專利名稱：靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品。同時(shí)，本發(fā)明還涉及一種靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法及其在靈芝或靈芝孢子制品中含量測(cè)定的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)普遍認(rèn)為靈芝、靈芝孢子產(chǎn)品中多糖含量的測(cè)定以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。其采用硫酸蒽酮溶液，紫外分光光度法測(cè)定，含靈芝多糖以無(wú)水葡萄糖(C6H12O6)計(jì)，而忽視有藥用價(jià)值的多糖肽活性成分的含量。特別是靈芝精粉生產(chǎn)工藝過(guò)程中，往往在靈芝提取液中加入淀粉，或其它淀粉類輔料，使該法無(wú)法排除干擾，造成靈芝產(chǎn)品的多糖含量偏高的問題，從而影響了靈芝產(chǎn)品的質(zhì)量提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，而提供一種可用于檢測(cè)靈芝和靈芝孢子產(chǎn)品中多糖肽含量、從而可提高靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。
本發(fā)明的目還在于提供一種靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品在檢查靈芝產(chǎn)品質(zhì)量中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品，該靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品由下述法制備獲得首先是獲得含有高分子量的多糖肽溶液(其制備的詳細(xì)方法請(qǐng)參見申請(qǐng)人的另一份專利文件—申請(qǐng)?zhí)?00410014681.3)其是以靈芝為原料進(jìn)行水提取，將提取液濃縮離心，用無(wú)水乙醇沉淀，沉淀用水溶解，透析，截留(Gamoderma LucidumPolysaccharide Peptide簡(jiǎn)稱GL-PP)。再通過(guò)進(jìn)一步分離與純化，而得到在毛細(xì)管電泳中呈多糖對(duì)稱峰的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品，其具有下述的理化及生物性質(zhì)1.形狀淺褐色至褐色粉末狀2.分子量相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為20萬(wàn)～40萬(wàn)3.靈芝多糖與肽結(jié)合不分離，其結(jié)構(gòu)中的單糖主要以β-型糖苷鍵連接，另有少數(shù)量以α-糖苷鍵連接4.多糖肽的糖鏈和肽鏈的連接性質(zhì)為O-糖苷鍵連接。在溫和條件下的稀堿水解，可以把與肽鏈上絲氨酸或蘇氨酸的羥基相連的單糖或鏈水解下來(lái)。
5.經(jīng)毛細(xì)管電泳測(cè)多糖呈對(duì)稱峰，因此說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)品是純的(見圖1)6.紅外光譜(IR)紅外光譜(IR)，通過(guò)400-4000cm-1掃描，GL-PPT組分分析表明，具有多糖吸收峰，分別為3385cm-1，2931cm-1，1647cm-1，1385cm-1和1074cm-1等多糖吸收峰，其中3385cm-1為強(qiáng)寬峰分子中羥基形成多種氫鍵所致的強(qiáng)吸收峰，在(891±7)cm-1處有吸收峰，這表明該糖肽具β-D葡萄糖苷鍵(見圖2)。
7.1H-核磁共振譜(1HNMR)多糖的信號(hào)多數(shù)在δ4.0-5.5ppm范圍，β型的多糖小于5.0ppm。靈芝多糖肽δ4.21ppm處具有寬的異頭碳信號(hào)，說(shuō)明這是D-葡萄糖殘基的構(gòu)象(見圖3)。
8.13C-核磁共振譜(13C NMR)靈芝多糖肽化學(xué)位移103.8→70.2ppm，表明有β-(1→6)；103.8→86.7ppm，表明有β-(1→3)；103.8-80.1ppm，表明有β-(1→4)存在，β-(1→4)連接還有δ81.0處的信號(hào)；103-105ppm為甘露糖和雜多糖等單糖構(gòu)型和構(gòu)象(見圖4)9.靈芝多糖肽中糖與肽連接性質(zhì)在溫和條件下，用稀堿水解，可以把與肽鏈上絲氨酸或蘇氨酸的羥基相連的單糖或鏈水解下來(lái)，說(shuō)明靈芝多糖肽中糖與肽為O-糖苷鍵連接。(見圖5.1，5.2)一般認(rèn)為靈芝主要活性成分為靈芝多糖，由于現(xiàn)有技術(shù)中還沒有意識(shí)到靈芝多糖與肽牢固結(jié)合存在的現(xiàn)實(shí)。自然不可能把它作為檢測(cè)與控制它的質(zhì)量指標(biāo)。本發(fā)明首先確定該化合物存在，提取該化合物做藥理實(shí)驗(yàn)，證明它是活性成分后，又尋找應(yīng)用這個(gè)化合物GL-PPT來(lái)鑒別與控制靈芝產(chǎn)品的質(zhì)量方法，從而可提高被測(cè)產(chǎn)品的的質(zhì)量。這種以多糖肽為標(biāo)準(zhǔn)品，在現(xiàn)有靈芝多糖的研究中未見記載。
