專利名稱：含視黃酸的糖尿病治療藥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種預防和/或治療糖尿病或其相關疾病的藥物，所述藥物含有視黃酸作為活性成分。更特別地，本發(fā)明涉及一種抗糖尿病藥，其不但控制血糖水平而且直接作用于胰臟的β細胞。
背景技術：
據說，目前在我國大約有6,000,000糖尿病患者，還有統(tǒng)計數(shù)據表明，特別是，十分之一的大于40歲的人患有糖尿病。糖尿病被定義為“一組具有胰島素功能缺乏導致的慢性高血糖的主要癥狀的代謝病”(日本糖尿病協(xié)會，關于糖尿病的分類和診斷標準的委員會報告，1999)。糖尿病主要分為兩種類型，I型糖尿病是由于一些原因分泌胰島素的胰臟的β細胞的破壞造成的胰島素的不足引起的，II型糖尿病是由于胰臟的胰島素分泌減少的狀態(tài)和胰島素作用不足的狀態(tài)(胰島素耐受性的狀態(tài))引起的。當持續(xù)高血糖狀態(tài)時，可以引起嚴重的疾病如視網膜病變、腎病和神經病變，它們被稱為糖尿病的三大并發(fā)癥，還有中風和心肌梗死。
在近年來，正在闡明高血糖的發(fā)病機理。除了主要采用口服藥(如磺酰脲類(SU)藥物和胰島素藥物制劑)的常規(guī)糖尿病治療外，基于新的功能機理，已經利用抑制肝臟中的葡萄糖再生或釋放或促進在骨骼肌或脂肪細胞中的葡萄糖的利用或貯藏的縮二胍(BG)藥、減少腸內的葡萄糖吸收的α-葡糖苷酶抑制劑、直接增強胰島素活性而并不促進胰島素的分泌的胰島素活性促進劑(胰島素耐受性改良劑)等(非專利文獻1)。作為直接作用于胰臟的β細胞的藥物NN-623、AY 4166等等，是除了已知的SU藥之外的新的胰島素分泌促進劑(非專利文獻1)。
這些口服藥對于保持胰島素分泌的患者是有效的，但是對于患有I型糖尿病的患者是無效的，I型糖尿病患者胰島素分泌不足而且抑制血糖水平的胰島素注射對于這樣的患者是必不可少的。甚至患有II型糖尿病的患者有時也需要胰島素注射通過食療和運動以及口服藥不能充分地控制血糖水平、嚴重的傳染病(如并發(fā)的嚴重的肺炎)、患者正在手術、并發(fā)的嚴重腎臟病或嚴重肝病或患者處于糖尿病昏迷。
非專利文獻1Ohta Masao，Journal of Nippon Medical School，1999，第66卷第3期，39-42頁。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的問題如上所述，普通的抗糖尿病藥主要旨在控制血糖水平，而經受β細胞破壞的I型糖尿病患者和經受胰島素分泌功能障礙的II型糖尿病患者目前除了依賴復雜的胰島素注射外沒有任何選擇。因此，需要通過直接作用于經受破壞或功能障礙的胰臟而從根本上治療糖尿病的醫(yī)用藥物。
解決問題的手段本發(fā)明人迄今為止獨立地研究視黃酸，并第一次發(fā)現(xiàn)視黃酸在體內給藥時恢復胰臟的功能。這個發(fā)現(xiàn)使本發(fā)明得以完成。
因此，本發(fā)明提供了一種治療和/或預防糖尿病的藥物，其含有視黃酸作為活性成分，借此解決了上述問題。
本發(fā)明的效果本發(fā)明的治療和/或預防糖尿病的藥物被認為是通過直接作用于胰臟來恢復胰臟(β細胞)的功能。因此，本發(fā)明的藥物不但對于控制患有胰島素耐受的II型糖尿病患者的血糖水平是有效的，而且對于遭受β細胞破壞的I型糖尿病患者也是有效的。
