專利名稱：一種何首烏提取物、含有該提取物的中藥組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥提取物，具體而言是一種何首烏提取物、含有該提取物的中藥組合物以及它在制備預(yù)防和治療動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，在全球范圍內(nèi)，中草藥都有一定的市場，隨著人們對健康要求認(rèn)識水平的增高以及人口的老齡化，亞健康狀態(tài)化，人們更加渴望回歸自然，利用純天然程度高的藥物治療、預(yù)防一些化學(xué)合成藥物所不能解決的問題，因此天然植物藥的應(yīng)用超出它原來民族傳統(tǒng)文化的背景。從天然藥物中尋求副作用小、且物美價廉的藥物成為世界各國醫(yī)藥企業(yè)所追逐的目標(biāo)。
高血脂是形成動脈粥樣硬化(AS)的重要原因。高血脂能引起凝血和纖溶功能的改變，促發(fā)AS，高膽固醉能整合于細(xì)膜脂中，使膜通透性減低，易于LPL滲入到內(nèi)膜下，造成內(nèi)膜損害，奠定AS的基礎(chǔ)。目前，調(diào)節(jié)血脂的藥物種類很多，就其化學(xué)結(jié)構(gòu)與主要調(diào)脂功能分為以下幾類膽酸整合樹脂類；煙酸及其衍生物；貝特類；應(yīng)用最為廣泛的是他汀類藥物。但是長期口服他汀類藥物存在著一過性轉(zhuǎn)氨酶升高、橫紋肌溶解癥等多種副反應(yīng)，因此，開發(fā)中藥降血脂藥物成為研究方向。
現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，何首烏Polygonum multiflorum Thunb.具有良好的調(diào)節(jié)血脂作用。宋士軍等[參見河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2003，18(4)27-28]通過對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥的研究表明何首烏醇提液明顯降低高脂大鼠血甘油三酯和膽固醇，對腹腔注射蛋黃液小鼠的血甘油酯和血膽固醇均無明顯降低作用。李韜等[參見右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，19(3)363-365]用何首烏提取液為主要成分的元首口服液喂養(yǎng)家兔1個月，可明顯提高家兔血清中的磷酯酰膽堿、膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)活性，提高血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)的含量，促進(jìn)HDL轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇。賈久珍等[參見吉林醫(yī)學(xué)信息，1998，146]則將何首烏明確列入抗動脈粥樣硬化的中藥中，認(rèn)為其醇提取物能抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠高脂血癥，對鵪鶉實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化有一定的預(yù)防和治療作用。
何首烏中主要化學(xué)成分為二苯乙烯苷類、聚合原花青素類和蒽醌成分，其中2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷是其最主要的活性成分?，F(xiàn)有技術(shù)對2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的制備報(bào)道比較少，藥理活性實(shí)驗(yàn)公布的更少。中國專利(CN 1539844A 2003.10.24)公開了一種制備2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的方法，其將何首烏水提醇沉，然后加氯仿萃取，水層用正丁醇萃取或用大孔吸附樹脂分離后再以氯仿-甲醇為洗脫劑，反復(fù)常壓硅膠柱層析，得2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。此工藝步驟繁瑣，不易產(chǎn)業(yè)化，且所用氯仿毒性大，對環(huán)境污染嚴(yán)重。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低廉、工藝簡單，適宜工業(yè)化生產(chǎn)的以2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為主要活性成分的何首烏提取物。
本發(fā)明的另一目的在于提供以上述何首烏提取物為主要活性成分的降血脂的中藥組合物。
本發(fā)明可以通過以下方案予以實(shí)施本發(fā)明的何首烏提取物，經(jīng)常規(guī)提取、濃縮方法提取、濃縮，其特征在于，提取液分離步驟中包括過聚酰胺柱。
所述的常規(guī)提取方法包括但不限于水浸提、水煎煮、醇浸提、醇回流提取、醇滲漉。
所述的常規(guī)濃縮方法包括但不限于常壓濃縮、減壓濃縮、反滲透濃縮。
所述的過聚酰胺柱步驟具體為首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液。
由此，本發(fā)明的何首烏提取物的制備方法為提取液上聚酰胺柱，以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物。
優(yōu)選的，當(dāng)流動相均采用含水低級醇時，作為第一次流動相的低級醇的濃度低于作為第二次流動相的低級醇的濃度。
優(yōu)選的，作為第二次流動相的低級醇為乙醇；更優(yōu)選的，低級醇為乙醇；最佳的，所述的低級醇為乙醇且作為第二次流動相的低級醇為30～99％乙醇。
此方法制備的何首烏提取物中2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量為不低于50％。
進(jìn)一步地，所述的提取液分離步驟包括過兩次聚酰胺柱，具體工藝為
提取液上聚酰胺柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得有醇洗脫液，將洗脫液減壓濃縮；濃縮液再上聚酰胺柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液。
由此，本發(fā)明的何首烏提取物的制備方法為提取液上聚酰胺柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液，將洗脫液減壓濃縮；濃縮液再上聚酰胺柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液；洗脫液減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物。
優(yōu)選的，對于上一次聚酰胺柱而言，當(dāng)流動相均采用含水低級醇時，作為第一次流動相的低級醇的濃度低于作為第二次流動相的低級醇的濃度。