現(xiàn)有技術(shù)中從靈芝提取的多糖有白色和淡黃色，分子量有高有低之分，一般在近萬(wàn)到十幾萬(wàn)范圍內(nèi)，而本發(fā)明所獲得多糖肽，從顏色上從淡褐色至褐色，分子量都比現(xiàn)有的多糖高。
本發(fā)明提供了一種制造靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品的方法，該方法包括下述順序的步驟(1)以靈芝為原料母體提取液，濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高分子量多糖肽(GL-PP)，用濃度為1％的靈芝多糖肽GL-PP溶液，在不斷攪拌中緩慢加入或無(wú)水乙醇、或甲醇、或丙酮至原體積的一半、靜置過(guò)夜，用3000-4000r/min離心，得GL-PP-1沉淀，再用或無(wú)水乙醇、或丙酮、或乙醚、或者它們的混合物洗滌該沉淀，并冷藏干燥。
(2)取步驟1所得的1％GL-PP-1溶液，3℃-5℃冷藏12個(gè)小時(shí)以上，次日對(duì)此溶液進(jìn)行離心、棄去沉淀，取清液加2～4倍量無(wú)水乙醇或甲醇或丙酮沉淀，離心靈芝多糖肽，再用或無(wú)水乙醇、或丙酮、或乙醚、或者它們的混合物洗滌該沉淀，冷藏干燥，得GL-PP-2靈芝多糖肽。
(3)取GL-PP-2，加1∶20水溶解，3℃-5℃冷藏12個(gè)小時(shí)以上，次日過(guò)DEAE-纖維素柱分離，分別用水，0.1mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl及1mol/L NaCl先后洗脫，收集0.5mol/L NaCl洗脫部分，流水透析12～48h，蒸餾水透析4～12h，袋內(nèi)液濃縮，冷凍干燥，得淺褐色至褐色粉末狀物質(zhì)為靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品。
在制造方法步驟2中的離心優(yōu)選轉(zhuǎn)速12000r/min離心10～40分鐘。
當(dāng)需要進(jìn)一步提高標(biāo)準(zhǔn)品GL-PPT的純度時(shí)，可重復(fù)上述的第3步驟。
本發(fā)明提供了一種靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)定靈芝或靈芝孢子產(chǎn)品質(zhì)量中的應(yīng)用。
本發(fā)明靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)定靈芝藥材活性成分-靈芝多糖肽中的應(yīng)用，以靈芝多糖肽計(jì)，靈芝藥材多糖肽不得少于0.15％。
本發(fā)明靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)定藥準(zhǔn)字《雙靈固本散》中的應(yīng)用，其質(zhì)量應(yīng)控制以靈芝多糖肽計(jì)，2g不得少于0.05g。


圖1為靈芝多糖肽的多糖毛細(xì)管電泳2為GL-PPT紅外光譜3為GL-PPT1H核磁共振4為GL-PPT13C核磁共振5.1為稀堿水解前紫外光譜掃描5.2為稀堿水解后紫外光譜掃描6為靈芝多糖肽紫外光譜掃描7為靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具體實(shí)施方式
通過(guò)下面給出的本發(fā)明的具體實(shí)施例以及比較實(shí)施例可以進(jìn)一步清楚地了解本發(fā)明。但它們不是對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1(一)制造靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品的方法1.將以靈芝為原料母體提取液，濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高分子量的靈芝多糖肽。取濃度為1％的靈芝多糖肽GL-PP溶液，在不斷攪拌中緩慢加入無(wú)水乙醇至原體積的一半、靜置過(guò)夜，用4000r/min離心20分鐘，得GL-PP-1沉淀，分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌該沉淀，并冷藏干燥。