進一步地，由于該藥物通過作用于含有β細胞的胰臟可以維持血糖水平在合適的范圍內來改善胰島素分泌的功能，其對于預防和治療伴隨高血糖等疾病的各種并發(fā)癥也是有效的。


該圖表示了給予或沒有給予視黃酸的患糖尿病的大鼠的體重的變化。(A)給予視黃酸(6mg)的大鼠；(B)給予視黃酸-無機物質(CaCO3)復合粒子(6mg)的大鼠；(C)給予視黃酸-有機物質(PLGA)復合粒子(6mg)的大鼠；(D)對照大鼠(沒有給予視黃酸)。
照片表示了給予視黃酸-無機物質復合粒子(LA/CaCO3)(6mg)的患糖尿病的大鼠和對照大鼠(沒有給予LA)在100天時的外觀，[圖3]該圖表示了給予和沒有給予視黃酸的患糖尿病大鼠的(a)體重的變化，(b)血漿胰島素濃度的變化，以及(c)血糖濃度的變化。●給予視黃酸-有機物質(PLGA)復合粒子(6mg)的大鼠；■對照大鼠(沒有給予視黃酸)。
該圖表示了給予和沒有給予視黃酸的患糖尿病大鼠的血漿胰島素濃度的變化。RA給予視黃酸的大鼠；Ra-Ca給予視黃酸-無機物質(CaCO3)復合粒子的大鼠；RA-PLGA給予視黃酸-有機物質(PLGA)復合粒子的大鼠；對照沒有給予視黃酸的大鼠。括號中的值表示劑量。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的藥物的特征在于含有視黃酸作為活性成分。視黃酸是衍生自維生素A的脂溶性的小分子，而且已知全反式視黃酸和9-順式-視黃酸是主要的異構體。在本發(fā)明的藥物中，優(yōu)選使用下式(I)表示的全反式視黃酸。
視黃酸具有誘導未分化細胞分化的功能，且認為視黃酸在形態(tài)發(fā)生中表現(xiàn)出形態(tài)發(fā)生素樣功能。在誘導分化的這個功能的基礎上，視黃酸在臨床上用作急性早幼粒細胞性白血病(APL)的治療藥。此外，在再生治療藥的最近的調查研究中，提出了一種方法，在體外，用視黃酸處理非洲蟾蜍的初期原腸胚的胚孔的上唇部分，再培養(yǎng)誘導分化成胰臟(JP-A-2001-299335的公報)。
也就是說，通過控制高等生物的未分化細胞的分化，在胚胎發(fā)生期間視黃酸在體外使胰臟再生。然而，到目前為止所研究的是針對有可能分化成所有組織(器官)的全能胚胎干細胞。還沒有獲得關于視黃酸在體內對從整個器官衍生的體細胞的干細胞表現(xiàn)出什么功能的知識。本發(fā)明是以新知識為基礎，所述新知識是視黃酸在體內作用于胰臟從而能恢復β細胞的胰島素分泌功能并改善血糖水平控制功能。
用作本發(fā)明藥物的活性成分的視黃酸優(yōu)選上式(I)表示的全反式視黃酸。其異構體、衍生物如酯類、鹽類或前藥也是有用的。
在本發(fā)明的藥物中，可以加入視黃酸本身。也可以制備合適的有機或無機物質與視黃酸的復合粒子，而且將所述視黃酸復合粒子作為活性成分加入。
視黃酸復合粒子的實例包括用無機物質(諸如鈣或鋅的碳酸鹽或磷酸鹽)和有機物質(諸如生物降解聚合物)進行表面修飾的視黃酸粒子、用這種物質整合起來的固體粒子等等。這些視黃酸復合粒子可以是視黃酸表面的全部或部分用無機或有機物質包衣的形式，或者是視黃酸分散于無機或有機物質構成的固體粒子中的形式。然而，這些形式不是關鍵。通過粒子所含的活性物質視黃酸的皮下注射和安全地控制釋放，這樣的復合粒子的用途是減輕視黃酸自身的刺激，甚至降低腫瘤形成的危險。
