專利名稱：納米炭混懸注射液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用診斷試劑領(lǐng)域，尤其是示蹤診斷試劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥是當(dāng)今人類健康的大敵，全球每年約有600萬人被癌癥奪去生命。我國每年有160萬至180萬人被診斷為癌癥患者，發(fā)病率僅次于心、腦血管疾病，位居第二。癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和診斷為癌癥的治療贏得了時間，而及時徹底地手術(shù)清除癌細(xì)胞是治療癌癥成功的關(guān)鍵。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤常見的轉(zhuǎn)移途徑，如胃癌、乳腺癌以及胰腺、肺、結(jié)腸等部位的癌腫瘤。實(shí)體癌手術(shù)或放療后遠(yuǎn)期存活率不令人滿意，失敗的主要原因是癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移，因此，手術(shù)中需要盡可能將淋巴結(jié)摘除，這需要一種示蹤劑來辨認(rèn)淋巴結(jié)。同時，未能摘除的淋巴結(jié)能夠富集較高濃度的抗癌藥物，以阻止癌細(xì)胞的擴(kuò)散。
科學(xué)家的長期研究發(fā)現(xiàn)納米炭一方面具有被巨噬細(xì)胞吞噬后進(jìn)入淋巴組織的特性，即具有靶向性，在腫瘤手術(shù)中作為指導(dǎo)淋巴結(jié)清除的示蹤劑；另一方面又因具有高的比表面，為攜帶藥物創(chuàng)造了有利的空間條件。可以用于淋巴細(xì)胞及多種實(shí)體瘤術(shù)中的示蹤劑和藥物的載體，對及時完整的手術(shù)提供有利的幫助，有效防止手術(shù)過程中的癌細(xì)胞擴(kuò)散，極大地提高了手術(shù)的成功率和癌癥患者的治愈率。利用納米炭來治療癌癥是一個理論上和臨床上都十分新穎而誘人的領(lǐng)域。治療癌癥極為重要的一環(huán)是防止癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移?？拱┧幍竭_(dá)各處淋巴結(jié)之前，絕大部分已被機(jī)體吸收，靶部位濃度不高，因而不能阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。為了解決這個難題，最新方法是將炭載體制成超微粒子(納米炭)，吸附上抗癌藥物后注入病灶附近，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅在近處，而且在較遠(yuǎn)處淋巴結(jié)上均含有高濃度的抗癌藥物，其濃度為對照組的20倍，從而防止了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。超微粒子在醫(yī)療上的這種妙用還未得到合理的解釋，有人認(rèn)為是由于抗癌藥物被納米炭載體吸附后，機(jī)體不能很快吸收，抗癌藥物則可緩緩不斷溶解、釋放；另外，納米炭載體具有被巨噬細(xì)胞吞噬后進(jìn)入淋巴組織的特性，即具有靶向性，避免了藥物在非靶位積累造成治療上的不利，使遠(yuǎn)處淋巴結(jié)上也出現(xiàn)了高濃度抗癌藥物。
日本學(xué)者荻原明郎開始便致力利用納米炭制備新制劑的研究，試用CH-NP吸附藥物，并將其應(yīng)用于臨床作為術(shù)中指示劑同時輔助化療，1984年進(jìn)一步改良并做了大量的動物實(shí)驗(yàn)且嘗試應(yīng)用于臨床，取得了良好的治療效果，由此歐美科學(xué)家也跟隨其后開始了研究，但目前還都處于臨床實(shí)驗(yàn)階段。
納米炭混懸注射液制備液存在納米炭顆?；钚院捅砻鎻埩Υ螅谒胁灰追稚?，會聚集成大顆粒，必須將大顆粒打碎使納米炭均勻地分布在注射液中，目前有報道的為日本用40號炭黑生產(chǎn)納米炭混懸注射液采用的研磨技術(shù)——三棍研磨設(shè)備，研磨分散時間長達(dá)100小時。生產(chǎn)效率低，同時易產(chǎn)生設(shè)備脫落物進(jìn)入最終產(chǎn)品，不易保證產(chǎn)品質(zhì)量。
