專利名稱：1－脫氧野尻霉素在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物學(xué)領(lǐng)域，公開了1-脫氧野尻霉素的一種新的藥物用途更特別的，本發(fā)明涉及1-脫氧野尻霉素在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，在西方國家糖尿病腎病是引起終末期腎臟疾病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因，美國透析病人中DN占30.0％，目前我國DN發(fā)病率呈上升趨勢，已占透析病人的13.5％。糖尿病腎病嚴(yán)重威脅患者的生命，并給社會(huì)和家庭造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此迫切需要深入闡明糖尿病腎臟的發(fā)病機(jī)制，并豐富和完善DN的防治措施。
糖尿病腎病細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多、降解減少，病理學(xué)特征表現(xiàn)為系膜擴(kuò)張和基底膜增厚，導(dǎo)致腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化。
腎小球系膜細(xì)胞是腎小球內(nèi)主要固有細(xì)胞之一，占腎小球細(xì)胞總數(shù)的30％-40％。系膜細(xì)胞呈多形性，胞漿及突起內(nèi)含有大量微絲樣結(jié)構(gòu)。系膜細(xì)胞可產(chǎn)生系膜基質(zhì)。系膜細(xì)胞具有收縮、吞噬及清除異物等多種功能。研究表明系膜細(xì)胞合成ECM增多，在DN腎小球硬化過程中起重要作用(HanedaM，Koya D，Kikkawa R.Mesangial cell dysfunction as a pathogenesis ofdiabetic nephropathy.Contrib Nephrol.2001.13416-29)。
1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是一種哌啶類多羥基生物堿，為天然糖結(jié)構(gòu)類似物，其化學(xué)名稱是3，4，5，3羥基-2-羥甲基哌啶，DNJ的化學(xué)結(jié)構(gòu)如(I)所示，分子式為C6H13NO4，分子量為163.2，它是一種天然糖的結(jié)構(gòu)類似物，該化合物及其衍生物具有很強(qiáng)的α-糖苷酶抑制活性，其機(jī)理是競爭性抑制腸道α-糖苷酶的活性，主要應(yīng)用研究多集中于糖尿病餐后血糖的抑制，如德國拜耳公司的第三代α-糖苷酶抑制劑米格列醇是DNJ的衍生物。
生物體內(nèi)糖苷酶廣泛存在，并參與重要的生命活動(dòng)過程，如細(xì)胞和大分子表面的觸須捕捉，細(xì)胞間的識(shí)別等。近年來研究表明DNJ不僅在腸道抑制α-糖苷酶活性而起降低餐后血糖升高外，可以進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮其生物活性，如抑制病毒復(fù)制過程中的糖鏈合成，影響糖蛋白的加工過程糖基的加工修飾。所以作為糖苷酶抑制劑也具有多樣的功能，對(duì)1-脫氧野尻霉素及其衍生物的進(jìn)一步研究為創(chuàng)立臨床疾病治療新方法、新藥開發(fā)提供了新的方向。
目前，除具有降糖作用外，1-脫氧野尻霉素及其衍生物具有抑制糖原分解及心肌保護(hù)、抗腫瘤、病毒抑制、GSLs貯積病治療等作用。但是，DNJ對(duì)糖尿病腎病治療作用如何，國內(nèi)外尚無報(bào)道。
本發(fā)明人觀察了DNJ對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖、合成ECM的影響，并從表達(dá)α-SMA、TGFβ1mRNA、整合素β1mRNA的變化，驗(yàn)證了其防治糖尿病腎病的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供1-脫氧野尻霉素在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種對(duì)于糖尿病腎病有效的藥物組合物，含有安全有效量的1-脫氧野尻霉素，以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，描述了1-脫氧野尻霉素對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞增殖的抑制作用。
糖尿病腎病的特定病征為系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)增多而引起腎小球系膜基質(zhì)硬化。系膜細(xì)胞是腎小球系膜的主要成分，具有收縮、內(nèi)分泌、分裂增殖、免疫及吞噬作用多種功能，對(duì)腎小球生理功能的調(diào)節(jié)起著重要作用。所以高濃度葡萄糖培養(yǎng)環(huán)境中的系膜細(xì)胞是研究糖尿病性腎小球硬化癥發(fā)生機(jī)制的具有使用價(jià)值的模型。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，48h 5、10mmol/L DNJ組、72h 2.5、5、10mmol/L DNJ組均可抑制高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞的增殖?？赡軝C(jī)理為DNJ為糖苷酶抑制劑，抑制糖苷酶可誘導(dǎo)糖鏈從細(xì)胞表面去除，細(xì)胞表面的糖蛋白糖鏈的缺失可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，另外糖蛋白加工過程中，糖蛋白的合成受抑制，也可以導(dǎo)致細(xì)胞DNA的合成下降，從而抑制細(xì)胞的增殖。因此可見，DNJ對(duì)高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞增殖具有抑制作用，可在糖尿病腎病的早期治療中發(fā)揮作用。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，描述了1-脫氧野尻霉素對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)其可抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞α-SMA表達(dá)的升高。
α-SMA是一種細(xì)胞骨架蛋白，是細(xì)胞張力纖維的主要成分，與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)。細(xì)胞增殖和肥大是系膜細(xì)胞激活的表現(xiàn)，在炎癥刺激下，系膜細(xì)胞可以從靜止期表型向增生性成肌纖維細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的特征是α-SMA表達(dá)增加，這種表型轉(zhuǎn)化也是腎小球病變進(jìn)展及趨于慢性化的基本特征。
在本發(fā)明提供的實(shí)施例2中，本發(fā)明人的研究顯示，DNJ可抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞α-SMA表達(dá)的升高，逆轉(zhuǎn)高糖培養(yǎng)引起的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，提示DNJ對(duì)早期糖尿病腎病具有治療作用。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，描述了1-脫氧野尻霉素對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞合成IV型膠原、纖維連接蛋白的影響。
本發(fā)明人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)增多，且隨時(shí)間延長增多明顯。DNJ能夠抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞ECM產(chǎn)生增多，提示DNJ對(duì)糖尿病腎病具有治療作用。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，描述了1-脫氧野尻霉素對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞TGFβ1、整合素β1mRNA表達(dá)的影響。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，DNJ能夠降低TGFβ1mRNA的表達(dá)，從而減少了細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白和IV型膠原合成增多，詳細(xì)的例子可見以下的實(shí)施例4。
本發(fā)明通過細(xì)胞模型進(jìn)行試驗(yàn)，充分驗(yàn)證了DNJ對(duì)于糖尿病腎病的治療作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，盡管本發(fā)明的實(shí)施例中采用的是動(dòng)物試驗(yàn)，但是DNJ對(duì)于人類也是同樣有效的。
本發(fā)明還涉及可用于治療糖尿病腎病的藥物組合物，它含有上述的1-脫氧野尻霉素，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括但并不限于腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可直接用于糖尿病腎病的治療。此外，還可同時(shí)使用其他治療劑。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的1-脫氧野尻霉素以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，配制成適合給藥于糖尿病腎病患者的方式。所述載體包括但并不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。