例如，視黃酸-無機物質復合粒子可以采用視黃酸的兩性分子的性質來制備。特別地，例如，選用碳酸鈣作為無機物質。首先，把視黃酸分散在含少量極性有機溶劑的堿性的水介質中形成球狀的微團(spherical micell)，其表面被負電荷覆蓋。此時，加入非離子表面活性劑形成視黃酸和非離子表面活性劑的混合的微團，由此可以阻止微團的聚集和沉淀。進一步地，加入氯化鈣吸收微團的負電荷表面上的鈣離子(Ca2+)形成球形或橢圓形的微團，其表面被鈣離子包被。此外，加入碳酸鈉吸收(結合)微團表面的鈣離子上的無機酸根離子如碳酸根離子(CO32-)，從而中和微團表面的電荷。因此，在視黃酸粒子的表面上形成碳酸鈣的膜，獲得了用無機物質修飾表面的視黃酸復合粒子。
分散視黃酸所用的極性溶劑的實例包括乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二甲亞砜等。在經皮給藥中，具有較少刺激的乙醇或甲醇是優(yōu)選的。
作為無機物質使用的是多價金屬尤其是二價金屬(如鈣、鎂和鋅)的無機酸鹽(如碳酸鹽和磷酸鹽)。有生物相容性的多價金屬無機酸鹽是優(yōu)選的。
多價金屬以氯化物、醋酸鹽、鹵化物等形式加入，例如氯化鈣、氯化鎂和醋酸鋅。無機酸以堿金屬鹽的形式加入，例如碳酸鈉和磷酸鈉。
上述制備方法中所用的非離子表面活性劑的實例包括聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯(8)辛基苯基醚(octylphenyl ether)、聚氧乙烯(20)膽甾醇酯、聚氧乙烯(30)膽甾醇酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油等等。作為商購的產品，可以提及的是吐溫80和類似物。
當加入的多價金屬(氯化物等)和無機酸(鈉鹽等)重量比是1∶0.05-1∶0.33，優(yōu)選1∶約0.2時，可以獲得具有約5-1,000nm粒徑的視黃酸-無機物質復合粒子的透明的水懸浮液。
而且，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在視黃酸微團的表面形成多價金屬無機鹽的膜的過程中，加入的多價金屬鹽(如氯化鈣)和無機酸(如碳酸或磷酸)的堿金屬鹽的摩爾比調節(jié)為約1∶0-1∶1.0的范圍，借此可以制得具有約5-300nm的平均粒徑的復合粒子(毫微粒)。當視黃酸皮下或靜脈內給藥或通過皮膚給藥經皮吸收(包衣給藥等)時，具有這樣毫微米級小粒徑的復合粒子是特別優(yōu)選的。
上述方法中在微團表面形成的多價金屬無機酸鹽(如碳酸鈣)具有無定形，就是所謂的玻璃體形式或半穩(wěn)定相六方碳鈣石(vaterite)結構。因此，薄膜在水中的溶解度高，改善生物降解性使容易分解。從而，已經確認，當將得到的視黃酸-碳酸鈣復合粒子向活體給藥時，微團表面的碳酸鈣膜層容易分解釋放出其中包含的視黃酸，產生結果是以受控制的方式展現(xiàn)藥效。
在實踐中，當將視黃酸-碳酸鈣復合粒子的含水懸浮液皮下注射進大鼠時，或復合粒子連同凡士林基質一起涂在皮膚表面時，與單獨使用視黃酸的情況相比，表現(xiàn)出了非常好的吸收率而且沒有引起給藥位點的腫瘤發(fā)生。
同時，有機物質和視黃酸的復合粒子可以通過使用生物可降解聚合物(如乳酸/羥乙酸共聚物(PLGA)或聚乳酸(PGA))的一般粒子形成方法(液中干燥法)制備。特別地，通過以下步驟制備粒子，把視黃酸分散在生物可降解聚合物多價金屬鹽的鹵代烴溶液中，再把所得的分散液分散于聚乙烯醇水溶液等中，揮發(fā)鹵代烴形成粒子并用蒸餾水等洗滌得到的粒子。