靈芝多糖肽(GL-PP)溶液是經(jīng)由下述方法制備而成的(詳細(xì)的請(qǐng)參見申請(qǐng)人的另一份中國(guó)專利申請(qǐng)2004100146813)1)、挑選段木或袋栽靈芝，將靈芝干品子實(shí)體清潔后，烘干，用粗顆粒粉碎機(jī)破碎成10-20目左右的煙絲狀物質(zhì)。
2)、稱取300克的已經(jīng)粉碎的煙絲狀靈芝，用95％的乙醇3000-4000毫升回流3小時(shí)，回收乙醇，干燥靈芝絲狀物。采用靈芝絲狀物∶熱水＝1∶15的比例對(duì)靈芝絲狀物進(jìn)行熱水回流提取3次，時(shí)間分別為2.5小時(shí)、2小時(shí)、1小時(shí)，合并過(guò)濾后的水提取液。
3)、在60-90℃的溫度下濃縮水提取液至原體積的十分之一，再用速度為3000-4000r/min，時(shí)間為15-30min的離心機(jī)進(jìn)行離心分離，將上清液濃縮至相當(dāng)于每毫升含靈芝生藥量1克為標(biāo)準(zhǔn)。
4)、用三倍量的95％乙醇沉淀濃縮液，攪拌，冷藏靜置得第一沉淀物。將第一沉淀物溶于適量的蒸餾水，將此溶液用2-3倍量的無(wú)水乙醇或甲醇或丙酮沉淀，攪拌，冷藏靜置24小時(shí)得第二沉淀物，將第二沉淀物再離心冷藏干燥得多糖肽粗制品。
5)、將4)糖肽溶于蒸餾水，放置于透析袋內(nèi)，逆流透析48小時(shí)得透析液，將透析液在60-90℃下濃縮，離心而得濃縮液。
6)、用三倍量于濃縮液的無(wú)水乙醇處理濃縮液，得多糖肽沉淀，將多糖肽沉淀用無(wú)水乙醇，丙酮和乙醚各洗滌3次，用速度為3000-4000r/min，時(shí)間為10-20min的離心機(jī)進(jìn)行離心分離，棄上清液，取沉淀物于冷藏干燥即得靈芝多糖肽(GL-PP)，該靈芝多糖肽的重均分子量MW在45萬(wàn)-54萬(wàn)之間，多糖肽呈黃褐色至褐色粉末狀，其多糖組成為鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖，且各糖摩爾比為0.549∶3.614∶3.167∶0.556∶6.89。
2.取步驟1所得的1％GL-PP-1溶液，冷藏過(guò)夜，次日用12000r/min離心20分鐘，棄去沉淀，取清液加3倍量無(wú)水乙醇沉淀多糖肽，分別用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，冷藏干燥，得GL-PP-2多糖肽。
3.取GL-PP-2，加1∶20水溶解，冷藏過(guò)夜，次日過(guò)DEAE-纖維素柱分離，分別用水，0.1mol/L NaCl和0.5m0l/L NaCl及1mol/L NaCl先后洗脫，收集0.5mol/L NaCl洗脫部分，流水透析16h，蒸餾水透析4h，袋內(nèi)液濃縮，冷凍干燥，得淺褐色至褐色粉末物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)品GL-PPT。
該標(biāo)準(zhǔn)品在檢糖的同時(shí)又檢肽，證明糖肽不分離。通過(guò)分離、純化所得GL-PPT多糖肽中多糖，經(jīng)毛細(xì)管電泳(CE)測(cè)定其多糖呈對(duì)稱峰，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)品是純的。
(二)以GL-PPT作為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)靈芝產(chǎn)品的方法1.檢測(cè)條件試驗(yàn)1.1波長(zhǎng)的選擇以0.25％GL-PPT在紫外分光光度計(jì)上掃描(900～450nm)，其最大吸收峰處在761.50nm上，吸收值為0.509。因此，檢測(cè)吸收波長(zhǎng)選擇為760nm(見圖6)。
1.2供試液的制備1.2.1靈芝供試液的制備準(zhǔn)確稱取粉碎的靈芝子實(shí)體5g置于100mL錐形瓶中，加入20倍體積蒸餾水，60℃下超聲30min，冷卻后過(guò)濾，得濾液①。濾渣再加入10倍體積蒸餾水，60℃下超聲20min，冷卻后過(guò)濾，得濾液②。濾渣再加入10倍體積蒸餾水，60℃下超聲20min，冷卻后過(guò)濾，得濾液③。合并①②③濾液，蒸發(fā)濃縮，4000rpm離心20分鐘，定容100mL。精確量取定容液4mL，加12mL無(wú)水乙醇，10000rpm離心10min，沉淀加水溶解，定容于10mL。
1.2.2《雙靈固本散》供試液的制備隨機(jī)抽取《雙靈固本散》產(chǎn)品5～10袋，撤開混勻，按四分法逐級(jí)縮分2g左右，準(zhǔn)確稱取1g置于小燒杯中，加少許水混勻，移入100ml容量瓶，60℃超聲溶解10分鐘，冷卻后，加水稀釋至刻度。搖勻，過(guò)濾。精確量取4ml，加12ml無(wú)水乙醇攪勻，10000rpm離心10分鐘，沉淀加水溶解并定容至10ml。