圖1顯示了DNJ對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖的影響。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 1-脫氧野尻霉素對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響1.材料和試劑大鼠系膜細(xì)胞系由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬上海長征醫(yī)院腎內(nèi)科梅長林教授惠贈(zèng)。試劑1-脫氧野尻霉素為日本和光Wako產(chǎn)品；MTT和DMSO為AMRESCO產(chǎn)品；Trypan Blue為美國Sigma產(chǎn)品。酶標(biāo)儀為芬蘭LabsystemMK3出品。
2.方法2.1高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)分組正常葡萄糖組(NG)D-葡萄糖濃度為5mmol/L。高糖組(HG)D-葡萄糖濃度為30mmol/L。每組設(shè)復(fù)孔6個(gè)。高滲組(甘露醇組)D-葡萄糖(5mmol/L)+甘露醇(25mmol/L)。
實(shí)驗(yàn)方法按常規(guī)方法將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至亞融合時(shí)換為無血清培養(yǎng)液中作用24h，使細(xì)胞同步于G0期。各組分別作用24h、48h、72h、96h，各時(shí)相點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h加MTT 10μl/孔，吸棄上清，加二甲基亞砜100μl/孔，振蕩5分鐘，570nm波長處讀取吸光度A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.2DNJ對(duì)系膜細(xì)胞毒性的影響(臺(tái)盼藍(lán)染色)將第2-5代MCs轉(zhuǎn)種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5×104/ml(臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞活性度＞95％)，培養(yǎng)2天后，加入最大實(shí)驗(yàn)用量DNJ 10mmol/L，以5mmol/L D-Glucose培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)96h后，行臺(tái)盼蘭染色，觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞比率。
2.3DNJ對(duì)正常糖組系膜細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)分組NG+DNJ(1mmol/L)組，NG+DNJ(2.5mmol/L)，NG+DNJ5mmol/L，NG+DNJ10mmol/L，另設(shè)不加DNJ的正常糖組為對(duì)照組。
實(shí)驗(yàn)方法將第2-5代系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)種于96孔板內(nèi)。調(diào)細(xì)胞進(jìn)入G0期，按上述分組分別予以DNJ干預(yù)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組分別作用24h、48h、72h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h加MTT 10μl/孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)吸棄上清，加二甲基亞砜100μl/孔，振蕩5分鐘，570nm波長處讀取吸光度A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.4DNJ對(duì)高糖組系膜細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)分組正常葡萄糖組(NG)D-葡萄糖濃度為5mmol/L；高糖組(HG)D-葡萄糖濃度為30mmol/L；HG+DNJ(1mmol/L)組，HG+DNJ(2.5mmol/L)，HG+DNJ5mmol/L HG+DNJ10mmol/L。
實(shí)驗(yàn)方法同上。
2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.結(jié)果3.1高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響與正常糖濃度組相比高糖組24h對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響(P＞0.05)；高糖組48h可促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖(P＜0.05)；高糖組72h、96h抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)，表明高糖對(duì)體外培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖具有雙相作用(見表1)。
表1高糖對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響(A值，X±SD)