作為生物可降解聚合物使用的乳酸/羥乙酸共聚物，可以采用D-異構體、L-異構體或它們的混合物，外消旋化合物是優(yōu)選采用的。乳酸/羥乙酸共聚物的共聚比(乳酸/羥乙酸；mol％)優(yōu)選為95/5至45/55。更優(yōu)選的是90/10至45/55。其重均分子量優(yōu)選是約3,000-20,000，更優(yōu)選是3,000至15,000。乳酸/羥乙酸共聚物的分散度(重均分子量/數(shù)均分子量)是1.2-4.0，優(yōu)選是約1.2-2.5。這些共聚物由本身已知的方法合成。當然，由非催化脫水縮合方法制得的共聚物是優(yōu)選的。
在本發(fā)明中，在共聚比和重均分子量上不相同的兩個或多個乳酸/羥乙酸共聚物可以以任選比例混合使用。例如，使用具有50/50的共聚比和約6,000的重均分子量的共聚物和具有50/50的共聚比和約3,000的重均分子量的共聚物的混合物?；旌蠒r大約的重量比是75/25至25/75。在本說明書中的重均分子量和數(shù)均分子量指得是根據使用聚苯乙烯作為標準品的凝膠滲透色譜法測量的值。
在上述制備方法中，對連同生物可降解聚合物一起使用的多價金屬鹽或氧化物沒有特別限制，只要金屬鹽或氧化物對活體沒有副作用。使用堿土金屬(鈣、鎂等)、鋅、鐵、銅、錫、鋁等與無機酸或有機酸的鹽，或這些金屬的氧化物。金屬優(yōu)選是堿土金屬、鋅、鐵和鋁，鋅和鈣是特別優(yōu)選的。無機酸的實例包括鹽酸、硫酸、硝酸、硫氰酸等。作為有機酸，可使用脂肪族的羧酸和芳香族的羧酸。
作為溶劑的鹵代烴，優(yōu)選使用有1或2個碳原子的氯代飽和烴和有1或2個碳原子的氟代飽和烴。其具體的實例包括氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、1，1-二氯乙烷、單氟甲烷、二氟甲烷等?；谏锟山到獾木酆衔?、多價金屬鹽或氧化物和鹵代烴的總量計，溶液含有生物可降解的聚合物和多價金屬鹽或氧化物的量優(yōu)選分別為10-90％重量和0.01-3％重量，更優(yōu)選為30-80％重量和0.01-2％重量。
在上述的液中干燥法中，與水混溶的另一種有機溶劑(如具有1-3個羥基的脂肪族的有機化合物)可以用于代替聚乙烯醇。這樣的化合物的實例包括甘油、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、異丙醇、苯甲醇等。
本發(fā)明的藥物通常以視黃酸或者視黃酸與無機或有機物質的視黃酸復合粒子和藥理學可接受的載體相混合得到的組合物的形式提供。作為在此涉及的藥理學可按受的載體，可以使用在藥物制劑領域常規(guī)使用的各種有機或無機載體物質。
當制備液體藥物制劑(如注射液)時，將視黃酸或視黃酸復合粒子分散或溶解于介質中，如注射用水、生理鹽水溶液、林格溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄欖油或棉籽油。特別地，將視黃酸分散于水性介質中獲得含水的懸浮液是優(yōu)選的。液體藥物制劑除了上述介質，可以包含另外的組分如增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩沖劑、防腐劑和抗氧化劑。
