專利名稱：抑制腫瘤和白血病細(xì)胞VEGF表達(dá)和增殖的siRNA及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為抑制VEGF蛋白表達(dá)和增殖的siRNA序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional genesilencing，PTGS)，在此情況下啟動(dòng)子是活躍的，靶基因能被轉(zhuǎn)錄，但不能正常積累mRNA。各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)21-23個(gè)nt的短雙鏈RNA，即siRNA(shortinterference RNA，siRNA)，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織內(nèi)引起基因封閉作用，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無須象反義核苷酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下，使靶基因降至極低水平甚至完全“敲除”，從而產(chǎn)生缺失突變表型。siRNA的干預(yù)效應(yīng)關(guān)鍵取決于其靶基因序列的選擇，任一nt的錯(cuò)誤均會(huì)導(dǎo)致RNAi效應(yīng)的喪失，這種高度序列特異性使其對(duì)點(diǎn)突變、序列插入和缺失的選擇性基因靜寂有很重要的藥理作用。已證明，siRNA技術(shù)可單獨(dú)或與其它現(xiàn)有的治療手段一同用于突變所致的疾病，如病毒感染、脊髓延髓肌肉萎縮癥(SBMA)，還可用于治療腫瘤。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、生存和遷移而刺激血管的生成，在胚胎生成、骨骼的生長以及生殖活動(dòng)中是一種生理性血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在各種腫瘤和白血病細(xì)胞中，都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)上調(diào)，而且它與腫瘤和白血病的進(jìn)展和預(yù)后差密切相關(guān)。
肝癌作為實(shí)體瘤，其發(fā)生、發(fā)展與腫瘤血管生成有著密切的聯(lián)系。VEGF在肝癌中高表達(dá)，與肝癌的分期、分級(jí)以及預(yù)后密切相關(guān)。將VEGF作為RNA干擾的靶標(biāo)，利用VEGFsiRNA阻斷VEGF及其受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而阻斷VEGF促血管形成，達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖的目的。因此，通過干擾VEGFmRNA，阻斷血管形成，抑制腫瘤的生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為腫瘤治療的一種新策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供能在細(xì)胞和蛋白水平上抑制肝癌和白血病細(xì)胞株VEGF表達(dá)的siRNA以及提供該siRNA在制藥中的應(yīng)用。
為達(dá)上述目的，發(fā)明人采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA序列，通過實(shí)驗(yàn)篩選以下9條高效VEGFsiRNA序列(見表1)表19條高效VEGFsiRNA序列

上述任一條或多條VEGFsiRNA可用于制備抗腫瘤和抗白血病的藥物。
RNA干擾技術(shù)是將一段雙鏈的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，使具有同源序列的基因表達(dá)受到抑制，是腫瘤基因治療的新領(lǐng)域。本發(fā)明的siRNA序列的長度均為19bp，這些siRNAs既足夠長誘導(dǎo)基因特異性抑制，又足夠短，逃避宿主干擾素反應(yīng)。本發(fā)明將上述針對(duì)VEGFmRNA編碼區(qū)不同位置的9條VEGFsiRNA序列分另導(dǎo)入肝癌7721細(xì)胞和白血病細(xì)胞HL60，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞的增殖受到抑制，同時(shí)VEGF蛋白的表達(dá)量降低。雖然針對(duì)同一靶基因，但位置不同，效果不同。本發(fā)明從細(xì)胞的增殖和靶基因蛋白的表達(dá)得到的結(jié)果是一致的。9條VEGFsiRNA序列均能抑制肝癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞的生長和增殖，以VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6和VEGFsiRNA9的效果好，且均優(yōu)于反義寡核苷酸對(duì)照組。ELISA法檢測(cè)，與空白對(duì)照組相比，VEGFsiRNA1～VEGFsiRNA9組細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)水平明顯地降低，VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7抑制靶基因表達(dá)的效果最好。
可見，RNA干擾在腫瘤和白血病的基因治療方面的效果優(yōu)于與反義技術(shù)。VEGFsiRNA因其序列的特異性，可以特異地降解VEGFmRNA，從而降低VEGF蛋白的表達(dá)水平；VEGFsiRNA具有雙鏈結(jié)構(gòu)，比反義寡核苷酸更易抵御細(xì)胞內(nèi)核酶的降解；VEGFsiRNA不需要化學(xué)修飾，可以避免反義寡核苷酸全硫代修飾引起的細(xì)胞毒性。因此，VEGFsiRNA可成為腫瘤和白血病基因治療的重要工具。