與5mmol/L葡萄糖組比較，*P＜0.05；與甘露醇組比較，#P＜0.053.2DNJ對(duì)系膜細(xì)胞的毒性測定測定結(jié)果表明，最大劑量的DNJ對(duì)正常培養(yǎng)的系膜細(xì)胞無殺傷作用(見表2)。
表2DNJ對(duì)MCs體外存活率的影響

3.3DNJ對(duì)正常糖組系膜細(xì)胞增殖的影響測定結(jié)果表明，24h與正常對(duì)照組比較，各劑量DNJ組均無顯著差異(P均＞0.05)；48h時(shí)與正常對(duì)照組比較，DNJ10mmol/L抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05＝；72h時(shí)與正常對(duì)照組比較，DNJ 5、10mmol/L對(duì)系膜細(xì)胞增殖均有抑制作用(P均＜0.05)(見表3)。
表3DNJ對(duì)正常糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖的影響(A值，X±SD)

與同一時(shí)間點(diǎn)正常糖對(duì)照組比較，*P＜0.053.4DNJ對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖的影響與高糖組相比DNJ各劑量組(1、2.5、5、10mmol/L)作用24h，對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響(P均＞0.05)；48h時(shí)DNJ1、2.5mmol/L兩組均對(duì)高糖促系膜細(xì)胞增殖無顯著作用(P均＞0.05)，48h DNJ 5、10mmol/L兩組均顯著抑制高糖導(dǎo)致的系膜細(xì)胞增殖(P＜0.05、P＜0.001)；72h除DNJ1mmol/L組對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖無顯著作用外，其余各組均顯著抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖(P均＜0.001)。DNJ具有抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖的作用，呈劑量依賴關(guān)系。見表4以及圖1。
表4DNJ對(duì)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖的影響(A值，X±SD)