優(yōu)選的，對于上一次聚酰胺柱而言，作為第二次流動相的低級醇為乙醇；更優(yōu)選的，低級醇為乙醇；最佳的，所述的低級醇為乙醇且作為第二次流動相的低級醇為30～99％乙醇。
進(jìn)一步地，提取液分離步驟中還包括過大孔吸附樹脂柱，具體的工藝為提取液上大孔吸附樹脂柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗大孔吸附樹脂柱，再以含水或無水低級醇作為流動相，得醇洗脫液，洗脫液減壓濃縮；濃縮液再上聚酰胺柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液。
或者提取液上聚酰胺柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液，洗脫液減壓濃縮；濃縮液再上大孔吸附樹脂柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗大孔吸附樹脂柱，再以含水或無水低級醇作為流動相，得醇洗脫液。
由此，本發(fā)明的何首烏提取物的制備方法為提取液上大孔吸附樹脂柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗大孔吸附樹脂柱，再以含水或無水低級醇作為流動相，得醇洗脫液，洗脫液減壓濃縮；濃縮液再上聚酰胺柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物。
或者提取液上聚酰胺柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液，洗脫液減壓濃縮；濃縮液再上大孔吸附樹脂柱，首先以水或含水低級醇為流動相沖洗大孔吸附樹脂柱，再以含水或無水低級醇作為流動相，得醇洗脫液；洗脫液減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物。
優(yōu)選的，大孔吸附樹脂柱為苯乙烯型。
優(yōu)選的，對于上大孔吸附樹脂柱而言，當(dāng)流動相均采用含水低級醇時，作為第一次流動相的低級醇的濃度低于作為第二次流動相的低級醇的濃度。
優(yōu)選的，對于上大孔吸附樹脂柱而言，作為第二次流動相的低級醇為乙醇；更優(yōu)選的，低級醇為乙醇；最佳的，低級醇為乙醇且作為第二次流動相的低級醇為20～99％乙醇。
優(yōu)選的，對于上聚酰胺柱而言，當(dāng)流動相均采用含水低級醇時，作為第一次流動相的低級醇的濃度低于作為第二次流動相的低級醇的濃度。
優(yōu)選的，對于上聚酰胺柱而言，作為第二次流動相的低級醇為乙醇；更優(yōu)選的，低級醇為乙醇；最佳的，所述的低級醇為乙醇且作為第二次流動相的低級醇為30～99％乙醇。
按照以上方法制備的何首烏提取物中2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量為不低于60％。
以本發(fā)明方法獲得的何首烏提取物可以制成藥劑學(xué)上任何一種制劑，也可配合其他藥物或組分一起制成制劑使用。這些劑型可以是注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。
另外，本發(fā)明藥物可在制備預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)勢1.易于產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中需要用氯仿或正丁醇萃取，且需反復(fù)硅膠柱層析的工藝步驟和條件，工藝步驟簡單、易操作，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。
2.成本低。本發(fā)明以水、乙醇等溶劑作為流動相，價格低廉且環(huán)保。
下面通過動物試驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明藥物的有益效果。
不同工藝何首烏二苯乙烯總苷片抗高脂性動脈粥樣硬化的藥效學(xué)比較研究材料與方法動物新西蘭種兔，體重1.8-2.2kg，全部雄性，北京維通利華動物公司提供。
鵪鶉，體重150g，全部雄性，北京維通利華動物公司提供。
動物飼料家兔高脂飼料，在家兔普通飼料的基礎(chǔ)上添加膽固醇0.5％(分析純，上海新興化學(xué)試劑公司)、蛋黃粉2.5％、豬油4％，現(xiàn)配加工制成。
鵪鶉高脂飼料，在鵪鶉普通飼料的基礎(chǔ)上，添加膽固醇1％(分析純，上海新興化學(xué)試劑公司)、花生油6％、豬油14％，現(xiàn)配加工制成。
藥品和儀器四種不同工藝的何首烏二苯乙烯總苷片均由天津天士力中藥所提供。
實(shí)驗(yàn)中的工藝1采用實(shí)施例1方法提取分離。
實(shí)驗(yàn)中的工藝2采用實(shí)施例2方法提取分離。
實(shí)驗(yàn)中的工藝3采用實(shí)施例3方法提取分離。
實(shí)驗(yàn)中的工藝4采用實(shí)施例4方法提取分離。
陽性對照藥辛伐他汀，上海博之達(dá)化學(xué)有限公司提供，批號021003。
TC、TG酶標(biāo)法試劑盒為上海明典試劑公司出品；HDL-C、LDL-C酶標(biāo)法試劑盒為日本第一化學(xué)株式會社出品；Lp(a)免疫濃度絡(luò)點(diǎn)法測試試劑盒為德國Diasys公司出品。
測試儀器奧林巴斯AU1000型全自動生化分析儀。
實(shí)驗(yàn)方法1.兔高脂性動脈粥樣硬化模型的預(yù)防作用將兔單籠、給予普通飼料飼養(yǎng)10天后，耳部血管取血2ml，分離出血清。分別測定各項(xiàng)血脂指標(biāo)正常值。根據(jù)血脂水平，進(jìn)行分層隨機(jī)分7組，每組10只，即高脂對照組，工藝1組，工藝2組，工藝3組，工藝4組，陽性藥辛伐他汀組和空白對照組。高脂對照組采用高脂飼料100g/kg定量喂食；四個工藝組及辛伐他汀組在高脂定量喂食的基礎(chǔ)上，按照給藥劑量每天一次，于每日上午9:30灌胃給藥；空白對照組給予正常飼料。給藥4、8、12周后，分別禁食12h后測試血清TC、TG、HDL-C、LDL-C等指標(biāo)；給藥8周后，還測定Lp(a)指標(biāo)。給藥12周后，將各組兔頸動脈放血處死，進(jìn)行病理檢查，觀察指標(biāo)為經(jīng)油紅O染色后主動脈斑塊面積占主動脈總面積的百分比。
2.鵪鶉高脂性動脈粥樣硬化模型的治療作用將鵪鶉每組8只放于鐵絲籠內(nèi)、給予普通飼料飼養(yǎng)10天后，采用高脂飼料喂食2月；頸靜脈取血2ml，分離出血清。分別測定各項(xiàng)血脂指標(biāo)值。根據(jù)血脂水平，進(jìn)行分層隨機(jī)分6組，每組8只，即高脂對照組，工藝1組，工藝2組，工藝3組，工藝4組和陽性藥辛伐他汀組。各組均給予正常飼料，各工藝組及辛伐他汀組在正常飼料喂食的基礎(chǔ)上，按照給藥劑量每天一次，于每日上午9:30飼料中添加給藥。給藥2、4、6、8周后，分別禁食12h后測試血清TC、TG、HDL-C、LDL-C等指標(biāo)。給藥8周后將各組鵪鶉頸動脈放血處死，分離其主動脈，進(jìn)行病理檢查。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA方差分析檢驗(yàn)差異的顯著性。
