專利名稱：豬苓多糖硫酸酯的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種主要用于抗乙型肝炎病毒(HBV)活性的多糖硫酸酯的制備方法，具體涉及的是對豬苓中的活性成分——水溶性豬苓多糖進行硫酸酯化修飾制備豬苓多糖硫酸酯的方法。
背景技術(shù)：
乙肝是一個嚴重的影響公眾健康問題，具有傳染性強，流行面廣和發(fā)病率高的特點，本病是目前已知七型肝炎中危害最大的一種。此種感染最終可發(fā)展為肝硬化、肝癌，是當前WTO公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。目前世界上有3億多人感染慢性乙型肝炎病毒，而我國近兩年據(jù)粗略估計，約有1.3億人是慢性乙型肝炎病毒感染者，其中有2000-3000萬左右患者需要抗病毒治療。對HBV的治療，尚沒有一種特效的藥物能夠達到滿意的治療效果，尋找有效的抗HBV藥物是當務之急。核普類似物在抗HBV方面顯示了其良好的治療作用，但由于其停藥后復發(fā)率高，對HBeAg作用不明顯，使其臨床應用受到了極大的限制。而從中草藥中可分離有效成分作為先導化合物并進行結(jié)構(gòu)改造得到新型高效低毒的抗肝炎藥物且具有眾多優(yōu)點，目前已有不少用于治療乙型肝炎的臨床觀察。當前常用于治療病毒性乙型肝炎的中藥有苦參素、白花蛇舌草、豬苓多糖、香菇多糖、冬蟲夏草等等。中藥作為干擾素、拉米夫定等抗病毒藥物的輔助治療，對提高療效、減輕副作用早已有許多報道。
多糖是一種良好的中藥活性成分，多糖在醫(yī)藥上還是一種很好的佐劑。能提高機體的免疫功能，具有防衰老、防癌、抗癌、抗肝炎等作用。豬苓多糖具有抗腫瘤和抗肝炎的生物活性，臨床上已用于癌癥輔助治療以及用以治療肝炎。
自1987年發(fā)現(xiàn)硫酸酯化葡聚糖可抑制艾滋病病毒(HIV)的活性以來，人們對硫酸酯化多糖(SPS)或稱多糖硫酸酯(PSS)產(chǎn)生了極大的興趣。有些本身不表現(xiàn)抗病毒活性的多糖，經(jīng)人工化學修飾得到的硫酸酯化多糖也具有抗病毒活性，這類人工合成的硫酸酯化多糖包括硫酸化右旋糖酐；硫酸化香菇多糖；硫酸化木聚糖。目前國內(nèi)外尚無文獻報道有關(guān)豬苓多糖硫酸酯的合成與及其對豬苓多糖生物活性影響的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物活性強的豬苓多糖硫酸酯的制備方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是豬苓多糖硫酸酯的制備方法，其特征是包括如下步驟1).制備酯化試劑按吡啶∶氯磺酸的體積份數(shù)比＝10∶1-3選取吡啶和氯磺酸，將附有冷凝裝置和攪拌裝置的容器置于鹽水-冰浴中加入吡啶，攪拌下緩慢加入氯磺酸，繼續(xù)攪拌20-40分鐘，得酯化試劑，密封后置冰箱中備用；2).豬苓多糖懸浮液的制備按豬苓多糖粉末∶無水甲酰胺或二甲基甲酰胺的質(zhì)量比＝(0.4-2.0)∶(36-48)選取豬苓多糖粉末，無水甲酰胺或二甲基甲酰胺，將豬苓多糖粉末懸浮于無水甲酰胺或二甲基甲酰胺中，得豬苓多糖懸浮液；3).進行酯化反應按酯化試劑∶豬苓多糖懸浮液中的無水甲酰胺或二甲基甲酰胺的體積比＝27.5-75∶40選取酯化試劑，將豬苓多糖懸浮液緩慢加入酯化試劑中，于100℃的水浴下攪拌反應2-4小時，冷至室溫，加反應液體積的0.3-0.5倍的冰水，用濃度為2.0-3.0mol/L NaOH中和到PH值為6-8；4).沉淀中和后加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，液固離心分離，收集沉淀物A；5).純化將沉淀物A溶于水，流水透析48-72小時，蒸餾水透析22-26小時，得到除去小分子雜質(zhì)后的水溶液B；6).對水溶液B采用無水乙醇沉淀水溶液B中加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，靜置12-24小時，液固離心分離，收集沉淀物C，對沉淀物C冷凍干燥，得豬苓多糖硫酸酯。
由圖1-3可知，通過豬苓多糖硫酸酯和豬苓多糖的紅外光譜對照分析表明，豬苓多糖硫酸酯除了多糖母體特征吸收峰得以保留外，還增加了1240cm-1左右的吸收，表明為OSO3-的S＝O伸縮振動，810cm-1左右的吸收表明為C-O-S的拉伸振動，這些是硫酸鍵的特征吸收峰；同時，還可以看出豬苓多糖硫酸酯在3400cm-1附近的羥基吸收峰有所降低，表明部分羥基已被酯化，以上充分說明豬苓多糖已形成豬苓多糖硫酸酯。
