專利名稱：用于抑制血栓形成的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制血栓形成的組合物。
背景技術(shù)：
血栓是在血管中形成的血凝塊，被稱為血纖維蛋白原的蛋白質(zhì)被激活，轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白，同時與血小板、白細(xì)胞等一起形成不溶性的聚合物，凝結(jié)在血管的內(nèi)壁上。身體正常時，發(fā)揮溶解該血栓的來源——血纖維蛋白的功能的纖溶酶可預(yù)防血栓，但如果纖溶酶不足，則無法溶解血纖維蛋白，形成血栓。血栓有一期止血(血小板凝集)和二期止血(血液凝固)。血管破裂發(fā)生出血，血小板粘附、凝集在血管壁破裂口處，首先進行止血。將其稱為一期止血，形成的血栓成為一期血栓。血漿中的水溶性凝固因子(血纖維蛋白原)變?yōu)榉撬苄?血纖維蛋白)，在血小板之間連成絲狀的網(wǎng)，使原發(fā)性血栓強化。將其稱為二期止血，形成的血栓稱為繼發(fā)性血栓。
血小板凝集是由于血管壁破裂，壁上的膠原暴露出來，血小板粘附于暴露的膠原上，并且血小板之間凝集而產(chǎn)生。血液凝固的機理有內(nèi)源性凝血和外源性凝血。內(nèi)源性凝血是XII因子與具有陰性電荷的內(nèi)皮下組織接觸，XII因子被激活，接著XI因子被活性XII因子激活，內(nèi)源性的凝血因子依次被激活，最終，I因子——血纖維蛋白原受到II因子(凝血酶原)的活性型——凝血酶的限制性分解，形成血纖維蛋白，形成血栓。外源性凝血是通過組織因子和VII因子激活，由X因子的激活轉(zhuǎn)移至與內(nèi)源性具有共通的凝血機理上，最終作為I因子的血纖維蛋白原受到II因子(凝血酶原)的活性型——凝血酶的限制性分解，形成血纖維蛋白，形成血栓。
形成的血栓附著于血管，使血管的截面積減小，阻礙血液循環(huán)，結(jié)果出現(xiàn)血液無法在細(xì)胞和組織中正常供給營養(yǎng)成分和氧，細(xì)胞和組織的代謝廢物無法排出，毒性被蓄積等的問題。
血管中，將血栓所引發(fā)的癥狀稱為廣義的血栓形成(以下簡稱為“血栓形成”時也是指廣義的血栓形成)，血栓為病因而引發(fā)的病態(tài)分為狹義的血栓形成和栓塞。狹義的血栓形成是血栓在形成處部分或完全阻塞血流而導(dǎo)致的癥狀，栓塞是血栓從形成處剝離，隨血流移動，在其他部位部分或完全阻塞血流而引起的病態(tài)。
所述血栓形成根據(jù)產(chǎn)生血栓的血管部位的不同而誘發(fā)各種疾病。其中特別是在腦血管、心臟血管中產(chǎn)生時，會發(fā)生腦卒中、腦出血、腦梗塞、心力衰竭、心肌梗塞、心臟麻痹等嚴(yán)重的癥狀，還可能引發(fā)半身不遂，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致死亡。
引發(fā)這些心臟疾病、腦血管疾病等的重大血栓與血流的淤積帶下形成的血纖維蛋白血栓的機理不同，是在動脈等血流比較快、存在豐沛血流下形成的。在血流中，凝血因子即使被激活，也會被血流稀釋，不至于有效形成血栓。不過，粘附、凝集于損傷血管壁、提高局部濃度的成分——血小板在血栓的形成中發(fā)揮了重要的作用。
血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)障礙，產(chǎn)生剝離，則血管內(nèi)皮細(xì)胞下組織的膠原暴露，通過在血管內(nèi)皮細(xì)胞中合成的馮維勒布蘭德因子(vWFVII因子)，膠原和vWF受體(GpIb)之間形成交聯(lián)(粘附)。并且，血小板被例如凝血酶等激動劑激活，通過血纖維蛋白原受體(GpIIb-IIIa)，經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合，引起血小板凝集，形成血小板血栓。因此，是否可抑制膠原和GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，或與其它血小板經(jīng)由血纖維蛋白原的GpIIb-IIIa結(jié)合，這成為預(yù)防血栓形成的一個重要要件。
已知瑞斯托菌素是促進膠原和GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)的激動劑，已知通過膠原和凝血酶等各種物質(zhì)從血管系的血小板和損傷的血液細(xì)胞、內(nèi)皮或組織釋放出來的腺苷二磷酸(腺苷-5’-二磷酸鈉ADP)是促進與其它血小板經(jīng)由血纖維蛋白原的GpIIb-IIIa結(jié)合的激動劑。
血栓形成的治療中，主要進行抑制血栓生成的抗血栓劑和血栓形成預(yù)防劑、使生成的血栓溶解的溶栓劑的研究開發(fā)。
抗血栓劑有血小板劑和抗凝藥?？寡“鍎┑哪康氖且种婆c血栓形成初期階段有關(guān)的血小板的功能，開發(fā)了阿司匹林等很多可口服的藥物，但目前它們被用于腦梗塞、心肌梗塞等的復(fù)發(fā)預(yù)防、以及各種旁路手術(shù)后的阻塞預(yù)防等，與其說是血栓形成的治療藥，其實是作為血栓形成預(yù)防藥使用?？鼓幹?，通過促進抗凝血酶III對凝血酶的抑制而起作用的肝素和口服抗凝藥香豆素衍生物——華法林等在臨床中使用。華法林通過在凝血酶原合成中抑制轉(zhuǎn)化后的維生素K依賴性γ-羧基化來抑制凝血酶的產(chǎn)生。但是，肝素必須是非口服給藥，這發(fā)揮了抗凝血酶III的輔因子的功能，因此如果沒有該抑制劑就沒有效果。華法林表達(dá)效果非常緩慢，個人的給藥量必須頻繁試驗調(diào)整。這些抗凝藥并不是僅對凝血酶特異性，它們也抑制其它的絲氨酸-蛋白酶，如果不正確地調(diào)節(jié)兩者的給藥量，則可能誘發(fā)出血。另外，最近二十碳五烯酸(EPA)、前列環(huán)素(PG12)衍生物等被制成商品。但是，這些藥物沒有特異性，在機體內(nèi)對血栓以外的部分也有影響，殘留在機體內(nèi)時，可能引起出血等。除此之外，還報道了水蛭素、合成抗凝血酶、噻氯匹定等的抗血栓活性，但尚未實現(xiàn)應(yīng)用化。
溶栓劑已知有鏈激酶、尿激酶等纖溶酶原激活藥，通常采用將纖溶酶原激活藥對形成了血栓的患者進行靜脈注射，以激活體內(nèi)溶栓系統(tǒng)的療法。該溶栓效果在很多臨床試驗中得到了驗證，但與抗血栓劑或血栓形成預(yù)防劑同樣，對血栓沒有特異性，治療血栓過程中有全身出血等副作用。另外，組織型纖溶酶原激活藥(tPA)對血栓的選擇性高，可認(rèn)為是理想的溶栓劑，但實際應(yīng)用于臨床治療時，依然有全身出血的副作用，只是程度有差異。另外，在血液內(nèi)的半衰期非常短，藥效持續(xù)時間短，因此為在體內(nèi)維持藥效，必須加大給藥量，因此治療費用比以往的溶栓劑高非常多。
上述藥物用于預(yù)防血栓的形成，但對于血栓的去除沒有體現(xiàn)太顯著的效果，并誘發(fā)嚴(yán)重的副作用，因此，最近，比起藥物治療，對于具有通過飲食方式預(yù)防疾病、調(diào)節(jié)或激活體質(zhì)的功能的成分或食品的研究日益受到人們的關(guān)注。
已知食品成分有多元不飽和脂肪酸、葡糖胺、洋蔥膜(例如參照專利文獻1)等材料，但它們風(fēng)味或性狀等方面存在問題，無法廣泛應(yīng)用于食品。
最近，有人公開了獼猴桃提取物(例如參照專利文獻2)的專利，但它有在中性區(qū)的活性弱的缺點。
還已知納豆激酶(ナツトウキナ一ゼ)(例如參照專利文獻3)，納豆激酶具有溶栓效果，但同時也含有產(chǎn)生凝血因子的維生素K。
專利文獻1日本特開2002-171934號公報(第2頁)
專利文獻2日本特開2003-171294號公報(第2-5頁)專利文獻3日本特開2004-65047號公報(第3頁)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題在于提供用于抑制血栓形成的組合物，該組合物含有可在飲料食品、準(zhǔn)藥(醫(yī)藥部外品)、藥物、飼料中使用的規(guī)定的植物成分。
本發(fā)明人利用各種天然植物，檢索血栓形成抑制成分，并進行多角度研究探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自印度醋栗(アムラ一)、茶、木槿(ハイビスカス)、蒼耳(オナモミ)、匙羹藤(ギムネマ)、羊棲菜(ヒジキ)、角叉菜聚糖(カラギナン)的規(guī)定的植物成分具有優(yōu)異的血栓形成抑制作用，從而完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明的主要宗旨是[1]抗血栓組合物，其特征在于含有選自印度醋栗的果實、果汁以及它們的提取物的至少一種。
抑制血纖維蛋白形成的組合物，其特征在于含有選自印度醋栗的果實、果汁以及它們的提取物的至少一種。
抗血小板凝集組合物，其特征在于含有選自印度醋栗的果實、果汁以及它們的提取物的至少一種。
抑制血小板凝集的組合物，其特征在于含有選自印度醋栗的果實、果汁以及它們的提取物的至少一種。
用于抗血栓的組合物，其特征在于含有茶的提取物。
用于抗血小板凝集的組合物，其特征在于含有茶的提取物。
抗血液凝固組合物，其特征在于含有選自木槿的果實、果汁、葉以及它們的提取物的至少一種。
預(yù)防血小板凝集的組合物，其特征在于含有選自木槿的果實、果汁、葉以及它們的提取物的至少一種。
用于預(yù)防血小板凝集的組合物，其特征在于含有選自木槿的果實、果汁、葉以及它們的提取物的至少一種。
抑制血小板凝集性血栓的組合物，其特征在于含有選自蒼耳的果實、果汁、種子以及它們的提取物的至少一種。
用于抑制血小板凝集性血栓的組合物，其特征在于含有選自蒼耳的果實、果汁、種子以及它們的提取物的至少一種。
血栓形成抑制劑，其特征在于含有匙羹藤、其提取物或它們的混合物。
預(yù)防外源性凝血的組合物，其特征在于含有羊棲菜、其提取物或它們的混合物。
預(yù)防血栓的組合物，其特征在于含有羊棲菜、其提取物或它們的混合物。
用于預(yù)防血栓的組合物，其特征在于含有羊棲菜、其提取物或它們的混合物的酶處理物。
抗血栓劑，其特征在于含有角叉菜聚糖。
本發(fā)明提供用于抑制血栓形成的組合物，該組合物含有具有抑制血栓形成作用的上述規(guī)定的植物成分。該成分來自一直以來人們在日常飲食生活中使用的天然植物，因此該組合物與以往的藥物不同，沒有體內(nèi)出血的副作用，可安全地抑制血栓形成，預(yù)防腦出血、腦梗塞、心肌梗塞、動脈硬化和冠狀動脈硬化等心血管疾病。本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物例如可應(yīng)用于飲料食品、準(zhǔn)藥、藥物、飼料中。
具體實施例方式
總而言之，本發(fā)明提供用于抑制血栓形成的組合物，具體來說，提供由作為有效成分使用的植物成分形成的各種組合物。本發(fā)明的組合物可以是有效成分本身。以下對每種使用植物分別進行說明。本發(fā)明的組合物的原料等可以任意單獨或?qū)?種或以上混合使用。
本說明書中，抗血小板凝集、血小板凝集抑制、預(yù)防血小板凝集和抗血小板等術(shù)語具有相同的含義。
(1)印度醋栗具體來說，本發(fā)明提供抗血栓組合物、抑制血纖維蛋白形成的組合物、抗血小板凝集組合物、以及抑制血小板凝集的組合物，其特征在于含有選自印度醋栗果實、果汁以及它們的提取物的至少一種作為有效成分。
本發(fā)明的組合物根據(jù)上述印度醋栗成分所具有的作用而發(fā)揮其效果，本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)所述印度醋栗成分具有以下的作用。
即，對上述印度醋栗成分測定活化部分凝血激酶時間(APTT)，結(jié)果顯示使與內(nèi)源性途徑有關(guān)的因子失活、抑制血纖維蛋白的形成，抑制血管內(nèi)的血栓形成的效果高。
對上述印度醋栗成分進行抑制血纖維蛋白形成的試驗，結(jié)果顯示在血栓形成的最終階段，抑制凝血酶導(dǎo)致的由血纖維蛋白原形成血纖維蛋白的效果高。
對上述印度醋栗成分進行血小板凝集試驗，結(jié)果顯示抑制血小板凝集物的生成的效果高。即，對于上述印度醋栗成分，進行加入激動劑ADP時出現(xiàn)血小板凝集、即所謂的ADP引發(fā)血小板凝集試驗，其中所述激動劑ADP引發(fā)通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，從而產(chǎn)生血小板凝集。結(jié)果顯示抑制通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原的與其它血小板的結(jié)合階段，由此抑制血小板凝集的效果高。
對于上述印度醋栗成分，進行加入激動劑瑞斯托菌素時出現(xiàn)血小板凝集、即所謂的瑞斯托菌素引發(fā)血小板凝集試驗，其中所述激動劑瑞斯托菌素通過vWF在膠原與GpIb之間形成交聯(lián)，從而產(chǎn)生血小板凝集。結(jié)果顯示抑制膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)的效果高。
本發(fā)明用的印度醋栗學(xué)名為エンビリカ·オフイシナル(Emblicaofficinale)或余甘子(フイランサス·エンビリカ，Phyllanthus embilica)，是屬于大戟科(トウダイグサ科)葉下珠屬(コミカンソウ屬)的落葉亞喬木，分布在印度至馬來西亞地區(qū)以及中國南部，可認(rèn)為印度是原產(chǎn)地。根據(jù)各地區(qū)或語言的不同，分別有其特定的名稱，也稱為余柑子(youganzi)、油甘(yougan)、奄摩勒(Anmaroku)、エンブリツク·ミロバラン(embolic myrobalan)、ア一マラキ一(himawarik)、マラツカノキ(malaka)、，マラツカツリ一(malaka tree)、インデイアング一ズベリ一(Indian gooseberry)、アロンラ(Alonla)、アミラ(Amali)、アミラキ(Amlaki)、アミラキヤトラ(Amila chatra)、ネリカイ(Nellikayi)、ネルリ(Nelli)、タシヤ(Tasha)、カユラカ(Kayruk)、ケムラカ(Kemurak)、ナツクホンポン(Makkham pom)等。
本發(fā)明中，印度醋栗的部位優(yōu)選使用果實。其形態(tài)沒有特別限定，可以是未成熟果實、完全成熟果實、干燥果實等的全部或部分等任何形式。榨取果實所得的果汁也可作為有效成分使用。果汁也可以以果汁粉末等的形式使用。
使用果汁或果汁粉末時，可以直接使用，但使用鮮果實或干燥果實等含有水不溶性成分的果實時，通過提取可以除去水不溶性成分，這可提高效果，因而優(yōu)選。
提取時，如果使用鮮果實，則優(yōu)選在除去種子之后添加或不添加水，為了提高提取效率，使用通過攪拌機等進行了破碎、勻質(zhì)化的材料作為提取原料。
使用干燥果實時，為提高提取效率，優(yōu)選使用粉碎成40目或以下粒度的材料作為提取原料。
果汁也可以作為提取原料使用。
本發(fā)明的抗血栓組合物中的提取物優(yōu)選如下制備。
關(guān)于提取方法，對于提取溶劑、提取溫度等沒有特別限定。提取溶劑可以使用水、堿、酸、其它食鹽水等非有機溶劑。優(yōu)選選自水、堿、酸的至少一種。
使用酸或堿作為提取溶劑時，優(yōu)選使提取物中和。中和反應(yīng)生成的鹽可通過透析法、凝膠過濾等公知的方法除去。使用水作為提取溶劑時，無需上述中和反應(yīng)，無需除去生成的鹽，因此進一步優(yōu)選使用水。
此時使用的酸沒有特別限定，可以使用大部分的酸，優(yōu)選選自鹽酸和硫酸的一種或?qū)煞N并用。
堿沒有特別限定，可以使用大部分的堿，優(yōu)選選自氫氧化鈉和氫氧化鉀的一種或?qū)烧卟⒂谩?br> 用于提取的酸或堿的濃度沒有特別限定，根據(jù)酸或堿的強度變化，優(yōu)選0.01-0.5摩爾的濃度。通常，酸或堿以所述濃度的水溶液使用。
相對于100重量份干燥的提取原料，提取溶劑可優(yōu)選使用500-5000重量份。提取溫度優(yōu)選40-70℃。提取可在靜置或攪拌下進行。
本說明書中的干燥操作可以通過將干燥對象在干燥機[例如送風(fēng)恒溫干燥機(ヤマト公司制造)]內(nèi)以60-110℃保持2-16小時來進行。例如將干燥對象在70℃保持10小時進行干燥。
上述提取中，通過對提取殘余物重復(fù)進行一次或多次再次提取步驟，可以使提取率提高、收率提高，因而優(yōu)選。此時提取所使用的溶劑可以是相同的，也可以使用另外的溶劑。
果汁或上述所得的提取液(含提取物的液體，以下相同)可以直接使用，但通過過濾、離心分離除去不溶性物質(zhì)，可以使抗血栓作用相對提高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
除去不溶性物質(zhì)之后，直接使用果汁或提取液，或者將果汁或提取液濃縮后加入乙醇、回收所得沉淀物，這可進一步使抗血栓作用提高，因而優(yōu)選。乙醇的濃度沒有特別限定，從提高收率和作用的角度考慮，優(yōu)選乙醇的濃度為60-95％(v/v)，更優(yōu)選70-90％(v/v)。本說明書中，“沉淀物”是指將含有沉淀物的液體在例如25℃、以2000rpm或以上離心分離時發(fā)生沉淀的物質(zhì)。
提取液可直接使用，也可以根據(jù)所需，通過噴霧干燥、冷凍干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本發(fā)明的抗血栓組合物中印度醋栗的果實含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；印度醋栗果汁的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為5-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選10-95重量％；它們的提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的抗血栓組合物優(yōu)選為使用選自水、堿和酸的至少一種從印度醋栗的果實或果汁中提取得到的印度醋栗的果實或果汁的提取物的抗血栓組合物；還優(yōu)選為含有通過乙醇從印度醋栗的果實或果汁的提取物、或果汁中分離出來的沉淀物的抗血栓組合物。
本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物中的提取物優(yōu)選如下制備。下述記載之外的內(nèi)容與上述抗血栓組合物的情況相同。
提取溶劑可以使用水、堿、酸、其它親水性溶劑。從操作性、提取效率角度考慮，親水性溶劑優(yōu)選甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇和丙酮。特別優(yōu)選選自水、堿和酸的至少一種。
果汁或提取液可以直接使用，但通過過濾、離心分離除去不溶性物質(zhì)，可以使血纖維蛋白形成抑制作用相對提高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
除去不溶性物質(zhì)之后，直接使用果汁或提取液，或者將果汁或提取液濃縮后加入乙醇、回收所得沉淀物，這可進一步使血纖維蛋白形成抑制作用提高，因而優(yōu)選。乙醇的濃度沒有特別限定，從作用提高的角度考慮，優(yōu)選20-80％(v/v)，更優(yōu)選60-80％(v/v)。
使用色譜、柱，進一步對加入乙醇得到的沉淀物進行純化，可得到血纖維蛋白形成抑制作用更高的組分，因而優(yōu)選。色譜、柱沒有特別限定，例如可以使用離子交換色譜、凝膠過濾色譜、疏水性色譜、吸附柱色譜、親和色譜、反相柱色譜、離子交換柱、凝膠過濾柱、疏水性柱、反相柱。從純化效率來看，優(yōu)選凝膠過濾色譜或凝膠過濾柱。
本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物中印度醋栗果實的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；印度醋栗果汁的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為5-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選10-95重量％；它們的提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物優(yōu)選為如下抑制血纖維蛋白形成的組合物，所述組合物為印度醋栗的果實或果汁的提取物，該提取物是使用選自水、堿、酸和親水性溶劑的至少一種從印度醋栗的果實或果汁中提取的；還優(yōu)選為含有通過乙醇從印度醋栗的果實或果汁的提取物、或果汁中分離出來的沉淀物的抑制血纖維蛋白形成的組合物。
本發(fā)明的抗血小板凝集組合物中的提取物優(yōu)選如下制備。下述記載之外的內(nèi)容與上述抗血栓組合物的情況相同。
果汁或提取液可以直接使用，但通過過濾或離心分離除去不溶性物質(zhì)，可以使抗血小板作用相對提高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
除去不溶性物質(zhì)之后，直接使用果汁或提取液，或者將果汁或提取液濃縮后加入乙醇，回收所得上清(含有可溶性組分)，這可進一步使抗血小板作用提高，因而優(yōu)選。乙醇的濃度沒有特別限定，從作用提高的角度考慮，優(yōu)選10-90％(v/v)，進一步優(yōu)選10-30％(v/v)。本說明書中，上清是指將含有沉淀物的液體在例如25℃、以2000rpm或以上離心，此時將發(fā)生沉淀的物質(zhì)除去的殘余液體。
本發(fā)明的抗血小板凝集組合物中的印度醋栗果實的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；印度醋栗果汁的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為5-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選10-95重量％；它們的提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的抗血小板凝集組合物優(yōu)選為如下抗血小板凝集組合物，所述組合物為印度醋栗的果實或果汁的提取物，該提取物是使用選自水、堿和酸的至少一種從印度醋栗的果實或果汁中提取的；還優(yōu)選為含有通過乙醇從印度醋栗的果實或果汁的提取物、或果汁中分離出來的含有可溶性組分的抗血小板凝集組合物。
本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物中的提取物優(yōu)選如下制備。下述記載之外的內(nèi)容與上述抗血栓組合物的情況相同。
提取溶劑除水、堿、酸等之外，還可以使用親水性溶劑、丙酮。從操作性、提取效率角度考慮，親水性溶劑優(yōu)選選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇的一種或以上。特別優(yōu)選選自水、堿和酸的至少一種。
果汁或提取液可以直接使用，但通過過濾、離心分離或分餾除去不溶性物質(zhì)和溶劑，可以使抗血小板作用提高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
除去不溶性物質(zhì)和溶劑之后，直接或者將果汁或提取液濃縮后用有機溶劑進行分配，可得到各溶劑可溶性組分。這些溶劑可溶性組分可使抗血小板作用進一步提高，因而優(yōu)選。有機溶劑可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基異丁基酮、己烷、丙酮或氯仿。為了提高可溶性組分的純度，可以結(jié)合其它疏水性溶劑進行分配來使用，優(yōu)選使用乙醇。這些溶劑的濃度沒有特別限定，從收率和作用提高的角度考慮，終濃度優(yōu)選20-80％(v/v)，更優(yōu)選20-60％(v/v)。
為了進一步提高純度，可以通過使用以酚系、苯乙烯系、丙烯酸系、環(huán)氧胺系、吡啶系、甲基丙烯酸系等為母體的疏水性樹脂的色譜、柱進行純化。此時，樹脂吸附后，洗脫液可以以單獨或水溶液的形式使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇和丙酮。
本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物中的印度醋栗果實的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；印度醋栗果汁的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為5-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選10-95重量％；它們的提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物優(yōu)選為使用選自水、堿、酸、親水性溶劑和丙酮的至少一種從印度醋栗的果實或果汁中提取得到的印度醋栗的果實或果汁的提取物的抑制血小板凝集的組合物；還優(yōu)選為含有印度醋栗的果實或果汁的提取物通過有機溶劑、優(yōu)選選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基異丁基酮、己烷或氯仿的至少一種分離的組分的抑制血小板凝集的組合物。
以上的用于本發(fā)明的各組合物的提取物的提取操作中，通過結(jié)合酶處理，可以得到收率、風(fēng)味得到改善、作用提高的提取物，因此優(yōu)選在提取前和/或提取時對提取原料進行酶處理。酶處理時的pH可以以要使用的酶的最適pH和pH穩(wěn)定性為指標(biāo)進行適當(dāng)選擇。處理時的溫度也可以以要使用的酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性為指標(biāo)進行適當(dāng)選擇。本發(fā)明的酶處理所使用的酶只要是食品工業(yè)用的酶即可，沒有特別限定，可以是選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麥芽三糖水解酶(マロトトリオヒドロラ一ゼ)、β-淀粉酶、轉(zhuǎn)葡糖苷酶、脂酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、脫氨酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、乳糖酶、鞣酸酶、綠原酸酯酶、支鏈淀粉酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、粗制凝乳酶、磷酸酯酶A2等的一種或兩種或以上。可優(yōu)選將選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、綠原酸酯酶和鞣酸酶的一種或?qū)煞N或以上并用。酶的用量沒有特別限定，根據(jù)酶的種類而不同，相對于100重量份干燥的提取原料，優(yōu)選使用0.05-2重量份。對印度醋栗的果實或果汁也可同樣進行酶處理。
因此，作為以上的本發(fā)明的組合物，更優(yōu)選含有經(jīng)酶處理的印度醋栗的果實、果汁或它們的提取物的組合物。
對于本發(fā)明的抗血栓組合物的抗血栓沒有特別限定，優(yōu)選是抑制血栓形成的作用(抗凝作用)。例如如后述的試驗例A-1所示，抗血栓效果可以是對內(nèi)源性凝血系統(tǒng)測定抗凝活性的方法，即，通過測定活化部分凝血激酶時間(APTT)來確認(rèn)。
例如如后述的試驗例A’-1所示，本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物中抑制血纖維蛋白形成的效果?？扇缦麓_認(rèn)向3ml 0.7％血纖維蛋白原試劑中加入300μl抑制血纖維蛋白形成的組合物，使其均勻，然后添加300μl凝血酶試劑(10U/ml)，使血纖維蛋白形成并凝固，測定該凝固重量，求出血纖維蛋白形成抑制率。血纖維蛋白形成抑制率通常優(yōu)選20％或以上，更優(yōu)選30％或以上。
本發(fā)明的抗血小板凝集組合物中的抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可簡稱為抗血小板。例如如后述的試驗例A”-1所示，抗血小板活性可如下確認(rèn)使用血小板凝集測定儀，測定在向血小板的懸浮液(富血小板血漿)或采集的血液中加入引發(fā)凝集的物質(zhì)(ADP、腎上腺素、膠原、花生四烯酸等)時的血小板凝集率的方法。
本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物中的血小板凝集抑制是指抑制血小板的凝集，可簡稱為抗血小板。例如如后述的試驗例A-1所示，抗血小板活性可如下確認(rèn)使用全血血小板凝集測定儀，測定在向采集的血液中加入瑞斯托菌素時的血小板凝集率的方法，其中所述激動劑瑞斯托菌素通過在膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)來引發(fā)血小板凝集。
本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于飲料食品、藥物、飼料等，優(yōu)選應(yīng)用于人可輕易接觸的飲料食品或藥物。他們的詳細(xì)的應(yīng)用例子如后所述。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量可考慮給予對象個體的身體狀況、體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)調(diào)節(jié)。對于攝取次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次攝取。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量以該組合物的形式考慮，通常每50kg體重的人為0.05-20g/天，優(yōu)選0.1-5g/天。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量可考慮給藥方法、疾病的癥狀、給藥對象的體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)確定。對于給藥次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次給藥。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人為40mg-3g/天，優(yōu)選100-500mg/天。
(2)茶本發(fā)明具體提供用于抗血栓的組合物和用于抗血小板凝集的組合物，其特征在于含有茶的提取物作為有效成分。
本發(fā)明的組合物根據(jù)上述茶成分所具有的作用而發(fā)揮其效果，本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)所述茶成分具有以下的作用。
即，對上述茶成分測定活化部分凝血激酶時間(APTT)，結(jié)果顯示使與內(nèi)源性途徑有關(guān)的因子失活，抑制血纖維蛋白的形成、抑制血管內(nèi)血栓形成的效果高。
對上述茶成分進行血小板凝集試驗，結(jié)果顯示抑制血小板凝集物的生成的效果高。即，對上述茶成分加入激動劑ADP時出現(xiàn)的血小板凝集，即所謂的ADP引發(fā)血小板凝集試驗結(jié)果顯示通過抑制通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原的與其它血小板的結(jié)合階段來抑制血小板凝集的效果高。其中所述激動劑ADP引發(fā)通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板的結(jié)合階段，發(fā)生血小板凝集。
