竿榛?OC(O)基團，其中的烷基基團如上述定義。
脂肪酸鏈?zhǔn)侵钢ф湹幕蚍侵ф?、飽和的或不飽和的帶有烷基或?；鶊F的烴鏈。
術(shù)語藥學(xué)上可接受的是指不會干擾有效成分的效力或者生物活性的物質(zhì)，并且對宿主或患者沒有毒性。
相轉(zhuǎn)變溫度或Tm是一種溫度，在此溫度脂質(zhì)體雙層體從低溫度的膠相，其特征在于有序的脂肪酸鏈(有序的固體相)，到高溫流體相，在其中脂肪酸鏈有高度構(gòu)象無序(液體無序相)，如通過差示掃描量熱法(DSC)測量的。
通過藥物制劑的穩(wěn)定性，意思是制劑在產(chǎn)品的貯存期限過程中在限定的范圍內(nèi)制劑維持的能力。脂質(zhì)體分散物顯示化學(xué)和物理的穩(wěn)定特點。
化學(xué)穩(wěn)定性涉及化學(xué)降解，而物理穩(wěn)定性涉及系統(tǒng)的膠體穩(wěn)定性。
脂質(zhì)體分散物的物理穩(wěn)定性通過小囊泡間的相互作用而確定，其依賴吸引力和排斥力之間的平衡。膠體系統(tǒng)通過例如靜電排斥和立體排斥的排斥力而穩(wěn)定，由于在大量水中和相互作用區(qū)域水中的化學(xué)潛能的區(qū)別。
佐劑限定為非特異性地增強抗原免疫反應(yīng)的物質(zhì)。根據(jù)佐劑的天然特定，它能促進細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答或二者的混合。由于免疫應(yīng)答的增強是非特異的，在本領(lǐng)域很能理解，同樣的佐劑能與不同的抗原一起使用以促進對抗不同靶的應(yīng)答，例如與來自M.結(jié)核的抗原一起促進對抗M.結(jié)核的應(yīng)答，或與來自腫瘤的抗原一起促進對抗特異種類腫瘤的免疫性。
季銨化合物，例如二甲基雙十八烷基溴化銨或、氯化銨或其其它有機的和無機的鹽(DDA-B、DDA-C或DDA-X)、二甲基雙十八烯基溴化銨、氯化銨或其其它有機的和無機的鹽(DODA-C、DODA-B或DODA-X)，或1，2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1，2-二肉豆蔻?；?3-三甲基銨丙烷、1，2-二棕櫚?；?3-三甲基銨丙烷、1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷、二油?；?3-二甲基銨丙烷(DODAP)和N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)，當(dāng)分散在水介質(zhì)中，有能力形成脂質(zhì)聚集體例如脂質(zhì)雙層體、各種類型的單層或多層的脂質(zhì)體、微粒、和類似物。這些結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)膜為包括其它例如糖脂的兩親化合物提供出色的基質(zhì)，其顯示穩(wěn)定本發(fā)明的小囊泡分散物。
而且，例如TDB和TDM的糖脂它們自己具有免疫刺激性質(zhì)，并且能與季銨化合物以協(xié)同的方式起作用，以增強免疫應(yīng)答。另外，例如寡核苷酸、肽和蛋白質(zhì)抗原的大分子能捕獲在單層和多層脂質(zhì)體的水相中。
例如TDB的疏水酰基鏈被期望嵌在從本發(fā)明的季銨化合物制備的脂質(zhì)雙層體的疏水區(qū)域之內(nèi)，因此固定在疏水區(qū)域和大量水之間界面的親水性海藻糖頭部基團。高度水化的糖類頭部基團增加整個界面的水化，引起水化力潛在地增加，其防止相對的雙層體的近接觸，這是小囊泡聚集和融合需要的。此外，作為界面水化的后果，雙層體的流動性會增加，其也易于穩(wěn)定小囊泡。
本發(fā)明的制劑中使用的分散物介質(zhì)可以是任何合適的水溶劑。然而，脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性顯示對例如磷酸和硫酸離子的陰離子敏感。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的佐劑組合物是在沒有或低濃度的這樣的離子中形成的。
當(dāng)作為疫苗佐劑使用時，抗原組分被加入到佐劑溶液，可能與例如MPL(單磷酸脂A)或其衍生物、聚肌胞(poly-IC)、胞壁酰二肽(MDP)或其類似物、酵母多糖、雙鏈RNA(dsRNA)、DC-Chol、CpG寡聚脫氧核苷酸和他莫昔芬等其它免疫調(diào)節(jié)因子一起?？乖M分或物質(zhì)是分子，其與預(yù)先形成的抗體和/或T和B細(xì)胞上的特異受體反應(yīng)。在疫苗接種方面，分子能刺激特異的T或B細(xì)胞的發(fā)育，引起免疫細(xì)胞的記憶群體的形成，如果免疫細(xì)胞第二次遇到所述抗原時其能促進更快的“記憶”應(yīng)答。因為記憶群體很少克隆，在實踐中這意思是，抗原是任何分子或分子的集合，當(dāng)被來自之前暴露給它的個體的免疫細(xì)胞再遇上時，其能刺激免疫應(yīng)答的增加。