傳統(tǒng)制備炭粉的方法有化學(xué)反應(yīng)和機(jī)械粉碎兩種?；瘜W(xué)反應(yīng)法是由許多烴類物質(zhì)(重油)經(jīng)不完全燃燒或裂解產(chǎn)生炭黑，其微晶具有準(zhǔn)石墨結(jié)構(gòu)，且呈同心取向，其粒子是近乎球形的膠體粒子，由于使用石油產(chǎn)品裂解，則所含雜質(zhì)較多，通常用于工業(yè)橡膠作為抗磨劑。機(jī)械粉碎法是采用較粗的炭顆粒通過機(jī)械的方法將其粉碎至所需粒度而得，(主要用于化學(xué)工業(yè)脫色純化)但該方法制備納米炭存在效率低、粒度分布寬、分級困難的缺點(diǎn)。納米炭的制備方法目前有爐法、槽法、熱裂法和燈煙法等，每種方法生產(chǎn)的炭粉有其特定的物理化學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)與所使用的原料、燃燒裂解過程、生產(chǎn)方式和工藝操作條件緊密相關(guān)。
這些問題制約了這種新型制劑的發(fā)展，因此尋找一種操作簡單、純度高、粒度可控的納米炭制備方法十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種納米炭混懸注射液技術(shù)，以解決現(xiàn)有工藝存在納米炭混懸注射液生產(chǎn)效率低，納米炭純度低、粒徑分布廣，產(chǎn)物需純化再分選及易再次污染的缺點(diǎn)。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案如下納米炭混懸注射液，含有納米炭2.5％，聚乙烯吡咯烷酮K30 1％-5％，余量為注射用水，制備時將上述納米炭和聚乙烯吡咯烷酮K30置于容器中，加入部分注射用水，第1次用磁力攪拌器攪拌，加熱回餾10-30分鐘，然后移置超聲波振蕩器，第1次超聲處理10-20分鐘，再第2次磁力攪拌加熱回餾10-20分鐘，第2次超聲處理10-20分鐘，加注射用水至1000毫升，搖勻，第3次超聲處理10-20分鐘。
制備時優(yōu)選的時間參數(shù)為第1次磁力攪拌、加熱回流20分鐘，第1次超聲處理15分鐘，第2次磁力攪拌、加熱回流10分鐘，第2次超聲處理15分鐘，第3次超聲處理10分鐘。
所述納米炭是使用乙炔氣為原料裂解生產(chǎn)的，原料乙炔氣預(yù)先經(jīng)酸洗堿洗水洗和干燥處理。乙炔裂解爐體材質(zhì)為不銹鋼，并用激光誘導(dǎo)加熱，爐體溫度為1400-1600℃，同時通入乙炔氣和氬氣。通入爐內(nèi)的乙炔流量為1-4L/分鐘，通入爐內(nèi)的氬氣流量為1-16L/分鐘，爐內(nèi)絕對壓力為100-900Pa。
納米炭混懸注射液的制備制劑中納米炭含量的確定根據(jù)國外進(jìn)口產(chǎn)品和文獻(xiàn)報道，納米炭的含量為5％，但根據(jù)本原料藥的粒度小、粒徑分布窄的特點(diǎn)及臨床用藥需要，通過實(shí)驗(yàn)將納米炭的含量定為2.5％。
助懸劑篩選為了解決納米炭在注射液中聚集問題，獲得良好的分散效果，采用了助懸劑，分別用甘油、吐溫-80及聚乙烯吡咯烷酮，即PVP K30作為助懸劑，甘油助懸能力差，納米炭明顯聚集，分散不均勻。另外考察吐溫-80和PVP K30，對按照上述制備工藝制得的樣品進(jìn)行檢測，以激光粒度分析儀測得的粒徑及粒度分布作為指標(biāo)篩選助懸劑，結(jié)果以PVP為助懸劑的納米炭團(tuán)聚粒徑均一，粒度分布窄。
制備時先用磁力攪拌器攪拌，同時伴隨加熱回流，以充分浸潤炭粒表面和破壞表面張力，打碎聚集的大顆粒，但此時會產(chǎn)生大量的泡沫，影響加熱回流的進(jìn)行，所以接著進(jìn)行超聲處理，用超聲波破除泡沫，待泡沫消除后再重復(fù)磁力攪拌、加熱回流，直至在注射液中肉眼看不見團(tuán)聚的炭粒。
先選取不同含量的納米炭及不同含量的聚乙烯吡咯烷酮制備一批樣品，以制得的混懸液的流動性及分散性為考察指標(biāo)來篩選納米炭及聚乙烯吡咯烷酮的含量，考察納米炭及PVP的含量試驗(yàn)方案見下表。

將處方量的微粒炭和聚乙烯吡咯烷酮置于研缽中，加適量注射用水研磨，用剩余注射用水將微粒炭混懸液分次轉(zhuǎn)移于超聲細(xì)胞粉碎器上超聲分散30次(超聲功率400W，每次超聲時間3秒，間隔時間4秒)，分裝于安瓿內(nèi)，扎口密封。
正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果選取納米炭2.5％、聚維酮2.5％的含量為擬定處方。
