專利名稱：脂質(zhì)體中的膽堿酯酶抑制劑及其制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于在脂質(zhì)體中的膽堿酯酶抑制劑的藥物組合物，涉及這樣的組合物的制備，和涉及其治療應(yīng)用的可能性。
背景技術(shù)：
中樞膽堿酯酶抑制劑用于輕度和中等嚴(yán)重程度的阿爾茨海默病的藥物治療，以便部分地修復(fù)在這一綜合征情況下由于疾病而降低的腦中的膽堿能刺激傳導(dǎo)系統(tǒng)的功能。新的研究表明，許多膽堿酯酶抑制劑不僅通過(guò)不同的機(jī)制阻斷乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶，而且對(duì)于神經(jīng)元煙堿性乙酰膽堿受體產(chǎn)生直接的作用。這些其天然配體為乙酰膽堿的受體不僅存在于膽堿能神經(jīng)上，而且存在于5-羥色胺能和谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)中，并在那里控制每種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。
這種作用在相關(guān)試劑的非常不同濃度的情況下出現(xiàn)，在受體的各種不同的受體結(jié)合位點(diǎn)上發(fā)生，和能夠(部分地還取決于膽堿酯酶抑制劑本身的濃度和/或同時(shí)存在的乙酰膽堿濃度)導(dǎo)致阻斷或增強(qiáng)乙酰膽堿對(duì)受體的作用。
在這方面經(jīng)特別深入研究的加蘭他敏適合于擔(dān)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)型的角色，因?yàn)樵谝鹁哂兄委熥饔玫哪憠A酯酶抑制的濃度下，其為在有別于乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)上的變構(gòu)調(diào)節(jié)性配體(Samochocki等人，Acta Neurol Scand Suppl.2000；17668-73；Dalas-Bailador等人，Mol Pharmacol.2003；64(5)1217-26)。由此，額外增強(qiáng)了通過(guò)加蘭他敏的膽堿酯酶抑制而升高的乙酰膽堿濃度的作用。根據(jù)公開(kāi)，他克林(Tacrin)同樣也結(jié)合在受體的這一和另一結(jié)合位點(diǎn)上(Svensson和Nordberg，Neuroreport 1996；7(13)2201-5)。對(duì)于毒扁豆堿(Physostigmin)(Onkojo等人，Eur J Biochem 1991；200(3)671-7)和多奈哌齊也存在可比較的提示。對(duì)于加蘭他敏還報(bào)道了非膽堿能的抗凋亡作用(Arroyo等人，Rev Neurol.2002；34(11)1057-65)，以及還有例如相應(yīng)于神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的作用(Capsoni等人，Proc Natl Acad Sci USA，2002；99(19)12432-7)。
雖然進(jìn)行了關(guān)于治療具有其特異的膽堿能缺乏的阿爾茨海默癡呆和與之相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)變性的這些研究，但是其還對(duì)于外周神經(jīng)系統(tǒng)，特別是感覺(jué)神經(jīng)的變性和疼痛般的疾病具有重大意義。一方面，很久以來(lái)就已知，煙堿和其他對(duì)煙堿性受體具有激動(dòng)作用的物質(zhì)的抗傷害作用。另一方面，在早先的關(guān)于糖尿病性感覺(jué)神經(jīng)病變研究中，以及還有如在急性神經(jīng)損傷時(shí)，在相關(guān)皮膚區(qū)段中NGF的濃度劇烈減少。在此，NGF或者與之相應(yīng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性能夠修復(fù)感覺(jué)功能，所述的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性直接或者通過(guò)與NGF緊密相關(guān)聯(lián)的膽堿能系統(tǒng)而介導(dǎo)。但是，與此相關(guān)的研究的成就不大，可能是因?yàn)椴荒塬@得沒(méi)有全身性副作用的足夠高的局部NGF濃度(Anand，Prog Brain Res.2004；146477-92)。還已經(jīng)證明，煙堿性激動(dòng)劑在其與此相關(guān)的治療可用性方面受到副作用如高血壓和神經(jīng)肌肉麻痹的不利影響。在外周起作用的膽堿酯酶抑制劑基本上也是由于副作用問(wèn)題而被認(rèn)為不適合用于在人類中進(jìn)行止痛治療(Ghelardini等人，Presynaptic Auto-andHeteroreceptors in the Cholinergic Regulation of Pain.InTrends in Receptor Research，Elsevier Science Publishers B.V.，1992)。已知基于膏藥的膽堿酯酶抑制劑的經(jīng)皮制劑，其含有溶解或分散在皮膚滲透增強(qiáng)劑中的活性物質(zhì)。關(guān)于這些被動(dòng)經(jīng)皮系統(tǒng)的示例性實(shí)例，可提及如下對(duì)于毒扁豆堿的EP-0376067、EP-0377147、EP-0667774、EP-0599952和EP-0517840；對(duì)于利凡斯的明(Rivastigmin)的WO-9934782；對(duì)于加蘭他敏的EP-0680325；以及對(duì)于石杉?jí)A(Huperzin)的WO-0132115。Moriearty等人(Methods FindExp Clin Pharmacol 1993；15(6)407-12)描述了對(duì)于美曲膦酯或者作為膽堿酯酶抑制劑具有活性的其水解產(chǎn)物敵敵畏的這樣的系統(tǒng)，和對(duì)于庚基毒扁豆堿的這樣的系統(tǒng)。毒扁豆堿的另外兩種合成的衍生物，Thiacymserin和Thiatolserin，被它們的研制者明確描述為特別適合于經(jīng)皮應(yīng)用。
這些經(jīng)皮系統(tǒng)全部都計(jì)劃用于應(yīng)用，它們要求全身性施用各活性物質(zhì)。在這些情況下，根據(jù)這樣的要求來(lái)選擇經(jīng)皮途徑，即活性物質(zhì)緩慢而均勻地釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中和/或避免在經(jīng)口攝入時(shí)出現(xiàn)的在肝臟中的“首過(guò)效應(yīng)”-降解，從而在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持治療上最佳的血漿水平。在此，全身性的作用通過(guò)如此來(lái)達(dá)到，即活性物質(zhì)以被動(dòng)擴(kuò)散的方式穿過(guò)皮膚并被皮下毛細(xì)血管吸收入血流中。活性物質(zhì)還可以暫時(shí)沉積或結(jié)合在皮下脂肪組織中，以便從那里緩慢地洗入血液循環(huán)中。在皮膚本身中，活性物質(zhì)按照意圖只有少量的保留。因此，所述系統(tǒng)不適合于治療神經(jīng)病痛或者神經(jīng)變性引起的皮膚感覺(jué)功能的減退。
已知脂質(zhì)體是作為用于受控釋放藥物活性物質(zhì)的手段(例如參見(jiàn)Ulrich，Biosci Rep.2002；22(2)129-50中的綜述)，特別地還為在特殊的經(jīng)皮“膏藥”-系統(tǒng)中(例如公開(kāi)于WO-8701938和US-5718914)和在凝膠中(US-5064655)使用的手段。局部麻醉藥在局部施用的脂質(zhì)體中的制劑對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是已知的；例如US-4937078描述的脂質(zhì)體，其含有常用的鈉通道阻斷劑如丁卡因、利多卡因等。