抗原組分或物質(zhì)能是多肽或多肽的一部分，其引起在動物中或人類中和/或通過在此描述的任何的生物分析確定的生物樣品中的免疫應(yīng)答。多肽的免疫原部分可以是T細(xì)胞表位或B細(xì)胞表位。為了確認(rèn)在免疫應(yīng)答中被識別的相關(guān)的T細(xì)胞表位，可能使用″強力″方法因為T細(xì)胞表位是線性的，如果系統(tǒng)構(gòu)建，多肽的缺失突變會揭示多肽的哪個區(qū)域?qū)γ庖咦R別是必需的，例如通過使這些缺失突變經(jīng)受例如在此描述的IFN-γ分析。另一種方法使用由多肽衍生的寡聚肽重疊(優(yōu)選地合成物具有例如20個氨基酸殘基的長度)。這些肽能在生物分析中測試(例如在此描述的IFN-γ分析)，并且這些中的一些會給出陽性應(yīng)答(并因此免疫原的)，如在肽中T細(xì)胞表位的存在證實的。線性B細(xì)胞表位能通過分析B細(xì)胞對覆蓋例如描述于Harboe等1998中的感興趣的多肽的重疊肽的識別而確定。
雖然T細(xì)胞表位的最短長度已經(jīng)顯示至少6個氨基酸，通常這樣的表位包括更長伸展的氨基酸。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽片段具有至少7個氨基酸殘基的長度，例如至少8個，至少9個，至少10個，至少12個，至少14個，至少16個，至少18個，至少20個，至少22個，至少24個，以及至少30個氨基酸殘基。因此，本發(fā)明方法的重要實施方案中，優(yōu)選地，多肽片段具有最多50個氨基酸殘基的長度，例如最多40、35、30、25和20個氨基酸殘基。期望具有10和20個氨基酸殘基之間的長度的肽會證明是作為診斷工具最有效的，并因此特別優(yōu)選用于本發(fā)明方法的多肽片段的長度是18，例如15、14、13、12并且甚至11個氨基酸。
疫苗被限定為死的、減弱的、或以其它方式修飾的微生物(細(xì)菌、病毒或立克次氏體)或其部分的懸浮物，用于接種以產(chǎn)生對疾病的免疫性。疫苗能被或者預(yù)防性的給藥以預(yù)防疾病或者作為治療性疫苗給藥以對抗已經(jīng)存在的疾病例如癌癥或潛伏性的感染疾病但也與過敏和自身免疫疾病聯(lián)系。疫苗可在合適的佐劑中乳化用于促進免疫應(yīng)答。
疫苗是以與劑量制劑相容的形式給藥的，并且在這樣的劑量會是治療有效的和免疫原的。給藥的量根據(jù)治療的受試者，包括例如到達免疫應(yīng)答的個體免疫系統(tǒng)的能力和期望的預(yù)防程度。合適的劑量范圍是每個接種疫苗幾百個數(shù)量級微克的活性成分，具有優(yōu)選的范圍從大約0.1μg到1000μg，例如在從大約1μg到300μg的范圍內(nèi)，并且特別在從10μg到50μg的范圍內(nèi)。初次給藥和加強給藥的合適的用藥法也是不同的，但典型地通過初次給藥，然后相繼接種或其它給藥。
應(yīng)用的形式可能很大不同。任何用于疫苗給藥的傳統(tǒng)方法是可用的。相信這些包括在固體生理上可接受的基質(zhì)上的口腔的或粘膜的應(yīng)用或在生理上可接受的懸浮物中，腸胃外的通過注射或類似的方法應(yīng)用。疫苗的劑量根據(jù)給藥的途徑并且根據(jù)接種疫苗的人的年齡，少量程度上根據(jù)接種疫苗的人的尺寸而不同。
疫苗傳統(tǒng)上通過胃腸外給藥，通過注射，例如或者是皮下的或者是肌肉內(nèi)的。適合其它給藥模式的另外的制劑包括栓劑和在一些情況下口腔或粘膜制劑。對于栓劑，傳統(tǒng)的粘合劑和載體可以包括例如聚烷醇(polyalkalene)或甘油三酯；這樣的栓劑可以從混合物形成，混合物包括活性成分在范圍0.5％到10％，優(yōu)選地1-2％?？诜苿┌ɡ缤ǔＳ米髻x形劑的例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂和類似物。這些組合物采用溶液、懸浮物、片劑、藥丸、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉末的形式，并且有利地包括10-95％的活性成分，優(yōu)選地25-70％。
選擇的疫苗可以是例如蛋白質(zhì)疫苗包括多肽(或至少其一個免疫原部分)或融合多肽的疫苗組合物。
活的重組疫苗在非病原微生物或病毒中在疫苗中相關(guān)抗原的表達。這樣的微生物的很已知例子是牛分枝桿菌BCG、沙門氏菌和假單胞菌，以及病毒的例子是牛痘苗病毒和腺病毒。
對于所有這些疫苗的構(gòu)建體，合適佐劑的加入已經(jīng)引起增強的疫苗效力(Brandt等2000；van Rooij等2001；Wang等2002；Eriksson，2003)。