與正常糖組比較，△P＜0.05；與高糖組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.001實(shí)施例21-脫氧野尻霉素對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響1.材料和試劑α-smooth muscle actin武漢博士德生物公司，使用時(shí)1∶200無菌水稀釋。大鼠IV型膠原(type IV collagen)、大鼠纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)ELISA試劑盒上海森雄生物公司。UltraSensitiveTMS-P免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，福州邁新生物公司。
2.方法2.1實(shí)驗(yàn)分組與藥物干預(yù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分組①正常糖組(NG)5mmol/L D-葡萄糖；②高糖組(HG)30mmol/L D-葡萄糖；③甘露醇組(M)5mmol/L D-葡萄糖+25mmol/L甘露醇；④DNJ組D-葡萄糖30mmol/L+DNJ5mmol/L，另設(shè)正常糖陰性對(duì)照組(不加一抗)。
藥物干預(yù)時(shí)間免疫細(xì)胞化學(xué)檢測DNJ作用48小時(shí)α-SMA表達(dá)2.2實(shí)驗(yàn)步驟選取對(duì)數(shù)生長期的大鼠MCs，接種于Chamber Slide上，培養(yǎng)至細(xì)胞亞融合，無血清培養(yǎng)基同步化24小時(shí)，按上述分組，給予干預(yù)因素，作用48h；按免疫組化試劑盒說明書方法進(jìn)行染色。
2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用IPP(Image pro plus)圖象分析軟件分析，每張玻片隨機(jī)選取6個(gè)視野分析，分別測定平均光密度、累積光密度、陽性區(qū)域面積，累積光密度＝平均光密度×陽性區(qū)域面積。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析累積光密度值，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.結(jié)果與正常糖組、高滲組相比，高糖組累積光密度值均顯著升高(P均＜0.05)。與高糖組相比，DNJ5mmol/L累積光密度值明顯降低(P＜0.05)。(見表5)。DNJ抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞α-SMA表達(dá)升高。
表5 1-脫氧野尻霉素對(duì)大鼠系膜細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響(IOD值，X±s)

與正常糖組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05實(shí)施例3 1-脫氧野尻霉素對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞合成IV型膠原、纖維連接蛋白的影響1.材料與試劑大鼠IV型膠原typeIVcollagen、大鼠纖維連接蛋白(Fibronectin)ELISA試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1ELISA法測定IV型膠原、纖維連接蛋白的表達(dá)按常規(guī)方法將MSc細(xì)胞接種于24孔板，同步于G0期后，分為正常葡萄糖濃度(NG)組含D-葡萄糖5mmol/L；高葡萄糖濃度(HG)組含D-葡萄糖30mmol/L；甘露醇組(M)組含D-葡萄糖5mmol/L+25mmol/L甘露醇；DNJ組含D-葡萄糖30mmol/L+1-脫氧野尻霉素(DNJ)。并干預(yù)細(xì)胞24h、48h、72h后，收集上清凍存于-70℃冰箱待測。
2.1實(shí)驗(yàn)方法按大鼠IV型膠原及纖維連接蛋白ELISA試劑盒說明書操作。
2.2統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以Excel軟件存儲(chǔ)，表示為means±s，應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，各組間差異采用方差分析。
3.結(jié)果3.1DNJ對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞產(chǎn)生IV型膠原的影響與正常糖組相比高糖組48hIV型膠原產(chǎn)生增多(P＜0.05)，72h增多更加明顯(P＜0.01)；高糖組問比較72h組較24h組IV型膠原產(chǎn)生顯著增多(P＜0.05)；48h組與72h組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與高糖組相比，DNJ組48h可抑制IV型膠原產(chǎn)生增多(P＜0.05)，72h組抑制作用更加顯著(P＜0.01)。見表6。
表6DNJ對(duì)系膜細(xì)胞產(chǎn)生IV型膠原的影響(OD值，X±SD)

注與正常糖組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高糖組比較，#P＜0.05，##P＜0.013.2DNJ對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞產(chǎn)生FN的影響與正常糖組相比高糖組48hFN產(chǎn)生增多(P＜0.05)，72h增多更加明顯(P＜0.01)；高糖組間比較72h組較24h組FN型膠原產(chǎn)生顯著增多(P＜0.05)，48h組與72h組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與高糖組相比，DNJ組48h、72h可抑制FN型膠原產(chǎn)生增多(P＜0.05)，72h抑制作用更加顯著(P＜0.01)。見表7。
表7DNJ對(duì)系膜細(xì)胞產(chǎn)生FN的影響(OD值，X±SD)

