專利名稱：抗動脈粥樣硬化核酸疫苗的納米顆?；c粘膜免疫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在醫(yī)藥領(lǐng)域中，本發(fā)明所提供的抗動脈粥樣硬化核酸疫苗/殼聚糖納米顆粒，能方便應(yīng)用于粘膜免疫，并且誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體水平優(yōu)于單純核酸疫苗的肌肉注射免疫。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化(Atherosclersis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，并且發(fā)病率在我國有明顯增加的趨勢。動脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素作用的結(jié)果，其病因尚未完全闡明。目前普遍認(rèn)為，膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cholester ester transfer protein，CETP)與動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-CETPC，通過肌肉注射可以有效地產(chǎn)生特異性抗CETP抗體，且能夠有效的預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生。
粘膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中重要的組成部分。是通過粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)接受抗原，誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的。鼻腔、咽喉乃至肛門有一系列的淋巴樣組織，它們均位于粘膜下區(qū)域，是一些彌散的淋巴組織，既可以是一大片密集較均勻的淋巴組織，也可以是一小片淋巴細(xì)胞、有時形成淋巴濾泡，在這些淋巴濾泡中有豐富的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等專職抗原遞呈細(xì)胞。粘膜的M細(xì)胞具有吸附和吞噬抗原顆粒的功能，大分子物質(zhì)粘附于表面上皮細(xì)胞后，很快就被攝入M細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的吞飲囊，并轉(zhuǎn)運(yùn)至周圍的淋巴細(xì)胞或細(xì)胞下的淋巴濾泡。粘膜層上皮細(xì)胞對粘膜表面的抗原也有攝入和呈遞作用，是一種“非專職”的抗原呈遞細(xì)胞。由于鼻腔是吸入性抗原的第一結(jié)合位點(diǎn)，幾乎所有引起呼吸系統(tǒng)疾病的病毒、細(xì)菌和寄生病原體都是通過鼻腔粘膜表面進(jìn)入并感染機(jī)體的，因此，鼻腔粘膜在整個粘膜系統(tǒng)中是非常重要的，鼻腔給藥，疫苗的靶部位是鼻相關(guān)淋巴組織(NALT)，它可以引起局部和周邊的粘膜免疫反應(yīng)。鼻腔免疫需要的疫苗量比口服免疫少，可能是由于鼻腔粘膜能夠更有效地吸收并利用疫苗。另外，鼻腔免疫比傳統(tǒng)注射方式更方便安全，易于對廣大人群進(jìn)行推廣免疫。
裸露DNA很難自主進(jìn)入細(xì)胞，選擇合適的載體，載荷核酸疫苗DNA進(jìn)入細(xì)胞有效表達(dá)是基因免疫成功的關(guān)鍵?；蜉d體分為病毒和非病毒二大類，病毒類作為一種高轉(zhuǎn)染率的基因載體已被研究多年，但它在臨床上暴露出的免疫原性和致瘤性等安全問題，阻礙著此類載體的進(jìn)一步發(fā)展，近年來，人們致力于尋找安全有效的非病毒類載體。
殼聚糖是一種從甲殼類動物中提取的天然聚多糖，由于其具有良好的生物相容性，可生物降解、免疫原性低、成本低廉等特點(diǎn)，近年來廣泛用作遞藥系統(tǒng)的載體。其中包括大分子的多肽、蛋白質(zhì)和核酸類藥物。隨著在此方面研究的不斷深入，人們已經(jīng)認(rèn)識到了殼聚糖作為核酸疫苗非病毒載體的應(yīng)用前景，并且將這一技術(shù)廣泛地應(yīng)用到多種疾病的治療研究中。
殼聚糖分子中的葡糖胺基在酸性溶液中發(fā)生質(zhì)子化，呈正電性，而DNA中的磷酸基團(tuán)呈負(fù)電性，因而二者可通過電性作用共聚形成多聚復(fù)合物，使DNA壓縮成納米(或微米)級的顆粒。由于納米顆粒尺度微小，可以靶向鼻相關(guān)淋巴組織中特殊上皮細(xì)胞-M細(xì)胞，并轉(zhuǎn)運(yùn)到深層的淋巴組織，提高機(jī)體對抗原的攝取。