仍然，本發(fā)明的另一個實施方案是一種包括佐劑的遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體已經(jīng)被在制藥和醫(yī)療上用作遞送系統(tǒng)，例如免疫佐劑、感染性疾病和炎癥的治療、癌癥治療和基因治療(Gregoriadis，1995)?？赡軐χ|(zhì)體的佐劑作用有影響的因子是脂質(zhì)體大小、脂質(zhì)組成和表面電荷。另外，抗原的位置也可能是重要的(例如是否它是被吸收或共價與脂質(zhì)體表面結(jié)合或封閉于脂質(zhì)體的水分隔中)?？乖瓕鐦渫患?xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞的負(fù)載已經(jīng)顯示對產(chǎn)生具有抗腫瘤免疫的活性T細(xì)胞是有效的方法。
本發(fā)明的脂質(zhì)體可通過本技術(shù)領(lǐng)域的多種已知的方法制備。
優(yōu)選的陽離子脂質(zhì)是季銨化合物，其具有二甲基銨的頭部基團和兩個長的疏水烷基鏈，其包括12到20個碳原子，例如二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA-B)、二甲基雙十八烯基氯化銨(DODA-C)。其它優(yōu)選類型的陽離子脂質(zhì)包括但不限于1，2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基銨丙烷、1，2-二棕櫚?；?3-三甲基銨丙烷、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基銨丙烷、和二油?；?3-二甲基銨丙烷(DODAP)和甚至N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)。
糖脂優(yōu)選的是?；擒?，通過1個到3個脂肪酸酰化1個到2個糖類殘基形成。脂肪酸或者是飽和的或非飽和的直鏈或絡(luò)合支鏈脂肪酸。糖類能是單糖或雙糖，其包括2個共價連接的單糖。在特別優(yōu)選的實施方案中，糖脂包括海藻糖與具有1個或2個糖苷鍵連接的脂肪酸鏈，其包括14到90個碳原子，例如α，α′-海藻糖6，6′二山萮酸酯(TDB)或者α，α′-海藻糖6，6′-二霉菌酸酯(TDM)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體包括形成陽離子脂質(zhì)的雙層體，優(yōu)選地具有季銨頭部基團和兩條長的疏水烷基鏈。在特別優(yōu)選的實施方案中，頭部基團是二甲基銨和并且疏水鏈?zhǔn)鞘榛?、十八烷基、十八烯基鏈。本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)能單獨使用或以任何組合使用。而且，陽離子脂質(zhì)或其混合物能與任何中性的磷脂組合，例如磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰甘油(PG)或任何其它形成雙層體的天然或合成的靜電中性的脂質(zhì)。
通過使用膜方法在脂質(zhì)體膜摻入糖脂穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體。相反，通過混合預(yù)形成的DDA和TDB溶液不會獲得穩(wěn)定作用，DDA和TDB是前面描述的制劑(Woodard等1980，Dzata等1991，Holten-Andersen等2004)。糖脂必須穩(wěn)定地?fù)饺胫|(zhì)雙層體，疏水部分嵌在雙層體膜的疏水區(qū)域，并且它的極性頭部定向膜的親水表面。加入陽離子脂質(zhì)體的糖脂的摩爾比例根據(jù)糖脂的性質(zhì)以及在制劑中使用的潛在賦形劑。特別的糖脂的摩爾百分?jǐn)?shù)能從0.5到大約95摩爾％，優(yōu)選地從大約2.5到大約20摩爾％并且更優(yōu)選地從大約5到大約18摩爾％。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，季銨化合物/陽離子脂質(zhì)是DDA-B并且糖脂是TDB。脂質(zhì)體制備通過溶解稱量量的DDA-B和TDB于合適的有機溶劑中，以摩爾百分?jǐn)?shù)5摩爾％或10摩爾％或15摩爾％，以總脂質(zhì)濃度大約1mM、2mM、5mM或甚至10mM。溶劑被蒸發(fā)，在試管的內(nèi)部留下薄的脂質(zhì)膜。干的脂質(zhì)膜然后在沒有或低鹽濃度的藥學(xué)上可接受的緩沖液中水化。穩(wěn)定的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的制劑顯示對離子的存在敏感，特別是例如磷酸和硫酸等陰離子。優(yōu)選的有機緩沖液例如2-氨基-2-(羥基甲基)-1，3丙二醇(Trometamolum或簡單的Tris)或2-Bis(2-羥基甲基)氨基-2-(羥基甲基)-1，3丙二醇(Bis-Tris)，具有pH 6.0到8.0，并且更優(yōu)選地具有pH6.5到7.5，通過在MiIIiQ水中溶解Tris或Bis-Tris堿并且然后通過加入HCl調(diào)節(jié)pH制備。緩沖液不限于Tris或Bis-Tris，而是可以是任何藥學(xué)上可接受的緩沖液或甚至是沒有添加緩沖物質(zhì)的純水?；旌衔锉患訜岬街|(zhì)混合物相轉(zhuǎn)變溫度以上的溫度20分鐘，并且每5分鐘劇烈振蕩。所得的佐劑制劑包括MLV，其特征在于具有超過普通陽離子脂質(zhì)體的顯著改進的物理穩(wěn)定性。