本發(fā)明的藥物可以由以上液體藥物制劑凍干獲得的藥物制劑或固化活性成分得到固體藥物制劑的形式提供。使用時可以將其分散或溶解于合適的溶劑中形成注射液。在固體藥物制劑的情況下，可以摻入另外的組分如賦形劑、粘合劑或崩解劑。
本發(fā)明藥物的劑型適用于液體藥物制劑如注射液。然而，胃腸外藥物如外用制劑(軟膏劑等)、栓劑、丸劑、經鼻的藥物和吸入或口服藥物(如膠囊)也是可利用的。
本發(fā)明如此制備的藥物是對預防和/或治療糖尿病(包括I型糖尿病和II型糖尿病)有效的，而且對預防和/或治療伴隨高血糖的各種疾病也是有效的。
本發(fā)明藥物的劑量隨給藥的患者、給藥的途徑、疾病的癥狀等而變化。例如，當藥物口服給予成人糖尿病患者時，在一次給藥中作為活性成分的視黃酸的劑量是約0.01-100mg/kg，優(yōu)選0.05-30mg，更優(yōu)選0.1-10mg每千克體重，優(yōu)選以這個劑量給予該藥物每日一至三次。
本發(fā)明藥物的特征在于直接作用于胰臟的β細胞改善糖尿病和使血糖水平回到正常水平，而且由普通血糖控制藥引起的高血糖癥狀發(fā)作的風險被認為是降低了。因此，其可以和用于控制血糖水平的常規(guī)藥物聯(lián)合使用，如胰島素藥物制劑，胰島素耐受性改良劑、a-葡糖苷酶抑制藥、縮二胍藥物或胰島素分泌促進劑(SU藥)。
具體實施例方式
實施例1視黃酸藥物制劑的制備作為視黃酸，按其原樣使用商購的視黃酸(固體粒子)。
(1)視黃酸-無機物質復合粒子的制備將13.6mg的視黃酸溶解于900μL乙醇(或甲醇)中，向該溶液中加入100μL的0.5N的NaOH水溶液。此時，pH值是7-7.5。作為母液，收集100μL該溶液，將其加入100μL含吐溫80(商品名)的蒸餾水，并充分攪拌混合物。大約30分鐘后，加入含5M的氯化鈣的水溶液，攪拌混合物。30分鐘后，加入含1M的碳酸鈉的水溶液，進一步攪拌混合物。連續(xù)攪拌24小時后，所得的溶液冷凍干燥過夜制得所需的視黃酸-碳酸鈣復合粒子。
(2)視黃酸-有機物質復合粒子的制備將PLGA(7.16g)、ZnO(40mg)和視黃酸(800mg)倒入二氯甲烷，用渦流混合器均勻地分散。隨后，得到的溶液傾注進管形瓶，瓶中含有已溶解了16g的聚乙烯醇(分子量45,000)和11.2g的醋酸鋅的蒸餾水(1,600mL)，攪拌混合物約3小時，蒸發(fā)掉二氯甲烷。蒸發(fā)掉二氯甲烷形成的粒子用離心分離器從蒸餾水中分離。作為沉淀分離的粒子用蒸餾水洗幾次，再進行采用125μm篩的濕法過濾使粒徑均勻。最后，用冷凍干燥器干燥粒子約24小時。
以上制備的視黃酸和無機或有機物質的視黃酸復合粒子，以預定的濃度(3-12mg/mL)分散于生理鹽水中，制得注射液。
實施例2通過配備18-21號針頭的注射器，把實施例1中制得的注射液(含6mg的視黃酸)以1mL的劑量皮下注射入每只患糖尿病大鼠的背部。當使用18號針頭時，注射后將注射點用手術用Aron Alpha(商品名)封閉，防止藥液泄漏。
隨后，觀測每只大鼠體重的變化，結果如圖1所示。從圖1中看出，沒有給予視黃酸的對照大鼠(D)體重逐漸減少。同時，在給予視黃酸的大鼠(A)至(C)中，在初期觀察到體重的減少，但是之后觀察到體重增加的趨勢。特別地，給予視黃酸-有機物質復合粒子的藥物制劑的大鼠(C)，其體重在很短的時間周期內減少了，從那以后增加了。
