專利名稱：抑制多效生長因子基因表達的小干擾rna及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小干擾RNA及其應(yīng)用，特別是涉及抑制多效生長因子(Pleiotrophin)基因表達的小干擾RNA及其作為腫瘤治療藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多效生長因子(Pleiotrophin，Ptn)是1989年從圍產(chǎn)期鼠腦組織中純化而來的，研究表明Ptn也存在于一些非神經(jīng)組織中，如子宮、心臟、軟骨等。它能夠促進軸突生長，刺激細胞的增殖與遷移，促進血管生成，促進神經(jīng)系統(tǒng)及骨的發(fā)育等。Ptn蛋白具有2個β-sheet(β-折疊)結(jié)構(gòu)域，通過易折疊的linker相連，每個β-折疊結(jié)構(gòu)域又含有3個呈反平行的β-鏈，N端和C端富含賴氨酸，形成袖口樣形狀。最近的研究表明肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等腫瘤患者血清中Ptn的水平明顯高于正常對照，尤其在腫瘤的早期階段更為顯著。Ptn在其信號傳導(dǎo)通路中有四個受體，分別為N-syndecan、PTPξ、ALK和LRP。Ptn與N-syndecan結(jié)合，可以促進軸突生長；與PTPξ結(jié)合，可以使磷酸化的PTPξ失活，最終導(dǎo)致β-catenin酪氨酸磷酸化；與ALK結(jié)合，可以促進細胞的錨著獨立性生長能力；LRP是一種膜蛋白，Ptn與其結(jié)合，可以抗凋亡。
腫瘤抑制基因PTEN在多種進展期腫瘤組織中，如腦腫瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膀胱癌、甲狀腺癌等都存在著不同程度的突變或丟失，它是人類腫瘤中突變率最高的基因之一。PTEN基因位于染色體10q23.3，作為脂質(zhì)磷酸酶，PTEN下調(diào)PI3K/AKT通路，調(diào)控細胞周期進展和細胞凋亡；作為蛋白磷酸酶，PTEN具有抑制MAPK信號通路的作用。
本發(fā)明的發(fā)明人通過基因芯片雜交發(fā)現(xiàn)正常小鼠胚胎成纖維細胞系和PTEN缺失的胚胎成纖維細胞系之間的基因表達存在差異，Northern雜交證實在PTEN缺失的胚胎成纖維細胞系中Ptn高表達，并發(fā)現(xiàn)在血小板衍生生長因子(PDGF)的刺激下，Ptn的表達增強。用LY294002抑制PI3K后，Ptn的表達明顯下降，并且PTEN缺失后，Akt的高表達可導(dǎo)致Ptn的表達增強。
上述研究表明抑制Ptn的表達水平可能會對Pten缺失的腫瘤起到抑制作用，提示Ptn可作為治療具有Pten基因突變的腫瘤的藥物靶標。近年發(fā)展起來的RNA干涉技術(shù)為成功抑制Ptn基因的表達提供了一種便捷、有效的手段。
RNA干擾(RNA interference，簡稱RNAi)是通過小分子雙鏈RNA(ds RNA)特異性互補結(jié)合靶向基因轉(zhuǎn)錄本，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種技術(shù)。具有基因沉默作用的小分子雙鏈RNA的長度通常為21-23nt，又被稱為小干擾RNA(siRNA，smallinterfering RNA)，這些小片段會進一步介導(dǎo)與其同源的單鏈RNA降解。siRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無須像反義核苷酸那樣進行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下，使靶基因降低至極低水平甚至完全“敲除”。siRNA的干預(yù)效應(yīng)關(guān)鍵取決于其靶基因序列的選擇，任一nt的錯誤均會導(dǎo)致RNAi效應(yīng)的喪失，這種高度序列特異性使其具有重要的藥理學(xué)價值。已證實，RNA干擾技術(shù)可單獨或與其它現(xiàn)有的治療手段一同用于某些疾病的治療，如病毒感染，腫瘤等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一對能有效抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA。
本發(fā)明所提供的抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA，是正義鏈為序列表中的SEQ ID №1，反義鏈為序列表中的SEQ ID №2的雙鏈RNA序列。
將上述雙鏈RNA序列命名為Ptn siRNA，其反義鏈與Ptn mRNA的243-261位置序列互補。序列表中SEQ ID №1由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中SEQ ID №2由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