制備工藝的改進(jìn)前述制備工藝煩瑣，不便操作，且易污染產(chǎn)品。根據(jù)水蒸氣高浸潤性及超聲波的超分散性，設(shè)計一新的制備工藝。
將處方量的納米炭和聚乙烯吡咯烷酮置于三角燒瓶中，加入500ml注射用水磁力攪拌，加熱回流10-30分鐘，移至超聲震蕩器(超聲功率400W)，超聲處理10-20分鐘，然后磁力攪拌，加熱回流10-20分鐘，再次超聲處理10-20分鐘。移入1000ml容量瓶中，用注射用水補(bǔ)到刻度。搖勻，超聲處理10-20分鐘。然后將納米炭混懸注射液分裝于1ml安瓿內(nèi)，熔封。在115℃滅菌30分鐘，即得納米炭混懸注射液。
以新舊制備方法分別制備三批納米炭混懸注射液，全面檢測有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行比較結(jié)果見下表

結(jié)論納米炭混懸注射液新舊制備方法其質(zhì)量無本質(zhì)區(qū)別。新工藝較舊工藝簡單易行，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。
納米炭生產(chǎn)的工藝選擇納米炭生產(chǎn)的方法有下列五種
上述五法中，A法由于殘留芳烴較難處理，一般不用于制備注射用納米炭；B法D法由于有空氣進(jìn)入助燃，納米炭夾有氧化物，須進(jìn)行洗滌純化，但納米級物質(zhì)較難洗滌、分離、干燥，同時易產(chǎn)生再聚集現(xiàn)象，其生產(chǎn)工藝較長，產(chǎn)率低，環(huán)境污染也較重。E法制備納米炭已有文獻(xiàn)報道，納米炭主要用于靶向制劑的載體，未見用于淋巴示蹤報道。
我們公司使用C法，將乙炔氣體先經(jīng)酸液、堿液及水洗滌純化(避免納米炭的納米級純化和干燥)，然后將不銹鋼爐體抽真空(排除空氣及氧氣避免產(chǎn)生氧化物雜質(zhì))，激光誘導(dǎo)加熱爐體至1400-1600℃，導(dǎo)入原料乙炔氣及載體氬氣，生成納米炭及氫氣，(產(chǎn)生氫氣對爐體有保護(hù)作用，因此不銹鋼爐體不會有脫落物進(jìn)入終產(chǎn)品，而影響產(chǎn)品質(zhì)量。)產(chǎn)生的納米炭及氫氣由載體氬氣帶出并冷卻，再由多方向超音速氣流裝置分離收集納米炭。必要時可用多方向超音速氣流裝置對納米炭進(jìn)行分離，直到納米炭符合要求為止。
由于溫度壓力流量等多種原因?qū)⒂绊懮傻募{米炭粒徑，為摸索相互之間關(guān)系，擬定各種因素不同水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。
正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表


實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)編號7所得納米炭粒徑符合要求。依據(jù)上述條件試制三批，批號分別為010512；010513；010514。并進(jìn)行全方位檢測，結(jié)果見下表

納米炭混懸注射液藥效學(xué)研究——(荷瘤小鼠淋巴結(jié)的示蹤)材料與方法1.1動物ICR種小鼠，雌雄各半(18-22克)，由北京醫(yī)科大學(xué)動物部提供。
1.2腫瘤細(xì)胞株小鼠肉瘤180(S180)由天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理組細(xì)胞庫提供。
3藥品名稱納米炭混懸注射液規(guī)格及濃度25mg/ml批號011007納米炭混懸注射液——電鏡單個粒徑80nm——團(tuán)聚粒度分布平均粒徑159.5nm，安瓿裝；納米炭混懸注射液1#樣品——電鏡單個粒徑80nm——團(tuán)聚粒度分布平均粒徑201.5nm，(50ml輸液瓶裝)；
納米炭混懸注射液2#樣品——電鏡單個粒徑80nm——團(tuán)聚粒度分布平均粒徑248.7nm，(50ml輸液瓶裝)；上述納米炭混懸注射液均為福建省三愛藥業(yè)股份有限公司提供。