本發(fā)明所使用的茶沒有特別限定，有由植物學(xué)山茶科植物的葉制造的不發(fā)酵茶——綠茶、半發(fā)酵茶——烏龍茶、發(fā)酵茶——紅茶。其中從效果角度考慮，優(yōu)選使用不發(fā)酵茶——綠茶。
本發(fā)明的茶提取物中，澀味成分多酚類降低，從風(fēng)味角度考慮優(yōu)選。
除去澀味成分多酚的方法可利用向提取液中添加聚乙烯聚吡咯烷酮的方法(日本特開平1-218550號公報)、通過冷凍濃縮與脫出的水一起除去多酚的方法(日本特開2002-325539號公報)等公知的方法。
本發(fā)明中的多酚含量的測定方法沒有特別限定，例如有酒石酸鐵比色法、福林-喬卡梯奧法，優(yōu)選酒石酸鐵比色法。從味道方面考慮，多酚含量優(yōu)選占茶提取物固體成分的15重量％或以下，進一步優(yōu)選10重量％或以下。
這里，例如目的是采集多酚類時，則從茶的水或熱水提取物中提取多酚類后的殘余物就符合本發(fā)明的“多酚類降低的茶提取物”。多酚類具有易溶解于特定的有機溶劑的性質(zhì)，因此，例如使用特定的有機溶劑進行分離時，大部分溶解于有機溶劑一側(cè)(非水溶性組分)，幾乎不含在水組分中。也就是說，用水或熱水提取茶葉或茶葉粉碎后的物質(zhì)，其分配到乙酸乙酯、丙酮等溶劑中時，可從進入水的組分中得到“多酚類降低的茶提取物”。近年來，鑒于多酚類所具有的各種功能性，多酚類的利用程度提高，從茶的熱水提取物中提取多酚類后余留的成分被作為副產(chǎn)物(或殘余物)處理，幾乎未得到有效利用，而直接扔棄。從這點來講，本發(fā)明使至今未被有效利用、被扔棄的成分得到有效利用，因此使茶的熱水提取物毫無剩余地得到利用，具有經(jīng)濟性得到提高和廢棄物排放量降低的優(yōu)點。
本發(fā)明的茶提取物優(yōu)選低咖啡因，其中所述咖啡因具有使作為凝血原因的凝血酶原和血纖維蛋白原的血中濃度增加的功能。
除去咖啡因的方法可利用使用酸性白土的方法(日本特開平06-142405號公報)、使用活性炭的方法(日本特開平08-070772號公報)、使用合成吸附劑的方法(日本特開平08-109178號公報)等常規(guī)已知方法。
咖啡因的測定方法沒有特別限定，例如有高效液相色譜?？Х纫蚝績?yōu)選占茶提取物固體成分的2重量％或以下，進一步優(yōu)選1重量％或以下。
關(guān)于從上述茶的水或熱水提取物分配到乙酸乙酯或丙酮中后的分配物的水組分中分離茶提取物的方法，該方法在除去多酚的同時還可降低咖啡因，因而優(yōu)選。
茶的提取方法沒有特別限定，例如使用水或熱水作為提取溶劑時，相對于100重量份干燥的提取原料，可優(yōu)選使用500-5000重量份提取溶劑。提取溫度優(yōu)選40-100℃。提取可在靜置或攪拌下進行。
上述提取中，通過對提取殘余物重復(fù)進行一次或多次再次提取步驟，可以使提取率提高，因而優(yōu)選。此時，提取所使用的溶劑可以是相同的，也可以使用另外的溶劑。
上述提取液可以直接使用，但通過過濾、離心分離除去不溶性物質(zhì)，可以使抗血栓效果或抗血小板凝集效果提高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
除去不溶性物質(zhì)之后，向提取液中加入乙醇，回收所得沉淀物，這可進一步使抗血栓效果或抗血小板凝集效果提高，因而優(yōu)選。乙醇的濃度沒有特別限定，從收率和作用提高的角度考慮，終濃度優(yōu)選為10-50％(v/v)，更優(yōu)選15-45％(v/v)。
提取液可直接使用，也可以根據(jù)所需干燥使用。
本發(fā)明的用于抗血栓的組合物或用于抗血小板凝集的組合物中，茶提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為5-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選10-90重量％。
本發(fā)明的用于抗血栓的組合物或用于抗血小板凝集的組合物優(yōu)選為以下的茶的提取物的組合物，多酚類降低的茶的提取物；咖啡因降低的茶的提取物；將多酚類和/或咖啡因降低的茶提取物再用乙醇分離得到的沉淀物。
本發(fā)明的用于抗血栓的組合物中，對于抗血栓沒有特別限定，優(yōu)選為抑制血栓形成的作用(抗凝作用)?？寡ㄐЧ臏y定沒有特別限定，例如如后述的試驗例B-1所示，在對內(nèi)源性凝血系統(tǒng)測定抗凝活性的方法中，可通過測定活化部分凝血激酶時間(APTT)來確認(rèn)。
本發(fā)明的用于抗血小板凝集的組合物中，抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可簡稱為抗血小板。例如如后述的試驗例B’-1所示，抗血小板活性可如下確認(rèn)使用血小板凝集測定儀，測定在向血小板的懸浮液(富血小板血漿)或采集的血液中加入引發(fā)凝集的物質(zhì)(ADP、腎上腺素、膠原、花生四烯酸等)時的血小板凝集率的方法。
本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于飲料食品、藥物、飼料等，優(yōu)選應(yīng)用于人可輕易接觸的飲料食品或藥物。它們的具體應(yīng)用例子如后所述。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量可考慮給予對象個體的身體狀況、體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)調(diào)節(jié)。對于攝取次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次攝取。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量以該組合物的形式考慮，通常每50kg體重的人為0.05-20g/天，優(yōu)選0.1-5g/天。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量可考慮給藥方法、疾病的癥狀、給藥對象的體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)確定。對于給藥次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次給藥。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人為50mg-3g/天，優(yōu)選100-500mg/天。
(3)木槿具體來說，本發(fā)明中提供抗血液凝固組合物、預(yù)防血小板凝集的組合物、以及用于預(yù)防血小板凝集的組合物，其特征在于含有選自木槿果實、果汁以及它們的提取物的至少一種作為有效成分。
本發(fā)明的組合物根據(jù)上述木槿成分所具有的作用而發(fā)揮其效果，本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)所述木槿成分具有以下的作用。
即，對上述木槿成分測定活化部分凝血激酶時間(APTT)，結(jié)果顯示使與內(nèi)源性途徑有關(guān)的因子失活，抑制血纖維蛋白的形成、抑制血管內(nèi)的血栓形成的效果高。
對上述木槿成分加入激動劑ADP時出現(xiàn)的血小板凝集，即所謂的ADP引發(fā)血小板凝集試驗結(jié)果顯示通過抑制通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原的與其它血小板的結(jié)合階段來抑制形成血小板凝集血栓的效果高。其中所述激動劑ADP引發(fā)通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，發(fā)生血小板凝集。
對上述木槿成分加入激動劑瑞斯托菌素時出現(xiàn)的血小板凝集，即所謂的瑞斯托菌素引發(fā)血小板凝集試驗結(jié)果顯示通過抑制膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，其抗血小板凝集效果高。其中所述激動劑瑞斯托菌素通過在膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，從而發(fā)生血小板凝集。
本發(fā)明使用的木槿學(xué)名為木槿(ハイビスカス，Hibiscus)，在日本被稱為佛桑華(ブツソウゲ)。木槿是屬于錦葵科(アオイ科)木槿屬(フヨウ屬)的常綠灌木，名稱源自古代埃及美麗的女神依西斯(ヒビス)。原產(chǎn)地為中國南部、中國南部·印度東部·太平洋諸島·熱帶非洲。木槿具有清爽的酸味，最近也作為法國菜或意大利菜的調(diào)味汁使用，作為草藥使用的食用木槿，學(xué)名為玫瑰茄(ハイビスカスサブダリフア，Hibiscus sabdariffa)/(英)洛神葵(ロゼ一ル，roselle)·(美)フロリダクランベリ一，F(xiàn)lorida cranberry的種類在牙買加、蘇丹、埃及、泰國、中國、蘇里南、馬來西亞等國都有栽培。
本發(fā)明中，木槿的部位可以使用果實、果汁、葉或其提取物，優(yōu)選使用來自花萼和花的果實瓣或葉的部分。其形態(tài)沒有特別限定，可以是鮮果實、干燥果實、果實粉末、鮮葉、干燥葉、干燥葉粉末等的任何形式。
使用果汁或果汁粉末時，可以直接使用，但鮮果實、干燥果實、鮮葉或干燥葉等含有水不溶性成分，優(yōu)選通過提取除去水不溶性成分。
提取時，如果使用鮮果實、干燥果實、鮮葉或干燥葉作為提取原料，為了提高提取效率，優(yōu)選使用通過攪拌機等進行破碎、勻質(zhì)化的材料。
使用干燥果實或干燥葉時，為提高提取效率，優(yōu)選使用粉碎成40目或以下的粒度。
關(guān)于提取方法，對提取溶劑、提取溫度等沒有特別限定。提取溶劑可以使用水、堿、酸、親水性溶劑、丙酮。作為親水性溶劑，從操作性、提取效率考慮，選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇的一種或以上的優(yōu)選。特別優(yōu)選選自水、堿、酸的至少一種。
使用酸或堿作為提取溶劑時，優(yōu)選使提取物中和。由中和反應(yīng)生成的鹽可通過透析法、凝膠過濾等公知的方法除去。使用水作為提取溶劑時，無需上述中和反應(yīng)，無需除去生成的鹽，因此進一步優(yōu)選使用水。
此時使用的酸沒有特別限定，可以使用大部分的酸，從容易獲得以及操作性方面考慮，優(yōu)選選自鹽酸和硫酸的一種或?qū)煞N并用。
堿沒有特別限定，可以使用大部分的堿，優(yōu)選選自氫氧化鈉和氫氧化鉀的一種或?qū)烧卟⒂谩?br> 用于提取的酸或堿的濃度不管是在酶處理提取物前或后都沒有特別限定，根據(jù)酸或堿的強度變化，從操作性和提取效率考慮，優(yōu)選使用0.01-0.5摩爾的濃度。通常，酸或堿以所述濃度的水溶液使用。
相對于100重量份干燥的提取原料，提取溶劑可優(yōu)選使用500-5000重量份。提取溫度優(yōu)選40-70℃。提取可在靜置或攪拌下進行。
上述提取中，通過對提取殘余物重復(fù)進行一次或多次再次提取步驟，可以使提取率提高、收率提高，因而優(yōu)選。此時的提取所使用的溶劑可以是相同的，也可以使用另外的溶劑。
上述所得的提取液可以直接使用，但通過過濾、離心分離或分餾除去不溶性物質(zhì)和溶劑，可以使抗凝血效果或抗血小板凝集效果高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
以上的用于本發(fā)明的各組合物的提取物的提取操作中，通過結(jié)合酶處理，可以得到收率、風(fēng)味得到改善、作用提高的提取物，因此優(yōu)選在提取前和/或提取時對提取原料進行酶處理。酶處理時的pH可以以要使用的酶的最適pH和pH穩(wěn)定性為指標(biāo)進行適當(dāng)選擇。處理時的溫度也可以以要使用的酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性為指標(biāo)進行適當(dāng)選擇。本發(fā)明的酶處理所使用的酶只要是食品工業(yè)用的酶即可，沒有特別限定，可以是選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麥芽三糖水解酶、β-淀粉酶、轉(zhuǎn)葡糖苷酶、脂酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、脫氨酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、乳糖酶、鞣酸酶、綠原酸酯酶、支鏈淀粉酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、粗制凝乳酶、磷酸酯酶A2等的一種或兩種或以上?？蓛?yōu)選將選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、綠原酸酯酶和鞣酸酶的一種或兩種或以上并用。酶的用量沒有特別限定，根據(jù)酶的種類而不同，相對于100重量份干燥的提取原料，優(yōu)選使用0.05-2重量份。酶處理也可同樣對木槿的果實、果汁或葉進行。
因此，作為以上的本發(fā)明的組合物，更優(yōu)選含有經(jīng)酶處理的木槿的果實、果汁、葉或它們的提取物的組合物。
另一方面，如上所述，在除去不溶性物質(zhì)和溶劑后，可直接或用有機溶劑對果汁或提取液進行濃縮后進行分配，得到各溶劑可溶性組分。這些溶劑可溶性組分可使抗凝血效果或抗血小板凝集效果進一步提高，因而優(yōu)選。有機溶劑可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基異丁基酮、己烷、丙酮或氯仿。為了提高可溶性組分的純度，可以結(jié)合其它疏水性溶劑進行的分配來使用，優(yōu)選使用乙醇。這些溶劑的濃度沒有特別限定，從收率和效果考慮，終濃度優(yōu)選20-80％(v/v)，進一步優(yōu)選20-60％(v/v)。
為了進一步提高純度，可以通過使用以酚系、苯乙烯系、丙烯酸系、環(huán)氧胺系、吡啶系、甲基丙烯酸系等為母體的疏水性樹脂的色譜、柱進行純化。此時，樹脂吸附后，洗脫液可以以單獨或水溶液的形式使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇和丙酮。
提取液和組分可直接使用，也可以根據(jù)所需，通過噴霧干燥、冷凍干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本發(fā)明的抗血液凝固組合物中，木槿果實的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；木槿果汁的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為5-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選10-95重量％；木槿葉的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；它們的提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物或用于預(yù)防血小板凝集的組合物中，木槿果實的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；木槿果汁的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為5-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選10-95重量％；木槿葉的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；它們的提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的抗血液凝固組合物、預(yù)防血小板凝集的組合物或用于預(yù)防血小板凝集的組合物優(yōu)選為通過選自水、堿、酸、親水性溶劑和丙酮的至少一種從木槿的果實、果汁或葉中提取得到的木槿果實、果汁或葉的提取物的組合物；還優(yōu)選為含有木槿的果實、果汁或葉的提取物通過有機溶劑、優(yōu)選選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基異丁基酮、己烷、丙酮或氯仿的至少一種分離的組分的組合物。
例如如后述的試驗例C-2所示，本發(fā)明的抗血液凝固組合物的抗凝血效果是通過對內(nèi)源性凝血系統(tǒng)測定抗凝血活性的方法，即，通過測定活化部分凝血激酶時間(APTT)來確認(rèn)。
本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物中，抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可簡稱為抗血小板。例如如后述的試驗例C’-1所示，抗血小板活性可如下確認(rèn)使用全血血小板凝集測定儀，測定在向采集的血液中加入激動劑ADP時的血小板凝集率的方法。其中所述激動劑ADP引發(fā)通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，從而發(fā)生血小板凝集。
本發(fā)明的用于預(yù)防血小板凝集的組合物中，抗血小板凝集是指抑制血小板的凝集，可簡稱為抗血小板。例如如后述的試驗例C”-1所示，抗血小板活性可如下確認(rèn)使用全血血小板凝集測定儀，測定在向采集的血液中加入激動劑瑞斯托菌素時的血小板凝集率的方法。其中所述激動劑瑞斯托菌素通過膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，從而發(fā)生血小板凝集。
本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于飲料食品、藥物、飼料等，優(yōu)選應(yīng)用于人可輕易接觸的飲料食品或藥物。它們的具體應(yīng)用例子如后所述。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量可考慮給予對象個體的身體狀況、體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)調(diào)節(jié)。對于攝取次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次攝取。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量以該組合物的形式考慮，通常每50kg體重的人為0.05-20g/天，優(yōu)選0.1-5g/天。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量可考慮給藥方法、疾病的癥狀、給藥對象的體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)確定。對于給藥次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次給藥。
本發(fā)明的抗血液凝固組合物作為藥物的給藥量，以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人為約50mg-2g/天，優(yōu)選100-500mg/天。
本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物或用于預(yù)防血小板凝集的組合物作為藥物的給藥量以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人為約40mg-3g/天，優(yōu)選100-500mg/天。
(4)蒼耳具體來說，本發(fā)明中提供抑制血小板凝集性血栓的組合物、以及用于抑制血小板凝集性血栓的組合物，其特征在于含有選自蒼耳果實、果汁、種子以及它們的提取物的至少一種作為有效成分。
本發(fā)明的組合物根據(jù)上述蒼耳成分所具有的作用而發(fā)揮其效果，本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)所述蒼耳成分具有以下的作用。
即，對上述蒼耳成分加入激動劑ADP時出現(xiàn)的血小板凝集，即所謂的ADP引發(fā)血小板凝集試驗結(jié)果顯示通過抑制通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，抑制血小板凝集性血栓形成的效果高。其中所述激動劑ADP引發(fā)通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，從而發(fā)生血小板凝集。
對上述蒼耳成分加入激動劑瑞斯托菌素時出現(xiàn)的血小板凝集，即所謂的瑞斯托菌素引發(fā)血小板凝集試驗結(jié)果顯示通過抑制膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)來抑制血小板凝集性血栓形成的效果高。其中所述激動劑瑞斯托菌素通過在膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，從而發(fā)生血小板凝集。
本發(fā)明使用的蒼耳學(xué)名為歐洲蒼耳(キサンテイウムストルマリウム，Xanthium strumarium L.)，是屬于菊科蒼耳屬的一年生草本，高約1米，整體有短剛毛。種子在莖上互生，形狀大體呈心形，先端尖，種子邊緣有不整齊的鋸齒，質(zhì)厚，有稍堅硬的短毛。夏季，在分開的枝頭呈圓錐狀生有黃綠色的頭狀花序。雄花位于上方，有綠色的堅硬的毛刺，雌花位于下方。果實被總苞包裹，周圍有刺，附著于衣物或動物毛皮上傳播。世界上有約20種蒼耳，原產(chǎn)地為亞洲大陸，廣泛分布于世界各地。特別是大多分布于美洲大陸。古代羅馬人用作將頭發(fā)染黃的染料，因此屬名來自于希臘語的黃色(Xanthos)，在日本，可將種子揉碎，用于趨驅(qū)蟲，因此名為“Namomi(生揉み)”。英文名稱為Cocklebur。將蒼耳的成熟果實在陽光下干燥，所得的生藥稱為蒼耳，用作解熱、發(fā)汗、頭痛藥。在歐洲、北非作為家畜的飼料使用，還用作治療淋巴腺腫的藥。
本發(fā)明中，蒼耳的部位可以使用果實、果汁、花萼、花瓣或種子。其形態(tài)沒有特別限定，果實可以是未成熟果實、成熟果實、果汁粉末等的任何形式。
使用果汁或果汁粉末時，可以直接使用，但使用鮮果實或干燥果實等含有水不溶性成分的材料時，從提到效果考慮，優(yōu)選通過提取除去水不溶性成分。
提取時，如果使用鮮果實作為提取原料，優(yōu)選在除去種子后添加或不添加水，為了提高提取效率，使用通過攪拌機等進行破碎、勻質(zhì)化的材料。
使用干燥果實和干燥種子作為提取原料時，為提高提取效率，優(yōu)選粉碎成40目或以下的粒度。
關(guān)于提取方法，對提取溶劑、提取溫度等沒有特別限定。提取溶劑可以使用水、堿、酸、親水性溶劑、丙酮。作為親水性溶劑，從操作性、提取效率考慮，優(yōu)選選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇的一種或以上的優(yōu)選。特別優(yōu)選選自水、堿、酸的至少一種。
使用酸或堿作為提取溶劑時，優(yōu)選使提取物中和。由于中和反應(yīng)而生成的鹽可通過透析法、凝膠過濾等公知的方法除去。使用水作為提取溶劑時，無需上述中和反應(yīng)，無需除去生成的鹽，因此進一步優(yōu)選使用水。
此時，使用的酸沒有特別限定，可以使用大部分的酸，從容易獲得和操作性方面考慮，優(yōu)選選自鹽酸和硫酸的一種或?qū)煞N并用。
堿沒有特別限定，可以使用大部分的堿，優(yōu)選選自氫氧化鈉和氫氧化鉀的一種或?qū)烧卟⒂谩?br> 用于提取的酸或堿的濃度不管是在酶處理提取物前或后都沒有特別限定，根據(jù)酸或堿的強度變化，從操作性和提取效率考慮，優(yōu)選使用0.01-0.5摩爾的濃度。通常，酸或堿以所述濃度的水溶液使用。
相對于100重量份干燥的提取原料，提取溶劑可優(yōu)選使用500-5000重量份。提取溫度優(yōu)選40-70℃。提取可在靜置或攪拌下進行。
上述提取中，通過對提取殘余物重復(fù)進行一次或多次再次提取步驟，可以使提取率提高、收率提高，因而優(yōu)選。此時的提取所使用的溶劑可以是相同的，也可以使用另外的溶劑。
提取液可以直接使用，但通過過濾、離心分離和分餾除去不溶性物質(zhì)和溶劑，可以使抗血小板凝集效果高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
以上的用于本發(fā)明的各組合物的提取物的提取操作中，通過結(jié)合采用酶處理，可以得到收率、風(fēng)味得到改善、作用提高的提取物，因此優(yōu)選在提取前和/或提取時對提取原料進行酶處理。酶處理時的pH可以以要使用的酶的最適pH和pH穩(wěn)定性為指標(biāo)進行適當(dāng)選擇。處理時的溫度也可以以要使用的酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性為指標(biāo)進行適當(dāng)選擇。本發(fā)明的酶處理所使用的酶只要是食品工業(yè)用的酶即可，沒有特別限定，可以是選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麥芽三糖水解酶、β-淀粉酶、轉(zhuǎn)葡糖苷酶、脂酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、脫氨酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、乳糖酶、鞣酸酶、綠原酸酯酶、支鏈淀粉酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、粗制凝乳酶、磷酸酯酶A2等的一種或兩種或以上?？蓛?yōu)選將選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、綠原酸酯酶和鞣酸酶的一種或兩種或以上并用。酶的用量沒有特別限定，根據(jù)酶的種類而不同，相對于100重量份干燥的提取原料，優(yōu)選使用0.05-2重量份。酶處理也可同樣對蒼耳的果實、果汁或種子進行。
因此，作為以上的本發(fā)明的組合物，更優(yōu)選含有經(jīng)酶處理的蒼耳的果實、果汁、種子或它們的提取物的組合物。
另一方面，如上所述，在除去不溶性物質(zhì)和溶劑后，直接或?qū)蛱崛∫簼饪s后用有機溶劑進行分配，得到各溶劑可溶性組分。這些溶劑可溶性組分可使抗血小板凝集效果進一步提高，因而優(yōu)選。有機溶劑可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基異丁基酮、己烷、丙酮或氯仿。為了提高可溶性組分的純度，可以結(jié)合由其它疏水性溶劑進行的分配來使用，優(yōu)選使用乙醇。這些溶劑的濃度沒有特別限定，從收率和效果考慮，終濃度優(yōu)選20-80％(v/v)，進一步優(yōu)選20-60％(v/v)。
為了進一步提高純度，可以通過使用以酚系、苯乙烯系、丙烯酸系、環(huán)氧胺系、吡啶系、甲基丙烯酸系等為母體的疏水性樹脂的色譜、柱進行純化。此時，樹脂吸附后，洗脫液可以以單獨或水溶液的形式使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇和丙酮。
提取液和組分可直接使用，也可以根據(jù)所需，通過噴霧干燥、冷凍干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本發(fā)明的抑制血小板凝集性血栓的組合物或用于抑制血小板凝集性血栓的組合物中，蒼耳果實的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；蒼耳果汁的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為5-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選10-95重量％；蒼耳種子的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；它們的提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的抑制血小板凝集性血栓的組合物或用于抑制血小板凝集性血栓的組合物優(yōu)選為通過選自水、堿、酸、親水性溶劑和丙酮的至少一種從蒼耳的果實、果汁或種子中提取得到的蒼耳果實、果汁或種子的提取物的組合物；還優(yōu)選為含有蒼耳的果實、果汁或種子的提取物通過有機溶劑、優(yōu)選選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基異丁基酮、己烷、丙酮或氯仿的至少一種分離的組分的組合物。
本發(fā)明的抑制血小板凝集性血栓的組合物中，抑制血小板凝集性血栓是指抑制血小板的凝集、抑制血栓的形成，血小板凝集可簡稱為抗血小板。例如如后述的試驗例D-1所示，抗血小板活性可如下確認(rèn)使用全血血小板凝集測定儀，測定在向采集的血液中加入激動劑ADP時的血小板凝集率的方法。其中所述激動劑ADP引發(fā)通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，從而發(fā)生血小板凝集。
本發(fā)明的用于抑制血小板凝集性血栓的組合物中，抑制血小板凝集性血栓是指抑制血小板的凝集、抑制血栓的形成，抑制血小板凝集可簡稱為抗血小板。例如如后述的試驗例D’-1所示，抗血小板活性可如下確認(rèn)使用全血血小板凝集測定儀，測定在向采集的血液中加入激動劑瑞斯托菌素時的血小板凝集率的方法。其中所述激動劑瑞斯托菌素通過在膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，從而發(fā)生血小板凝集。
本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于飲料食品、藥物、飼料等，優(yōu)選應(yīng)用于人可輕易接觸的飲料食品或藥物。它們的具體應(yīng)用例子如后所述。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量可考慮給予對象個體的身體狀況、體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)調(diào)節(jié)。對于攝取次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次攝取。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量以該組合物的形式考慮，通常每50kg體重的人為0.05-20g/天，優(yōu)選0.1-5g/天。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量可考慮給藥方法、疾病的癥狀、給藥對象的體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)確定。對于給藥次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次給藥。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人約為40mg-3g/天，優(yōu)選100-500mg/天。
(5)匙羹藤具體來說，本發(fā)明中提供血栓形成抑制劑，其特征在于含有選自匙羹藤、其提取物或它們的混合物作為有效成分。
本發(fā)明的組合物根據(jù)上述匙羹藤成分所具有的作用而發(fā)揮其效果，本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)所述匙羹藤成分具有以下的作用。