編碼上述抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA的序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。它具有下述雙鏈核苷酸序列正義鏈(不做模板的DNA鏈)具有序列表SEQ ID№3的核苷酸序列；反義鏈(做模板的DNA鏈)具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID №3由64個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中SEQ ID №4由64個堿基組成，序列的方向從左至右為3′端→5′端。
含有抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA編碼序列的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌以及擴增抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA編碼序列中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制多效生長因子基因表達的方法。
本發(fā)明所提供的抑制多效生長因子基因表達的方法，是將上述含有抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA編碼序列的載體導(dǎo)入宿主中，多效生長因子基因的表達得到抑制。
所述抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA的編碼序列可通過含有所述抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA的編碼序列的siRNA干擾載體導(dǎo)入宿主；用于構(gòu)建所述siRNA干擾載體的出發(fā)載體可為任意一種可在宿主中表達外源siRNA的載體，如pSilencerTM3.1-H1(購自美國Ambion公司，物理圖譜如

圖1所示)。
以pSilencerTM3.1-H1為出發(fā)載體，構(gòu)建的siRNA表達載體為pPtn-siRNA B。
本發(fā)明提供了一對抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA。實驗證明，本發(fā)明的小干擾RNA對Ptn基因具有顯著的抑制作用，此外，通過沉默Ptn基因，可以抑制PTEN基因缺失細胞的增殖，表明Ptn可以作為治療具有PTEN基因突變的腫瘤的藥物靶標。因此可以以抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA的編碼序列作為活性成分制備成腫瘤治療性藥物。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域具有較大的實際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
說明書附1為載體pSilencerTM3.1-H1的物理圖譜圖2為Northern印跡檢測不同siRNA對Ptn基因表達抑制能力的結(jié)果圖3為Northern印跡篩選Ptn被穩(wěn)定沉默的Pten-/-MEF241細胞克隆的結(jié)果圖4為抑制Ptn基因的表達對Pten-/-MEF241細胞生長影響的檢測結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)的DNA自動合成儀合成。
實施例1、抑制多效生長因子基因表達的siRNA干擾載體的構(gòu)建根據(jù)多效生長因子基因的mRNA序列設(shè)計其siRNA序列，得到三條雙鏈RNA序列，分別命名為Ptn-siRNA A、Ptn-siRNA B、Ptn-siRNA C，序列如下Ptn-siRNA A正義鏈5’-aaagucugacuguggagaaug-3’反義鏈5’-cauucuccacagucagacuuu-3’；Ptn-siRNA B正義鏈5’-aagacucagagauguaagauc-3’(序列表中SEQ ID №1)反義鏈5’-gaucuuacaucucugagucuu-3’(序列表中SEQ ID №2)；Ptn-siRNA C正義鏈5’-aaugugaccucaauaccgccu-3’反義鏈5’-aggcgguauugaggucacauu-3’。
再根據(jù)上述三條Ptn siRNA序列合成構(gòu)建抑制多效生長因子基因表達的siRNA
干擾載體所需的DNA序列，序列如下Ptn-siRNA A的編碼序列Ptn-siDNA A1(正義鏈)5’-gatcccagtctgactgtggagaatgttcaagagacattctccacagtcagactttttttggaaa-3’Ptn-siDNA A2(反義鏈)5’-ggtcagactgacacctcttacaagttctctgtaagaggtgtcagtctgaaaaaaaccttttcga-3’；Ptn-siRNA B的編碼序列Ptn-siDNA B1(正義鏈)5’-gatcccgactcagagatgtaagatcttcaagagagatcttacatctctgagtcttttttggaaa-3’(序列表中SEQ ID №3)Ptn-s iDNA B2(反義鏈)5’-ggctgagtctctacattctagaagttctctctagaatgtagagactcagaaaaaaccttttcga-3’(序列表中SEQ ID №4)；Ptn-siRNA C的編碼序列Ptn-siDNA C1(正義鏈)5’-gatcccctgtgacctcaataccgcctttcaagagaaggcggtattgaggtcacattttttggaaa-3’Ptn-siDNA C2(反義鏈)5’-ggcacactggagttatggcggaaagttctcttccgccataactccagtgtaaaaaaccttttcga-3’。