本發(fā)明對豬苓多糖進行硫酸酯化后，顯著增強其生物活性，產(chǎn)生了原多糖所不具有的生物活性。研究表明豬苓多糖硫酸酯具有可以減輕肝組織的病理損傷，促進肝細胞再生和肝功能恢復，還可以促進乙型肝炎表現(xiàn)抗體的產(chǎn)生。另外還能刺激機體的免疫細胞，釋放淋巴因子，提高機體的體液免疫及細胞免疫，具有抗腫瘤的作用，與化療藥物合用具有增效減毒的作用。本發(fā)明得到的豬苓多糖硫酸酯能增強治療乙型肝炎療效而減小毒副作用，能更好的用于乙型肝炎及化療的輔助治療。


圖1為豬苓多糖的紅外光譜2為豬苓多糖硫酸酯的紅外光譜3為豬苓多糖與豬苓多糖硫酸酯的紅外光譜對照圖具體實施方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。
實例11.儀器不銹鋼鍋、電爐、玻璃棒、燒杯(1000ml)、量筒(1000ml)、分析天平、紐力天平、錐形瓶、溫度計、透析袋、移液管(10ml，5ml)、三頸燒瓶、球形冷凝管、分液漏斗、滴液漏斗、攪拌器、TDL-5臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海嘉朋科技有限公司)、KQ-100B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、766-2型遠紅外快速干燥箱(滬粵科學儀器廠)、SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)、WQF-200傅立葉變換紅外光譜儀(北京第二光學儀器廠)。
2.試劑
吡啶、氯磺酸、無水乙醇、2.5mol·L-1NaOH(以上試劑均為分析純)3.豬苓多糖的鑒定α-萘酚-濃硫酸反應(Molisch反應)于豬苓多糖的水解溶液中加入10％α-萘酚乙醇溶液混合后，沿著器壁滴加濃硫酸，使酸層集于下層。多糖類在此條件下水解產(chǎn)生單糖，則于兩液層交界處呈現(xiàn)紫色環(huán)，推測該反應的機制可能是由于糖先轉(zhuǎn)變?yōu)樘侨┗蚱溲苌?，在與醛縮合并經(jīng)氧化而產(chǎn)生有色物質(zhì)。
本實驗鑒定了豬苓中提取的多糖成分。呈正反應。
4.豬苓多糖硫酸酯的制備氯磺酸-吡啶法將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置鹽水-冰浴中，加入吡啶25ml，攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸2.5ml，約30-40min滴加完畢，燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，得酯化試劑；將多糖粉末0.4g懸浮于二甲基甲酰胺40ml，得豬苓多糖懸浮液；緩慢地將豬苓多糖懸浮液加入到酯化試劑中，迅速將三頸燒瓶移入沸水浴中，恒溫攪拌1.8-2.2小時，冷至室溫，將反應液傾入反應液0.3-0.5倍的冰水中，用濃度為2.5mol/L NaOH中和到PH值為6-8；中和后加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，液固離心分離，收集沉淀物A；將沉淀物A溶于水，透析48h，蒸餾水透析24h，得到除去小分子雜質(zhì)后的水溶液B；對水溶液B再次采用無水乙醇沉淀水溶液B中加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，靜置12-24小時，液固離心分離，收集沉淀物C，對沉淀物C冷凍干燥；得豬苓多糖硫酸酯。
5.豬苓多糖硫酸酯的紅外光譜分析將豬苓多糖與豬苓多糖硫酸酯粉末用溴化鉀壓片后，運用WQF-200傅立葉變換紅外光譜儀進行紅外分析。
6.分析通過豬苓多糖硫酸酯和豬苓多糖的紅外光譜對照分析(圖3)表明，豬苓多糖硫酸酯除了多糖母體特征吸收峰得以保留外，還增加了1240cm-1左右的吸收，表明為OSO3-的S＝O伸縮振動，810cm-1左右的吸收表明為C-O-S的拉伸振動，這些是硫酸鍵的特征吸收峰；同時，還可以看出豬苓多糖硫酸酯在3400cm-1附近的羥基吸收峰有所降低，表明部分羥基已被酯化，以上充分說明豬苓多糖已形成豬苓多糖硫酸酯。豬苓多糖經(jīng)過硫酸酯化化學修飾后能顯著增強其生物活性，或產(chǎn)生原多糖所不具有的生物活性。