即，對上述匙羹藤成分進行血小板凝集試驗，結(jié)果顯示抑制血小板凝集物的生成的效果高。即，對上述匙羹藤成分加入激動劑ADP時出現(xiàn)的血小板凝集，即所謂的ADP引發(fā)血小板凝集試驗結(jié)果顯示通過抑制通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原的與其它血小板結(jié)合的階段來抑制血小板凝集的效果高。其中所述激動劑ADP引發(fā)通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，從而發(fā)生血小板凝集。
本發(fā)明使用的匙羹藤學(xué)名為匙羹藤(ギムネマ·スルヴエスタ，Gymnema Sylvestre)，是原產(chǎn)于印度、廣泛分布于印度尼西亞、中國西南部等熱帶至亞熱帶地區(qū)的蘿摩科(Asclepidaceae)爬蔓植物，從植物分類學(xué)上講，是與在日本也有生長的籮摩(ガガイモ，Metaplexisjaponica)、イケマ(Cynanchum caudatum)、馬利筋(トウワタ，Asclepiascurassavica)等屬于同科的植物。
本發(fā)明中，匙羹藤的部位通?？梢允褂眠x自葉、莖、蔓的一種或兩種或以上。其形態(tài)沒有特別限定。為粉末時，可以直接使用，但優(yōu)選通過用水等提取，使水不溶性成分除去。
關(guān)于提取方法，對提取溶劑、提取溫度等沒有特別限定。提取溶劑可以使用水、堿、酸、醇類、其它食鹽水等非有機溶劑，優(yōu)選選自水、堿、酸和醇類的一種或以上。
使用酸或堿作為提取溶劑時，優(yōu)選使提取物中和。由中和反應(yīng)生成的鹽可通過透析法、凝膠過濾等公知的方法除去。使用水作為提取溶劑時，無需上述中和反應(yīng)，無需除去生成的鹽，因此進一步優(yōu)選使用水。
此時，使用的酸沒有特別限定，可以使用大部分的酸，優(yōu)選選自鹽酸和硫酸的一種或?qū)煞N并用。
堿沒有特別限定，可以使用大部分的堿，優(yōu)選選自氫氧化鈉和氫氧化鉀的一種或?qū)烧卟⒂谩?br> 用于提取的酸或堿的濃度沒有特別限定，根據(jù)酸或堿的強度變化，優(yōu)選使用0.01-0.5摩爾的濃度。通常，酸或堿以所述濃度的水溶液使用。
本發(fā)明中的醇類沒有特別限定，優(yōu)選可在飲料食品材料的制備中使用的醇類，進一步優(yōu)選選自乙醇、異丙醇、丙二醇和甘油的一種或以上，最優(yōu)選乙醇。
相對于100重量份干燥的提取原料，提取溶劑可優(yōu)選使用500-5000重量份。提取溫度優(yōu)選40-70℃。提取可在靜置或攪拌下進行。
上述提取中，通過對提取殘余物重復(fù)進行一次或多次再次提取步驟，可以使提取率提高、收率提高，因而優(yōu)選。此時的提取所使用的溶劑可以是相同的，也可以使用另外的溶劑。
上述提取液可以直接使用，但通過過濾或離心分離除去不溶性物質(zhì)，可以使抑制血栓形成的效果提高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
在除去不溶性物質(zhì)后，向提取液中直接或濃縮后加入乙醇，回收所得上清(含有可溶性組分)，所得的抑制血栓形成的效果進一步提高，因而優(yōu)選。乙醇的濃度沒有特別限定，從收率和效果考慮，終濃度優(yōu)選10-95％(v/v)，進一步優(yōu)選60-90％(v/v)。
提取液可直接使用，也可以根據(jù)所需，通過噴霧干燥、冷凍干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本發(fā)明的血栓形成抑制劑中，匙羹藤含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；其提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的血栓形成抑制劑優(yōu)選為通過選自水、堿、酸、醇類的一種或以上提取得到的匙羹藤提取物的血栓形成抑制劑；還優(yōu)選為匙羹藤提取物進一步通過乙醇分離得到的可溶性組分的血栓形成抑制劑。
本發(fā)明的血栓形成抑制劑中，血栓形成抑制沒有特別限定，優(yōu)選主要因抗血小板凝集而抑制血栓的形成?？寡“迥侵敢种蒲“宓哪珊喎Q為抗血小板。例如如后述的試驗例E-1所示，抑制血栓形成的效果中，抗血小板活性可如下確認(rèn)使用血小板凝集測定儀，測定在向血小板的懸浮液(富血小板血漿)或采集的血液中加入引發(fā)凝集的物質(zhì)(ADP、腎上腺素、膠原、花生四烯酸等)時的血小板凝集率的方法。
本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于飲料食品、藥物、飼料等，優(yōu)選應(yīng)用于人可輕易接觸的飲料食品或藥物。它們的具體應(yīng)用例子如后所述。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量可考慮給予對象個體的身體狀況、體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)調(diào)節(jié)。對于攝取次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次攝取。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量以該組合物的形式考慮，通常每50kg體重的人為0.05-20g/天，優(yōu)選0.1-5g/天。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量可考慮給藥方法、疾病的癥狀、給藥對象的體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)確定。對于給藥次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次給藥。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人約為50mg-2g/天，優(yōu)選100-500mg/天。
(6)羊棲菜具體來說，本發(fā)明中提供預(yù)防外源性凝血的組合物、預(yù)防血栓的組合物、以及用于預(yù)防血栓的組合物，其特征在于含有選自羊棲菜、其提取物或它們的混合物的至少一種作為有效成分。
本發(fā)明的組合物根據(jù)上述羊棲菜成分所具有的作用而發(fā)揮其效果，本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)所述羊棲菜成分具有以下的作用。
即，對上述羊棲菜成分進行抗凝血試驗，結(jié)果顯示抑制外源性凝血的生成的效果高。
對上述羊棲菜成分測定活化部分凝血激酶時間(APTT)，結(jié)果顯示使與內(nèi)源性途徑有關(guān)的因子失活，抑制血纖維蛋白的形成、抑制血管內(nèi)的血栓生成的效果高。
本發(fā)明使用的羊棲菜學(xué)名為ヒジキア·フシフオルミス(Hijikiafusiforumis)，是屬于褐藻類馬尾藻科的海藻。是分布于日本北海道日高地方以南的太平洋沿岸、瀨戶內(nèi)海、兵庫縣附近以西的日本海一側(cè)、九州沿岸的日本近海特產(chǎn)。干品為黑褐色，但鮮品為黃褐色。羊棲菜生長于波浪大的外海巖礁上、低潮帶附近，藻體為濃綠褐色，根為交織的纖維狀，非常發(fā)達(dá)，附著在巖石上生長。藻體的莖是軟骨質(zhì)，呈圓柱狀，粗3-4mm，長度0.5-1mm，從莖部側(cè)生細(xì)長的圓柱狀的葉和側(cè)枝，葉片在幼苗期時肉質(zhì)多、平坦，在成熟期，葉呈線型，長3-10cm，大多先端尖，中間部位整齊，但常常是先端部位呈膨大的棍棒狀，中空且有氣泡，春季至初夏期間生長茂盛。澀味重，不能生食，但用鐵鍋水煮數(shù)小時，則可去除澀味，色素也被去除，將其在日光下干燥，則成“曬干羊棲菜”。只收集曬干羊棲菜中的側(cè)枝部分，則稱為“牙羊棲菜(芽ヒジキ)、米羊棲菜(米ヒジキ)或姬羊棲菜(姬ヒジキ)”，莖狀長的部分(主軸部分)稱為“長羊棲菜(長ヒジキ)”。牙羊棲菜在水中復(fù)原，體積為原來的3倍，重量約為6倍。別名有ひずきも、ねいり、ゎようせんヒジキ、みゎヒジキ等。
本發(fā)明中，羊棲菜的部位沒有特別限定，優(yōu)選使用側(cè)枝部分和主軸部分。其形態(tài)沒有特別限定，可以是鮮羊棲菜、曬干羊棲菜、干燥羊棲菜、羊棲菜粉末等的任何形式。
使用羊棲菜粉末時，可以直接使用，但由于含有水不溶性成分，優(yōu)選通過提取除去水不溶性成分。
提取時，如果使用鮮羊棲菜、曬干羊棲菜、干燥羊棲菜作為提取原料，為了提高提取效率，優(yōu)選使用通過攪拌機等進行破碎、勻漿得到的材料。
使用曬干羊棲菜或干燥羊棲菜作為提取原料時，為提高提取效率，優(yōu)選粉碎成40目或以下的粒度。
關(guān)于提取方法，對提取溶劑、提取溫度等沒有特別限定。提取溶劑可以使用水、堿、酸、親水性溶劑、丙酮。作為親水性溶劑，從操作性、提取效率考慮，優(yōu)選選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇的一種或以上。特別優(yōu)選選自水、堿、酸和親水性溶劑的至少一種。
使用酸或堿作為提取溶劑時，優(yōu)選使提取物中和。由中和反應(yīng)生成的鹽可通過透析法、凝膠過濾等公知的方法除去。使用水作為提取溶劑時，無需上述中和反應(yīng)，無需除去生成的鹽，因此進一步優(yōu)選使用水。
此時使用的酸沒有特別限定，可以使用大部分的酸，從容易獲得方面和操作性方面考慮，優(yōu)選選自鹽酸和硫酸的一種或?qū)煞N并用。
堿沒有特別限定，可以使用大部分的堿，優(yōu)選選自氫氧化鈉和氫氧化鉀的一種或?qū)烧卟⒂谩?br> 用于提取的酸或堿的濃度沒有特別限定，根據(jù)酸或堿的強度變化，從操作性和提取效率考慮，優(yōu)選使用0.01-0.5摩爾的濃度。通常，酸或堿以所述濃度的水溶液使用。
相對于100重量份干燥的提取原料，提取溶劑可優(yōu)選使用500-5000重量份。提取溫度優(yōu)選40-70℃。提取可在靜置或攪拌下進行。
以上的提取中，通過酶處理，可以得到收率、風(fēng)味得到改善、作用提高的提取物，因此優(yōu)選進行酶處理。酶處理時的pH可以以要使用的酶的最適pH和pH穩(wěn)定性為指標(biāo)進行適當(dāng)選擇。處理時的溫度也可以以要使用的酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性為指標(biāo)進行適當(dāng)選擇。本發(fā)明的酶處理所使用的酶只要是食品工業(yè)用的酶即可，沒有特別限定，可以使用選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麥芽三糖水解酶、β-淀粉酶、轉(zhuǎn)葡糖苷酶、脂酶、蛋白酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、脫氨酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、乳糖酶、鞣酸酶、綠原酸酯酶、支鏈淀粉酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、粗制凝乳酶、磷酸酯酶A2等的一種或并用兩種?？蓛?yōu)選將選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、綠原酸酯酶和鞣酸酶的一種或兩種并用。酶的用量沒有特別限定，根據(jù)酶的種類而不同，相對于100重量份干燥的提取原料，優(yōu)選使用0.05-2重量份。
上述提取中，通過對提取殘余物重復(fù)進行一次或多次再次提取步驟，可以使提取率提高、收率提高，因而優(yōu)選。此時的提取所使用的溶劑可以是相同的，也可以使用另外的溶劑。
提取液可以直接使用，但通過過濾、離心分離和分餾除去不溶性物質(zhì)和溶劑，可以使預(yù)防外源性凝血的效果或預(yù)防血栓的效果提高，應(yīng)用范圍也廣，因而優(yōu)選。
除去不溶性物質(zhì)和溶劑之后，直接或?qū)⑻崛∫簼饪s后用有機溶劑進行分配，可得到各溶劑可溶性組分。這些溶劑可溶性組分可使預(yù)防外源性凝血效果或預(yù)防血栓的效果進一步提高，因而優(yōu)選。有機溶劑可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基異丁基酮、己烷、丙酮或氯仿，更優(yōu)選使用乙醇。為了提高可溶性組分的純度，可以結(jié)合其它疏水性溶劑進行分配來使用。這些溶劑的濃度沒有特別限定，從收率和效果的角度考慮，終濃度優(yōu)選20-80％(v/v)，進一步優(yōu)選20-60％(v/v)。
為了進一步提高純度，可以通過使用以酚系、苯乙烯系、丙烯酸系、環(huán)氧胺系、吡啶系、甲基丙烯酸系等為母體的疏水性樹脂的色譜、柱進行純化。此時，樹脂吸附后，洗脫液可以以單獨或水溶液的形式使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇和丙酮。
提取液和組分可直接使用，也可以根據(jù)所需，通過噴霧干燥、冷凍干燥等方法使其形成干燥粉末后使用。
本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物、預(yù)防血栓的組合物、或用于預(yù)防血栓的組合物中，羊棲菜的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為10-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選20-90重量％；其提取物的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物、預(yù)防血栓的組合物、或用于預(yù)防血栓的組合物優(yōu)選為通過選自水、堿、酸、親水性溶劑和丙酮的至少一種從羊棲菜提取得到的羊棲菜提取物的組合物；還優(yōu)選為含有羊棲菜提取物通過有機溶劑、優(yōu)選選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇，乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚、甲醚、甲基異丁基酮、己烷、丙酮或氯仿的至少一種分離的組分的組合物。更優(yōu)選提取物經(jīng)過酶處理。
例如如后述的試驗例F-1所示，本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物中，預(yù)防外源性凝血效果可通過測定對外源性凝血系統(tǒng)的抗凝血活性的方法、即，通過測定凝血酶原時間(PT)來確認(rèn)。
本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物和用于預(yù)防血栓的組合物中的預(yù)防血栓的效果例如可通過測定對內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的抗凝血活性的方法、即，通過測定活化部分凝血激酶時間(APTT)來確認(rèn)。例如對本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物，通過后述的試驗例F’-1、對本發(fā)明的用于預(yù)防血栓的組合物，通過后述的試驗例F”-1分別確認(rèn)效果。
本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于飲料食品、藥物、飼料等，優(yōu)選應(yīng)用于人可輕易接觸的飲料食品或藥物。它們的具體應(yīng)用例子如后所述。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量可考慮給予對象個體的身體狀況、體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)調(diào)節(jié)。對于攝取次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次攝取。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量以該組合物的形式考慮，通常每50kg體重的人為0.05-20g/天，優(yōu)選0.1-5g/天。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量可考慮給藥方法、疾病的癥狀、給藥對象的體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)確定。對于給藥次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次給藥。
本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物作為藥物的給藥量以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人約為50mg-2g/天，優(yōu)選100-500mg/天。
本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物和用于預(yù)防血栓的組合物作為藥物的給藥量以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人為約1mg-40mg/天，優(yōu)選2-10mg/天。
(7)角叉菜聚糖具體來說，本發(fā)明提供抗血栓劑，其特征在于含有角叉菜聚糖作為有效成分。
本發(fā)明的組合物根據(jù)上述角叉菜聚糖成分所具有的作用而發(fā)揮其效果，本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)所述角叉菜聚糖成分具有以下的作用。
即，對上述角叉菜聚糖成分測定活化部分凝血激酶時間(APTT)，結(jié)果顯示使與內(nèi)源性途徑有關(guān)的因子失活，抑制血纖維蛋白的形成、抑制血管內(nèi)的血栓生成的效果高。
本發(fā)明使用的角叉菜聚糖是從長枝沙菜(イバラノリ，Hypneacharoides Lamouroux)、麒麟菜(キリンサイ，Eucheuma)、銀杏藻(ギンナンソウ，Iridaea)、線形軟刺藻(スギノリ，chondracanthustenellus Hommersand)或角叉菜(ツノマ，Chondrus ocellatus Holmes)等海藻中提取、純化的天然高分子物質(zhì)，是以分子量為100,000-500,000的半乳糖、3，6-脫水半乳糖為主要成分的多糖類。
可以使用市場銷售的角叉菜聚糖，優(yōu)選為先用水或熱水溶解、然后過濾除去不溶性成分的角叉菜聚糖。
角叉菜聚糖的種類可以是ι-角叉菜聚糖、κ-角叉菜聚糖、λ-角叉菜聚糖的任何一種，也可以是多種的組合。從效果角度看，優(yōu)選ι-角叉菜聚糖或λ-角叉菜聚糖的一種或多種的組合，進一步優(yōu)選λ-角叉菜聚糖。
本發(fā)明的抗血栓劑中，角叉菜聚糖的含量換算成干燥物質(zhì)優(yōu)選為1-100重量％，考慮到該組合物的使用便利性，更優(yōu)選5-95重量％。
本發(fā)明中的抗血栓沒有特別限定，優(yōu)選指抑制血栓形成的作用(抗凝作用)。例如如后述的試驗例G-1所示，抗血栓效果可在測定對內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的抗凝血活性的方法中，通過測定活化部分凝血激酶時間(APTT)來確認(rèn)。
本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于飲料食品、藥物、飼料等，優(yōu)選應(yīng)用于人可輕易接觸的飲料食品或藥物。它們的具體應(yīng)用例子如后所述。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量可考慮給予對象個體的身體狀況、體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)調(diào)節(jié)。對于攝取次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次攝取。
本發(fā)明的組合物作為飲料食品的攝取量以該組合物的形式考慮，通常每50kg體重的人為0.05-20g/天，優(yōu)選0.1-5g/天。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量可考慮給藥方法、疾病的癥狀、給藥對象的體重、年齡、性別等，根據(jù)各種情況適當(dāng)確定。對于給藥次數(shù)、時間間隔、時間等沒有限制，例如可以每天一次至分?jǐn)?shù)次給藥。
本發(fā)明的組合物作為藥物的給藥量以干燥重量下的有效成分量考慮，通常每50kg體重的成人約為50mg-2g/天，優(yōu)選100-500mg/天。
上述(1)-(7)中記載的本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物中，本發(fā)明的有效成分以外的成分例如有糊精、環(huán)糊精、クラスタ一糊精、難消化性糊精、蒼耳烷、瓜耳膠、瓜耳膠分解物、藻酸等多糖類，大豆蛋白等植物性蛋白質(zhì)和大豆肽等植物性蛋白質(zhì)的分解物，卵黃、卵清、全卵等動物性蛋白質(zhì)以及卵黃、卵清、全卵肽等動物性蛋白質(zhì)的分解物，乳糖等公知的食品原料成分。本發(fā)明的組合物可以將這些公知的成分和本發(fā)明的有效成分適當(dāng)混合來制備。以上的成分可以是天然產(chǎn)物也可以是合成產(chǎn)物。
(8)本發(fā)明的組合物的應(yīng)用舉例本發(fā)明的一個方案提供含有本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物而成的飲料食品。用于抑制血栓形成的組合物是指上述任何的本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明中的飲料食品只要是溶液、懸浮物、粉末、固體成型物等可口服攝取的形式即可，沒有特別限定。該飲料食品中，本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物的含量通常優(yōu)選0.01-15重量％，更優(yōu)選0.05-10重量％。所述飲料食品除混合本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物作為原料的一部分之外，都可按照公知的飲料食品的配比組成和制造方法進行制造。
更具體地說，本發(fā)明的飲料食品的例子有快餐面、加熱蒸煮食品、罐頭、微波爐食品、快餐湯·醬湯類、凍干食品等快餐食品類，清涼飲料、果汁飲料、蔬菜飲料、豆乳飲料、咖啡飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、營養(yǎng)飲料、酒精飲料等飲料類，面包、通心面、面條、蛋糕粉、炸粉、面包粉等小麥粉制品，糖果、卡拉密爾糖(カラミル)、香口膠、巧克力、小甜餅、餅干、蛋糕、夾心蛋糕、小吃點心、脆點心、日式點心、甜點心等點心類，調(diào)味汁、番茄加工調(diào)味品、風(fēng)味調(diào)味料、烹調(diào)調(diào)料、調(diào)料汁類、沙拉調(diào)料類、湯汁、咖喱·燉菜料中的菜等的調(diào)味品，加工油脂、黃油、人造黃油、沙拉醬等油脂類，乳飲料、酸牛奶類、乳酸菌飲料、冰激凌類、奶油類等乳制品，冷凍食品、魚肉火腿·火腿腸、水產(chǎn)攪肉等水產(chǎn)加工品，家畜肉火腿·火腿腸等畜產(chǎn)加工品，農(nóng)產(chǎn)品罐頭、果醬·橙子醬類、腌漬品、煮豆、谷類食品等農(nóng)產(chǎn)加工品，營養(yǎng)食品、片劑、膠囊等。
可以對本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物或含有該組合物的飲料食品強化各種營養(yǎng)成分。
可強化的營養(yǎng)成分沒有特別限定，可以使用維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素C、維生素D、維生素E、煙酸(尼克酸)、泛酸、葉酸等維生素類，賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸等必需氨基酸類，鈣、鎂、鐵、鋅、銅等礦物質(zhì)類，以及例如α-亞油酸、EPA、DHA、月見草油、二十八碳醇、酪蛋白磷酸肽(CPP)、酪蛋白鈣肽(CCP)、水溶性食物纖維、不溶性食物纖維、低聚糖等對人體健康有益的物質(zhì)類，其它認(rèn)可為食品、食品添加物的有用物質(zhì)的一種或兩種或以上。
本發(fā)明的一個方案，提供含有本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物而成的準(zhǔn)藥和藥物。用于抑制血栓形成的組合物是指上述任何的本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明的準(zhǔn)藥和藥物可以將適合口服或非口服給藥的賦型劑、其它添加劑和本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物混合，按照常規(guī)方法制備例如口服制劑或注射劑。優(yōu)選的口服制劑例如是口服固體制劑或口服液體制劑，最優(yōu)選的是容易服用且保存、便于攜帶的口服固體制劑。該準(zhǔn)藥和藥物中的本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物的含量通常優(yōu)選0.1-300重量％，更優(yōu)選1-100重量％。
口服固體制劑有片劑、散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、緩釋劑等。所述固體制劑中可以混合適當(dāng)?shù)目伤幱玫妮d體、賦型劑(例如淀粉、乳糖、白糖、碳酸鈣、磷酸鈣等)、粘合劑(例如淀粉、阿拉伯樹膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、結(jié)晶纖維素、藻酸、明膠、聚乙烯吡硌烷酮等)、潤滑劑(例如硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣等)、崩解劑(例如羧甲基纖維素、滑石粉等)等與本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物混合，按照常規(guī)方法制成片劑、散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、緩釋劑等形式。
口服液體制劑包含制藥學(xué)可用的乳濁劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、酏劑等，也包含常規(guī)使用的惰性稀釋劑例如純凈水、乙醇。所述制劑除惰性稀釋劑之外，也可以含有濕潤劑、混懸劑等助劑、甜味劑、風(fēng)味劑、芳香劑、防腐劑。
非口服給藥用的注射劑包含無菌的水性或非水性溶液劑、混懸劑、乳濁劑。水性的溶液劑、混懸劑的稀釋劑例如包含注射用蒸餾水和生理鹽水。非水性的溶液劑、混懸劑的稀釋劑例如有丙二醇、聚乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類、聚山梨酯80等。注射劑還可以含有防腐劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑(例如乳糖)、助溶劑(例如谷氨酸、天冬氨酸)等助劑。它們例如過細(xì)菌捕獲過濾器進行過濾、混合滅菌劑或通過照射進行無菌化處理。它們還可以制成無菌的固體組合物，在使用前溶解于無菌水或無菌的注射用溶劑中使用。
本發(fā)明的又一方案提供含有本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物而成的飼料。用于抑制血栓形成的組合物是指上述任何的本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明的飼料除混合本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物作為原料的一部分之外，其余均按公知的飼料的配比組成和制造方法來制造。該飼料中，本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物的含量通常優(yōu)選0.01-15重量％，更優(yōu)選0.05-10重量％。
可采用該飼料的生物沒有特別限定，例如有養(yǎng)殖動物、寵物動物等，養(yǎng)殖動物有馬、牛、豬、綿羊、山羊、駱駝、駝羊等家畜，小鼠、大鼠、豚鼠、兔等實驗動物，雞、鴨、火雞、駝鳥等家禽，寵物動物有狗、貓等。
本發(fā)明使用植株、其果實、葉或種子作為有效成分，它們可直接使用，除此之外，可以以干燥物、破碎物、粉碎物等按照公知的方法實施物理處理得到的各種形態(tài)使用。因此，本發(fā)明中，上述實施了物理處理的形態(tài)也作為植株、其果實、葉、種子處理。另外，若以實施了物理處理的植株、其果實、葉或種子單獨或者2種或以上與例如糊精、環(huán)糊精、クラスタ一糊精、難消化性糊精、蒼耳烷、瓜耳膠、瓜耳膠分解物、藻酸等多糖類，大豆蛋白等植物性蛋白質(zhì)和大豆肽等植物性蛋白質(zhì)的分解物，卵黃、卵清、全卵等動物性蛋白質(zhì)以及卵黃、卵清、全卵肽等動物性蛋白質(zhì)的分解物，乳糖等賦型劑，淀粉、纖維素、阿拉伯樹膠、葡萄糖等粘合劑，明膠、瓊脂、纖維素等崩解劑，硬脂酸鎂、蔗糖酯類、甘油脂肪酸酯類等潤滑劑混合并制成固體所得的物質(zhì)也包含在本發(fā)明的組合物、飲料品、準(zhǔn)藥、藥物、飼料等中。
作為上述的本發(fā)明的組合物的應(yīng)用例的飲料食品等含有本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物，因此通過本發(fā)明的各組合物所發(fā)揮的作用效果，可發(fā)揮抑制血栓形成的效果。
實施例以下通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，以下的實施例并不限定本發(fā)明的范圍。按照作為有效成分使用的植物成分的來源植物給出實施例。
實施例A-1抗血栓組合物的制備1將印度醋栗干燥果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，得到本發(fā)明的抗血栓組合物A。
所得提取液的固體成分為70.8g，收率為88.5％。
試驗例A-1抗血栓效果的確認(rèn)利用從人血液中分離的貧血小板血漿(PPP)，用血凝分析儀(シスメツクス公司制造)測定本發(fā)明的抗血栓組合物的抗凝血活性。
向反應(yīng)管中加入10μl試樣、25μl APTT試劑(國際試藥公司制造)、25μl 10％腦磷脂，在37℃反應(yīng)3分鐘，然后加入50μl PPP，反應(yīng)2分鐘。最后，加入50μl 25mmol的氯化鈣，使其凝固，測定血漿凝固所需的時間(秒)，以此作為APTT。
此時，向?qū)φ罩屑尤胨猛瑯拥姆椒y定APTT。通過以下算式，由測定的試樣的APTT計算相相對于對照的抗凝血活性(％)。
抗凝血活性(％)＝((試樣的APTT-對照的APTT)/對照的APTT)×100為確認(rèn)本發(fā)明的抗血栓組合物A的濃度與抗凝血活性的關(guān)系，使用0(對照)、1、3、5mg/mL的本發(fā)明的抗血栓組合物，作為固體成分濃度，測定其活性。結(jié)果如下表1所示。