雖然描述了用作鎮(zhèn)痛劑的膽堿酯酶抑制劑新斯的明(Neostigmin)的脂質(zhì)體制劑(Grant等人，Acta Anaesthesiol Scand。2002；46(1)90-4)，但是是鞘內(nèi)(即在結(jié)締組織中)給予的，從而所觀察到的麻醉作用是中樞神經(jīng)的麻醉。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的任務(wù)是發(fā)現(xiàn)一種給予具有對(duì)于神經(jīng)元煙堿性受體的已知作用和/或NGF-樣神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的膽堿酯酶抑制劑的方法，從而不僅可以最小化或避免膏藥應(yīng)用的已知缺點(diǎn)(例如要求盡可能平的表面用于涂覆膏藥；可能的皮膚刺激；膏藥中的活性物質(zhì)濃度必須非常高；滲透增強(qiáng)劑可能造成皮膚損傷)，而且可以最小化或避免侵入性施用方法和其他全身性使用方式的缺點(diǎn)，特別是與所需的高劑量相關(guān)的、不希望的全身性副作用。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供具有膽堿酯酶抑制劑的藥物組合物，其允許這些活性物質(zhì)的總體劑量低，但同時(shí)在皮膚神經(jīng)末梢范圍內(nèi)的局部劑量又足夠高，同時(shí)盡可能避免其全身化。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種組合物，其可以涂在身體的任何部位，特別是還可涂在不適合于膏藥應(yīng)用的“不平的”位置處，例如在糖尿病性神經(jīng)病變時(shí)的足部、三叉神經(jīng)痛時(shí)的臉部。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種組合物，其不在皮膚上引起浸漬現(xiàn)象，這在已經(jīng)先前受損的和/或脆弱的皮膚的情況下是特別重要的，例如在糖尿病患者中。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種組合物，其作為無(wú)菌產(chǎn)品制備，和由此可以例如在帶狀皰疹的情況下于小皰階段或者愈合期作為治療劑涂覆。
最后，本發(fā)明的目標(biāo)還在于提供一種組合物，其在皮膚中產(chǎn)生活性物質(zhì)貯存庫(kù)，從該貯存庫(kù)中連續(xù)地釋放出物質(zhì)，此外，由此與全身性應(yīng)用相比獲得更好的生物利用率和更長(zhǎng)的半壽期。
根據(jù)本發(fā)明，這些目標(biāo)通過(guò)提供用于局部給予膽堿酯酶抑制劑的脂質(zhì)體系統(tǒng)而達(dá)到。
令人驚奇地證實(shí)，通過(guò)將膽堿酯酶抑制劑包封入具有確定組成和大小的脂質(zhì)體中，并隨后將這些脂質(zhì)體配制入適合于經(jīng)皮給藥的蓋倫氏系統(tǒng)中，可以實(shí)現(xiàn)前述的目標(biāo)。在此，對(duì)于脂質(zhì)體的制備和用活性物質(zhì)加載，在WO-0236257中公開(kāi)的、可標(biāo)度化的用于活性物質(zhì)膠囊化的方法經(jīng)證明是特別有利的，因?yàn)槠渫瑫r(shí)在極為溫和的操作條件下具有高的有效性。但是，同樣也可以采用其他在現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于制備和加載脂質(zhì)體的方法。
發(fā)明詳述用活性物質(zhì)加載脂質(zhì)體可以劃分成兩種主要類別膜的加載和脂質(zhì)體內(nèi)水相的加載。由于加蘭他敏-堿溶于乙醇，所以首先嘗試了將活性物質(zhì)分子整合入脂質(zhì)體膜中，然而沒(méi)有成功。越多的加蘭他敏沒(méi)有包封入膜中，而是通過(guò)過(guò)濾而被除去，就會(huì)有越多的加蘭他敏仍由該膜再次釋放出來(lái)。結(jié)合在膜上的和未結(jié)合的加蘭他敏的份額大致是同樣多的。由于這一原因，隨后嘗試了用加蘭他敏加載脂質(zhì)體內(nèi)的水相。這一過(guò)程可以以兩種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)通過(guò)主動(dòng)和被動(dòng)的加載。從對(duì)于用在PBS溶液中的加蘭他敏-HBr/堿被動(dòng)加載脂質(zhì)體的試驗(yàn)中表明，因而不能制得穩(wěn)定的加蘭他敏-脂質(zhì)體-懸浮液。如已經(jīng)在先前的膜試驗(yàn)中的一樣，一旦未包封的活性物質(zhì)被從周圍介質(zhì)中去除，活性物質(zhì)就還會(huì)從含水環(huán)境中擴(kuò)散出來(lái)。
因此，要求更詳細(xì)一些地檢查活性物質(zhì)加蘭他敏。在此，發(fā)現(xiàn)加蘭他敏具有類似于阿霉素(Doxorubicin)的化學(xué)特性，并可以通過(guò)pH梯度控制的加載而包封在脂質(zhì)體中。對(duì)于這種類型的主動(dòng)加載，重要的特征是脂質(zhì)體膜/脂質(zhì)體介質(zhì)-分配系數(shù)。發(fā)現(xiàn)辛醇/緩沖液-分配系數(shù)為物質(zhì)的跨膜擴(kuò)散提供了很好的提示，因而與用活性物質(zhì)加載或者釋放特性有關(guān)。此外，活性物質(zhì)必須含有可質(zhì)子化的氨基，從而在低pH的情況下該活性物質(zhì)是親水的，且在中性或堿性pH情況下是親脂的。
基于該理論模型，在合適的加載緩沖液中，優(yōu)選在檸檬酸/碳酸鈉-緩沖液中制備具有不同脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體，優(yōu)選具有長(zhǎng)鏈的磷脂和低的膽固醇濃度。由于脂質(zhì)體在低pH的情況下制備，所以周圍的介質(zhì)被堿化，并由此產(chǎn)生pH梯度，在將加蘭他敏加入堿化的介質(zhì)之后，活性物質(zhì)借助于該pH梯度而遷移入脂質(zhì)體中，在那里質(zhì)子化，并穩(wěn)定地停留在脂質(zhì)體中。
在使用這一技術(shù)時(shí)，加載的規(guī)?；蛘哒f(shuō)加載容量首先取決于脂質(zhì)體內(nèi)部和外部pH值的比例。在所實(shí)施的試驗(yàn)中，用200-400nmol活性物質(zhì)/μmol脂質(zhì)的活性物質(zhì)/脂質(zhì)-比例能夠獲得類似的值，正如可從關(guān)于主動(dòng)加載的脂質(zhì)體的文獻(xiàn)中可獲知的。升高加載介質(zhì)中的活性物質(zhì)濃度不導(dǎo)致加載容量的增加。
前述的主動(dòng)加載是一個(gè)三步過(guò)程，其由小泡形成、添加活性物質(zhì)和堿化組成。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是建立一步制備方法，其可以通過(guò)使用在WO-0236257中公開(kāi)的叉流模塊(Kreuzstrom-modul)來(lái)實(shí)現(xiàn)。為此目的，將加蘭他敏溶解在檸檬酸溶液中，借助于叉流注射技術(shù)包封入脂質(zhì)體中，并隨后用稀釋緩沖液(檸檬酸/碳酸鈉pH9.0-9.5)直接將剩余的檸檬酸溶液堿化。
在下面的實(shí)施例中尤其指出了，加載了活性物質(zhì)的脂質(zhì)體的質(zhì)量?jī)H僅通過(guò)小泡膜中的膽固醇含量的變化，特別是降低，就已經(jīng)可以得到改善，主要是在其皮膚滲透性方面。此外，對(duì)于來(lái)自三步和一步方法的產(chǎn)品進(jìn)行的穩(wěn)定性測(cè)試表明，在所述這兩種產(chǎn)品的情況下，在超過(guò)六個(gè)月的儲(chǔ)存之后，產(chǎn)品穩(wěn)定性和質(zhì)量保持不變。
如果需要或希望，可以通過(guò)將大約150-200nm的平均脂質(zhì)體大小(如在此所述的實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)所采用的)增加至300-500nm來(lái)進(jìn)一步提高加載容量。另外，操作方法的效率，即每ml懸浮液中的包封在脂質(zhì)體中的活性物質(zhì)的量，還可以通過(guò)在制備小泡期間或者在隨后過(guò)濾小泡時(shí)增加脂質(zhì)濃度而更加進(jìn)一步地得到提高。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了用于制備脂質(zhì)體的裝置的示意性圖。
圖2顯示了在脂質(zhì)體中加蘭他敏包封試驗(yàn)的HPLC結(jié)果。暗色的柱為保留物中的加蘭他敏(即脂質(zhì)體加蘭他敏)，而亮色的柱為濾液中的加蘭他敏(未包封的加蘭他敏)，和空的柱為加蘭他敏的總含量。縱坐標(biāo)以μg/ml表示的加蘭他敏。