例如蛋白質(zhì)或肽的抗原物質(zhì)被加入并且與佐劑制劑混合。最優(yōu)選的抗原物質(zhì)是通過吸引的靜電力或疏水相互作用與小囊泡結(jié)合。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，對抗結(jié)核的終疫苗通過混合TDB穩(wěn)定的包含DDA的脂質(zhì)體的佐劑制劑和融合蛋白Ag85B-ESAT-6的溶液制備。佐劑根據(jù)本發(fā)明制備，包括DDA 2.50mg/ml(4mM)和TDB 0.25mg/ml(0.25mM)，相應(yīng)于TDB的濃度大約5摩爾％，在具有pH 7.4的10mM tris緩沖液中。大約4.5ml的這樣的佐劑制劑與Ag85B-ESAT-6的0.5ml 1.0mg/ml Tris-緩沖液混合，以獲得在隨時可用的終疫苗中融合蛋白的100mg/ml的濃度。在另一個優(yōu)選的實施方案中，抗原物質(zhì)使用脫水-再水化方法封閉于小囊泡中，或替代地抗原使用冷凍和融解技術(shù)摻入。
圖1.此圖顯示在本發(fā)明中使用的一些陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
圖.2.在4℃儲存2個月后的10mM DDA制劑的數(shù)字圖像。(樣品02)包括16摩爾％TDB，(樣品03)包含12.5摩爾％TDB，(樣品04)包含6摩爾％TDB，(樣品05)包含2.5摩爾％TDB，(樣品06)包含0.5摩爾％TDB，以及參考樣品只包含DDA。從圖示明顯看出包含TDB的懸浮物更均一并且沒有沉淀。
圖.3.包括濃度增加的TDB(從上到下)的DDA-B的多層脂質(zhì)體的DSC熱解曲線，以30C/h的掃描速度獲得。脂質(zhì)體懸浮于pH 7.4的10mMTris緩沖液中。熱解曲線明顯的顯示TDB嵌入DDA脂質(zhì)體膜中。
圖.4.包括濃度增加的抗原Ag85B-ESAT-6(從上到下)的DDA-B和TDB的多層脂質(zhì)體的DSC熱解曲線，以30C/h的掃描速度獲得。脂質(zhì)體分散于pH7.4的10mM Tris緩沖液中。熱解曲線顯示脂質(zhì)體內(nèi)摻入抗原不改變相轉(zhuǎn)變溫度。
圖.5.DDA脂質(zhì)體平均粒度的時間發(fā)展，DDA脂質(zhì)體包括0摩爾％(-◆-)、6摩爾％(-▲-)、11摩爾％(-☆-)和20摩爾％(-■-)的TDB。脂質(zhì)體分散于pH7.4的10mM Tris緩沖液中。在14天后觀察到?jīng)]有TDB的DDA脂質(zhì)體的顯著增加。
圖.6.A.DDA脂質(zhì)體(-◆-)和包含11摩爾％通過水加熱的方法制備的TDB的DDA脂質(zhì)體(-▲-)、通過膜方法制備的11摩爾％TDB(-■-)的平均粒度的時間發(fā)展。脂質(zhì)體分散于調(diào)節(jié)在pH7.4的10mM Tris緩沖液中。在14天后觀察到通過水加熱方法制備的DDA脂質(zhì)體和DDA/TDB脂質(zhì)體的顯著增加。
圖.7.A.包含11摩爾％TDB(-■-)、10％(w/v)海藻糖(-●-)和10％(w/v)蔗糖(-X-)的DDA脂質(zhì)體的平均粒度的時間發(fā)展。脂質(zhì)體分散于調(diào)節(jié)在pH7.4的10mM Tris緩沖液中。包含海藻糖和蔗糖的DDA脂質(zhì)體聚集到一種程度，使不可能進一步在14天后通過PCS測量。
圖.7.B.10mM DDA制劑的數(shù)字圖像，分別包括10％(w/v)海藻糖和11摩爾％TDB，在4℃儲存14天后。在包含海藻糖的制劑中觀察到嚴(yán)重聚集。
圖.8.進行隨時可用的終疫苗的超速離心的Ag85B-ESAT-6的上清液和再懸浮沉淀物的SDS-PAGE分析以觀察抗原對陽離子脂質(zhì)體的吸附。