1.4方法取小鼠S180腫瘤細(xì)胞，經(jīng)處理后將細(xì)胞稀釋為5×106/ml。在無菌條件下，按0.2ml/只，接種于小鼠左側(cè)腹中部。然后分組，每組10只，接種8天后分別在腫瘤中心和周圍部位注射011007，1號和2號納米炭混懸注射液0.2ml。注射納米炭混懸注射液21～22小時后解剖小鼠，肉眼觀察并記錄小鼠前肢腋下、腹股溝和頸部染黑的淋巴結(jié)數(shù)。染黑的淋巴結(jié)包括淋巴結(jié)為黑色、淋巴結(jié)呈灰色和淋巴結(jié)邊緣的淋巴管為黑色。計算每組平均淋巴結(jié)數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。
表.納米炭混懸注射液對小鼠淋巴結(jié)的影響

2.結(jié)果從表中結(jié)果可以看出，局部周圍注射1號、2號和011007制劑后，納米炭混懸注射液染黑的淋巴結(jié)數(shù)沒有差異。從圖6-9中顯示，局部或腫瘤周圍注射1號、2號和011007制劑后，可見小鼠腹膜外納米炭混懸注射液均呈黑色并有擴(kuò)散，但腫瘤、腹部肌肉、前后肢肌肉組織未被納米炭混懸注射液染黑。在小鼠前肢腋下、腹股溝和頸部，可見黑色淋巴結(jié)、灰色淋巴結(jié)和淋巴結(jié)邊緣為黑色。上述結(jié)果說明淋巴結(jié)對納米炭混懸注射液有特異的吸附作用。011007制劑采用了兩種注射方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠染黑的淋巴結(jié)數(shù)相差不多，沒有顯著性差異。而且從肉眼觀察的結(jié)果淋巴結(jié)染黑的程度也基本相同?？傊?，從小鼠腫瘤淋巴示蹤結(jié)果表明，本研究采用的納米炭混懸注射濃度能夠較好的起到示蹤目的。
3.結(jié)論
(1)納米炭混懸注射液對小鼠淋巴系統(tǒng)具有特異導(dǎo)向性。
(2)小鼠肌肉和腫瘤組織對三種納米炭混懸注射液沒有吸附作用。
(3)011007納米炭混懸注射液的兩種給藥方式，小鼠淋巴結(jié)染黑示蹤沒有顯著性差異。
(4)三種納米炭混懸注射液通過腫瘤周圍注射給藥，小鼠淋巴結(jié)染黑示蹤沒有顯著性差異。
本發(fā)明具有如下特點(diǎn)1.制備納米炭混懸注射液簡單易行，大大節(jié)約了制備時間，從100小時縮減到2小時。
2.質(zhì)量穩(wěn)定可靠。混懸性能好，注射液中的平均團(tuán)聚粒徑保持在160-185nm。
3.由于使用乙炔氣為原料生產(chǎn)納米炭，事前可以對原料乙炔進(jìn)行酸洗、堿洗及水洗和干燥，而得到精制高純乙炔原料，使產(chǎn)生的納米炭純度提高，可直接用于納米炭混懸注射液的配制，摒棄納米炭的后純化過程。
4.由于使用激光對爐體進(jìn)行加熱，同時通入惰性氣體對爐體不銹鋼進(jìn)行保護(hù)，不會有其他雜質(zhì)源進(jìn)入最終納米炭產(chǎn)品中，使產(chǎn)生的納米炭純度高、質(zhì)量好，可直接作為注射用納米炭。
5.由于使用激光對爐體加熱，調(diào)節(jié)爐溫穩(wěn)定可靠。加之可通過調(diào)節(jié)通入的乙炔氣及惰性保護(hù)氣體的壓力和流速，使得產(chǎn)生納米炭的粒徑變?yōu)榭尚?。因此具備了生產(chǎn)不同粒徑納米炭隨意性。
6.由于爐溫及通入氣體壓力和流速相對穩(wěn)定，因此所得產(chǎn)品納米炭的粒徑分布范圍較窄，具有較好的單一性和均一性。


圖1為以重油為原料生產(chǎn)納米炭(A法)的流程2為以柴油為原料生產(chǎn)納米炭(B法)的流程3為以乙炔為原料激光誘導(dǎo)法生產(chǎn)納米炭(C法)的流程4為以乙炔為原料生產(chǎn)納米炭(D法)的流程5為以木柴為原料生產(chǎn)納米炭(E法)的流程6為本發(fā)明納米炭混懸注射液(011007)給小鼠腫瘤周圍注射后的藥效學(xué)研究照片圖7為本發(fā)明納米炭混懸注射液(011007)給小鼠腫瘤中心注射后的藥效學(xué)研究照片圖8為本發(fā)明納米炭混懸注射液(1號)給小鼠注射后的藥效學(xué)研究照片圖9為本發(fā)明納米炭混懸注射液(2號)給小鼠注射后的藥效學(xué)研究照片具體實(shí)施方式
1納米炭的生產(chǎn)(1)對KJ-95激光誘導(dǎo)爐裝置進(jìn)行抽真空，當(dāng)真空度小于1Pa時關(guān)電磁閥；(2)在無氧的條件下調(diào)節(jié)激光功率為1.5~2.0KW，對生產(chǎn)裝置進(jìn)行加熱，當(dāng)爐溫達(dá)到1200~1600℃時；(3)將乙炔氣和氬氣通入KJ-95激光納米炭生產(chǎn)裝置內(nèi)；通入爐內(nèi)的乙炔、氬氣的流量，L/min