上表1的結(jié)果表明本發(fā)明的抗血栓組合物顯示高的抗凝血活性。還顯示通過增加提取物的濃度，抗凝血活性也成比例增加。
實施例A-2抗血栓組合物的制備2將印度醋栗干燥果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，減壓濃縮，制成200mL。向該濃縮液中加入乙醇，制成1L(乙醇終濃度為80％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離沉淀物，減壓干燥后再溶解于1L水，過濾除去不溶性成分，然后將濾液冷凍干燥，得到30.8g本發(fā)明的抗血栓組合物B(收率38.5％)。
試驗例A-2抗血栓效果的確認(rèn)對于實施例A-2中得到的抗血栓組合物B，以5mg/mL的濃度，與試驗例A-1同樣地測定APTT。結(jié)果表明APTT為85.1秒，抗凝血活性為89.1％，與只用水提取的抗血栓組合物A相比，顯示高的抗凝血活性。
實施例A-2中，對于乙醇可溶性成分同樣測定APTT，結(jié)果，APTT為48.0秒，抗凝血活性為6.7％，可知抗血栓活性組分含在乙醇沉淀的組分中。
實施例A’-1抑制血纖維蛋白形成的組合物的制備1將印度醋栗干燥果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心分離(3000rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，然后冷凍干燥，得到35.0g本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物A。收率為43.8％。
試驗例A’-1抑制血纖維蛋白形成的效果的確認(rèn)1關(guān)于本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物的抑制血纖維蛋白形成的效果，利用血纖維蛋白原試劑和凝血酶試劑，研究血纖維蛋白形成的比例。
在試管中，向3ml 0.7％血纖維蛋白原試劑中加入300μl下述物質(zhì)用生理鹽液將實施例A’-1得到的抑制血纖維蛋白形成的組合物A稀釋至一定濃度而得到的物質(zhì)。在37℃均化3分鐘，然后添加300μl凝血酶試劑(10U/mL)，血纖維蛋白形成凝固，測定其凝固重量(g)，通過以下計算式求出血纖維蛋白形成抑制率。
血纖維蛋白形成抑制率(％)＝((全體溶液重量-凝固重量)/全體溶液重量)×100此時，向?qū)φ罩屑尤肷睇}水，代替抑制血纖維蛋白形成的組合物，用相同的方法測定血纖維蛋白形成抑制率。
為了確認(rèn)本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物的濃度與血纖維蛋白形成抑制率的關(guān)系，使用0(對照)、10、25、40mg/mL的本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物作為固體成分濃度，測定其抑制率。結(jié)果如下表2所示。