殼聚糖作為載體的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在促滲作用和生物粘附作用這兩個方面。它的促滲作用表現(xiàn)在，質(zhì)子化殼聚糖可以增加藥物在粘膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)外之間(transcellular)和細(xì)胞與細(xì)胞之間(paracellular)轉(zhuǎn)運(yùn)。促進(jìn)核酸疫苗穿過粘膜屏障與其下的淋巴組織作用，提高M(jìn)細(xì)胞對核酸疫苗的攝取率。其生物粘附性是因?yàn)檎衬ど系恼骋涸谏韕H下帶有負(fù)電荷，而核酸與殼聚糖結(jié)合形成的納米顆粒表面帶有正電荷，與粘液之間存在靜電作用，而使其粘附于上皮細(xì)胞表面，延長疫苗與粘膜的作用時間，有利于細(xì)胞對核酸的攝取。兩個方面協(xié)同作用，顯著提高疫苗的有效性。
用殼聚糖遞送核酸的另一個顯著優(yōu)點(diǎn)是可以有效的減少核酸的降解。外源性核酸在轉(zhuǎn)移到淋巴細(xì)胞的過程中易被核酸酶降解，而殼聚糖將核酸包裹于其中，可以抵御核酸酶的酶解作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備抗動脈粥樣硬化核酸疫苗納米顆粒的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供抗動脈粥樣硬化核酸疫苗納米顆粒的粘膜免疫方法。
在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種制備抗動脈粥樣硬化核酸疫苗的納米粒的方法。通過該方法制得的納米顆粒可有效地裝載核酸。其制備是將殼聚糖與核酸在弱酸性溶液中，利用二者的電性中合，并在絮凝劑硫酸鈉的作用下，共聚形成納米顆粒。如圖1.所示，核酸疫苗與殼聚糖經(jīng)共聚后形成的納米顆粒與裸露核酸疫苗在瓊脂糖凝膠板上的電泳行為不同，共聚后的核酸疫苗幾乎完全滯留于加樣孔中。經(jīng)透射電子顯微鏡觀察，如圖2.所示，通過本發(fā)明提供的方法可制得不規(guī)則球形納米級顆粒。并且可以通過調(diào)整殼聚糖和核酸的比例，制得100nm-1000nm粒徑范圍，動電電位在12-24mV，包封率＞90％，載藥量約為28％的納米顆粒。
在本發(fā)明的第二方面，提供納米顆?；怂嵋呙绲恼衬っ庖叻椒ā⒖箘用}粥樣硬化核酸疫苗納米顆粒通過鼻腔免疫新西蘭白兔，通過殼聚糖納米粒的遞送作用，使抗動脈粥樣硬化核酸疫苗進(jìn)入鼻腔粘膜系統(tǒng)，經(jīng)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)表達(dá)出表面呈現(xiàn)含有CETP表位的重組抗原，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白C端多肽的特異性抗體。


圖1.抗動脈粥樣硬化核酸疫苗/殼聚糖納米粒的電泳行為。圖例1.未經(jīng)納米顆?；目箘用}粥樣硬化核酸疫苗；2.經(jīng)納米顆?；目箘用}粥樣硬化核酸疫苗圖2.抗動脈粥樣硬化核酸疫苗/殼聚糖納米粒在透射電子顯微鏡下的圖片(放大100000倍)。
圖3.ELISA測定結(jié)果顯示核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-CETPC誘發(fā)兔產(chǎn)生抗CETP抗體。圖例 表示生理鹽水組； 表示殼聚糖(滴鼻)組； 表示裸露核酸疫苗(滴鼻)組；■表示核酸疫苗納米顆粒(滴鼻)組； 表示裸露核酸疫苗(肌肉注射)組
具體實(shí)施例方式
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明抗動脈粥樣硬化核酸疫苗的納米顆粒的制備方法實(shí)施例1.
將適量殼聚糖溶解于5mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中(pH5.5)，制成濃度為2mg/ml溶液。將適量抗動脈粥樣硬化核酸疫苗溶解于15mM硫酸鈉溶液中，制成濃度為500μg/ml溶液。將上述二溶液分別于55℃中水浴加熱5分鐘，用旋渦振蕩儀將1倍體積的核酸疫苗溶液旋起，迅速將0.5倍體積的殼聚糖溶液倒入核酸疫苗溶液中，旋渦20秒，室溫靜置1h以上，即得抗動脈粥樣硬化核酸疫苗/殼聚糖納米粒的膠體溶液。
實(shí)施例2.
將適量殼聚糖溶解于5mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中(pH5.5)，制成濃度為300μg/ml溶液。將適量抗動脈粥樣硬化核酸疫苗溶解于15mM硫酸鈉溶液中，制成濃度為100μg/ml溶液。將上述二溶液分別于55℃中水浴加熱5分鐘，等體積迅速混合，渦旋30秒，室溫放置1h，即得抗動脈粥樣硬化核酸疫苗/殼聚糖納米粒的膠體溶液。
實(shí)施例3.
將適量殼聚糖溶解于5mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中(pH5.5)，制成濃度為2mg/ml溶液。將適量抗動脈粥樣硬化核酸疫苗溶解于6.25mM硫酸鈉溶液中，制成濃度為800μg/ml溶液。將上述二溶液分別于55℃中水浴加熱5分鐘，等體積迅速混合，渦旋30秒，室溫放置1h，即得抗動脈粥樣硬化核酸疫苗/殼聚糖納米粒的膠體溶液。
實(shí)施例4.
將實(shí)施例2中得到的抗動脈粥樣硬化核酸疫苗/殼聚糖納米粒的膠體溶液加入0.75％(W/V)填充劑(甘露醇/乳糖＝2∶1)，攪拌使溶解，經(jīng)冷凍干燥，制成凍干粉劑?？箘用}粥樣硬化核酸疫苗的藥效學(xué)研究實(shí)施例5.