結(jié)果一、四種工藝對兔高脂性動脈粥樣硬化模型的預(yù)防作用比較結(jié)果1.對兔脂質(zhì)代謝紊亂的預(yù)防作用1.1對血清總膽固醇(TC)的影響經(jīng)高脂喂食后，高脂對照組血清TC顯著升高，由1.77±0.87mmol/L升至30.93±1.25mmol/L。四種工藝二苯乙烯總苷對TC的影響與高脂對照組相比，均可顯著降低TC的升高，陽性對照藥辛伐他汀在給藥4、8、12周均顯著降低TC的含量。而四種工藝相互之間無顯著性差異。(表1)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥能顯著降低高脂飲食引起的兔血清TC的升高程度，且四種工藝的降低作用無差別。
表1四種不同工藝二苯乙烯總苷對兔血清總膽固醇(TC)的影響(mmol/L，x±SD)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較1.2對血清甘油三酯(TG)的影響經(jīng)高脂喂食后，高脂對照組血清TG顯著升高。四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀在給藥4、8、12周均可顯著降低TG的升高程度。而四種工藝的作用相互之間無顯著性差異。(表2)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥能顯著降低高脂飲食引起的兔血清TG的升高程度，且四種工藝的降低作用無差別。
表2四種不同工藝二苯乙烯總苷對兔血清甘油三酯(TG)的影響(mmol/L，x±SD)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較1.3對血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的影響經(jīng)高脂喂食后，試驗(yàn)各組血清HDL-C有所升高(4、8周后顯著，12周后不顯著)。與高脂組相比四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀在給藥4、8、12周對HDL-C含量均無顯著影響。(表3)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥對血清HDL-C的含量沒有影響。
表3四種工藝二苯乙烯總苷對兔血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的影響(mmol/L)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較1.4對血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的影響經(jīng)高脂喂食后，高脂對照組血清LDL-C顯著升高。四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀在給藥4、8、12周均可顯著降低LDL-C的升高程度。而四種工藝的作用相互之間無顯著性差異。(表4)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥能顯著降低高脂飲食引起的兔血清LDL-C的升高程度，且四種工藝的降低作用無差別。
表4四種工藝二苯乙烯總苷對兔血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的影響(mmol/L)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較1.5對血清極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的影響經(jīng)高脂喂食后，高脂對照組血清VLDL-C顯著升高。四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀在給藥4、8、12周均可顯著降低VLDL-C的升高程度。(表5)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥能顯著降低高脂飲食引起的兔血清VLDL-C的升高程度，且四種工藝的降低作用無顯著性差別。
1.6對血清TC/HDL-C比值的影響經(jīng)高脂喂食后，高脂對照組血清TC/HDL-C比值顯著升高。四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀在給藥4、8、12周均可顯著降低TC/HDL-C比值的升高程度。(表6)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥能顯著降低高脂飲食引起的血清TC/HDL-C的升高程度，且四種工藝的降低作用無顯著性差別。
表5四種工藝二苯乙烯總苷對兔血清極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的影響(mmol/L)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較表6四種不同工藝二苯乙烯總苷對兔血清TC/HDL-C比值的影響(mmol/L，x±SD)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較1.7對血清載脂蛋白(a)(Lp(a))的影響經(jīng)高脂喂食8周后，與高脂對照組相比，四種工藝給藥組在給藥8周后可顯著降低Lp(a)，且升高的程度無明顯差異。陽性對照藥辛伐他汀則對Lp(a)無顯著影響。(表7)表7四種不同工藝二苯乙烯總苷對兔血清Lp(a)的影響(mmol/L，x±SD)
△p＜0.05，與高脂組比較2.對兔主動脈病變斑塊程度的影響根據(jù)《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》，采用剪紙法計(jì)算斑塊面積，經(jīng)油紅O染色后，將主動脈斑塊圖形印在紙板上，再將斑塊部分剪下，將斑塊和動脈壁部分的圖形分別稱重，以斑塊重量所占動脈壁總重量的比值作為斑塊所占動脈壁的面積比。結(jié)果顯示，四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀經(jīng)灌胃給藥后，與高脂對照組相比，斑塊面積百分率明顯降低。(表8)結(jié)果表明四種工藝的二苯乙烯總苷均能顯著降低兔主動脈粥樣硬化斑塊，且作用基本一致沒有顯著性差異。
表8四種不同工藝二苯乙烯總苷對兔主動脈斑塊面積百分率的影響(％，x±SD)
△p＜0.05，與高脂組比較二、四種工藝對鵪鶉高脂性動脈粥樣硬化模型的治療作用比較結(jié)果1.對鵪鶉脂質(zhì)代謝紊亂的治療作用1.1對血清總膽固醇(TC)的影響給予普通飼料后，各組血清TC均顯著降低。與高脂對照組血清TC相比，四種工藝的二苯乙烯總苷和陽性對照藥辛伐他汀在給藥2周可明顯降低TC；4、6、8周后對血清TC影響不顯著。(表9)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥2周能顯著降低鵪鶉血清TC的含量，且四種工藝的降低作用無差別。