上表2的結(jié)果表明本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物對于血栓形成的最終過程中血纖維蛋白的形成顯示了高的抑制效果。還表明通過增加提取物的濃度，血纖維蛋白形成抑制率也成比例增加。
實施例A’-2抑制血纖維蛋白形成的組合物的制備2將印度醋栗干燥果實粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入2L蒸餾水，再加入0.1g果膠酶和0.1g鞣酸酶，在55℃提取2小時。然后在90℃使酶失活30分鐘。然后離心分離(3000rpm、10分鐘)，過濾其上清，濾液進行噴霧干燥，得到45g本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物B。
實施例A’-3抑制血纖維蛋白形成的組合物的制備3將印度醋栗果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心分離(3000rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，減壓濃縮，制成200mL。向該濃縮液中加入乙醇，制成250mL(乙醇終濃度為20％)，然后在4℃靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(3000rpm、10分鐘)除去上清，將沉淀物冷凍干燥，得到8.5g本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物C。
向乙醇終濃度為20％的上清中加入乙醇，使乙醇的終濃度為40％，進行沉淀，同樣地得到4.6g本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物D，再重復(fù)同樣的操作，使乙醇的終濃度為60％，再制成80％，得到沉淀物，得到1.3g本發(fā)明的抑制血纖維蛋白形成的組合物E、2.4g F。
試驗例A’-2抑制血纖維蛋白形成的效果的確認(rèn)2對實施例A’-2得到的抑制血纖維蛋白形成的組合物B和實施例A’-3得到的抑制血纖維蛋白形成的組合物C-F分別用生理鹽水稀釋，以10mg/mL的試樣濃度，與試驗例A’-1同樣地確認(rèn)抑制血纖維蛋白形成的效果。。
對于實施例A’-3中60-80％乙醇下的上清成分也同樣地制成試樣，確認(rèn)抑制血纖維蛋白形成的效果。其結(jié)果如表3所示。