(4)維持爐內(nèi)氣壓為100-900Pa(真空表壓) (1~2小時)；(5)打開KJ-96多方向超音速氣流裝置，通入氬氣，將納米炭粉冷卻到50℃以下、分散、轉(zhuǎn)輸出爐體；(6)收集納米炭顆粒，可得到50~300nm可控的納米炭(7)乙炔裂解反應(yīng)是吸熱反應(yīng)，激光在生產(chǎn)裝置外連續(xù)加熱，控制生產(chǎn)裝置內(nèi)的溫度在1200~1800℃。溫度超過1800℃，可得到30~500納米炭，成石墨結(jié)構(gòu)。
2.納米炭混懸注射液的制備(1)取顆粒度為80nm的納米炭2.5％，PVP2.5％注入三角瓶中加入500ml注射用水。
(2)第1次磁力攪拌，加熱回流10-30分鐘，移至400W超聲振蕩器，超聲處理10-20分鐘。
(3)然后再進(jìn)行第2次磁力攪拌，加熱回流10-20分鐘，超聲處理10-20分鐘。
(4)移入1000ml容量瓶中，用注射用水補(bǔ)到1000ml刻度處，搖均，第3次超聲處理10-20分鐘。
(5)然后分裝入1ml安瓿內(nèi)，熔封，在115℃滅菌30分鐘即成。
納米炭混懸注射液制備時，實(shí)施例中各工藝流程采用的時間(分)

權(quán)利要求
1.納米炭混懸注射液，含有納米炭2.5％，聚乙烯吡咯烷酮K301％-5％，余量為注射用水，其特征為制備時將上述納米炭和聚乙烯吡咯烷酮K30置于容器中，加入部分注射用水，第1次用磁力攪拌器攪拌，加熱回餾10-30分鐘，然后移置超聲波振蕩器，第1次超聲處理10-20分鐘，再第2次磁力攪拌加熱回餾10-20分鐘，第2次超聲處理10-20分鐘，加注射用水至1000毫升，搖勻，第3次超聲處理10-20分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米炭混懸注射液，其特征為制備時優(yōu)選的時間參數(shù)為第1次磁力攪拌、加熱回流20分鐘，第1次超聲處理15分鐘，第2次磁力攪拌、加熱回流10分鐘，第2次超聲處理15分鐘，第3次超聲處理10分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述納米炭混懸注射液，其特征為所述納米炭是使用乙炔氣為原料裂解生產(chǎn)的，原料乙炔氣預(yù)先經(jīng)酸洗堿洗水洗和干燥處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述納米炭混懸注射液，其特征為乙炔裂解爐體材質(zhì)為不銹鋼，并用激光誘導(dǎo)加熱，爐體溫度為1400-1600℃，同時通入乙炔氣和氬氣。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述納米炭混懸注射液，其特征為通入爐內(nèi)的乙炔流量為1-4L/分鐘，通入爐內(nèi)的氬氣流量為1-16L/分鐘，爐內(nèi)絕對壓力為100-900Pa。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)用示蹤診斷試劑領(lǐng)域，在實(shí)體腫瘤治療方面及時徹底地手術(shù)清除癌癥組織是關(guān)鍵，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是癌腫瘤擴(kuò)散常見的途徑之一，因此手術(shù)中要盡可能將病灶周圍淋巴結(jié)切除。手術(shù)廓清時較大的淋巴結(jié)肉眼可見，容易清除，新增生淋巴結(jié)較小肉眼難辨，為改變這種狀況，需要一種示蹤劑來辨認(rèn)淋巴結(jié)，納米炭是一種理想的示蹤劑，納米炭混懸注射液需要克服炭顆粒團(tuán)聚成大粒子的問題。本發(fā)明在注射液中采用80nm的炭加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP－K30)助懸劑，在制備時通過反復(fù)磁力攪拌、回流和超聲處理的工藝，得到的納米炭混懸注射液具有制備工藝簡單易行，大大節(jié)約了制備時間，從100小時縮減到2小時，混懸性能好，平均團(tuán)聚粒徑保持在160－185nm。
文檔編號A61P35/00GK1935263SQ20051010532
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者熊天英, 吳杰 申請人:福建三愛藥業(yè)有限公司