圖3顯示了在脂質(zhì)體中加蘭他敏包封試驗(yàn)的HPLC結(jié)果。暗色的柱為保留物中的加蘭他敏(即脂質(zhì)體加蘭他敏)，而亮色的柱為濾液中的加蘭他敏(未包封的加蘭他敏)，和空的柱為加蘭他敏的總含量。前三個(gè)柱陽(yáng)性加載了硬脂胺的脂質(zhì)體；后三個(gè)柱陰性加載了E-PG的脂質(zhì)體。3A加蘭他敏-HBr；3B加蘭他敏-堿。
圖4顯示了在脂質(zhì)體中加蘭他敏包封試驗(yàn)的HPLC結(jié)果。暗色的柱為保留物中的加蘭他敏(即脂質(zhì)體加蘭他敏)，而亮色的柱為濾液中的加蘭他敏(未包封的加蘭他敏)，和空的柱為加蘭他敏的總含量。
圖5顯示了在不同pH的水相的情況下主動(dòng)加載的加蘭他敏-脂質(zhì)體的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果?？v坐標(biāo)以nmol活性物質(zhì)/μmol脂質(zhì)表示的活性物質(zhì)濃度；橫坐標(biāo)從制備該制備物開(kāi)始計(jì)的以周表示的時(shí)間。
圖6顯示了依據(jù)溫度和加載持續(xù)時(shí)間用加蘭他敏加載預(yù)先成型的脂質(zhì)體的HPLC數(shù)據(jù)。以使用的加蘭他敏濃度的百分比給出。
圖7顯示了來(lái)自兩種制備試驗(yàn)的在加蘭他敏過(guò)量的情況下主動(dòng)加載的脂質(zhì)體的HPLC數(shù)據(jù)。暗色的柱為未包封的加蘭他敏的量，亮色的柱為包封在脂質(zhì)體中的加蘭他敏的量。三角形符號(hào)(附屬的值右邊縱坐標(biāo))之間的亮色的線指出了穩(wěn)定的脂質(zhì)/活性物質(zhì)-比例。
圖8顯示了脂質(zhì)體制備物的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，其中所述脂質(zhì)體在一步方法中用加蘭他敏主動(dòng)加載。縱坐標(biāo)以nmol活性物質(zhì)/μmol脂質(zhì)表示的活性物質(zhì)濃度；橫坐標(biāo)從制備該制備物開(kāi)始計(jì)的以周表示的時(shí)間。
圖9顯示了下列主動(dòng)加載的加蘭他敏-脂質(zhì)體的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)A)以三步方法制備的；B)以一步方法制備的。
圖10顯示了主動(dòng)加載的DMPC-脂質(zhì)體的加蘭他敏包封率和穩(wěn)定性。
圖11顯示了依賴于膽固醇含量的DPPC-脂質(zhì)體中的加蘭他敏吸收。
圖12顯示了根據(jù)硫酸銨梯度方法制得的加蘭他敏-脂質(zhì)體的穩(wěn)定性測(cè)試。F1、F2、F3用于標(biāo)明濾液試樣，R表示保留物。
圖13顯示了含有具有不同鏈長(zhǎng)(AC16，和BC14)的脂質(zhì)的加蘭他敏脂質(zhì)體在水凝膠制劑中的穩(wěn)定性。
圖14顯示了對(duì)于具有不同脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體加蘭他敏-制備物進(jìn)行的體外皮膚滲透研究的結(jié)果?？v坐標(biāo)在每個(gè)試樣中的絕對(duì)ng加蘭他敏；橫坐標(biāo)脂質(zhì)組成的變化。
圖15顯示了反復(fù)施用之后對(duì)于脂質(zhì)體加蘭他敏-制備物進(jìn)行的體外皮膚滲透研究的結(jié)果。
圖16顯示了依據(jù)試樣量和滲透持續(xù)時(shí)間的對(duì)于脂質(zhì)體加蘭他敏-制備物進(jìn)行的體外皮膚滲透研究的結(jié)果。
圖17顯示了依據(jù)水凝膠濃度的對(duì)于脂質(zhì)體加蘭他敏-制備物進(jìn)行的體外皮膚滲透研究的結(jié)果。
圖18顯示了對(duì)于微乳液形式的脂質(zhì)體加蘭他敏-制備物進(jìn)行的體外皮膚滲透研究的結(jié)果。
圖19顯示了與包封在脂質(zhì)體中的加蘭他敏相比較，對(duì)于基于游離存在的加蘭他敏的水凝膠制備物進(jìn)行的體外皮膚滲透研究的結(jié)果。
圖20顯示了對(duì)于懸浮液形式的或作為凝膠的脂質(zhì)體加蘭他敏-制備物進(jìn)行的體外皮膚滲透研究的結(jié)果。
圖21顯示了在不同的皮膚試樣中對(duì)于脂質(zhì)體加蘭他敏-制備物進(jìn)行的體外皮膚滲透研究的結(jié)果。
為了更好地進(jìn)行闡述，本發(fā)明將借助于下面的實(shí)施例作進(jìn)一步的解釋。試驗(yàn)的實(shí)施采用作為活性物質(zhì)的加蘭他敏，其為游離的堿的形式或者作為HBr-鹽。技術(shù)人員容易理解，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，加蘭他敏還可以以其對(duì)映異構(gòu)體和其所有藥學(xué)上可接受的鹽的形式使用。同樣地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括加蘭他敏的化學(xué)衍生物及其對(duì)映異構(gòu)體，例如在WO-9612692、WO-9740049和WO-0174820中所要求保護(hù)的分子，只要其為膽堿酯酶抑制劑和/或煙堿性受體調(diào)節(jié)劑和/或顯示出神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性的、NGF-類型的作用，其中脂質(zhì)體的組成和大小可以適應(yīng)于這些分子的物理化學(xué)特性。
在同樣的意義上，對(duì)于專業(yè)人員來(lái)說(shuō)明顯的是，除了加蘭他敏之外的其他物質(zhì)及其鹽和衍生物同樣也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要其為膽堿酯酶抑制劑和/或煙堿性受體調(diào)節(jié)劑和/或顯示出神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性的、NGF-類型的作用。屬于此的，除了所有在現(xiàn)有技術(shù)的引導(dǎo)性描述部分中所列舉的物質(zhì)之外，特別地還有在WO 02059074中所述的分子，同樣還有如在WO 0178728和WO 0198271中所述的多奈哌齊的衍生物，特別是還有其氟-衍生物ER-127528。
實(shí)施例1加蘭他敏-脂質(zhì)體的制備和穩(wěn)定性檢驗(yàn)為了制備小泡，使用合成的二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC，Genzyme，Schweiz)和膽固醇(Solvay，Niederlande)。一些實(shí)驗(yàn)使用雞蛋磷脂酰甘油(E-PG；Fa.Lipoid，Deutschland)或者用硬脂胺(Sigma，USA)來(lái)進(jìn)行，以便在脂質(zhì)體膜中引入陽(yáng)性或陰性加載。將加蘭他敏(Sanochemia AG，Austria)以游離的堿或者以HBr-鹽用于包封試驗(yàn)。使用PBS(磷酸緩沖鹽水)或者聯(lián)合碳酸鈉的檸檬酸作為緩沖溶液。
優(yōu)選地，借助于根據(jù)WO-0236257的無(wú)剪切力的叉流注射技術(shù)來(lái)制備脂質(zhì)體。該技術(shù)具有非常良好的可重復(fù)性，和允許任何活性物質(zhì)包封入脂質(zhì)體中。該可連續(xù)進(jìn)行的一步方法使得能夠通過(guò)改變操作條件，特別是脂相的注射壓力，來(lái)穩(wěn)定地制備具有指定的、可預(yù)先選擇的平均大小和大小分布的帶有脂雙層(“雙分子層”)的單層脂質(zhì)體。此外，其還可以在非常溫和的操作條件下施行，并使得能夠完全放棄使用可能有害的溶劑，以及特別是放棄使用剪切力來(lái)形成小泡。這一方法的其他優(yōu)點(diǎn)在WO-0236257中有詳細(xì)的描述。
此外，用此方法能夠以經(jīng)消毒的或無(wú)菌的形式提供所有的試劑和在無(wú)菌的條件下進(jìn)行脂質(zhì)體的制備和加載，從而最終產(chǎn)生以加載有活性物質(zhì)的脂質(zhì)體形式存在的經(jīng)消毒的或無(wú)菌的產(chǎn)品。
包封的加蘭他敏的檢測(cè)，在攪拌池(Amicon，USA)中進(jìn)行超濾和/或滲濾(Diafiltration)之后或者于在Sephadex G25柱(Pharmacia，Deutschland)上進(jìn)行凝膠過(guò)濾之后，借助于rp-HPLC(反相高效液相色譜)來(lái)進(jìn)行。內(nèi)部rp-HPLC技術(shù)使得能夠在唯一的工藝過(guò)程中定量測(cè)定膜成分膽固醇和活性物質(zhì)加蘭他敏。脂質(zhì)體的大小和分布借助于光子相關(guān)光譜法(PCS)來(lái)測(cè)定。