由上述表3的結(jié)果可知抑制血纖維蛋白形成的組分中，乙醇沉淀組分中的60-80％乙醇沉淀組分的活性最高。
實施例A”-1抗血小板凝集組合物的制備1將印度醋栗干燥果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，然后冷凍干燥，得到35g本發(fā)明的抗血小板凝集組合物A。
試驗例A”-1抗血小板活性的確認(rèn)本發(fā)明的抗血小板凝集組合物的抗血小板活性如下求出。使用血小板凝集測定儀(アイエスケ一公司制造)，向400μl健康人的血小板懸浮液(富血小板血漿)中添加80μl試樣，然后加入20μl ADP(1mg/mL溶液)作為引發(fā)凝集的物質(zhì)，測定5分鐘后血小板凝集率。
另外，添加水作為對照(試樣濃度0mg/mL)，用相同方法測定血小板凝集率。通過以下算式，由測定的血小板凝集率計算相對于對照的抗血小板活性(％)。
抗血小板活性(％)＝((對照的血小板凝集率-添加試樣時的血小板凝集率)/對照的血小板凝集率)×100表4表示以試樣濃度2.5、5.0、7.5mg/mL測定的結(jié)果。


上表4的結(jié)果表明本發(fā)明的抗血小板凝集組合物顯示高的抗血小板活性。還表明通過增加提取物的濃度，抗血小板活性也成比例增加。
實施例A”-2抗血小板凝集組合物的制備2將印度醋栗果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，減壓濃縮，制成200mL。向該濃縮液中加入乙醇，制成250mL(乙醇終濃度為20％)，然后在4℃靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離除去沉淀物，將上清減壓干燥，再溶解于1L水，過濾除去不溶性成分，然后將濾液冷凍干燥，得到29g本發(fā)明的抗血小板凝集組合物B。
同樣，使乙醇的終濃度為40％、60％、80％，分別得到27g、26g、25g本發(fā)明的抗血小板凝集組合物C、D、E。
試驗例A”-2抗血小板活性的確認(rèn)對實施例A”-2得到的抗血小板凝集組合物B-E，以5.0mg/mL的試樣濃度，與試驗例A”-1同樣地測定抗血小板活性。
對于實施例A”-2中80％乙醇的沉淀組分也同樣地制成試樣，測定抗血小板活性。其結(jié)果如表5所示。