以pSilencerTM3.1-H1(pSilencer hygroTM試劑盒提供，購自美國Ambion公司)為出發(fā)載體，構(gòu)建抑制多效生長因子基因表達的siRNA干擾載體，具體方法為用水將合成好的六條發(fā)夾狀寡核苷酸序列溶解并稀釋至濃度為1μg/μl；將六條序列分成三對(Ptn-siDNA B1和Ptn-siDNA B2、Ptn-siDNA A1和Ptn-siDNA A2、Ptn-siDNAC1和Ptn-siDNA C2)，先將Ptn-siDNA B1和Ptn-siDNA B2各吸取2μl，并加入1×DNAAnnealing Solution 46μl配制成總體積為50μl的退火反應(yīng)體系，混勻后90℃3min，37℃孵育1h。再從退火后的混合液中吸取1μl，并加入10×T4DNA連接酶緩沖液1μl、pSilencerTM3.1-H1 1μl、T4 DNA連接酶0.5μl、水6.5μl，配制成總體積為10μl的連接反應(yīng)體系，16℃連接12-24小時。用常規(guī)方法將連接產(chǎn)物及siRNA表達載體試劑盒pSilencer hygroTM中所提供的陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，涂板并挑取陽性克隆進行序列測定，將正確插入siRNA的克隆大量擴增后，用QIAprep@Spin Miniprep質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司)并參照試劑盒說明書提取質(zhì)粒，由此得到抑制多效生長因子基因表達的siRNA干擾質(zhì)粒，命名為pPtn-siRNA B，用同樣方法得到分別含有Ptn-siRNA A編碼序列和Ptn-siRNA C編碼序列的siRNA干擾質(zhì)粒，并分別命名為pPtn-siRNA A和pPtn-siRNA C。
實施例2、檢測不同siRNA對Ptn基因表達的抑制能力將實施例1構(gòu)建的三種多效生長因子基因表達的siRNA干擾載體分別瞬時轉(zhuǎn)染至3T3細胞，陰性對照siRNA質(zhì)粒購自Ambion公司，轉(zhuǎn)染24小時后，用NorthernBlotting的方法雜交檢測三種siRNA在RNA水平上對Ptn基因的抑制效果，具體方法為分別提取瞬時表達pPtn-siRNA A、pPtn-siRNA B和pPtn-siRNA C細胞的總RNA，以Prime-a-Gene標記試劑盒(Promega)標記α-32P dCTP于Ptn基因的cDNA片段作為探針(探針序列為序列表中SEQ ID №5)，檢測結(jié)果如圖2所示(18S、28S rRNA為加樣量控制，加樣量控制采用甲醛變性膠RNA電泳的照片)，表明Ptn-siRNA B和Ptn-siRNA C具有較好的抑制Ptn RNA水平的能力。
實施例3、穩(wěn)定表達Ptn siRNA細胞株的獲得及其檢測通過脂質(zhì)體法將實施例1獲得的抑制多效生長因子基因表達的siRNA干擾質(zhì)粒pPtn-siRNA B和pPtn-siRNA C分別轉(zhuǎn)染Pten-/-MEF241細胞(腫瘤抑制基因Pten缺失的小鼠胚胎成纖維細胞，F(xiàn)reeman et al.Cancer Cell.2003 Feb；3(2)117-30)，陰性對照質(zhì)粒與實施例2相同，Pten-/-MEF241細胞為永生化Ptenloxp.loxp小鼠胚胎成纖維細胞經(jīng)體外條件敲除Pten基因后得到的細胞克隆，然后再將兩種轉(zhuǎn)染細胞分別接種裸鼠，并從成瘤裸鼠腫瘤中分離得到的單克隆細胞。將單克隆細胞用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司、胎牛血清購自Hyclone公司)常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24h后，加入濃度為180μg/mL的潮霉素進行篩選，細胞常規(guī)培養(yǎng)，每三天換液一次，換液時加入新鮮潮霉素，兩周后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ptn siRNA的細胞在60mm培養(yǎng)皿中逐漸長滿，胰酶消化并傳至25cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，加入濃度減半為90μg/mL的潮霉素以維持細胞生長。當穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ptn siRNA的細胞在培養(yǎng)瓶中連續(xù)傳代培養(yǎng)5代后，將此細胞以極低密度接種的方法接種于60mm培養(yǎng)皿中使之為單細胞生長，當單細胞分裂成上千個細胞而成為克隆時，挑選生長狀態(tài)良好的單克隆，用去頭的槍尖挑取這些單克隆分別培養(yǎng)，最終得到穩(wěn)定表達Ptn-siRNA B、Ptn-siRNA C的細胞克隆株。