圖.9.來自血液淋巴細(xì)胞的IFN-γ的釋放，血液淋巴細(xì)胞從用Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB免疫的C57BI/6j小鼠分離，Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB如本發(fā)明實施例1中描述的制備或Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB按照Holten-Andersen等(2004)描述的制備。在第三次免疫后1周分離淋巴細(xì)胞，并且用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6刺激。
圖.10.來自血液淋巴 細(xì)胞的IFN-γ和IL-5的釋放，血液淋巴細(xì)胞從用2μg的Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB或500μg鋁中的Ag85B-ESAT-6免疫的C57BI/6j小鼠分離。在第三次免疫后1周分離淋巴細(xì)胞，并且在體外用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6刺激。
圖.11.A.來自脾細(xì)胞的IFN-γ的釋放，脾細(xì)胞從BALB/C小鼠分離，BALB/C小鼠用2μg的Ag85B-ESAT-6免疫，或者在250μg DDA/50μgTDB、100μg的Poly IC中，或者在250μg DDA/50μg TDB/100μg Poly IC中。在第三次免疫后3周分離脾細(xì)胞，并且在體外用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6再刺激。
圖.11.B.來自血液淋巴細(xì)胞的IFN-γ的釋放，血液淋巴細(xì)胞從BALB/C小鼠分離，BALB/C小鼠用2μg的Ag85B-ESAT-6免疫，在250μg DDA/50μg TDB、25μg的MDP中，或在250μg DDA/50μg TDB/25μgMDP中。在第三次免疫后3周分離脾細(xì)胞，并且在體外用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6再刺激。
圖.12.包含11摩爾％TDB(-●-)、1摩爾％乳糖基酰基鞘氨醇(lactocylceramide)(-*-)和11摩爾％α-半乳糖神經(jīng)酰胺(-X-)的DDA脂質(zhì)體s(-◆-)和DDA脂質(zhì)體的平均粒度的時間發(fā)展。脂質(zhì)體分散于調(diào)節(jié)在pH 7.4的10mM Tris緩沖液中。在14天后觀察到?jīng)]有糖脂的DDA脂質(zhì)體的顯著的增高。提示除TDB的其它糖脂能穩(wěn)定DDA。
具體實施例方式
實施例1包含濃度增加的TDB的DDA小囊泡的制備使用薄的脂質(zhì)膜的方法制備包含TDB的DDA小囊泡。二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA-B，Mw＝630.97)和D-(+)-海藻糖6，6′-二山萮酸酯(TDB，Mw＝987.5)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，Al)分別溶解在氯仿甲醇(9∶1)中到達10mg/ml的濃度。特定體積的每個單獨的化合物在玻璃試管中混合。使用N2溫和的蒸汽蒸發(fā)溶劑，并且在低壓下脂質(zhì)膜被干燥過夜以除去殘留量的溶劑。干燥的脂質(zhì)膜在Tris-緩沖液(10mM，pH＝7.4)中水化，到達表1中特定的濃度，并且放在70℃水浴上20分鐘，每5分鐘劇烈振蕩樣品。
表1根據(jù)本發(fā)明制備的佐劑制劑的范圍表
實施例2 TDB增加DDA制劑的長鏈穩(wěn)定性包括濃度增加的TDB的DDA-B小囊泡的制劑被儲存在4℃，并且在一天后和2個月后再次評價不同制劑的視覺現(xiàn)象(圖2和表2)。評價清楚地顯示TDB穩(wěn)定DDA小囊泡。沒有TDB的DDA在緩沖水溶液中的懸浮物在1天后沉淀，而在包含多于10摩爾％TDB的DDA的懸浮物中沒有沉淀形成。在具有低到6％的TDB濃度的懸浮物中，只有非常少量的沉淀形成，其能通過輕輕振蕩而輕易再懸浮。
表2不同佐劑制劑范圍的2個月的穩(wěn)定性的描述
為促進長期儲存，懸浮物在3000g離心30分鐘。包含多于2.5摩爾％TDB的DDA-B懸浮物只形成非常少量的沉淀，其能通過振蕩再懸浮。
實施例3 TDB摻入DDA小囊泡的脂質(zhì)雙層體中從合成的二烷基二甲基銨形成的脂質(zhì)雙層體在特征性的相轉(zhuǎn)變溫度Tm經(jīng)歷從膠到液體晶體的主要相轉(zhuǎn)變。相轉(zhuǎn)變包括二烷基鏈在小囊泡雙層體中的融化，并且鏈的組織改變，從高度構(gòu)象有序為特征的狀態(tài)到具有高度無序的狀態(tài)。大量的轉(zhuǎn)變焓與鏈的融化過程有關(guān)。這種在焓中的變化在熱容量曲線中作為峰值而檢測到，在轉(zhuǎn)變溫度Tm具有最大值。轉(zhuǎn)變溫度以及熱容量曲線的形狀依賴極性頭部基團的特征、抗衡離子、和二烷基鏈的長度。一般Tm的值隨鏈長度的減少和烷基鏈的不對稱性的增加而下降。第二個二烷基表面活性劑對正溫相行為的作用能對2種化合物間的相互作用提供有用的信息。