脂質(zhì)體制備脂質(zhì)體優(yōu)選借助于叉流技術(shù)來(lái)制備。如在圖1中所描繪的，用于脂質(zhì)體制備的裝置由叉流注射模塊1、用于極性相的容器(注射緩沖液2和稀釋緩沖液3)、用于乙醇/脂質(zhì)溶液的容器4和氮?dú)鈮嚎s機(jī)5構(gòu)成。叉流模塊中的注射口的直徑為大約250μm。優(yōu)選地，將脂質(zhì)混合物于25-60℃的溫度(根據(jù)脂質(zhì)選擇或脂質(zhì)組成)在攪拌下溶解在96％乙醇中，優(yōu)選地在DPPC-脂質(zhì)體的情況下，溫度為50-55℃。優(yōu)選地，也將緩沖溶液的溫度調(diào)節(jié)至同樣的溫度，優(yōu)選55℃。在借助于泵6，例如蠕動(dòng)泵，將極性相抽吸通過(guò)叉流模塊期間，同時(shí)將乙醇/脂質(zhì)溶液在可預(yù)先任意選擇的壓力下注射入極性相中。
變體方案I將DPPC、膽固醇和硬脂胺(摩爾比為7∶2∶1)與加蘭他敏一起溶解在96％乙醇中，并注射入PBS緩沖液中。在自發(fā)形成脂質(zhì)體之后，將其過(guò)濾，并且用rp-HPLC分析保留物以及濾液。如可從圖2中所見(jiàn)的，不能將加蘭他敏以這種方式穩(wěn)定地整合入脂質(zhì)體中。濾液(未包封的加蘭他敏)和保留物(包封在脂質(zhì)體中的加蘭他敏)顯示出相同的活性物質(zhì)濃度。
在圖2中柱1表示給出的加蘭他敏的總含量；柱2和3表示在第一次滲濾之后(柱2)和在又一次滲濾之后(柱3)濾液和保留物中的活性物質(zhì)分布。
變體方案II再次將脂質(zhì)溶解在乙醇中。對(duì)于用陰性加載的脂質(zhì)體所進(jìn)行的試驗(yàn)，用雞蛋磷脂酰甘油(E-PG)代替硬脂胺。將乙醇/脂質(zhì)溶液注射入PBS/加蘭他敏堿的溶液或者PBS/加蘭他敏-HBr溶液中。
如可從圖3A和3B中所見(jiàn)的，還根據(jù)該方法，將加蘭他敏并不令人滿意地包封入脂質(zhì)體中。在過(guò)濾之后，在濾液和保留物中發(fā)現(xiàn)了相同量的加蘭他敏。
在圖3A和3B中柱1和4表示各給出的加蘭他敏的總含量；柱2和3或者柱5和6表示在第一次滲濾之后(柱2和5)或者在又一次滲濾之后(柱3和6)濾液和保留物中的活性物質(zhì)分布。
變體方案III借助于pH梯度用加蘭他敏對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行外部加載。將脂質(zhì)(DPPC∶膽固醇的摩爾比＝55∶45)溶解在乙醇中，并將該溶液注射入300mM檸檬酸(pH 3.5-4.5)中。在自發(fā)形成小泡后，加入加蘭他敏-HBr，并用500mM碳酸鈉將該溶液堿化。以這種方式，在脂質(zhì)小泡(脂質(zhì)體)的內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間形成了pH梯度。低于2.5的pH值由于所出現(xiàn)的水解問(wèn)題而是較不適宜的，同樣地，大于5.5的pH值由于總是變得平緩的pH梯度而不是優(yōu)選的。
如可從圖4中所見(jiàn)的，在濾液中的加蘭他敏份額顯著少于在保留物中的，這證實(shí)大部分的加蘭他敏明顯沿著pH梯度遷移入脂質(zhì)體中，在那里質(zhì)子化，并滯留在脂質(zhì)體內(nèi)部的酸性介質(zhì)中。
在圖4中柱1表示給出的加蘭他敏的總含量；柱2和3表示在第一次滲濾之后(柱2)或者在又一次滲濾之后(柱3)濾液和保留物中的活性物質(zhì)分布。
將該產(chǎn)品分成多個(gè)等分試樣，并進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。在圖5中描繪了在9周的時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)品穩(wěn)定性，為了測(cè)定用加蘭他敏主動(dòng)加載脂質(zhì)體的動(dòng)力學(xué)，研究了加載過(guò)程的持續(xù)時(shí)間和確定了最佳加載溫度。如可從圖6中所見(jiàn)的，在足足15分鐘內(nèi)，全部加蘭他敏的量遷移入脂質(zhì)體中，并且不僅對(duì)于活性物質(zhì)的吸收，而且對(duì)于脂質(zhì)體內(nèi)的活性物質(zhì)的保留，室溫(18-22℃)范圍內(nèi)的溫育溫度是有利的。但是，對(duì)于22-40℃范圍內(nèi)的溫度而得到的差異要小，并且肯定不起重要作用。更高的溫育溫度的負(fù)面影響看起來(lái)首先在于影響加載的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，其中在60℃的溫度下，在3個(gè)小時(shí)的溫育之后，活性物質(zhì)的損失已經(jīng)達(dá)到大約20-25％(圖6)。
為了增加包封在脂質(zhì)體中的加蘭他敏的量，準(zhǔn)備每ml溶液具有8-10mg加蘭他敏的溶液。如可從圖7中所見(jiàn)的，過(guò)量的加蘭他敏(暗色的柱；左邊縱坐標(biāo))并不能改善活性物質(zhì)/脂質(zhì)這一比例，該比例在該試驗(yàn)中恒定地保持在大約200-300nmol加蘭他敏/μmol脂質(zhì)(三角形符號(hào)之間的亮色的線；右邊縱坐標(biāo))。因此，在通過(guò)pH梯度的主動(dòng)外部加載的情況下，有效加載量看起來(lái)首先取決于該梯度，而較少取決于給出的活性物質(zhì)濃度。
變體方案IV根據(jù)首先對(duì)于在前的結(jié)果的評(píng)價(jià)，建立了一步制備方法。將脂質(zhì)(DPPC∶膽固醇＝55∶45Mol％)溶解在乙醇中，并將該溶液注射入加蘭他敏-HBr/檸檬酸溶液(pH 3.5-4.5)中，隨后在緊接著自發(fā)形成小泡之后，加入碳酸鈉/檸檬酸-緩沖溶液(pH 9.0-9.5)以便稀釋和堿化反應(yīng)混合物，即所產(chǎn)生的脂質(zhì)體懸浮液。通過(guò)在緊接著形成小泡之后制備該pH梯度，加蘭他敏不僅在一個(gè)步驟中被吸收入脂質(zhì)體中，而且穩(wěn)定地滯留在那里。以這種方式吸收在脂質(zhì)體中的加蘭他敏的量(依賴于pH值或者pH梯度)在至少100nmol加蘭他敏/μmol脂質(zhì)的范圍內(nèi)，優(yōu)選在至少150-400nmol加蘭他敏/μmol脂質(zhì)的范圍內(nèi)，例如當(dāng)pH值為3.5時(shí)通常在250-350nmol加蘭他敏/μmol脂質(zhì)的范圍內(nèi)(圖8-11)。在6周的觀察時(shí)間內(nèi)完全保持了該產(chǎn)品的穩(wěn)定性(見(jiàn)圖8)。
實(shí)施例2以具有可變的脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體或微乳液形式的加蘭他敏制備物的制備和比較在該實(shí)施例中，使用合成的二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC，Genzyme，Schweiz)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DMPC，Genzyme，Schweiz)和膽固醇(Solvay，Niederlande)作為脂質(zhì)。將加蘭他敏(Sanochemia AG，Austria)以HBr-鹽用于脂質(zhì)體包封研究。使用檸檬酸/碳酸鈉作為緩沖溶液。
作為主動(dòng)加載的第二種可能性，采用硫酸胺梯度方法。使用硫酸胺溶液和葡萄糖溶液作為用于小泡制備的水相。在此，再次采用叉流技術(shù)。在借助于凝膠過(guò)濾除去未包封的加蘭他敏之后，用rp-HPLC測(cè)定活性物質(zhì)含量以及脂質(zhì)含量。脂質(zhì)體的大小和分布也還是借助于光子相關(guān)光譜法(PCS)來(lái)測(cè)定。
除了脂質(zhì)體之外，還通過(guò)在用多個(gè)熱循環(huán)進(jìn)行逐步加熱(加熱至80℃)的情況下劇烈混合來(lái)制備微乳液形式的制備物。使用肉豆蔻酸異丙酯(IPM)作為油相。Tween和Span 20用作乳化劑和共乳化劑。脂質(zhì)體設(shè)計(jì)和穩(wěn)定性與實(shí)施例1中一樣，進(jìn)行脂質(zhì)體的制備、加載和分析。接著進(jìn)行脂質(zhì)摩爾比為DPPC∶膽固醇＝55∶45的脂質(zhì)體樣品的穩(wěn)定性測(cè)試。結(jié)果顯示在圖9A和9B中。