接著對穩(wěn)定表達Ptn-siRNA B、Ptn-siRNA C的細胞克隆株用Northern印跡的方法檢測Ptn基因的表達情況，所用探針與實施例2相同，結(jié)果如圖3所示(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的選取1個克隆，轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA B的選取3個克隆，轉(zhuǎn)染Ptn-siRNAC的選取2個克隆；18S、28S rRNA為加樣量控制，加樣量控制采用甲醛變性膠RNA電泳的照片)，Ptn基因的表達在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA B的3個克隆中都被顯著抑制，而轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA C的兩個細胞株的抑制效果相對要差。選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA B的2號克隆及轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA C的2號克隆作進一步分析。
實施例4、利用細胞生長曲線檢測沉默Ptn基因?qū)ten-/-MEF241細胞生長的影響對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA B的2號克隆，轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA C的2號克隆以及轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的克隆的細胞生長曲線進行重復(fù)檢測，以檢測沉默Ptn基因?qū)ten-/-MEF241細胞生長的影響。具體實驗方法為實驗分3組Pten-/-MEF241/陰性對照組，Pten-/-MEF241/Ptn-siRNA B2號克隆細胞組，Pten-/-MEF241/Ptn-siRNA C2號克隆細胞組，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔接種8×103個細胞(24孔板)，按常規(guī)方法培養(yǎng)。自接種后第2天起，每天同一時間消化每組細胞3孔，精確計數(shù)，連續(xù)7d，然后繪制各組細胞的生長曲線，生長曲線重復(fù)測定3次，統(tǒng)計學(xué)分析采用方差分析，用GraphPad Prism4軟件包完成，生長曲線如圖4所示(結(jié)果為3次獨立實驗的典型代表，*表示同對照組相比P值小于0.001，**表示同對照組相比P值小于0.0001)，結(jié)果穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA B及Ptn-siRNA C的Pten-/-MEF241細胞的增殖能力均落后于對照細胞，尤其是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA B的細胞增殖能力顯著低于對照細胞，在指數(shù)期第3-4天，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ptn-siRNA B的2號克隆的細胞密度僅為對照細胞密度的四分之一，細胞增殖明顯減慢，表明Ptn-siRNA B對Pten-/-MEF241細胞的增殖能力具有較強的抑制作用。
實施例5、裸鼠成瘤實驗將實施例3獲得的穩(wěn)定表達Ptn-siRNA B的2號克隆細胞株接種裸鼠進行裸鼠成瘤實驗，以觀察Ptn基因沉默后Pten-/-MEF241細胞的致瘤特性是否改變，具體方法為裸鼠被分為2組，每組8只動物實驗組接種穩(wěn)定表達Ptn-siRNA B的2號克隆細胞株；對照組為接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的Pten-/-MEF241細胞；每只裸鼠接種細胞量約為2-3×106個細胞，接種部位為右肩胛后皮下。細胞接種后每周觀察一次，致瘤性檢測結(jié)果如表1所示，穩(wěn)定表達Ptn-siRNA B的2號克隆細胞株的成瘤率顯著降低，而且腫瘤的潛伏時間也得到很大程度地延長，表明抑制Ptn基因的表達水平，會對Pten缺失的具有惡性表型的細胞的增殖及致瘤性起到抑制作用，提示Ptn基因可作為治療具有PTEN基因突變的腫瘤的藥物靶標。
表1 Ptn表達水平被siRNA抑制后Pten-/-MEF241細胞的致瘤性檢測結(jié)果

注*表示接種2個月后秤重 **表示接種4個月10天后秤重。