展示在開始測量后100天的視黃酸(無機物質復合粒子)給藥大鼠和對照大鼠(沒有給予視黃酸)的外觀的照片如圖2所示。已經發(fā)現(xiàn)，對照大鼠因為體重的減少變瘦，而給予視黃酸的大鼠通過抑制體重的減少而得以恢復。
當視黃酸的劑量從3mg到12mg變化時，觀察到相同的趨勢。
實施例3
給予視黃酸-有機物質(PLGA)復合粒子(6mg)的糖尿病大鼠和對照的糖尿病大鼠(沒有給予視黃酸)直到約40天時的體重變化如圖3(a)所示，在相同階段的大鼠的血漿胰島素濃度的變化和血糖濃度的變化如圖3(b)和3(c)所示。在圖中，●表示給予視黃酸-有機物質(PLGA)復合粒子(6mg)的大鼠，■表示對照大鼠(沒有給予視黃酸)。
在沒有給予視黃酸的對照大鼠中，觀察到一個趨向，血漿胰島素濃度無變化或逐漸降低，而在給予視黃酸-有機物質復合粒子(LA/PLGA)的大鼠中，血漿胰島素濃度大約在15天最低，然后增加(圖.3(b))。
進一步地，圖3(c)顯示了血糖濃度的改變，因為數(shù)據是在大鼠沒有被禁食的情況下測量的，所以數(shù)據很沒有規(guī)律。同時，圖3(c)與圖3(a)和圖3(b)相比較時，觀察到一個趨向，血糖濃度(血糖水平)根據血漿中胰島素濃度的變化而增加或降低?？梢哉f，這些結果證明了圖1所示體重的變化是取決于糖尿病(對照大鼠)的發(fā)展和糖尿病的恢復(給藥的大鼠)。
視黃酸沒有直接刺激胰島素分泌的功能。因此認為通過給予視黃酸改善了胰島素的分泌活性，恢復了胰臟β細胞的功能，同時抑制了血糖濃度而減輕了糖尿病癥狀。
實施例4圖4顯示了比較在給予視黃酸之前或之后的不同情況下血漿胰島素濃度變化的結果。通過比較給藥之前的值和給藥后42天的值，發(fā)現(xiàn)與給藥前的胰島素水平相比，在任何情況下，未給予視黃酸的對照大鼠中的胰島素濃度保持不變，而在給予視黃酸的大鼠中的胰島素水平增加了。還在給藥后的141天發(fā)現(xiàn)，與對照大鼠相比，給藥大鼠的胰島素水平趨向于高值。
權利要求
1.一種治療或預防糖尿病的藥物，所述藥物中含有視黃酸作為活性成分。
2.如權利要求1所述的藥物，其中視黃酸是下式(I)表示的全反式視黃酸。
3.如權利要求1所述的藥物，其是視黃酸的水性懸浮液的形式。
4.如權利要求1所述的藥物，其中視黃酸為視黃酸與無機或有機物質的復合粒子的形式。
5.如權利要求4所述的藥物，其中無機物質是多價金屬無機酸鹽。
6.如權利要求4所述的藥物，其中有機物質是生物可降解的聚合物。
7.如權利要求4所述的藥物，其中復合粒子是毫微粒，具有5-300nm的平均粒徑。
8.一種激活胰臟的β細胞的藥物，所述藥物含有視黃酸作為活性成分。
全文摘要
本發(fā)明旨在提供一種新的治療和/或預防糖尿病的藥物，其不但可以控制血糖水平，而且可以從根本上治療經受β細胞破壞的Ⅰ型糖尿病患者和胰島素分泌存在功能障礙的Ⅱ型糖尿病患者。本發(fā)明提供一種治療和/或預防糖尿病的藥物，藥物包含視黃酸作為活性成分。作為活性成分使用的視黃酸可以是全反式視黃酸，其異構體、衍生物、鹽或者其前藥。視黃酸可以單獨地使用。選擇性地，可以采用由視黃酸與合適的有機或無機物質制備的復合粒子。
文檔編號A61P9/00GK1921843SQ20058000543
公開日2007年2月28日 申請日期2005年1月21日 優(yōu)先權日2004年1月23日
發(fā)明者山口葉子, 五十嵐理慧 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構