圖9A顯示了第一個(gè)成功地根據(jù)主動(dòng)方法用加蘭他敏加載的脂質(zhì)體樣品的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在0.3mol檸檬酸(pH 3.5-4.5)存在下制備脂質(zhì)體。在小泡形成之后加入加蘭他敏，并同時(shí)將脂質(zhì)體外部溶液的pH值提高至7.5。由此產(chǎn)生的在脂質(zhì)體內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間的pH梯度導(dǎo)致，依賴于脂質(zhì)體內(nèi)部的H+離子濃度，加蘭他敏被吸收進(jìn)脂質(zhì)體中。
圖9B顯示了具有類似組成的脂質(zhì)體樣品的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，但其中小泡形成和加蘭他敏加載采用在一步方法中的叉流技術(shù)來(lái)進(jìn)行。數(shù)據(jù)明顯地顯示出，pH梯度，因而包封在脂質(zhì)體中的加蘭他敏的含量，在超過(guò)半年的時(shí)間內(nèi)保持恒定。
為了確定在膜柔韌性和與之相關(guān)的皮膚滲透特性方面最好的脂質(zhì)體制劑，準(zhǔn)備并測(cè)試具有不同脂質(zhì)組成的多種不同的脂質(zhì)體懸浮液。在此，首先使用磷脂，可選地與膽固醇組合。但是，用其他脂質(zhì)代替磷脂或者補(bǔ)充其他脂質(zhì)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如糖脂、腦苷脂、硫腦苷脂或半乳糖苷?？墒褂玫闹|(zhì)的典型代表為例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、鞘磷脂、縮醛磷脂、甘油糖脂、神經(jīng)酰胺、鞘糖脂、中性鞘糖脂。
一種改善對(duì)于經(jīng)皮施用來(lái)說(shuō)重要的膜流動(dòng)性的可能性在于減少脂質(zhì)體雙層膜的相轉(zhuǎn)變，其尤其由磷脂的?；湹拈L(zhǎng)度、膽固醇的量和磷脂的飽和度確定。出于這一原因，將DPPC，一種?；滈L(zhǎng)度為16個(gè)碳原子的磷脂，用DMPC(鏈長(zhǎng)為14個(gè)碳原子)替代，其將熔點(diǎn)TM從大約45℃降低至31℃。
圖10顯示這樣的脂質(zhì)體懸浮液的包封率，所述脂質(zhì)體懸浮液借助于3.5-7.5和4.0-7.5的pH梯度來(lái)制備。在獲得令人滿意的包封率(與在使用DPPC時(shí)的包封率相當(dāng))之后，獲取樣品并檢測(cè)其穩(wěn)定性(圖10)。
第二種降低膜剛性和增加流動(dòng)性的可能性在于減少膜中的膽固醇含量。從55∶45Mol％的DPPC∶膽固醇比例(如在文獻(xiàn)中對(duì)于脂質(zhì)體加載所描述的)開(kāi)始，將膽固醇的量連續(xù)地減少至38或30％，基于總脂質(zhì)含量。在圖11中，可以看到，與具有更高膽固醇含量的以前的數(shù)據(jù)相比，加蘭他敏加載具有輕微的減退。但是，這些脂質(zhì)體顯示出改善的皮膚滲透特性，如下文中還將進(jìn)行描述的。此外，圖11還顯示了加載的脂質(zhì)體在長(zhǎng)時(shí)間試驗(yàn)中保持穩(wěn)定并且沒(méi)有丟失加蘭他敏。
與從以前的工作中獲得的認(rèn)識(shí)相反，還可以穩(wěn)定地制備無(wú)膽固醇的脂質(zhì)體，并成功地用活性物質(zhì)進(jìn)行加載，從而根據(jù)本發(fā)明，膽固醇含量在0-50Mol％的范圍內(nèi)，基于總脂質(zhì)含量。
第三種使得脂質(zhì)體膜更柔韌的可能性在于用雞蛋磷脂酰膽堿(E-PC)，一種具有不飽和磷脂的天然脂質(zhì)混合物，來(lái)代替完全飽和的DPPC-或DMPC-脂質(zhì)。除了在使用這些天然脂質(zhì)時(shí)的穩(wěn)定性問(wèn)題之外，還需要在氮?dú)鈿夥障轮苽渲|(zhì)體。盡管如此，這些小泡既沒(méi)有顯示出在小泡大小和均一性方面的良好結(jié)果，也沒(méi)有顯示出皮膚滲透特性方面的改善，如在實(shí)施例3-10中所描述的。
除了用于產(chǎn)生pH梯度的檸檬酸/碳酸鈉技術(shù)之外，通常還可以采用硫酸胺梯度方法。使用該方法，在硫酸胺緩沖液(125mmol)存在下形成脂質(zhì)體。在小泡形成之后，借助于滲濾將脂質(zhì)體外部的硫酸胺溶液用5％葡萄糖溶液替代，由此可以將小的兩親性分子加載入脂質(zhì)體中并在那里質(zhì)子化，同時(shí)與此相反地，NH3從脂質(zhì)體中逸出。眾所周知，該過(guò)程是比檸檬酸/碳酸鈉方法更溫和的方法。
然而，在使用加蘭他敏作為用于加載脂質(zhì)體的活性物質(zhì)的情況下，這些試驗(yàn)無(wú)論如何都沒(méi)有給出令人滿意的結(jié)果。在圖12中的數(shù)據(jù)表明，加蘭他敏的包封失敗了，因?yàn)樵诒Ａ粑镏泻驮跒V液中能夠發(fā)現(xiàn)相同量的活性物質(zhì)。因此，對(duì)于將加蘭他敏包封入脂質(zhì)體中，優(yōu)選用于外部主動(dòng)加載的檸檬酸/碳酸鈉方法，但其中在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還可以使用可選擇的、技術(shù)人員已知的、在功能上等價(jià)的酸/堿-系統(tǒng)來(lái)形成所希望的pH梯度。因此，可以用其他合適的、制藥上允許的酸來(lái)代替檸檬酸，例如無(wú)機(jī)酸如磷酸，或者優(yōu)選有機(jī)酸，特別是選自可食用的有機(jī)酸的那些，如蘋(píng)果酸、富馬酸、酒酸，可選地還有抗壞血酸。同樣地，還可以用另一種堿來(lái)代替碳酸鈉，特別是另一種堿金屬或堿土金屬的碳酸鹽或者碳酸氫鹽。
在本文中，“在功能上等價(jià)的”涉及這樣的能力，即能夠越過(guò)脂質(zhì)雙層膜形成pH梯度并且在那里并不破壞膜的完整性，從而被包封的、特別是質(zhì)子化的活性物質(zhì)穩(wěn)定地(在此處公開(kāi)的穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)的意義上)滯留在脂質(zhì)體中。
加蘭他敏-脂質(zhì)體凝膠的制備和穩(wěn)定性檢測(cè)為了將脂質(zhì)體的加蘭他敏組合物用作待局部使用的治療劑，優(yōu)選地將脂質(zhì)體混合入水凝膠中，其比純懸浮液更易于涂覆在皮膚上。但是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還可以制備和局部使用對(duì)于加蘭他敏-脂質(zhì)體的其他蓋倫氏制劑，特別是溶液、洗液、乳液、酊劑、噴霧劑、軟膏、霜?jiǎng)┬问降闹苿?，或者可選地還有經(jīng)浸漬的紡織織物或者繃帶材料的形式的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員相信有其他的可能性，如用于制備各種不同的蓋倫氏制劑的、為此所需的、制藥上允許的伴生物質(zhì)和添加劑一樣。
在以前的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)驗(yàn)證了例如Carbopol 981NF，一種水凝膠，其可以在非常低的濃度下使用。其允許用于藥物應(yīng)用，能夠以相對(duì)便宜的價(jià)格買(mǎi)到，和有大量的可動(dòng)用。
制備下列脂質(zhì)體凝膠，以用于使用Franz-擴(kuò)散池的滲透研究DPPC∶膽固醇＝55∶45/pH3.5DPPC∶膽固醇＝62∶38/pH3.5DPPC∶膽固醇＝70∶30/pH3.5DMPC∶膽固醇＝55∶45/pH3.5E-PC∶膽固醇＝63∶38/pH3.5E-PC∶膽固醇＝70∶30/pH3.5。
為此目的，將小泡懸浮液通過(guò)超濾進(jìn)行濃縮，并隨后在攪拌下與預(yù)制的無(wú)菌凝膠基材混合。在這種方法中，可以通過(guò)超濾或者通過(guò)用小泡懸浮液稀釋至0.5％的Carbopol-濃度的凝膠基材的初始濃度來(lái)改變脂質(zhì)體的加蘭他敏濃度。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，就可能的活性物質(zhì)損失進(jìn)行測(cè)試，其可以是由于在蓋倫氏生成操作過(guò)程期間的膜損傷和/或長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存而引起的。為此目的，用緩沖液將凝膠稀釋并過(guò)濾。在膜受損的情況下，可以在濾液中檢測(cè)到更大量的釋放出的加蘭他敏。如可從圖13A和圖13B中所見(jiàn)的，既沒(méi)有在蓋倫氏配制過(guò)程期間，也沒(méi)有在隨后的19周4℃下的儲(chǔ)存期間釋放出顯著份額的活性物質(zhì)。在用Carbopol-水凝膠進(jìn)行蓋倫氏配制之后活性物質(zhì)仍然還保留在脂質(zhì)體中，并且其在皮膚測(cè)試中顯示出依然如故的滲透特性，這證明在凝膠基質(zhì)中，不僅脂質(zhì)體而且pH梯度保持完整。