圖1是各實(shí)驗(yàn)組分別作用于SMMC7721細(xì)胞后MTT法測(cè)得各組細(xì)胞的存活率比較圖。*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖2是各實(shí)驗(yàn)組分別作用于SMMC7721細(xì)胞后CCK8法測(cè)得各組細(xì)胞的存活率比較圖。*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖3是各實(shí)驗(yàn)組分別作用于SMMC7721細(xì)胞后ELISA法測(cè)得各組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平比較圖。*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖4是各實(shí)驗(yàn)組分別作用于HL60細(xì)胞后MTT法測(cè)得各組細(xì)胞的存活率比較圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一VEGFsiRNA的設(shè)計(jì)與合成。
從Genbank獲得VEGFmRNA全序列，采用以下原則設(shè)計(jì)siRNA序列①在mRNA的起始密碼子AUG的下游50～100nt處開始設(shè)計(jì)；②以AA(N19)為模式；③G/C的百分比為30％～70％；④一行中不要有4個(gè)以上的A或T；⑤一行中不要有4個(gè)及以上的G；⑥一行中不要有7個(gè)連續(xù)的GC鏈延伸；⑦完成序列比對(duì)(BLAST)，以保證特異性；⑧結(jié)合RNAstructure3.7軟件，計(jì)算總自由能overallΔG37。表2顯示，設(shè)計(jì)VEGFsiRNA序列9條，同時(shí)設(shè)計(jì)反義寡核苷酸對(duì)照(中國專利申請(qǐng)?zhí)?3139788.3)，陽性對(duì)照(針對(duì)GAPDH基因)。siRNA模板和反義藥物(全硫代修飾)由上海生工生物工程有限公司合成，使用Ambion公司的siRNA構(gòu)建試劑盒合成VEGFsiRNA。
表2設(shè)計(jì)的VEGFsiRNA及反義對(duì)照、陽性對(duì)照

實(shí)施例二MTT法分析各實(shí)驗(yàn)組對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的抑制效果。
人的肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中(含10％小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37℃、含5％CO2溫箱孵育，用0.25％的胰蛋白酶消化。
取對(duì)數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞，配制2.0×104/mL起始濃度細(xì)胞，每孔加100μL到96孔培養(yǎng)板內(nèi)(Coming，美國)，設(shè)空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組(Invitrogen公司)、陽性對(duì)照組(針對(duì)GAPDH基因)、反義組(25nmol/L)及siRNA 1-9組(25nmol/L)。每組5孔，接種24h后棄去上清，轉(zhuǎn)染siRNA 1-9和對(duì)照組，置37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中無血清繼續(xù)培養(yǎng)4h，再各補(bǔ)加無雙抗含10％胎牛血清的1640 100μL，72h后加入MTT 20μL/孔，孵箱內(nèi)孵育4h后棄上清，加入DMSO 150μL/孔，在570nm的波長的酶標(biāo)儀下檢測(cè)各組的吸光度。
MTT實(shí)驗(yàn)中通過方差分析發(fā)現(xiàn)各個(gè)組別之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝20.21，P＜0.01)。VEGFsiRNA1～VEGFsiRNA9組與空白對(duì)照組之間均有顯著差異，其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA9對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果均好于反義藥物組。結(jié)果見圖1和表3。
表3MTT法分析各實(shí)驗(yàn)組對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的抑制效果