由上述表5的結(jié)果可知抗血小板活性組分包含在乙醇可溶性組分中，通過20％乙醇除去沉淀的組分的活性最高。
實施例A-1抑制血小板凝集的組合物的制備1將印度醋栗果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心分離(3000rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，冷凍干燥，得到35.0g本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物A。收率為43.8％。
試驗例A-1抗血小板凝集活性的確認(rèn)1
本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集測定儀(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl試樣，然后加入22μl終濃度調(diào)節(jié)為10μM的硫酸瑞斯托菌素(アメリカンバイオケミカル100mg/管)作為引發(fā)凝集的物質(zhì)，測定5分鐘后血小板凝集率。
另外，添加水作為對照(試樣濃度0mg/mL)，用相同方法測定血小板凝集率。通過以下算式，由測定的血小板凝集率計算相對于對照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((對照的血小板凝集率-添加試樣時的血小板凝集率)/對照的血小板凝集率)×100試樣是將抑制血小板凝集的組合物A用蒸餾水稀釋，制成1.25、2.5、5.0mg/mL，抑制血小板凝集的組合物A的濃度和測定各濃度下的抗血小板凝集活性(％)的結(jié)果如表6所示。


上述表6的結(jié)果表明血小板凝集中，本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物抑制膠原和GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，顯示抗血小板凝集效果。還表明通過增加抑制血小板凝集的組合物的濃度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
實施例A-2抑制血小板凝集的組合物的制備2將印度醋栗果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心分離(3000rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，減壓濃縮，制成200mL。向該濃縮液中加入乙醇，制成1L(乙醇終濃度為80％)，然后在4℃靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離除去沉淀物，減壓濃縮上清，再溶解于1L水，過濾除去不溶性成分，然后將濾液冷凍干燥，得到12.5g本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物B(收率15.6％)。
同樣地，使乙醇的終濃度為20％、40％、60％，得到本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物C 13.6g(收率17.0％)、D 20.8g(收率26.0％)、E 21.2g(收率26.5％)。
實施例A-3抑制血小板凝集的組合物的制備3將印度醋栗果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心分離(3000rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，冷凍干燥，得到約37.0g干燥物。向35g該干燥物中加入1L乙醇，在4℃靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離除去沉淀物，減壓濃縮上清，再溶解于1L水，過濾除去不溶性成分，然后將濾液冷凍干燥，得到3.5g本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物F。
實施例A-4抑制血小板凝集的組合物的制備3將印度醋栗果實粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后離心，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，減壓濃縮，制成200mL。向該濃縮液中加入乙酸乙酯，制成500mL(乙酸乙酯終濃度為60％)，充分?jǐn)嚢瑁缓笤?℃靜置24小時，分離乙酸乙酯層，減壓濃縮，再將濾液冷凍干燥，得到12.5g本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物G。
實施例A-5抑制血小板凝集的組合物的制備4將印度醋栗干燥果實粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入2L蒸餾水，再加入0.1g果膠酶和0.1g鞣酸酶，在55℃提取2小時。然后在90℃使酶失活30分鐘。然后離心分離(3000rpm、10分鐘)，過濾其上清，濾液進行噴霧干燥，得到45g本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物H。
試驗例A-2抗血小板凝集活性的確認(rèn)2對實施例A-2得到的抑制血小板凝集的組合物B、C、D、E，實施例A-3得到的抑制血小板凝集的組合物F、實施例A-4得到的抑制血小板凝集的組合物G和實施例A-5得到的抑制血小板凝集的組合物H，以5.0mg/mL的濃度、按照與試驗例A-1同樣的方法測定血小板凝集率，計算抗血小板凝集活性。其結(jié)果如表7所示。


如表7所示，任何抑制血小板凝集的組合物都顯示高的抗血小板凝集活性。
實施例A-6含抑制血小板凝集的組合物的食品(糖片)的制備將5g實施例A-1得到的抑制血小板凝集的組合物A、30g乳糖、12g含DHA的粉末油脂(サンコ一トDY-5；太陽化學(xué)株式會社制造)、4g蔗糖脂肪酸酯、4g酸牛奶香精混合，用旋轉(zhuǎn)式壓片機將該混合物加壓成型，得到每片為300mg的含本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物的飲料食品(糖片)。
實施例A-7含抑制血小板凝集的組合物的飲料的制備將5g實施例A-2得到的抑制血小板凝集的組合物B、2.1g 1/5濃縮葡萄柚透明果汁、30g赤蘚醇、2.5g檸檬酸結(jié)晶、0.5g檸檬酸三鈉、0.5g L-抗壞血酸、1.93g乳酸鈣、0.15g CCP、1.0葡萄柚香精與水混合并溶解，使總量為1000mL，將其填充到100mL的瓶中，用蓋子密封，然后在90℃加熱滅菌30分鐘，得到含有本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物的飲料食品。
實施例A-8含抑制血小板凝集的組合物的飲料(蔬菜果汁混合飲料)的制備將0.2g實施例A-2得到的抑制血小板凝集的組合物C、3g瓜耳膠分解物(サンフアイバ一R；太陽化學(xué)株式會社制造)添加到100mL市場銷售的蔬菜果汁混合飲料中并混合溶解，得到含有本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物的飲料食品(蔬菜果汁混合飲料)。
實施例A-9含抑制血小板凝集的組合物的小甜餅的制備將4g實施例A-2得到的抑制血小板凝集的組合物D、200g市場銷售的蛋糕粉裝入容器中，然后加入35g黃油，用木勺子攪拌混合。向其中加入25g打散的雞蛋，充分?jǐn)嚢?，制成滑溜的生坯料。將生坯料取出放置在篩灑有小麥粉的臺子上面，再篩灑小麥粉，用搟面杖搟成5mm厚度，用圓形模子取出面團，將其在170℃的烤箱中烘烤10分鐘，得到每個約5g的含本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物的小甜餅。
實施例A-10含抑制血小板凝集的組合物的酸牛奶的制備將1g實施例A-5得到的抑制血小板凝集的組合物H、95g市場銷售的脫脂乳(明治乳業(yè)公司制造。蛋白質(zhì)含量34％)、以及35g市場銷售的無鹽黃油(雪印如業(yè)公司制造)溶解在0.8L溫水中，均化，將總量調(diào)節(jié)為1L。接著在90℃加熱滅菌15分鐘，冷卻，接種3g市場銷售的乳酸菌引子(ハンゼン制造)(2g唾液鏈球菌嗜熱亞種(ストレプトコツカス·サ一モフイラス，Streptococcus thermophilus)和1g保加利亞乳桿菌(ラクトバシラス·ブルガリクス，Lactobacillus bulgaricus)，均勻混合，分注到100mL容器中，填充，密封，在37℃發(fā)酵20小時，然后冷卻，得到含本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物的酸牛奶。
實施例A-11含抑制血小板凝集的組合物的口服流食的制備將50g酪素鈉(DMV公司制造)、42.5g卵清酶分解物(太陽化學(xué)公司制造)、100g糊精(松谷化學(xué)公司制造)溶解于1L水中，在罐內(nèi)制備水相。另行將45g MCT(花王公司制造)、17.5g棕櫚油(不二制油公司制造)、35g紅花油(太陽油脂公司制造)、0.7g卵磷脂(太陽化學(xué)公司制造)、1g消泡劑(太陽化學(xué)公司制造)混合溶解，制成油相。向罐內(nèi)的水相中添加油相，攪拌混合，然后加溫至70℃，再通過均化器、以14.7MPa的壓力均化。接著在90℃滅菌10分鐘，然后濃縮，噴霧干燥，制成約260g中間制品粉末。向200g該中間制品粉末中添加4g實施例A-2得到的抑制血小板凝集的組合物C、156g糊精(松谷化學(xué)公司制造)、18g瓜耳膠分解物(サンフアイバ一R；太陽化學(xué)株式會社制造)、少量的維生素和礦物質(zhì)以及粉末香精，均勻混合，得到約380g含抑制血小板凝集的組合物的口服流食。
實施例A-12含抑制血小板凝集的組合物的片劑的制備將10g實施例A-3得到的抑制血小板凝集的組合物F、5g結(jié)晶纖維素、13.8g玉米淀粉、32.5g乳糖、3.3g羥丙基纖維素混合，制成顆粒。向該顆粒物質(zhì)中加入1.0g硬脂酸鎂，均勻混合，將該混合物用旋轉(zhuǎn)式壓片機加壓成型，得到每片為130mg的含本發(fā)明的抑制血小板凝集的組合物的片劑。
將實施例A-6至12中使用的抑制血小板凝集的組合物換成以下的實施例所示的本發(fā)明的抗血栓組合物、抑制血纖維蛋白形成的組合物、抗血小板凝集組合物、預(yù)防血栓的組合物、用于預(yù)防血栓的組合物、預(yù)防外源性凝血的組合物、抗血液凝固組合物、預(yù)防血小板凝集的組合物、用于預(yù)防血小板凝集的組合物、用于抗血栓的組合物、用于抗血小板凝集的組合物、抑制血小板凝集性血栓的組合物、用于抑制血小板凝集性血栓的組合物、抗血栓劑或血栓形成抑制劑，制備同樣的組合物。

實施例B-1用于抗血栓的組合物的制備1向1kg綠茶葉中加入15kg熱水，在90℃提取30分鐘，為除去茶葉渣而進行過濾，向12kg該濾液中加入12kg乙酸乙酯，振蕩、靜置、分配。取該水組分，減壓下(0.067mpa)脫溶劑，然后噴霧干燥，得到110g本發(fā)明的用于抗血栓的組合物A。
其中多酚含量為9.2％，咖啡因含量為0.7％。
試驗例B-1抗血栓效果的確認(rèn)利用從人血液中分離的貧血小板血漿(PPP)，用血凝分析儀(シスメツクス公司制造)測定本發(fā)明的抗血栓組合物的抗凝血活性。
向反應(yīng)管中加入10μl試樣、25μl APTT試劑(國際試藥公司制造)、25μl 10％腦磷脂，在37℃反應(yīng)3分鐘，然后加入50μl PPP，反應(yīng)2分鐘。最后，加入50μl 25mmol的氯化鈣，使其凝固，測定血漿凝固所需的時間(秒)，以此作為APTT。
此時，向?qū)φ罩屑尤胨猛瑯拥姆椒y定APTT。通過以下算式，由測定的試樣的APTT計算相對于對照的抗凝血活性(％)。
抗凝血活性(％)＝((試樣的APTT-對照的APTT)/對照的APTT)×100為確認(rèn)本發(fā)明的用于抗血栓的組合物的濃度與抗凝血活性的關(guān)系，使用0(對照)、1、3、5mg/mL本發(fā)明的用于抗血栓的組合物作為固體成分的濃度，測定其活性。結(jié)果如下表8所示。


上表8的結(jié)果表明本發(fā)明的用于抗血栓的組合物顯示高的抗凝血活性。還表明通過增加提取物的濃度，抗凝血活性也成比例增加。
實施例B-2用于抗血栓的組合物的制備2向100g實施例B-1得到的用于抗血栓的組合物A中加入2L水進行溶解，加入乙醇，制成2.22L(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離沉淀物，減壓干燥后再溶解于2L水，過濾除去不溶性成分，然后將濾液冷凍干燥，得到25g(收率25％)本發(fā)明的用于抗血栓的組合物B。
同樣地，使乙醇的終濃度為40％、60％、80％，得到本發(fā)明的用于抗血栓的組合物C、D、E。
這里所得用于抗血栓的組合物B-E的多酚含量分別為B1.1％、C1.5％、D1.8％、E2.3％，咖啡因含量分別為B0.1％、C0.3％、D0.4％、E0.5％。
試驗例B-2抗血栓效果的確認(rèn)對于實施例B-2中得到的用于抗血栓的組合物B-E，以5mg/mL的濃度、與試驗例B-1同樣地測定APTT。結(jié)果如表9所示。


上表9的結(jié)果可知乙醇濃度為40％時，抗血栓效果最高。
實施例B’-1用于抗血小板凝集的組合物的制備1向1kg綠茶葉中加入15kg熱水，在90℃提取30分鐘，為除去茶葉渣而進行過濾，向12kg該濾液中加入12kg乙酸乙酯，振蕩、靜置、分配。取該水組分，減壓下(0.067mpa)脫溶劑，然后噴霧干燥，得到110g本發(fā)明的用于血小板凝集的組合物A。
其中多酚含量為9.2％，咖啡因含量為0.7％。
試驗例B’-1抗血小板活性的確認(rèn)本發(fā)明的用于抗血小板凝集的組合物的抗血小板活性如下求出。使用血小板凝集測定儀(アイエスケ一公司制造)，向400μl健康人的血小板懸浮液(富血小板血漿)中添加80μl試樣，然后加入20μl ADP(1mg/mL溶液)作為引發(fā)凝集的物質(zhì)，測定5分鐘后血小板凝集率。
另外，添加水作為對照(試樣濃度0mg/mL)，用相同方法測定血小板凝集率。通過以下算式，由測定的血小板凝集率計算相對于對照的抗血小板活性(％)。
抗血小板活性(％)＝((對照的血小板凝集率-添加試樣時的血小板凝集率)/對照的血小板凝集率)×100表10表示以試樣濃度2.5、5.0、7.5mg/mL測定的結(jié)果。