為了就皮膚滲透特性方面進(jìn)行比較，還以同樣的類型和方式將游離的加蘭他敏與水凝膠混合并進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果呈現(xiàn)在實(shí)施例3-10中?？蛇x擇的方案除了脂質(zhì)體之外，對(duì)于確定的活性物質(zhì)的局部應(yīng)用，微乳液近來(lái)也引起了越來(lái)越大的對(duì)于它的注意力。微乳液是兩種互不相溶的組分的分散體，其通過(guò)第三種兩性的組分來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定。但是，由于存在表面活性物質(zhì)如乳化劑和共乳化劑，以類似的類型和方式如經(jīng)皮的膏藥，微乳液可能損傷皮膚。
根據(jù)在前的文獻(xiàn)研究，用制備了多種具有加蘭他敏作為活性物質(zhì)的微乳液(表1)，并隨后用Franz-擴(kuò)散池進(jìn)行滲透測(cè)試(結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例3-10)。
表1微乳液

ME＝微乳液；W/O＝油包水；O/W＝水包油在所有與此處所描述的試驗(yàn)中均表明，僅僅降低脂質(zhì)體膜中膽固醇的含量就因此改善了經(jīng)皮的滲透特性。制成的脂質(zhì)體懸浮液和脂質(zhì)體的凝膠制備物自從超過(guò)半年的時(shí)間以來(lái)一直是穩(wěn)定的，并且沒(méi)有顯示出產(chǎn)品特性的改變。
實(shí)施例3-10各種不同的基于脂質(zhì)的加蘭他敏制備物的皮膚滲透測(cè)試Franz-擴(kuò)散池?cái)U(kuò)散池來(lái)自PermGear，USA。該設(shè)備包括三個(gè)擴(kuò)散池，每一個(gè)裝配有位于攪拌器支架長(zhǎng)的充滿水的雙層夾套，并連接有水浴以便控制溫度。池本身具有各8ml的容積，表面積為0.78cm2的皮膚固定夾，和容積為2ml的給料室。
皮膚完整性測(cè)試對(duì)于在Franz-擴(kuò)散池中的測(cè)試，可以使用豬皮。為了保證完整的皮膚表面，在實(shí)驗(yàn)之前和之后測(cè)試每塊皮膚。在將皮膚固定在擴(kuò)散池的皮膚固定夾上之后，將2ml緩沖液涂覆在皮膚上，并將溫度調(diào)節(jié)至32℃±1。30分鐘后，測(cè)量電導(dǎo)率，其是皮膚電阻和皮膚質(zhì)量的量度。測(cè)量值取決于皮膚的來(lái)源、其厚度、所使用的緩沖系統(tǒng)和用于測(cè)量的設(shè)備。基于多個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，確定在涂覆樣品之前完整皮膚的電導(dǎo)率的閾值為≤1mS/cm2。不滿足該要求的皮膚樣品不允許進(jìn)行滲透實(shí)驗(yàn)。
滲透緩沖液在0.3M檸檬酸緩沖液(用1M碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 7.5)中制備根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體，在這之后，也將同樣的緩沖液用于所有的滲透試驗(yàn)。
滲透試驗(yàn)后的樣品處理在每個(gè)結(jié)束的實(shí)驗(yàn)之后，通過(guò)用緩沖液洗滌表面來(lái)去除過(guò)量的加蘭他敏樣品。之后，再次測(cè)量電導(dǎo)率，并將皮膚樣品從固定夾上取下。為了分離表皮和真皮，將皮膚樣品放在電熱板上，并于60℃加熱30秒。在這樣的熱處理之后，可以借助于鑷子容易地將表皮完全揭下。在這之后緊接著將各自相互分開(kāi)的表皮和真皮轉(zhuǎn)移入塑料小管中，并在-20℃下冷凍。為了提取加蘭他敏，在液氮存在下向冷凍的樣品中加入300μl緩沖液，并隨后在低溫研磨機(jī)中將深度凍結(jié)的樣品磨成粉末。將粉末立即轉(zhuǎn)移入離心管中，并在4℃下離心，接著將澄清的上清液轉(zhuǎn)移入干凈的小管中，并在-20℃下重新冷凍直至開(kāi)始進(jìn)行分析。加蘭他敏-上清液的定量為了測(cè)定少量的加蘭他敏，建立了經(jīng)修飾的、靈敏的并且快速的rp-HPLC方法HPLCAgilent 1100
柱Thermo Hypersil Keystone150×4.6mm，5μm，190A梯度線性梯度溶劑AH2O/0.1％TFA溶劑BACN/0.1％TFA檢測(cè)DAD，230nm定量范圍30-1000ng/ml注射體積100μl測(cè)試材料用多種不同的加蘭他敏制劑對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)試。改變給料體積和滲透設(shè)計(jì)，這些改變概括在結(jié)果中。
材料-脂質(zhì)體加蘭他敏懸浮液C16/3.5/(55/45)C14/3.5/(55/45)-脂質(zhì)體加蘭他敏凝膠C16/3.5/(55/45)C16/3.5/(62/38)C16/3.5/(70/30)C14/3.5/(55/45)E-PC/3.5/(62/38)E-PC/3.5/(70/30)-游離的加蘭他敏凝膠2-20mg/g凝膠-加蘭他敏-微乳液卵磷脂-ME(1mg/ml)水/油(W/O)-ME(1mg/ml)
油/水(O/W)-ME(1.6mg/ml)。
借助于叉流注射技術(shù)來(lái)制備不同的脂質(zhì)體加蘭他敏制劑。不僅在懸浮液中，而且在Carbopol(981NF)-凝膠基材中測(cè)試材料。通過(guò)使用不同的脂質(zhì)和不同的膽固醇含量(參見(jiàn)實(shí)施例1和2)來(lái)獲得脂質(zhì)體膜組成的變化。
以不同的樣品體積、單次和多次樣品給料來(lái)進(jìn)行下文中的滲透研究，其中以一定的時(shí)間間隔獲取用于加蘭他敏測(cè)定的樣品。在圖14和21中所描述的結(jié)果各基于一個(gè)一式三份的滲透研究。所述圖顯示了以“絕對(duì)ng加蘭他敏/分析的樣品”表示的結(jié)果。
結(jié)果分成從接受液體REZ(＝在接受容器中收集的、滲透過(guò)皮膚的液體)中測(cè)定的值，和從表皮(EP)和真皮(DER)中測(cè)定的值實(shí)施例3在實(shí)施例3中，將具有不同膽固醇含量的不同的DPPC(C16)-脂質(zhì)體的結(jié)果與DMPC(C14)-脂質(zhì)體和E-PC-脂質(zhì)體的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。一次涂覆50μl的樣品體積，并讓其滲透4個(gè)小時(shí)的時(shí)間。所有經(jīng)測(cè)試的制備物顯示出相當(dāng)?shù)陌獾募犹m他敏的量，并將這些制備物懸浮在0.5％Carbopol 981NF中。在該試驗(yàn)中最有效的制劑具有C16/70/30(?；滈L(zhǎng)度/Mol％磷脂/Mol％膽固醇)脂質(zhì)組成的樣品。在該凝膠中，脂質(zhì)體中的膽固醇濃度為30Mol％。其他兩種制備物具有顯著更高的膽固醇份額(38或45Mol％)，因而是明顯更為剛性的。從該試驗(yàn)中測(cè)定的數(shù)據(jù)證實(shí)了這一理論，即流動(dòng)性更強(qiáng)的脂質(zhì)體，也就是剛性較小的膜，能夠更有效地滲透(圖14)。
在圖14中1＝C16/55/45；2＝C16/62/38；3＝C16/70/30；4＝C14/55/45；5＝E-PC/62/38；6＝E-PC/70/30。
實(shí)施例4
在實(shí)施例4中，在皮膚上反復(fù)涂覆之后，研究了凝膠樣品的滲透特性。比較了兩種具有不同脂質(zhì)組成但膽固醇含量相同的不同的凝膠。樣品各以50μl涂覆3次，每次間隔4小時(shí)。過(guò)量的材料各在涂覆下一次樣品之前去除。
如可從圖(圖15)中所見(jiàn)的，雖然最后達(dá)到了加蘭他敏濃度的提高，但是似乎在三次涂覆材料的情況下不知怎么地妨礙或阻止了滲透進(jìn)表皮中。在此，可能涉及某一類型的飽和，其是由于所裝入的皮膚塊的小表面積以及高使用劑量而引起的。對(duì)于兩種樣品得到了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，從而不能明顯地看出來(lái)脂質(zhì)組成的影響(圖15)。