1.2對血清甘油三酯(TG)的影響給予正常飼料后，各組血清TG在8周后顯著降低。四種不同工藝的二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀給藥2、4、6、8周與高脂組相比較，對血清TG均無顯著影響。(表10)1.3對血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的影響給予普通飼料后，試驗(yàn)各組血清HDL-C在8周后顯著降低。與高脂組相比四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀在給藥2、4、6、8周對HDL-C含量均無顯著影響。(表11)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥對血清HDL-C的含量沒有影響。
1.4對血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的影響給予普通飼料后，各組血清LDL-C均顯著降低。與高脂對照組血清LDL-C相比，四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀2周后可顯著降低LDL-C的升高程度。給藥、6、8周對血清LDL-C的影響不明顯。(表12)1.5對血清極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的影響給予普通飼料后，各組血清VLDL-C均顯著降低。與高脂對照組血清VLDL-C相比，四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀在2周后均可顯著降低VLDL-C，給藥4、6、8周對血清VLDL-C影響不顯著。(表13)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥2周能顯著降低鵪鶉血清VLDL-C的含量，且四種工藝的降低作用無顯著性差別。
1.6對血清TC/HDL-C比值的影響給予普通飼料后，各組血清TC/HDL-C比值顯著降低。與高脂對照組相比，四種工藝二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀給藥2周均可顯著降低TC/HDL-C比值，給藥4、6、8周影響不顯著。(表14)結(jié)果表明，四種工藝二苯乙烯總苷灌胃給藥2周能顯著降低鵪鶉血清TC/HDL-C比值，且四種工藝的降低作用無顯著性差別。
2.對鵪鶉主動脈病變斑塊程度的影響給藥8周后，將動物處死，進(jìn)行病理檢查。觀察指標(biāo)為經(jīng)油紅O染色主動脈斑塊進(jìn)行分級打分，分級標(biāo)準(zhǔn)參照《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法》0分-無斑塊；0.5分-輕度紅染，無凸出斑塊；1分-有凸出紅染斑塊，面積＜3mm2；2分-斑塊面積＞3mm2；3分-斑塊大小不等，融合成片；4分-動脈內(nèi)膜幾乎全為融合斑塊所覆蓋。
結(jié)果顯示，四種不同工藝的二苯乙烯總苷及陽性對照藥辛伐他汀給藥8周后，與高脂對照組相比，斑塊病變程度明顯降低。(表15)且四種工藝的降低程度沒有明顯差異。
表15四種不同工藝二苯乙烯總苷對鵪鶉主動脈斑塊面積百分率的影響(％，x±SD)
△p＜0.05，與高脂組比較表9四種不同工藝二苯乙烯總苷對鵪鶉血清總膽固醇(TC)的影響(mmol/L，x±SD)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較表10四種不同工藝二苯乙烯總苷對鵪鶉血清甘油三酯(TG)的影響(mmol/L，x±SD)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較表11四種工藝二苯乙烯總苷對鵪鶉血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的影響(mmol/L)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較表12四種工藝二苯乙烯總苷對鵪鶉血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的影響(mmol/L)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較表13四種工藝二苯乙烯總苷對鵪鶉血清極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的影響(mmol/L)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較表14四種工藝二苯乙烯總苷對鵪鶉血清TC/HDL-C比值的影響(mmol/L，x±SD)
注*p＜0.05，與給藥前比較；△p＜0.05，與高脂組比較以上的藥理試驗(yàn)結(jié)果表明，工藝一、工藝二、工藝三、工藝四的二苯乙烯總苷片都具有抗高脂性動脈粥樣硬化的藥理作用，對脂質(zhì)代謝紊亂和高脂性動脈粥樣硬化具有良好的預(yù)防和治療作用。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很清楚本發(fā)明的其它實(shí)施方案，本發(fā)明實(shí)施例僅作為示例。在不違反本發(fā)明主旨及范圍的情況下，可對本發(fā)明進(jìn)行各種改變和改進(jìn)，例如所選用的溶液可以是丙酮、乙酸乙酯或者是其他有機(jī)溶劑，但只要使用本發(fā)明所述的提取分離方法，均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過14目篩，用8倍藥材量的80％乙醇滲漉，滲漉液在60℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用10倍柱體積的水作為流動相沖洗聚酰胺柱；然后改換5倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液于60℃減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物243g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為60％。
實(shí)施例2(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過14目篩，用10倍藥材量的80％醇滲漉，滲漉液在60℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過AB-8樹脂柱，首先用5倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的30％醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在60℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用10倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換5倍柱體積的95％醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在60℃下減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物218g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為70.3％。