實例2將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置于鹽水-冰浴中，加入吡啶40ml，劇烈攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸5ml，30min滴加完畢，燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，得酯化試劑；將豬苓多糖粉末0.5g懸浮于無水甲酰胺40ml，得豬苓多糖懸浮液；緩慢地將豬苓多糖懸浮液加入到酯化試劑中，迅速將三頸瓶移入沸水浴中(100℃)，恒溫攪拌1.8-2.2小時，冷至室溫，將反應液傾入反應液0.3-0.5倍的冰水中，用濃度為2.5mol/L NaOH中和到PH值為6-8；中和后加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，液固離心分離，收集沉淀物A；將沉淀物A溶于水，透析48h，蒸餾水透析24h，得到除去小分子雜質(zhì)后的水溶液B；對水溶液B再次采用無水乙醇沉淀水溶液B中加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，靜置12-24小時，液固離心分離，收集沉淀物C，對沉淀物C冷凍干燥；得豬苓多糖硫酸酯。
實例3將附有冷凝管和攪拌裝置于的三頸燒瓶置冰鹽浴中，加入吡啶60ml，劇烈攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸15ml，40min滴加完畢，燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，得酯化試劑；將豬苓多糖粉末2.0g懸浮于無水甲酰胺40ml，得豬苓多糖懸浮液；緩慢地將豬苓多糖懸浮液加入到酯化試劑中，迅速將三頸瓶移入沸水浴中(100℃)，恒溫攪拌2.8-3.2小時，冷至室溫，將反應液傾入反應液0.3-0.5倍的冰水中，用濃度為2.5mol/L NaOH中和到PH值為6-8；中和后加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，液固離心分離，收集沉淀物A；將沉淀物A溶于水，透析48h，蒸餾水透析24h，得到除去小分子雜質(zhì)后的水溶液B；對水溶液B再次采用無水乙醇沉淀水溶液B中加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，靜置12-24小時，液固離心分離，收集沉淀物C，對沉淀物C冷凍干燥；得豬苓多糖硫酸酯。
本發(fā)明的吡啶、氯磺酸、豬苓多糖粉末、無水甲酰胺或二甲基甲酰胺各原料的上限、下限及區(qū)間值都能實現(xiàn)本發(fā)明，在此就不一一舉例。
權(quán)利要求
1.豬苓多糖硫酸酯的制備方法，其特征是包括如下步驟1).制備酯化試劑按吡啶∶氯磺酸的體積份數(shù)比＝10∶1-3選取吡啶和氯磺酸，將附有冷凝裝置和攪拌裝置的容器置于鹽水-冰浴中加入吡啶，攪拌下緩慢加入氯磺酸，繼續(xù)攪拌20-40分鐘，得酯化試劑，密封后置冰箱中備用；2).豬苓多糖懸浮液的制備按豬苓多糖粉末∶無水甲酰胺或二甲基甲酰胺的質(zhì)量比＝0.4-2.0∶36-48選取豬苓多糖粉末，無水甲酰胺或二甲基甲酰胺，將豬苓多糖粉末懸浮于無水甲酰胺或二甲基甲酰胺中，得豬苓多糖懸浮液；3).進行酯化反應按酯化試劑∶豬苓多糖懸浮液中的無水甲酰胺或二甲基甲酰胺的體積比＝27.5-75∶40選取酯化試劑，將豬苓多糖懸浮液緩慢加入酯化試劑中，于100℃的水浴下攪拌反應2-4小時，冷至室溫，加反應液體積的0.3-0.5倍的冰水，用濃度為2.0-3.0mol/L NaOH中和到PH值為6-8；4).沉淀中和后加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，液固離心分離，收集沉淀物A；5).純化將沉淀物A溶于水，流水透析48-72小時，蒸餾水透析22-26小時，得到除去小分子雜質(zhì)后的水溶液B；6).對水溶液B采用無水乙醇沉淀水溶液B中加入無水乙醇使無水乙醇的體積濃度為75-80％，攪拌析出沉淀，靜置12-24小時，液固離心分離，收集沉淀物C，對沉淀物C冷凍干燥，得豬苓多糖硫酸酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多糖硫酸酯的制備方法。豬苓多糖硫酸酯的制備方法，其特征是包括如下步驟1).制備酯化試劑；2).按豬苓多糖粉末∶無水甲酰胺或二甲基甲酰胺的質(zhì)量比＝0.4－2.0∶36－48選取，將豬苓多糖粉末懸浮于無水甲酰胺或二甲基甲酰胺中，得豬苓多糖懸浮液；3).進行酯化反應按酯化試劑∶豬苓多糖懸浮液中的無水甲酰胺或二甲基甲酰胺的體積比＝27.5－75∶40選取酯化試劑，將豬苓多糖懸浮液緩慢加入酯化試劑中，于100℃的水浴下攪拌反應2－4小時，冷至室溫，加冰水，用NaOH中和到pH值為6－8；4).沉淀用無水乙醇沉淀，收集沉淀物；5).純化；6).再沉淀，對沉淀物冷凍干燥，得豬苓多糖硫酸酯。本發(fā)明得到的豬苓多糖硫酸酯具有生物活性強的特點。
文檔編號A61P31/12GK1786034SQ200510019980
公開日2006年6月14日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者劉小平, 徐述明, 王瑩, 萬水昌 申請人:武漢理工大學