在圖15中(鏈長(zhǎng)/磷脂/膽固醇/總的樣品量)1＝C16/55/45/50μl；2＝C16/55/45/100μl；3＝C16/55/45/150μl；4＝C14/55/45/50μl；5＝C14/55/45/100μl；6＝C14/55/45/150μl。
實(shí)施例5在實(shí)施例5中，在一次涂覆之后相互比較有著具有高和低膽固醇含量的C16-脂質(zhì)體的凝膠。讓150μl和50μl的樣品體積滲透4或10小時(shí)。再次在使用具有低膽固醇含量的脂質(zhì)體時(shí)發(fā)現(xiàn)了最高的皮膚中的加蘭他敏量。在此，看起來(lái)也是低劑量是有利的。如果使用50μl，則在4和10小時(shí)后，在表皮中發(fā)現(xiàn)了高加蘭他敏量。這些結(jié)果證實(shí)了在實(shí)施例3和4中獲得的值，即在同時(shí)采用低的總施用量的情況下給予具有低膽固醇含量的脂質(zhì)體，可能是在預(yù)防或治療應(yīng)用中當(dāng)局部使用本發(fā)明的制備物時(shí)的一種有利的策略(圖16)。
在此，在圖16中(鏈長(zhǎng)/磷脂/膽固醇/樣品量/滲透持續(xù)時(shí)間)1＝C16/55/45/150μl/4h；2＝C16/70/30/150μl/4h；3＝C16/55/45/50μl/4h；4＝C16/70/30/50μl/4h；5＝C16/55/45/150μl/10h；6＝C16/70/30/150μl/10h；7＝C16/55/45/50μl/10h；8＝C16/70/30/50μl/10h。
實(shí)施例6在實(shí)施例6中，研究了與游離的、懸浮在凝膠中的加蘭他敏的三種不同濃度相關(guān)的凝膠濃度的影響。一次涂覆50μl每種制劑，開(kāi)進(jìn)行滲透實(shí)驗(yàn)4或10小時(shí)(圖17)。圖17中的前三個(gè)柱表示用1％Carbopol 981NF在4小時(shí)后的結(jié)果，緊接著的三個(gè)柱表示用0.5％Carbopol 981NF在10小時(shí)后的結(jié)果。4小時(shí)后的結(jié)果表明，游離的加蘭他敏相對(duì)較快地?cái)U(kuò)散入皮膚組織中。然而，如可從10h-值中看出的，在接受液體中也發(fā)現(xiàn)了高濃度的游離活性物質(zhì)，因而預(yù)期只有不大的貯存效果(圖17)。
實(shí)施例7在實(shí)施例7中，測(cè)試了不同的施用策略。從文獻(xiàn)中已知，作為載體系統(tǒng)的微乳液是用于給予小的兩親性分子的有利工具。為了檢查這一觀念，制備每ml各具有1mg加蘭他敏的微乳液(卵磷脂；油包水；水包油)(見(jiàn)實(shí)施例1和2)。
每一次涂覆50μl的樣品體積，并進(jìn)行滲透4h的時(shí)間。如可從圖(圖18)中看出的，絕對(duì)的皮膚中的加蘭他敏量比在使用具有脂質(zhì)體的水凝膠時(shí)的低。此外，活性物質(zhì)同樣地分布在真皮和接受液體中，從中可推斷出，當(dāng)在最好的情況下存在皮膚組織中的臨界(marginal)貯藏時(shí)發(fā)生了快速滲透(圖18)。這些結(jié)果與其他作者的結(jié)果一致，并表明與在使用經(jīng)皮的加蘭他敏膏藥時(shí)類似的滲透機(jī)制。
實(shí)施例8在實(shí)施例8中，比較了用在水凝膠和微乳液中的游離加蘭他敏獲得的結(jié)果與優(yōu)選的脂質(zhì)組成(具有低膽固醇含量的C16-磷脂)的結(jié)果。在所有的試驗(yàn)中，在類似的條件下研究了相當(dāng)?shù)募犹m他敏濃度。
如可從圖(圖19)中看出的，在使用具有游離的加蘭他敏的水凝膠制劑的情況下，在皮膚中發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)大的加蘭他敏量。用脂質(zhì)體制劑也獲得了可接受的值，而用微乳液獲得的較小。但是，如在前面的實(shí)施例中已經(jīng)解釋的，新的局部活性物質(zhì)制劑的目標(biāo)首先不是快速的皮膚滲透而是形成皮膚中的活性物質(zhì)貯存的能力，從該皮膚中可以延緩釋放活性物質(zhì)。這樣的貯存一方面可以減少使用的頻繁程度，另一方面可以引起更均勻的、受控的活性物質(zhì)的給予，這將會(huì)增強(qiáng)治療效果。如果活性物質(zhì)貯藏在上部的皮層中而不是更深的區(qū)域中，如在根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的情況下，則可以獲得這樣的效果。
在圖19中1＝脂質(zhì)體(C16/70/30)；2＝1.8mg在水凝膠中游離的加蘭他敏；3＝1.8mg在卵磷脂-微乳液中游離的加蘭他敏；4＝1.8mg在W/O-ME中游離的加蘭他敏；和5＝1.8mg在O/W-ME中游離的加蘭他敏。
實(shí)施例9在實(shí)施例9中，相互比較了在懸浮液中和在水凝膠中的脂質(zhì)體制劑。在至少24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)給予過(guò)量的1ml脂質(zhì)體懸浮液僅導(dǎo)致低的滲透效果(圖20)。因此，看來(lái)似乎證實(shí)了，合適的凝膠基質(zhì)不僅穩(wěn)定脂質(zhì)體和使得涂覆更適意和更舒適，而且使得脂質(zhì)體更接近皮膚，從而增強(qiáng)了滲透作用。
在圖20中(鏈長(zhǎng)/磷脂/膽固醇/樣品量/滲透持續(xù)時(shí)間/類型)1＝C16/55/45/1ml/24h/懸浮液；2＝C14/55/45/1ml/24h/懸浮液；3＝C16/55/45/100μl/8h/凝膠；4＝C14/55/45/100μl/8h/凝膠。
實(shí)施例10總的看來(lái)，借助于Franz-擴(kuò)散池的體外測(cè)試為用于對(duì)不同的脂質(zhì)體制劑進(jìn)行滲透研究的有利方法，即使當(dāng)確定的該方法的可用性的界限涉及天的時(shí)候，特別是在使用脂質(zhì)體凝膠制劑的情況下。從以前的在體內(nèi)使用不同脂質(zhì)體凝膠的經(jīng)驗(yàn)開(kāi)始，對(duì)于此處描述的體外滲透測(cè)試還期望，每種凝膠能夠完全滲透入皮膚中而沒(méi)有剩余的量滯留在皮膚表面上。但是，在使用Franz-擴(kuò)散池的實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有能夠以相同的效果給予凝膠。在所有的試驗(yàn)，顯著過(guò)量的樣品材料滯留在皮膚表面上。這一缺點(diǎn)可能不利地影響滲透效率。因此，期望體內(nèi)更多量的脂質(zhì)體加蘭他敏滲透入皮膚中。
但是，即使在此處描述的用各種不同的脂質(zhì)體制劑進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)之中，根據(jù)換算，畢竟還是有至多1.8×1016活性物質(zhì)分子/0.78cm2皮膚表面轉(zhuǎn)運(yùn)入了表皮中。
為了檢驗(yàn)具有皮區(qū)(Dermatom)的皮膚提取或者皮膚的預(yù)處理是否可能是造成所觀察到的施用問(wèn)題的原因，測(cè)試了不同的皮膚樣品(圖21)。然而，根據(jù)結(jié)果，確定沒(méi)有明確的影響。因此，推測(cè)皮膚本身并不顯著地對(duì)所獲得的結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。
在圖21中1＝未處理的皮膚；脂質(zhì)體70/30(磷脂/膽固醇)；2＝用乙醇洗凈的皮膚；脂質(zhì)體70/30；3＝用脂肪紗布(Fettgaze)處理的皮膚；脂質(zhì)體55/45；4＝用乙醇洗凈并用脂肪紗布處理的皮膚；脂質(zhì)體55/45。
不管怎樣，可以概括地說(shuō)，當(dāng)治療位點(diǎn)在皮膚組織(真皮)中時(shí)，甚至當(dāng)活性物質(zhì)只是每天兩次涂覆在皮膚上時(shí)，在親水性凝膠中的脂質(zhì)體加蘭他敏制劑是有利的劑型。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明地、溫和地、非侵入性地且非皮膚刺激性地使用包封在脂質(zhì)體中的活性物質(zhì)，能夠獲得顯著的在表皮中的貯存效應(yīng)，和活性物質(zhì)緩慢而均勻地釋放入位于其下的皮膚組織中。
縮寫(xiě)ACN 乙腈DAD 二極管陣列檢測(cè)器DER 真皮DMPC 二肉豆蔻?；字Ｄ憠ADPPC 二棕櫚?；字Ｄ憠AE-PC 來(lái)自雞蛋的天然磷脂酰膽堿E-PG 來(lái)自雞蛋的天然磷脂酰甘油EP表皮IPM 肉豆蔻酸異丙酯NGF 神經(jīng)生長(zhǎng)因子PBS 磷酸緩沖鹽水REZ 接受器皿(接受容器)rp-HPLC 反相高效液相色譜TFA 三氟乙酸