序列表<160>5<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aagacucaga gauguaagau c 21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaucuuacau cucugagucu u 21<210>3<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gatcccgact cagagatgta agatcttcaa gagagatctt acatctctga gtcttttttg60gaaa 64<210>4<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4ggctgagtct ctacattcta gaagttctct ctagaatgta gagactcaga aaaaaccttt60tcga 64<210>5<211>507<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5atgtcgtccc agcaatatca gcagcaacgt agaaaatttg cagctgcctt cctggcattg 60attttcatct tggcagctgt ggacactgct gaggccggga agaaagagaa acctgaaaaa120aaggtgaaaa agtctgactg tggagaatgg cagtggagtg tgtgtgtgcc taccagcggg180gactgtggat tgggcacccg ggagggcact cgcactggcg ccgagtgcaa acagaccatg240aagactcaga gatgtaagat cccttgcaac tggaagaagc agtttggagc tgagtgcaag300
taccagttcc aggcttgggg agaatgtgac ctcaataccg ccttgaagac cagaactggc 360agcctgaagc gagctctgca caatgctgac tgtcagaaaa ctgtcaccat ctccaagccc 420tgtggcaagc tcaccaagcc caagcctcaa gcggagtcaa agaagaagaa aaaggaaggc 480aagaaacagg agaagatgct ggattaa 50權(quán)利要求
1.抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA，是正義鏈為序列表中的SEQ ID №1，反義鏈為序列表中SEQ ID №2的雙鏈RNA序列。
2.權(quán)利要求1所述的抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA的編碼序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼序列，其特征在于所述抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA的編碼序列是下述雙鏈核苷酸序列正義鏈具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼序列的表達載體。
5.含有權(quán)利要求4所述表達載體的轉(zhuǎn)基因細胞系。
6.含有權(quán)利要求4所述表達載體的宿主菌。
7.一種抑制多效生長因子基因表達的方法，是將權(quán)利要求2所述的抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA的編碼序列導(dǎo)入宿主中，多效生長因子基因得到抑制。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA的編碼序列通過含有所述抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA編碼序列的siRNA干擾載體導(dǎo)入宿主；用于構(gòu)建所述siRNA干擾載體的出發(fā)載體為pSilencerTM 3.1-H1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述含有抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA編碼基因的sRNAi干擾載體為pPtn-siRNA B。
10.權(quán)利要求1所述的抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA作為腫瘤治療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA及其應(yīng)用，其目的是提供抑制多效生長因子基因表達的小干擾RNA與其作為腫瘤治療性藥物的應(yīng)用。該小干擾RNA是正義鏈為序列表中的SEQ ID №1，反義鏈為序列表中SEQ ID №2的雙鏈RNA序列。其編碼序列是下述雙鏈核苷酸序列正義鏈具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域具有較大的實際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK1800387SQ20051013467
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者李剛, 胡迎春, 霍艷英, 吳德昌 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所