1.3制備供試液的條件試驗(yàn)1.3.1超聲時(shí)間的選擇

1.3.2離心時(shí)間的選擇

1.3.3用無(wú)水乙醇沉淀多糖肽時(shí)間的選擇


結(jié)論由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，制備供試液的最佳條件為在60℃超聲10min，過(guò)濾后，濾液可立即離心，離心時(shí)間為10min。
2 檢測(cè)方法(分光光度法)2.1 供試液的制備2.1.1靈芝供試液的制備準(zhǔn)確稱取粉碎的靈芝子實(shí)體5g置于100mL錐形瓶中，加入20倍體積蒸餾水，60℃下超聲30min，冷卻后過(guò)濾，得濾液①。濾渣再加入10倍體積蒸餾水，60℃下超聲20min，冷卻后過(guò)濾，得濾液②。濾渣再加入10倍體積蒸餾水，60℃下超聲20min，冷卻后過(guò)濾，得濾液③。合并①②③濾液，蒸發(fā)濃縮，4000rpm離心20分鐘，定容100mL。精確量取定容液4mL，加12mL無(wú)水乙醇，10000rpm離心10min，沉淀加水溶解，定容于10mL。
2.1.2《雙靈固本散》供試液的制備隨機(jī)抽取《雙靈固本散》產(chǎn)品5～10袋，撤開混勻，按四分法逐級(jí)縮分2g左右，準(zhǔn)確稱取1g置于小燒杯中，加少許水混勻，移入100ml容量瓶，60℃超聲溶解10分鐘，冷卻后，加水稀釋至刻度。搖勻，過(guò)濾。精確量取4ml，加12ml無(wú)水乙醇攪勻，10000rpm離心10分鐘，沉淀加水溶解并定容至10ml。
2.2 改良Lowry法2.2.1原理Lowry反應(yīng)是雙縮脲方法的發(fā)展，第一步涉及到在堿性溶液中銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，然后這個(gè)復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin氏試劑)，產(chǎn)生深藍(lán)色(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物)。
2.2.2方法特點(diǎn)A.0.25％GL-PPT光譜掃描結(jié)果表明，其最大吸收峰處于760nm，故檢測(cè)波長(zhǎng)做了修改(原方法中檢測(cè)波長(zhǎng)為500nm)。
B.原方法中在加入(Folin氏試劑)后，于20～25℃保溫30分鐘，進(jìn)行比色，其結(jié)果穩(wěn)定性較差。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)加入Folin氏試劑后，于60℃保溫30分鐘，再進(jìn)行比色，其結(jié)果穩(wěn)定。
2.2.3操作方法A.樣品測(cè)定取1mL供試液(約含20-250μg多肽)，加入5mL試劑甲，混勻，于20～25℃放置10分鐘。再加入0.5mL試劑乙(Folin氏試劑)，立即振搖均勻，在60℃保溫30分鐘，然后于760nm處比色。以1mL水代替供試液做空白對(duì)照。
B.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取GL-PPT12.5mg，用70℃熱水溶解，并定溶50ml。分別吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL GL-PPT標(biāo)品溶液(250μg/mL)，用水補(bǔ)足到1mL，然后按樣品測(cè)定方法進(jìn)行操作，測(cè)定光吸收值。以GL-PPT濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為定量的依據(jù)(見圖7)。
C.Folin-酚試劑的配置(均用分析純?cè)噭?試劑甲由下述4種溶液配制。(1)4％碳酸鈉(Na2CO3)溶液；(2)0.2mol/L氫氧化鈉溶液；(3)1％硫酸銅溶液(CuSO4·2H2O)溶液；(4)2％酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀、酒石酸鈉)。在使用前，將(1)與(2)等體積混和配成碳酸鈉-氫氧化鈉溶液，將(3)與(4)等體積配成硫酸銅-酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩種溶液按50∶1的比例混合，即為Folin-酚試劑甲。該試劑只能用一天，過(guò)期失效。試劑乙(Folin氏試劑)購(gòu)于SIGMA公司產(chǎn)品。
3 試驗(yàn)結(jié)果3.1 紫外光譜掃描圖(見圖6)。