與空白對(duì)照組相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01與反義藥物組相比，Δ表示P＜0.05，ΔΔ表示P＜0.01實(shí)施例三CCk8法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組siRNA抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖的效果。
人的肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中(含10％小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37℃、含5％CO2溫箱孵育，用0.25％的胰蛋白酶消化。
取對(duì)數(shù)生長期的7721細(xì)胞，配制1.0×105/mL起始濃度細(xì)胞，接種96孔板，每孔100ul，置37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于72h每孔加入10ul的CCK8試劑，然后把培養(yǎng)板放在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，在450nm波長處測(cè)定吸光度，參考波長為655nm。細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100％。
使用CCK8試劑盒測(cè)定各個(gè)藥物組別。經(jīng)過方差分析，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F＝17.46，P＜0.01)，VEGFsiRNA1～VEGFsiRNA9組與空白對(duì)照組之間均有顯著差異(P＜0.01)；兩兩比較分析發(fā)現(xiàn)VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA4、VEGFsiRNA6、VEGFsiRNA7、VEGFsiRNA8、VEGFsiRNA9的效果均好于反義藥物組，而VEGFsiRNA1、VEGFsiRNA3、VEGFsiRNA5與反義藥物組沒有差異。結(jié)果見圖2和表4。
表4CCK8法分析各實(shí)驗(yàn)組對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的抑制效果

與空白對(duì)照組相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01與反義藥物組相比，Δ表示P＜0.05，ΔΔ表示P＜0.01實(shí)施例四VEGFsiRNA抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的測(cè)定。
人的肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中(含10％小牛血清、青霉素和鏈霉素的終濃度為100U/毫升)，置于37℃、含5％CO2溫箱孵育，用0.25％的胰蛋白酶消化。
將對(duì)數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞接種96孔板，每孔100ul，置37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。SiRNA1-9組和反義寡核苷酸藥物組按25nm分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，72h后離心收取上清夜，VEGF蛋白測(cè)定按人VEGF ELISA試劑盒說明書操作(晶美生物工程有限公司)，加入終止液混勻后即刻用酶標(biāo)儀(BIO-RID公司)測(cè)定OD450值，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔的OD值減去空白孔的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(pg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。通過樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)求出樣品VEGF濃度。結(jié)果見圖3和表5。
表5ELISA法分析各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)水平

與空白對(duì)照組相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01與反義藥物組相比，Δ表示P＜0.05，ΔΔ表示P＜0.01實(shí)施例五CCK8法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組siRNA抑制白血病HL60細(xì)胞增殖的效果。
分別用25nM，50nM，100nM的VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7和反義藥物組作用HL60細(xì)胞，結(jié)果轉(zhuǎn)染24小時(shí)，采用嵌套設(shè)計(jì)資料的方差分析發(fā)現(xiàn)，同一藥物的不同濃度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而不同組別之間差異顯著(F＝4.231，P＝0.016)，其中VEGFsiRNA2、VEGFsiRNA7與空白對(duì)照組有差異，而反義藥物組與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見圖4和表6。
表6轉(zhuǎn)染藥物24小時(shí)后的細(xì)胞生長狀況