實(shí)施例3(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過14目篩，用8倍藥材量的80％醇滲漉，滲漉液在60℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝
將上清液過聚酰胺柱，首先用5倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換5倍柱體積的95％醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液60℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過AB-8樹脂柱，用5倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的30％醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在60℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物215g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為69.4％。
實(shí)施例4(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，打碎成粗顆粒，6倍量50％乙醇70℃回流提取三次，每次1小時，減壓回收乙醇，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用5倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的70％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在60℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用5倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換5倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在6℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物228g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為75.3％。
實(shí)施例5(1)提取工藝稱取何首烏藥材15kg，粉碎后過篩，用6倍量水煎煮三次，每次30min，提取液過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用15倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的99％乙醇作為流動相，得洗脫液，將洗脫液90℃減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物355g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為60.8％。
實(shí)施例6(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過篩，用12倍藥材量的60％醇滲漉，滲漉液在70℃下減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用4倍柱體積的30％乙醇作為流動相，得醇洗脫液；然后改換4倍柱體積的90％甲醇作為流動相，得洗脫液，將洗脫液于50℃減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物250g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為62.0％。
實(shí)施例7(1)提取工藝稱取何首烏藥材20kg，粉碎后過篩，用6倍藥材量的75％乙醇浸提12h，提取液過濾，得上清液；
(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用8倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換6倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，70℃減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物490g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為65.0％。
實(shí)施例8(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過篩，用10倍藥材量的85％乙醇滲漉，滲漉液在70℃下減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用4倍柱體積的35％乙醇作為流動相，得醇洗脫液；然后改換4倍柱體積的無水乙醇作為流動相，得醇洗脫液，50℃減壓濃縮，干燥，得何首烏提取物256g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為62.4％。
實(shí)施例9(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，打碎成粗顆粒，8倍量60％乙醇70℃回流提取三次，每次1小時，減壓回收乙醇，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過AB-8樹脂柱，首先用10倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換15倍柱體積的40％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，90℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用15倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的30％甲醇作為流動相，得洗脫液，洗脫液在90℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物223g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為71.2％。