注與正常糖組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高糖組比較，#P＜0.05，##P＜0.01實(shí)施例4 1-脫氧野尻霉素對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞TGFβ1、整合素β1mRNA表達(dá)的影響1材料與試劑總RNA抽提試劑Trizol美國Invitrogen公司；RNase-Free DNase大連寶生物工程有限公司；RNA酶抑制劑華美生物工程有限公司；oligoDT、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTP、DNA marker、Loading Buffer大連寶生物工程有限公司TaKaRa產(chǎn)品；Unico UV-2000型紫外分光光度計(jì)為BeckMan；PTC200型基因擴(kuò)增儀為MJ Research，USA；凝膠圖像處理系統(tǒng)UVP。引物均由上海捷倍思技術(shù)有限公司合成，見表8。
表8PCR特異性引物及擴(kuò)增條件

2實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分組正常葡萄糖濃度(NG)組含D-葡萄糖5mmol/L；高葡萄糖濃度(HG)組含D-葡萄糖30mmol/L；甘露醇組(M)組含D-葡萄糖5mmol/L+25mmol/L甘露醇；DNJ組含D-葡萄糖30mmol/L+5mmol/L1-脫氧野尻霉素(DNJ)。
實(shí)驗(yàn)方法按常規(guī)方法接種腎小球系膜細(xì)胞，培養(yǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞布滿瓶底給予無血清RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，然后分別給予以上四種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。用Trizol試劑一步法提取系膜細(xì)胞總RNA。以O(shè)ligogo(dT)為引物，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA。然后以cDNA為模板利用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。應(yīng)用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，拍照并進(jìn)行半定量分析，計(jì)算目的基因/β-actin mRNA相對(duì)值。
3統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以Excel軟件存儲(chǔ)，結(jié)果表示為mean±s，應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組間差異用方差分析。
4.結(jié)果TGFβ1、整合素β1 mRNA表達(dá)情況見表9。
表9TGFβ1、整合素β1mRNA表達(dá)(灰度值，靶基因/內(nèi)參X±SD)

與正常糖組比較，*p＜0.05；與高糖組比較，#p＜0.05本發(fā)明人的研究顯示，高糖培養(yǎng)48h后，系膜細(xì)胞TGFβ1、整合素β1mRNA水平明顯升高，在甘露醇組未見TGFβ1、整合素β1mRNA的高表達(dá)，說明高糖促進(jìn)TGFβ1、整合素β1mRNA表達(dá)升高不依賴于滲透壓的影響。而DNJ處理組TGFβ1、整合素β1mRNA水平則明顯下降，說明DNJ可下調(diào)高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞TGFβ1、整合素β1mRNA的表達(dá)。
綜上所述，本發(fā)明人首次證實(shí)生物堿1-脫氧野尻霉素可抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖，并可抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)增多，從一個(gè)新視角證明了糖苷酶抑制劑對(duì)糖尿病腎病具有防治作用，這為糖尿病腎病的防治開拓了嶄新的治療方向。
權(quán)利要求
1.1-脫氧野尻霉素在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。
2.一種對(duì)于糖尿病腎病有效的藥物組合物，其特征在于，含有安全有效量的1-脫氧野尻霉素，以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物學(xué)領(lǐng)域，公開了1－脫氧野尻霉素在制備治療糖尿病腎病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了對(duì)于糖尿病腎病有效的藥物組合物，其含有安全有效量的1－脫氧野尻霉素，以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明人首次證實(shí)生物堿1－脫氧野尻霉素可抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞增殖，并可抑制高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)增多，從一個(gè)新視角證明了糖苷酶抑制劑對(duì)糖尿病腎病具有防治作用。
文檔編號(hào)A61K31/445GK1709251SQ20051002678
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月15日
發(fā)明者原愛紅, 黃哲, 馬駿, 蔣曉峰, 吳毅泰 申請人:同濟(jì)大學(xué)