熱容量曲線通過使用VP-DSC差示掃描微量熱計(CalorimetrySciences Corp.，Provo)的具有0.34ml的孔體積的能量補償型號而獲得。0.34ml的樣品的3個連續(xù)的上位掃描(upscan)以30C/h進行。樣品在起始溫度平衡50分鐘。
顯示在圖3的包含DDA-B和TDB的2組分系統(tǒng)的DSC熱解曲線顯示增加TDB的摩爾濃度對脂質(zhì)膜熱力學(xué)的顯著影響。在DDA脂質(zhì)體的雙層體中的TDB的膜嵌入通過主要的相轉(zhuǎn)變溫度Tm的降低而顯示。純DDA-B脂質(zhì)體的從膠到液體的轉(zhuǎn)變，其特征在于在48℃的狹窄的界限分明的熱容量峰。增加TDB的濃度引起膠到液體相共存的加寬，其中膠和液體相同時都存在。
包含20摩爾％TDB的DDA-B脂質(zhì)體的相轉(zhuǎn)變溫度比純的DDA-B下降大約5℃。在DDA-B脂質(zhì)體膜中嵌入TDB具有引起相轉(zhuǎn)變峰分成2個的趨勢。這最可能由于在膠到液體的轉(zhuǎn)變過程中脂質(zhì)膜中少量組分相的分離。熱動力參數(shù)顯示在表3。
TDB的穩(wěn)定性作用最可能由于TDB的高度水化的海藻糖的頭部基團嵌入DDA-B脂質(zhì)體膜中，其防止小囊泡雙層的脫水和融合。
表3.包含濃度增加的TDB的DDA-B脂質(zhì)體的熱動力參數(shù)，通過使用差示掃描量熱法(DSC)以30℃/h的掃描速度獲得。脂質(zhì)體分散于pH7.4的10mM Tris緩沖液中并且總脂質(zhì)濃度是5mM。
為評價蛋白質(zhì)抗原的加入是否影響轉(zhuǎn)變態(tài)，包含DDA和TDB的脂質(zhì)體被加入濃度增加的分枝桿菌融合蛋白Ag85B-ESAT-6，并且通過差示掃描量熱計分析制劑。如在圖4中描述的，相轉(zhuǎn)變溫度不會由于蛋白質(zhì)的摻入而變化。
實施例4包含TDB的DDA脂質(zhì)體的粒度實施例4A通過TDB的摻入增強DDA-B的穩(wěn)定性包含濃度增加的TDB和通過膜方法制備的DDA-B的顆粒的穩(wěn)定性通過使用Malvern ZetaSizer 4(Malvern Instruments Ltd.UK)的動態(tài)光散射測量法測量。在第0天摻有0、6、11和20摩爾％的TDB的DDA-B顆粒的制劑被分散在pH7.4的10mM Tris緩沖液中。在制備后第0、14、28、42、56和105天進行測量(圖5)。在時間過程中粒度穩(wěn)定性的比較顯示TDB的摻入穩(wěn)定DDA-B顆粒并防止它們聚集。相反，只具有DDA的制劑在4℃儲存幾天后聚集并且在42天后由于聚集，沒有可能測量到更多的粒度。這些數(shù)據(jù)支持如圖2顯示的DDA和DDA/TDB制劑的視覺印象。
實施例4B DDA-B粒度的穩(wěn)定性通過摻入TDB提高而不是通過水加熱方法混合兩種組分或添加作為海藻糖的糖類部分TDB摻入DDA-B顆粒以穩(wěn)定它們的必要性通過使用MalvernZetaSizer4(Malvern Instruments Ltd.UK)的動態(tài)光散射測量法研究。通過膜方法制備的包含11摩爾％TDB的DDA-B顆粒的粒度與同11摩爾％TDB混合的DDA-B顆粒(由Holten-Andersen早先描述的水加熱方法)比較。兩種制劑都分散在pH7.4的10mM Tris緩沖液中。在制備后第0、14和28天進行測量(圖6)。在時間過程中粒度穩(wěn)定性的比較顯示，與混合兩種組分防止它們聚集相比，TDB的摻入穩(wěn)定DDA-B顆粒。
為了研究是否TDB的脂質(zhì)部分對穩(wěn)定DDA-B顆粒是必需的，通過膜方法制備的包含11摩爾％TDB的DDA-B顆粒的粒度分別與包含10％(w/v)蔗糖和海藻糖的DDA-B顆粒比較。所有的制劑被分散在pH7.4的10mM Tris緩沖液中。在制備后第0、14、和28天進行測量(圖7A)。在時間過程中粒度穩(wěn)定性的比較顯示TDB的脂質(zhì)部分對穩(wěn)定DDA-B脂質(zhì)體是必需。TDB，而不是海藻糖和蔗糖，防止DDA-TDB脂質(zhì)體聚集(圖.7B)。