權(quán)利要求
1.基于包封在脂質(zhì)體中的活性物質(zhì)的藥物組合物，其用于局部的經(jīng)皮施用，其特征在于，所述脂質(zhì)體在其內(nèi)部具有酸性的含水環(huán)境，并在其中含有至少一種膽堿酯酶抑制劑，該膽堿酯酶抑制劑優(yōu)選選自多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏、毒扁豆堿、庚基毒扁豆堿、Phenserin、Tolserin、Cymserin、Thiatolserin、Thiacymserin、新斯的明、石杉?jí)A、他克林、美曲膦酯和敵敵畏，或者這些化合物中至少一種的對(duì)映異構(gòu)體或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于，脂質(zhì)體內(nèi)的含水環(huán)境的pH值在2.5-5.5的范圍內(nèi)，特別是在3.5-4.5的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其特征在于，脂質(zhì)體內(nèi)的含水環(huán)境含有有機(jī)酸，特別是檸檬酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，脂質(zhì)體外部的介質(zhì)具有中性或堿性的pH值，優(yōu)選7-8的pH值，特別是7.5的pH值。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體是單層的并具有脂雙層膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有酰基鏈長(zhǎng)為至少14個(gè)碳原子，優(yōu)選至少16個(gè)碳原子的磷脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體以總脂質(zhì)的0-50Mol％，優(yōu)選30-45Mol％的量含有膽固醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體的平均大小為150-500nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體以至少100nmol/μmol脂質(zhì)，特別是150-400nmol/μmol脂質(zhì)的濃度含有活性物質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，所述組合物以懸浮液、洗液、乳液、酊劑、噴霧劑、凝膠、霜?jiǎng)┗蜍浉嗟男问?，?yōu)選以無(wú)菌的形式存在。
11.制備基于包封在脂質(zhì)體中的活性物質(zhì)的藥物組合物的方法，其特征在于，通過(guò)將含有乙醇的脂相注射入酸性水相中而自發(fā)地形成在其內(nèi)部具有酸性的含水環(huán)境的脂質(zhì)體，接著中和或者堿化水相，從而在脂質(zhì)體內(nèi)部和外部之間形成pH梯度，并且其中活性物質(zhì)a)預(yù)置于酸性的水相中，并在自發(fā)脂質(zhì)體形成過(guò)程中被吸收入脂質(zhì)體中，或者b)直至小泡形成完成之后才添加到水相中，并沿著pH梯度而遷移入脂質(zhì)體中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于，在脂質(zhì)體形成完成之后立即實(shí)施中和或堿化。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于，在中和或堿化之前，水相的pH值為2.5-5.5，優(yōu)選3.5-4.5，并且在中和或堿化之后，水相的pH值為7-8，優(yōu)選7.5。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述酸性水相含有有機(jī)酸，特別是檸檬酸，并且通過(guò)用堿性緩沖液，特別是用碳酸鈉稀釋水相來(lái)進(jìn)行所述中和或堿化。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述脂相含有?；滈L(zhǎng)為至少14個(gè)碳原子，優(yōu)選至少16個(gè)碳原子的磷脂。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述脂相以總脂質(zhì)的0-50Mol％，優(yōu)選30-45Mol％的量含有膽固醇。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在水相中預(yù)置或者在脂質(zhì)體形成完成之后向水相中添加至少一種膽堿酯酶抑制劑作為活性物質(zhì)，該膽堿酯酶抑制劑優(yōu)選選自多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏、毒扁豆堿、庚基毒扁豆堿、Phenserin、Tolserin、Cymserin、Thiatolserin、Thiacymserin、新斯的明、石杉?jí)A、他克林、美曲膦酯和敵敵畏，或者這些化合物中至少一種的對(duì)映異構(gòu)體或衍生物。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，制備具有加載了活性物質(zhì)的脂質(zhì)體的藥物組合物，其為懸浮液、洗液、乳液、酊劑、噴霧劑、凝膠、霜?jiǎng)┗蜍浉嘈问?，?yōu)選為無(wú)菌的形式。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的藥物組合物作為局部施用至皮膚的藥物的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的藥物組合物用于制備具有在皮膚中的貯存作用的藥物的用途，該藥物用于預(yù)防和/或治療皮膚神經(jīng)病痛或神經(jīng)病引起的皮膚感覺(jué)功能的喪失。
21.至少一種膽堿酯酶抑制劑用于制備具有在皮膚中的貯存作用的、用于局部施用的藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預(yù)防和/或治療皮膚神經(jīng)病痛或神經(jīng)病引起的皮膚感覺(jué)功能的喪失，所述膽堿酯酶抑制劑優(yōu)選選自多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏、毒扁豆堿、庚基毒扁豆堿、Phenserin、Tolserin、Cymserin、Thiatolserin、Thiacymserin、新斯的明、石杉?jí)A、他克林、美曲膦酯和敵敵畏，或者這些化合物中至少一種的對(duì)映異構(gòu)體或衍生物。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)的用途，用于減少或避免不希望的全身性副作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于包封在脂質(zhì)體中的活性物質(zhì)的藥物組合物，其用于局部的經(jīng)皮施用，其中所述脂質(zhì)體在其內(nèi)部具有酸性的含水環(huán)境，并在其中含有至少一種膽堿酯酶抑制劑，該膽堿酯酶抑制劑優(yōu)選選自多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏、毒扁豆堿、庚基毒扁豆堿、Phenserin、Tolserin、Cymserin、Thiatolserin、Thiacymserin、新斯的明、石杉?jí)A、他克林、美曲膦酯和敵敵畏，或者這些化合物中至少一種的對(duì)映異構(gòu)體或衍生物。此外，本發(fā)明還涉及制備這種組合物的方法，這種組合物可選地為無(wú)菌的形式，以及涉及該載有活性物質(zhì)的脂質(zhì)體在多種蓋倫氏制劑中的用途，所述蓋倫氏制劑用于在表皮中具有貯存效果的局部的經(jīng)皮施用，用于預(yù)防和/或治療皮膚神經(jīng)病痛或神經(jīng)病引起的皮膚感覺(jué)功能的喪失。
文檔編號(hào)A61K9/127GK1946377SQ200580012561
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月22日
發(fā)明者A·博登泰克, J·伯克曼, W·弗朗特西茨, E·皮里克, A·韋格納, K·沃勞爾－烏爾 申請(qǐng)人:薩諾化學(xué)藥物股份公司