實(shí)施例10(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過篩，用4倍藥材量的60％乙醇滲漉，滲漉液在30℃下減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過D101樹脂柱，首先用3倍柱體積的20％乙醇作為流動相，得水洗脫液；然后改換5倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，30℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用5倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換5倍柱體積的99％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在30℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物228g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為70.2％。
實(shí)施例11(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過篩，用6倍藥材量的75％乙醇滲漉，滲漉液在70℃下減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過D101樹脂柱，首先用4倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換8倍柱體積的60％乙醇作為流動相，得洗脫液，50℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用8倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換4倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得洗脫液，洗脫液在50℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物223g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為71.4％。
實(shí)施例12(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過篩，用6倍量水煎煮三次，每次30min提取液過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過AB-8樹脂柱，首先用6倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換4倍柱體積的20％乙醇作為流動相，得洗脫液，再以4倍柱體積的80％乙醇作為流動相，得洗脫液70℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用8倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換4倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在50℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物216g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為71.2％。
實(shí)施例13(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，打碎成粗顆粒，10倍量50％乙醇70℃回流提取三次，每次1小時，減壓回收乙醇，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用10倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的75％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，90℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過AB-8樹脂柱，用10倍柱體積的20％乙醇作為流動相，得水洗脫液；然后改換15倍柱體積的60％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在90℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物228g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為71.3％。
實(shí)施例14(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過篩，用6倍藥材量的75％乙醇滲漉，滲漉液在50℃下減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用4倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換6倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，70℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過D101樹脂柱，用6倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換12倍柱體積的99％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在70℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物71.4％。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為71.5％。
實(shí)施例15(1)提取工藝稱取何首烏藥材，粉碎后過篩，用12倍藥材量的60％乙醇滲漉，滲漉液在90℃下減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用10倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的40％甲醇作為流動相，得洗脫液，30℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用10倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的90％甲醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在90℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物235g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為76.2％。