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線用計(jì)算回歸方程為r相關(guān)系數(shù)r為0.99957；線性范圍在50～500μg/ml，其呈良好線性關(guān)系。(見圖7)3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)(見表1)

表1穩(wěn)定性試驗(yàn)由表1可見檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，精確稱取樣品1g，按樣品測(cè)定方法進(jìn)行顯色測(cè)定，每隔30分鐘再測(cè)一次，持續(xù)2小時(shí)。連續(xù)測(cè)定三個(gè)樣品，其RSD在0.74-0.82之間。將2小時(shí)內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定的樣品，延長(zhǎng)至4小時(shí)，再度檢測(cè)，依然穩(wěn)定(見穩(wěn)定性試驗(yàn))。
3.4精密度試驗(yàn)(見表2)

表2精密度實(shí)驗(yàn)由表2可見，精密度高，將待測(cè)液分別連續(xù)進(jìn)樣5次，RSD在0.09-0.24之間(n＝3)3.5重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)(見表3)

表3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)3.6回收率實(shí)驗(yàn)(見表4)

表4回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)論據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果表明，用GL-PPT作為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)《雙靈固本散》中靈芝多糖肽含量的方法，其穩(wěn)定性、精密度、回收率和重現(xiàn)性均符合要求，RSD分別為0.74-0.82％、0.09-0.10％、1.73％、1.26-1.86％。
(三)靈芝藥材及其制品的多糖肽含量測(cè)定
1 GL-PPT用于靈芝藥材活性成分多糖肽的檢測(cè)，以多糖肽計(jì)，不得少于0.15％。
2 對(duì)于測(cè)定藥準(zhǔn)字《雙靈固本散》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)控制以多糖肽計(jì)，2g不得少于0.05g。
附20批《雙靈固本散》多糖肽含量檢測(cè)結(jié)果

權(quán)利要求
1.靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于以靈芝(Ganodermalucidum)為原料母體提取液，將其濃縮，離心，透析而截留高分子量的多糖肽GL-PP，而后將高分子量多糖肽GL-PP進(jìn)一步分離、純化而得到的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品，其具有下述的理化性質(zhì)(1)形狀淺褐色至褐色粉末狀(2)分子量相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為20萬(wàn)～40萬(wàn)(3)靈芝多糖與肽結(jié)合不分離，其結(jié)構(gòu)中的單糖主要以β-(1→3)(1→6)(1→4)聚糖肽，另有少量以α-糖苷鍵連接存在。(4)多糖肽的糖鏈和肽鏈連接性質(zhì)為0-糖苷鍵連接。在溫和條件下的稀堿水解，可以把與肽鏈上絲氨酸或蘇氨酸的羥基相連的單糖或鏈水解下來(lái)。(5)靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品，其多糖在毛細(xì)管電泳(CE)中呈對(duì)稱峰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于紅外光譜(IR)，用KBr壓片400-4000cm-1掃描，GL-PPT組分分析表明，具有多糖吸收峰，分別為3385cm-1，2931cm-1，1647cm-1，1385cm-1和1074cm-1等多糖吸收峰，其中3385cm-1為強(qiáng)寬峰分子中羥基形成多種氫鍵所致的強(qiáng)吸收峰，在(891±7)cm-1處有吸收峰，這表明該糖肽具β-D葡萄糖苷鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于1H核磁共振譜(1HNMR)多糖的信號(hào)多數(shù)在δ4.0-5.5ppm范圍，β型的多糖小于5.0ppm。靈芝多糖肽δ4.21ppm處具有寬的異頭碳信號(hào)，說(shuō)明這是D-葡萄糖殘基的構(gòu)象。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在核磁共振譜(13C NMR)多糖肽化學(xué)位移103.8→70.2ppm，表明有β-(1→6)；103.8→86.7ppm，表明有β-(1→3)；103.8-80.1ppm，表明有β-(1→4)；103-105ppm為甘露糖和雜多糖構(gòu)型。