實施例5包含TDB的DDA小囊泡吸附抗原進行隨時可用的終疫苗的超速離心的Ag85B-ESAT-6的上清液和再次懸浮沉淀物的SDS-PAGE分析以觀察抗原對陽離子脂質(zhì)體的吸附。通過摻入15摩爾％的糖脂TDB，包含佐劑的陽離子脂質(zhì)體包含穩(wěn)定的DDA。在終疫苗中Ag85B-ESAT-6(Mw 45KDa)的濃度是40、80、160和200mg/ml，并且DDA和TDB的濃度分別是10和0.6mM。疫苗被超速離心(100.000g)30分鐘，并且對上清液和再次懸浮于原體積Tris緩沖液中的沉淀物進行SDS-PAGE分析(圖.8)。包含Ag85B-ESAT-6 50mg/ml的參考樣品加載在第1泳道，以及分子量標(biāo)記加載在第2泳道。通過考馬斯染色觀察蛋白質(zhì)帶。加載上清液的泳道沒有觀察到可見的蛋白質(zhì)帶，而在加載再次懸浮的沉淀的泳道中觀察到在大約分子量45kDa的清楚的帶，提示所有或多數(shù)抗原吸附到陽離子脂質(zhì)體。
實施例6結(jié)合TDB的DDA促進對Ag85B-ESAT-6的有效免疫應(yīng)答通常認(rèn)為佐劑對誘導(dǎo)某些類型的免疫應(yīng)答具有一些選擇性。由于基于IFN-γ產(chǎn)生的Th1細(xì)胞因子的釋放的重要性已經(jīng)顯示在對抗TB中是關(guān)鍵的(Flynn等1993；Cooper等1993)，包含20摩爾％TDB的DDA-B脂質(zhì)體通過如本發(fā)明實施例1中描述的制備，并且用Ag85B-ESAT-6的Tris緩沖液混合為終疫苗。終疫苗中的濃度是250μg的DDA、100μgTDB和2μgAg85B-ESAT-6。為了比較，另一種疫苗被包括，其包括相同量的DDA和TDB，但是如先前描述的制備在DMSO中(Holten-Andersen等，2004)，即沒有用膜方法在脂質(zhì)體中摻入TDB。小鼠被免疫三次，在第三次免疫后一周研究血液細(xì)胞特別的免疫應(yīng)答(圖9)。與先前描述的方法比較，用通過膜方法制備的DDA/TDB免疫后觀察到非常更高的應(yīng)答，顯示與簡單的混合DDA/TDB相比通過膜方法制備的DDA/TDB增強佐劑的作用。
相似地，通過膜方法制備的DDA/TDB的免疫應(yīng)答與已經(jīng)被批準(zhǔn)的用于臨床的基于鋁的佐劑Alhydrogel相比。如圖10所示，用DDA/TDB免疫引起高水平的IFN-γ和低水平的IL-5，而Alhydrogel免疫的小鼠顯示相反的情況，很少的IFN-γ分泌和高水平的IL-5。
研究DDA/TDB產(chǎn)生體液應(yīng)答的能力，通過在初次免疫后5周監(jiān)測Ag85B-ESAT-6特異性IgG抗體的應(yīng)答。終疫苗中的濃度是250μg的DDA、100μg TDB和2μg Ag85B-ESAT-6。一組小鼠接受在Alhydrogel中的Ag85B-ESAT-6用于比較。如表5所示，高滴度的特異性IgG存在于用在DDA/TDB中的Ag85B-ESAT-6接種疫苗的小鼠的血清中。與用Ag85B-ESAT-6/Alhydrogel免疫后獲得的滴度相比，包含DDA/TDB的佐劑制劑誘導(dǎo)更高水平的特異性抗體。
表5來自Ag85B-ESAT-6免疫的小鼠的血清中的抗原-特異性抗體的中值滴度
a在第一次免疫后5周通過ELISA檢測的Ag85B-ESAT-6特異性IgG的水平實施例6A通過在DDA/TDB組合中加入第三種組分增強免疫應(yīng)答最近Toll樣受體(TLR)的配體被認(rèn)為是包括在新的佐劑制劑中的有吸引力的靶。為了研究在DDA/TDB制劑中摻入例如TLR配體的其它免疫刺激組分的作用，小鼠用在250μg DDA/50μg TDB中的2μgAg85B-ESAT-6以及選定的免疫調(diào)節(jié)因子免疫。這些包括加入預(yù)形成的已知是TLR3的配體的DDA-TDB脂質(zhì)體的100μg的Poly IC(Polyinosinic-polycytidylic acid，Sigma Aldrich)以及給予TLR2/TLR4活化的25μg的胞壁酰二肽(MDP)。在水化之前在DDA-TDB脂質(zhì)膜中包括MDP。
在末次免疫后3周，從每個小鼠純化脾細(xì)胞或血液細(xì)胞(如在附圖描述中提示的)，并且在體外用5μg/ml的Ag85B-ESAT-6再次刺激后測量IFN-γ釋放的水平。與或者只用DDA/TDB或只用第三種組分(Poly IC和TDM)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答比較，包括所有三種組分的制劑引起增強的免疫應(yīng)答，顯示DDA/TDB和免疫調(diào)節(jié)因子之間的協(xié)同作用(圖11a和b)。
實施例7 DDA-B顆粒的穩(wěn)定性通過摻入TDB以外的其它糖脂有效的增強舉例說明DDA-B顆粒能被TDB以外的其它糖脂穩(wěn)定，分別是11摩爾％β-D-乳糖基?；拾贝?β-LacCer)、11摩爾％β-半乳糖神經(jīng)酰胺(β-GalCer)和44w/w％G(M1)神經(jīng)節(jié)糖苷。制劑是通過膜方法制備并且在第0天分散在pH7.4的10mM Tris緩沖液中。粒度通過使用MalvernZetaSizer4(Malvern Instruments Ltd.UK)的動態(tài)光散射測量法測量。在制備后第0、14、28天進行測量(圖12)。在時間過程中對粒度穩(wěn)定性的比較顯示糖脂的摻入穩(wěn)定DDA。