選用新西蘭大白兔40只，雌性，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為生理鹽水組，殼聚糖溶液組，裸露核酸疫苗組和核酸疫苗/殼聚糖納米粒組，鼻腔給藥，另設(shè)裸露核酸疫苗肌肉注射組。給藥劑量為250μg核酸疫苗/只，給藥體積200μl。其中，肌肉注射組用無菌生理鹽水將250μg核酸疫苗稀釋成1.25μg/μl備用。以200μl 0.25％鹽酸布比卡因(無菌生理鹽水為溶劑)處理兔后肢雙側(cè)股四頭肌。3天后，在每只兔的處理肌肉處兩側(cè)各分別多點(diǎn)注射200μl裸露核酸疫苗。分別于3、6周以相同方法加強(qiáng)免疫一次，按2、5、7、9周行耳緣靜脈取血，離心取血清-20℃冷凍保存。
抗人膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白特異抗體的ELISA檢測用純化的重組人血管內(nèi)皮生長因子121及人膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白C端26肽的融合蛋白(rhVEGF-CETPC)4℃包被96孔ELISA酶標(biāo)板過夜，每孔100μg，棄去包被液。加入5％牛血清白蛋白溶液(pH7.4磷酸鹽緩沖液的配制)，37℃滿孔封閉1小時，棄去封閉液。將兔血清用封閉液稀釋50倍，然后每孔加入100μl稀釋后的兔血清，于37℃孵育1小時。棄去血清，用磷酸鹽緩沖液(含0.05％吐溫-20)滿孔洗滌6次，每孔加入按1∶10000稀釋的羊抗兔IgG二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)100μl，37℃孵育1小時，棄去二抗液，磷酸鹽緩沖液(含0.05％吐溫-20)滿孔洗滌6次，洗滌后，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3、3｀、5、5｀-四甲基聯(lián)苯胺溶液，于37℃顯色30分鐘后，加入50μl 2M硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定450nm波長的吸光度值。兔血清ELISA檢測結(jié)果見圖3，結(jié)果表明，抗動脈粥樣硬化核酸疫苗/殼聚糖納米粒組能誘發(fā)兔產(chǎn)生特異的抗CETP的抗體，且抗體水平高于核酸疫苗肌肉注射組和裸露核酸疫苗組，經(jīng)t檢驗(yàn)，7周時，核酸疫苗/殼聚糖納米粒組與生理鹽水組，殼聚糖溶液組，裸露核酸疫苗組比較，均存在非常顯著性差異(p＜0.01)；與裸露核酸疫苗肌肉注射組比較存在顯著性差異(p＜0.05)。
權(quán)利要求
1.一種制備抗動脈粥樣硬化核酸疫苗(pCR3.1-X8-HBc-CETPC)顆粒的方法，其特征是通過共聚作用將抗動脈粥樣硬化核酸疫苗與殼聚糖組成多聚復(fù)合物，使之更有效的被機(jī)體所吸收，增強(qiáng)其免疫原性。
2.權(quán)利要求1的多聚復(fù)合物，其形態(tài)特征是納米或微米級的顆粒，粒徑為50nm～10μm。
3.權(quán)利要求2的多聚復(fù)合物顆粒，其特征是顆粒的粒徑優(yōu)選為100nm～500nm。
4.權(quán)利要求1的多聚復(fù)合物，其特征是殼聚糖的分子量為1萬～200萬。
5.權(quán)利要求4的殼聚糖的分子量，其特征是分子量優(yōu)選為3萬～20萬。
6.權(quán)利要求1的多聚復(fù)合物，其特征是核酸疫苗與殼聚糖的重量比，殼聚糖以分子中的N計算，核酸以分子中的P計算，N和P的重量比為1～10∶1。
7.權(quán)利要求6的N和P的重量比，其特征是N和P的重量比優(yōu)選為3～6∶1。
8.權(quán)利要求1的多聚復(fù)合物，特征是其劑型為膠體溶液、混懸液、凍干粉劑、噴霧劑。
9.一種抗動脈粥樣硬化核酸疫苗納米顆粒的粘膜免疫方法，其特征在于，它將權(quán)利要求1所述抗動脈粥樣硬化核酸疫苗顆粒應(yīng)用于粘膜免疫。
全文摘要
將殼聚糖溶液和抗動脈粥樣硬化核酸疫苗質(zhì)粒DNA在共聚作用下結(jié)合形成納米顆粒。通過鼻腔粘膜免疫，抗動脈粥樣硬化核酸疫苗納米顆粒能誘發(fā)兔產(chǎn)生特異的抗膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抗體，且抗體水平高于核酸疫苗肌肉注射組。應(yīng)用這項技術(shù)，優(yōu)化了核酸疫苗的免疫方式與途徑。
文檔編號A61K48/00GK1679966SQ200510038150
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月19日
發(fā)明者宗莉, 顧凱, 龍軍, 王學(xué)軍, 陳伶俐, 曹榮月, 吳潔, 劉景晶 申請人:中國藥科大學(xué)