5.一種制造權(quán)利要求1所述的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于以靈芝(Ganoderma lucidum)為原料母體提取液，將其濃縮，離心、透析而截留高分子量的多糖肽GL-PP，而后將高分子量多糖肽GL-PP進(jìn)一步分離、純化為靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品，所述的靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)下述步驟制備(1)將以靈芝為原料母體提取液，濃縮、離心、透析、截留而獲得的含有高分子量多糖肽(GL-PP)，用濃度為1％的靈芝多糖肽GL-PP溶液，在不斷攪拌中緩慢加入或無(wú)水乙醇、或甲醇、或丙酮至原體積的一半、靜置過(guò)夜，用3000-4000r/min離心，得GL-PP-1沉淀，再用或無(wú)水乙醇、或丙酮、或乙醚、或者它們的混合物洗滌該沉淀，并冷藏干燥。(2)取步驟1所得的1％GL-PP-1溶液，3℃-5℃冷藏12個(gè)小時(shí)以上，次日對(duì)此溶液進(jìn)行離心、棄去沉淀，取清液加2～4倍量無(wú)水乙醇或甲醇或丙酮沉淀，離心靈芝多糖肽，再用或無(wú)水乙醇、或丙酮、或乙醚、或者它們的混合物洗滌該沉淀，冷藏干燥，得GL-PP-2靈芝多糖肽。(3)取GL-PP-2，加1∶20水溶解，3℃-5℃冷藏12個(gè)小時(shí)以上，次日過(guò)DEAE-纖維素柱分離，分別用水，0.1mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl及1mol/L NaCl先后洗脫，收集0.5mol/LNaCl洗脫部分，流水透析12～48h，蒸餾水透析4～12h，袋內(nèi)液濃縮，冷凍干燥，得淺褐色至褐色粉末狀物質(zhì)為靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于所述的步驟2中的離心為轉(zhuǎn)速12000r/min離心10～40分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)定靈芝或靈芝孢子的產(chǎn)品質(zhì)量中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)定靈芝藥材活性成分-靈芝多糖肽中的應(yīng)用，以靈芝多糖肽計(jì)，靈芝藥材多糖肽不得少于0.15％。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的靈芝多糖肽GL-PPT標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)定藥準(zhǔn)字《雙靈固本散》中的應(yīng)用，其質(zhì)量應(yīng)控制以多糖肽計(jì)，2g不得少于0.05g。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法與應(yīng)用。所說(shuō)的多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品以靈芝(Ganoderma lucidum)為原料母體提取液，將其濃縮，離心，透析而截留高分子量的多糖肽GL－PP，而后將高分子量多糖肽GL－PP進(jìn)一步分離、純化而得到。所述的靈芝多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品可用于測(cè)定靈芝或靈芝孢子的產(chǎn)品多糖肽含量，從而提高靈芝產(chǎn)品的質(zhì)量。
文檔編號(hào)A61K36/06GK1786023SQ20051001917
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者王賽貞, 林志彬, 劉梅英, 李寶棣, 林樹錢, 劉斌, 曹琦珍 申請(qǐng)人:西安綠谷制藥有限公司, 福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所, 王賽貞, 林志彬, 劉梅英, 李寶棣, 林樹錢, 劉斌, 曹琦珍