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US5922350
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定在水制劑中的陽離子脂質(zhì)體的方法，其通過在脂質(zhì)體中摻入糖脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體的方法，其中所述陽離子脂質(zhì)是兩親季銨化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中所述兩親季銨化合物有一個或兩個脂肪鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中所述脂肪鏈各包括12-20個碳原子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中所述兩親季銨化合物是DDA-B、DDA-C、DDA-X、DODA-B、DODA-C、DODA-X、DOTAP、DODAP或DOTMA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中所述糖脂是?；奶擒眨溆?個或高到3個脂肪烴基鏈和1個或2個糖類殘基結(jié)合形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中所述糖脂是具有2個?；湹碾p糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-7所述的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中所述?；湴?5-90個碳原子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中所述糖脂是α，α′-海藻糖6，6′二山萮酸酯(TDB)或α，α′-海藻糖6，6′-二霉菌酸酯(TDM)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求的任何所述的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中具體的糖脂的摩爾百分?jǐn)?shù)是從0.5到大約95摩爾％，優(yōu)選地從大約2.5到大約20摩爾％，以及更優(yōu)選地從大約5到大約18摩爾％。
11.一種脂質(zhì)體產(chǎn)品，其經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的方法穩(wěn)定化處理。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其中一種抗原化合物封閉在所述脂質(zhì)體中。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其用于藥物遞送。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其用于作為佐劑。
15.一種疫苗佐劑，其包括根據(jù)權(quán)利要求11所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的一種佐劑，其用于對抗衣原體、瘧疾或結(jié)核的疫苗中。
17.一種對抗衣原體、瘧疾或結(jié)核的疫苗，其包括根據(jù)權(quán)利要求15所述的佐劑。
18.一種遞送系統(tǒng)，其包括根據(jù)權(quán)利要求11所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及物理學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體制劑。特別地，本發(fā)明涉及通過在脂質(zhì)體中摻入糖脂而立體穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體。穩(wěn)定的脂質(zhì)體能作為抗原成分的佐劑或作為藥物遞送系統(tǒng)。特別地，當(dāng)終產(chǎn)物是穩(wěn)定的時候，本發(fā)明涉及用于免疫接種的在水性介質(zhì)中具有佐劑的疫苗。
文檔編號A61K39/04GK1980638SQ200580022926
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月7日
發(fā)明者賈斯博·大衛(wèi)德森, 艾達·羅森克蘭達斯, 彼得·安德森 申請人:國立血清研究所