實(shí)施例16(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，打碎成粗顆粒，10倍量60％乙醇80℃回流提取三次，每次1小時，減壓回收乙醇，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用2倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的50％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，70℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用10倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換10倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在90℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物234g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為75.1％。
實(shí)施例17(1)提取工藝稱取何首烏藥材10kg，粉碎后過篩，用8倍藥材量的85％乙醇滲漉，滲漉液在70℃下減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用6倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換6倍柱體積的95％甲醇作為流動相，得醇洗脫液，70℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用3倍柱體積的30％乙醇作為流動相，得醇洗脫液；然后改換6倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在70℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物237g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為76.1％。
實(shí)施例18(1)提取工藝稱取何首烏藥材，粉碎后過篩，用6倍藥材量的75％乙醇滲漉，滲漉液在50℃下減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)，離心、過濾，得上清液；(2)分離工藝將上清液過聚酰胺柱，首先用4倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換15倍柱體積的40％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，70℃減壓濃縮至1∶1(1ml相當(dāng)于藥材1g)；濃縮液過聚酰胺柱，用6倍柱體積的水作為流動相，得水洗脫液；然后改換6倍柱體積的95％乙醇作為流動相，得醇洗脫液，醇洗脫液在50℃下濃縮，干燥，得何首烏提取物245g。經(jīng)HPLC檢測，該提取物中二苯乙烯苷含量為76.3％。
實(shí)施例19何首烏提取物膠囊劑處方何首烏提取物210g微晶纖維素 250g滑石粉 1.4％3％聚維酮乙醇溶液 適量共制成 1000粒取何首烏與微晶纖維素混合均勻，加3％聚維酮乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，60℃干燥30-45分鐘，整粒，加入滑石粉，混勻，充于1號膠囊中，即得。
實(shí)施例20何首烏提取物粉針劑處方何首烏提取物100g甘露醇 30g依地酸鈣鈉 5g蒸餾水 1000ml將何首烏提取物溶于適量水中，加入甘露醇依地酸鈣鈉，攪拌至完全溶解，補(bǔ)加水至1000ml，分裝500支，冷凍干燥，即得。
權(quán)利要求
1.一種何首烏提取物，經(jīng)常規(guī)提取、濃縮方法提取、濃縮，其特征在于，提取液分離步驟中包括過聚酰胺柱，所述的過聚酰胺柱的步驟為首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱；再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液。
2.權(quán)利要求1所述的何首烏提取物，其特征在于，分離步驟還包括在提取液過聚酰胺柱之前過大孔吸附樹脂柱。
3.權(quán)利要求1所述的何首烏提取物，其特征在于，分離步驟還包括提取液過聚酰胺柱之后再過大孔吸附樹脂柱或聚酰胺柱。
4.權(quán)利要求2或3所述的何首烏提取物，其特征在于，過大孔吸附樹脂的步驟為首先以水或含水低級醇為流動相沖洗大孔吸附樹脂柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，得醇洗脫液。
5.權(quán)利要求1所述的何首烏提取物，其特征在于，當(dāng)流動相均采用含水低級醇時，作為第一次流動相的低級醇的濃度低于作為第二次流動相的低級醇的濃度。
6.權(quán)利要求1所述的何首烏提取物，其特征在于，作為第二次流動相的低級醇為乙醇。
7.權(quán)利要求6所述的何首烏提取物，其特征在于，所述的乙醇濃度為30～99％。
8.權(quán)利要求4所述的何首烏提取物，其特征在于，所述的大孔吸附樹脂為苯乙烯型。
9.權(quán)利要求4所述的何首烏提取物，其特征在于，當(dāng)流動相均采用含水低級醇時，作為第一次流動相的低級醇的濃度低于作為第二次流動相的低級醇的濃度。
10.權(quán)利要求4所述的何首烏提取物，其特征在于，作為第二次流動相的低級醇為乙醇。
11.權(quán)利要求10所述的何首烏提取物，其特征在于，所述的乙醇濃度為20～99％。
12.以權(quán)利要求1、2或3所述的何首烏提取物為活性成分制成的任一藥學(xué)上可接受劑型的中藥組合物。
13.權(quán)利要求1、2或3所述的何首烏提取物在制備預(yù)防和治療動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種何首烏提取物，經(jīng)常規(guī)提取方法提取后，提取液首先以水或含水低級醇為流動相沖洗聚酰胺柱，再以無水或含水低級醇作為流動相，洗脫液減壓濃縮，干燥，即得。本發(fā)明的何首烏提取物中2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷含量不低于50％。本發(fā)明還公開了以該提取物為活性成分的中藥組合物和該提取物在制備預(yù)防和治療動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P9/10GK1957991SQ20051001589
公開日2007年5月9日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者魏峰, 岳洪水, 黃芝娟, 陳慶闖, 羅崇念, 胡晨旭 申請人:天津天士力制藥股份有限公司