實(shí)施例六VEGFsiRNA在制備抗肝癌和白血病藥物中的應(yīng)用。
取實(shí)施例一合成的VEGFsiRNA1～9中任一條序列，配制成濃度為25nmol/l的抗肝癌或抗白血病藥品，臨床上可以通過靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內(nèi)進(jìn)行治療。
實(shí)施例七VEGFsiRNA在制備抗肝癌和白血病藥物中的應(yīng)用。
取實(shí)施例一合成的VEGFsiRNA2和VEGFsiRNA7，混合配制成濃度為25nmol/l的抗肝癌或抗白血病藥品，臨床上可以通過靜脈注射或者直接將siRNA藥物直接注射到瘤體內(nèi)進(jìn)行治療。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)<120>抑制腫瘤和白血病細(xì)胞VEGF表達(dá)和增殖的siRNA及應(yīng)用<130>1<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA1序列正義鏈<400>1aacttcacca cttcgtgatg a 21<210>2<211>21<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA1序列反義鏈<400>2aatcatcacg aagtggtgaa g 21<210>3<211>21
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<223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA2序列正義鏈<400>3aatatctttc tttggtctgc a 21<210>4<211>21<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA5序列正義鏈<400>9aataactcaa gctgcctcgc c 21<210>10<211>21<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA8序列反義鏈<400>16aacgaacgta cttgcagatg t 21<210>17<211>21<212>DNA
<213>Artificial sequence<220>
<223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VEGFsiRNA9序列正義鏈<400>17aattcccttt cctcgaactg a 21<210>18<211>21<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>采用siRNA設(shè)計(jì)法則并結(jié)合RNAstructure3.7軟件輔助設(shè)計(jì)VE6FsiRNA9序列反義鏈<400>18aatcagttcg aggaaaggga a 2權(quán)利要求
1.一種抑制腫瘤和白血病細(xì)胞VEGF表達(dá)和增殖的siRNA，包括以下九條序列中的任一條或一條以上VEGFsiRNA1正義鏈AACTTCACCACTTCGTGATGA，反義鏈AATCATCACGAAGTGGTGAAG；VEGFsiRNA2正義鏈AATATCTTTCTTTGGTCTGCA，反義鏈AATGCAGACCAAAGAAAGATA；VEGFsiRNA3正義鏈AAATTTACACGTCTGCGGATC，反義鏈AAGATCCGCAGACGTGTAAAT；VEGFsiRNA4正義鏈AATCTCTCCTATGTGCTGGCC，反義鏈AAGGCCAGCACATAGGAGAGA；VEGFsiRNA5正義鏈AATAACTCAAGCTGCCTCGCC，反義鏈AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTA；VEGFsiRNA6正義鏈AATGTCACATCTGCAAGTACG，反義鏈AACGTACTTGCAGATGTGACA；VEGFsiRNA7正義鏈AATTTCTTGTCTTGCTCTATC，反義鏈AAGATAGAGCAAGACAAGAAA；VEGFsiRNA8正義鏈AAACATCTGCAAGTACGTTCG，反義鏈AACGAACGTACTTGCAGATGT；VEGFsiRNA9正義鏈AATTCCCTTTCCTCGAACTGA；反義鏈AATCAGTTCGAGGAAAGGGAA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制腫瘤和白血病細(xì)胞VEGF表達(dá)和增殖的siRNA，包括以下兩條序列VEGFsiRNA2正義鏈AATATCTITCTTTGGTCTGCA，反義鏈AATGCAGACCAAAGAAAGATA；VEGFsiRNA7正義鏈AATTTCTTGTCTTGCTCTATC，反義鏈AAGATAGAGCAAGACAAGAAA。
3.權(quán)利要求1所述的任一條或一條以上siRNA序列用于制備抗腫瘤的藥物。
4.權(quán)利要求1所述的任一條或一條以上siRNA序列用于制備抗肝癌的藥物。
5.權(quán)利要求1所述的任一條或一條以上siRNA序列用于制備抗白血病的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的siRNA序列用于制備抗肝癌的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為9條抑制VEGF蛋白表達(dá)的增殖的siRNA序列。經(jīng)過MTT和CCK8法檢測(cè)，9條VEGFsiRNA改變SMMC7721細(xì)胞的生物學(xué)特性，抑制腫瘤和白血病細(xì)胞的生長和增殖，ELISA檢測(cè)9條VEGFsiRNA序列均可下調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)。形態(tài)學(xué)觀察，VEGFsiRNA能引起腫瘤和白血病細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化。因此，VEGFsiRNA可用于制備抗腫瘤和白血病的藥物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1727477SQ20051003500
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者張洹, 荊春霞 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)