上表10的結(jié)果表明本發(fā)明的抗血小板凝集組合物顯示高的抗血小板活性。還表明通過增加提取物的濃度，抗血小板活性也成比例增加。
實施例B’-2用于抗血小板凝集的組合物的制備2向10g實施例B’-1中得到的用于抗血小板凝集的組合物A中加入200mL水進行溶解，加入乙醇，制成1L(乙醇終濃度為80％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。
通過離心分離沉淀物和上清，減壓干燥沉淀物，然后再溶解于200mL水中，過濾除去不溶性成分，然后將濾液冷凍干燥，得到2.7g本發(fā)明的80％乙醇不溶性組分——用于抗血小板凝集的組合物B。
同樣地對上清進行處理，得到7.3g 80％乙醇可溶性組分——用于抗血小板凝集的組合物C。
這里所得用于抗血小板凝集的組合物B和C的多酚含量分別為B3.8％、C9.9％，咖啡因含量分別為B0.5％、C0.8％。
試驗例B’-2抗血小板活性的確認(rèn)對于實施例B’-2中得到的用于抗血小板凝集的組合物B和C，以5.0mg/mL的濃度、與試驗例B’-1同樣地測定抗血小板活性。結(jié)果如表11所示。


上表11的結(jié)果可知80％乙醇的沉淀組分的抗血小板活性高。
實施例C-1抗血液凝固組合物的制備1將木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到29.8g(收率19.9％)本發(fā)明的抗血液凝固組合物A。
實施例C-2抗血液凝固組合物的制備2將木槿的干燥的葉粉碎成20目或以下，向100g該粉末中加入2L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到13.4g(收率13.4％)本發(fā)明的抗血液凝固組合物B。
試驗例C-1類肝素活性向反應(yīng)管中加入10μl調(diào)節(jié)至0.05、0.1、0.2和0.4U/mL的肝素和40μl人血液中分離的貧血小板血漿(PPP)，在37℃反應(yīng)1分鐘。然后加入50μl APTT試劑(國際試藥公司制造)，再在37℃反應(yīng)2分鐘，之后，加入50μl 25mM的氯化鈣，用血凝分析儀(シスメツクス公司制造)測定血漿凝固所需的時間(APTT；秒)，為評價本發(fā)明的抗血液凝固組合物的抗凝血效果，由該肝素的濃度和肝素的APTT的關(guān)系求出類肝素活性值(U/mg)的計算式。結(jié)果如下表12所示。


由表12的結(jié)果可知求出類肝素活性值的關(guān)系式如下。
類肝素活性值(U/mg)＝(0.2301×Log(試樣的APTT)-0.8053)/試樣濃度(mg/mL)試驗例C-2抗凝血效果的確認(rèn)1向反應(yīng)管中加入10μl固體成分濃度分別調(diào)節(jié)至0、0.1、0.3、0.5、1.0mg/mL的實施例C-1得到的抗血液凝固組合物A和實施例C-2得到的抗血液凝固組合物B的試樣以及40μl PPP，在37℃反應(yīng)1分鐘。然后加入50μl APTT試劑(國際試藥公司制造)，再在37℃反應(yīng)2分鐘，之后，加入50μl 25mM的氯化鈣，與試驗例C-1同樣地測定APTT，由試驗例C-1中求出的類肝素活性值的關(guān)系式求出類肝素活性值。結(jié)果如下表13所示。


表13的結(jié)果表明本發(fā)明的抗血液凝固組合物A和B隨著抗血液凝固組合物濃度的增加，APTT也增加，換算成可用作抗血液凝固劑的肝素而得到的類肝素活性值分別顯示平均0.22U/mg和0.10U/mg，特別是果實部分顯示高的抗凝血效果。
實施例C-3抗血液凝固組合物的制備3將木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，制成400mL。該濃縮液中加入乙醇，制成500mL(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(8500rpm、10分鐘)沉淀物，減壓濃縮上清，然后加入1L蒸餾水再溶解。過濾除去不溶性成分，減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到12.4g(收率8.3％)本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物C。向同樣得到的濃縮液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60％、80％時的不溶性成分沉淀，進行同樣的操作，分別得到本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物D 9.8g(收率6.5％)、E 6.7g(收率4.5％)。
實施例C-3抗凝血效果的確認(rèn)2
對于實施例C-3中得到的抗血液凝固組合物C、D和E，以0.5mg/mL的濃度、與試驗例C-1同樣地測定APTT。結(jié)果顯示APTT分別為55.6秒、63.7秒和65.1秒，類肝素活性值為0.24U/mg、0.30U/mg和0.31U/mg和通過用乙醇分離，顯示更高的抗凝血效果。
實施例C-3中，同樣地對乙醇終濃度為20％下的沉淀成分測定APTT，結(jié)果APTT為38.1秒，類肝素活性值為0.06U/mg，可知抗血液凝固組分包含在乙醇可溶性組分中。
實施例C’-1預(yù)防血小板凝集的組合物的制備1將木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到29.8g本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物A(收率19.9％)。
實施例C’-2預(yù)防血小板凝集的組合物的制備2將木槿的干燥的葉粉碎成20目或以下，向100g該粉末中加入2L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到13.4g本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物B(收率13.4％)。
試驗例C’-1抗血小板凝集活性的確認(rèn)1本發(fā)明的抗血小板凝集組合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集測定儀(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl試樣，然后加入22μl終濃度調(diào)節(jié)為10μM的ADP(シグマ公司制造100mg/管)作為引發(fā)凝集的物質(zhì)，測定5分鐘后血小板凝集率。
另外，添加水作為對照(試樣濃度0mg/mL)，用相同方法測定血小板凝集率。通過以下算式，由測定的血小板凝集率計算相對于對照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((對照的血小板凝集率-添加試樣時的血小板凝集率)/對照的血小板凝集率)×100試樣是將預(yù)防血小板凝集的組合物用蒸餾水稀釋，制成1.25、2.5、5.0mg/mL進行測定，結(jié)果如表14所示。


上表14的結(jié)果表明在血小板凝集中，本發(fā)明的抗血小板凝集組合物抑制通過與ADP相關(guān)的通過GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，以此顯示抗血小板凝集效果。還表明增加抗血小板凝集組合物的濃度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
實施例C’-3預(yù)防血小板凝集的組合物的制備3將木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，制成400mL。該濃縮液中加入乙醇，制成500mL(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(8500rpm、10分鐘)沉淀物，減壓濃縮上清，然后加入1L蒸餾水再溶解。過濾除去不溶性成分，減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到12.4g本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物C(收率8.3％)。向同樣得到的濃縮液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60％、80％時的不溶性成分沉淀，進行同樣的操作，分別得到本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物D 9.8g(收率6.5％)、E 6.7g(收率4.5％)。
試驗例C’-2抗血小板凝集活性的確認(rèn)2
對于實施例C’-3中得到的預(yù)防血小板凝集的組合物C、D和E，以5.0mg/mL的濃度、按照與試驗例C’-1同樣的方法血小板凝集率，計算抗血小板凝集活性。結(jié)果顯示抗血小板凝集活性(％)分別為79.2、81.4和83.6，以及通過用乙醇分離，顯示更高的抗血小板凝集效果。
實施例C’-3中，同樣地對乙醇終濃度為20％下的沉淀成分測定血小板凝集率，計算抗血小板凝集活性，結(jié)果抗血小板凝集活性(％)為11.9秒，可知抗血小板凝集包含在乙醇可溶性組分中。
實施例C”-1用于預(yù)防血小板凝集的組合物的制備1將木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到29.8g本發(fā)明的用于預(yù)防血小板凝集的組合物A(收率19.9％)。
實施例C”-2用于預(yù)防血小板凝集的組合物的制備2將木槿的干燥的葉粉碎成20目或以下，向100g該粉末中加入2L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到13.4g本發(fā)明的用于預(yù)防血小板凝集的組合物B(收率13.4％)。
試驗例C”-1抗血小板凝集活性的確認(rèn)1本發(fā)明的抗血小板凝集組合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集測定儀(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl試樣，然后加入22μl終濃度調(diào)節(jié)為10μM的硫酸瑞斯托菌素(アメリカンバイオケミカル公司制造100mg/管)作為引發(fā)凝集的物質(zhì)，測定5分鐘后血小板凝集率。
另外，添加水作為對照(試樣濃度0mg/mL)，用相同方法測定血小板凝集率。通過以下算式，由測定的血小板凝集率計算相對于對照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((對照的血小板凝集率-添加試樣時的血小板凝集率)/對照的血小板凝集率)×100試樣是將用于預(yù)防血小板凝集的組合物用蒸餾水稀釋，制成1.25、2.5、5.0mg/mL進行測定，結(jié)果如表15所示。


上表15的結(jié)果表明在血小板凝集中，本發(fā)明的抗血小板凝集組合物抑制在膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，由此顯示抗血小板凝集效果。還表明增加抗血小板凝集組合物的濃度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
實施例C”-3用于預(yù)防血小板凝集的組合物的制備3將木槿的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，制成400mL。該濃縮液中加入乙醇，制成500mL(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(8500rpm、10分鐘)沉淀物，減壓濃縮上清，然后加入1L蒸餾水再溶解。過濾除去不溶性成分，減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到12.4g本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物C(收率8.3％)。向同樣得到的濃縮液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60％、80％時的不溶性成分沉淀，進行同樣的操作，分別得到本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物D 9.8g(收率6.5％)、E 6.7g(收率4.5％)。
試驗例C”-2抗血小板凝集活性的確認(rèn)2對于實施例C”-3中得到的用于預(yù)防血小板凝集的組合物C、D和E，以5.0mg/mL的濃度、按照與試驗例C”-1同樣的方法，測定血小板凝集率，計算抗血小板凝集活性。結(jié)果顯示抗血小板凝集活性(％)分別為91.2、93.4和94.6，以及通過用乙醇分離，顯示更高的抗血小板凝集效果。
實施例C”-3中，同樣地對乙醇終濃度為20％下的沉淀成分測定血小板凝集率，計算抗血小板凝集活性，結(jié)果抗血小板凝集活性(％)為13.7，可知抗血小板凝集包含在乙醇可溶性組分中。
實施例D-1抑制血小板凝集性血栓的組合物的制備1將蒼耳的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到26.4g本發(fā)明的抑制血小板凝集性血栓的組合物A(收率17.6％)。
實施例D-2抑制血小板凝集性血栓的組合物的制備2將木槿的干燥的種子粉碎成20目或以下，向100g該粉末中加入2L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到14.1g本發(fā)明的抑制血小板凝集性血栓的組合物B(收率14.1％)。
試驗例D-1抗血小板凝集活性的確認(rèn)1本發(fā)明的抗血小板凝集組合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集測定儀(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl試樣，然后加入22μl終濃度調(diào)節(jié)為10μM的ADP(シグマ公司制造100mg/管)作為引發(fā)凝集的物質(zhì)，測定5分鐘后血小板凝集率。
另外，添加水作為對照(試樣濃度0mg/mL)，用相同方法測定血小板凝集率。通過以下算式，由測定的血小板凝集率計算相對于對照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((對照的血小板凝集率-添加試樣時的血小板凝集率)/對照的血小板凝集率)×100試樣是將抑制血小板凝集性血栓的組合物用蒸餾水稀釋，制成1.25、2.5、5.0mg/mL進行測定，結(jié)果如表16所示。


上表16的結(jié)果表明在血小板凝集中，本發(fā)明的抑制血小板凝集性血栓的組合物抑制通過與ADP相關(guān)的GpIIb-IIIa、經(jīng)由血纖維蛋白原與其它血小板結(jié)合的階段，以此顯示抗血小板凝集效果。還表明增加抑制血小板凝集性血栓的組合物的濃度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
實施例D-3抑制血小板凝集性血栓的組合物的制備3將蒼耳的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，制成400mL。該濃縮液中加入乙醇，制成500mL(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(8500rpm、10分鐘)沉淀物，減壓濃縮上清，然后加入1L蒸餾水再溶解。過濾除去不溶性成分，減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到11.4g本發(fā)明的抑制血小板凝集性血栓的組合物C(收率7.6％)。向同樣得到的濃縮液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60％、80％時的不溶性成分沉淀，進行同樣的操作，分別得到本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物D 8.7g(收率5.8％)、E 5.9g(收率3.9％)。
試驗例D-2抗血小板凝集活性的確認(rèn)2對于實施例D-3中得到的抑制血小板凝集性血栓的組合物C、D和E，以5.0mg/mL的濃度、按照與試驗例D-1同樣的方法血小板凝集率，計算抗血小板凝集活性。結(jié)果顯示抗血小板凝集活性分別為72.2(％)、74.6(％)和76.4(％)，以及通過用乙醇分離，顯示更高的抗血小板凝集效果。
實施例D-3中，同樣地對乙醇終濃度為20％下的沉淀成分測定血小板凝集率，計算抗血小板凝集活性，結(jié)果，抗血小板凝集活性為10.4(％)，可知抗血小板凝集組分包含在乙醇可溶性組分中。
實施例D’-1用于抑制血小板凝集性血栓的組合物的制備1將蒼耳的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到26.4g(收率17.6％)本發(fā)明的用于抑制血小板凝集性血栓的組合物A。
實施例D’-2用于抑制血小板凝集性血栓的組合物的制備2將蒼耳的干燥的種子粉碎成20目或以下，向100g該粉末中加入2L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到14.1g本發(fā)明的用于抑制血小板凝集性血栓的組合物B(收率14.1％)。
試驗例D’-1抗血小板凝集活性的確認(rèn)1本發(fā)明的用于抑制血小板凝集性血栓的組合物的抗血小板凝集活性如下求出。使用全血血小板凝集測定儀(WBA-Neoアイエスケ一公司制造)，向200μl健康人的血液中添加5μl試樣，然后加入22μl終濃度調(diào)節(jié)為10μM的硫酸瑞斯托菌素(アメリカンバイオケミカル公司制造100mg/管)作為引發(fā)凝集的物質(zhì)，測定5分鐘后血小板凝集率。
另外，添加水作為對照(試樣濃度0mg/mL)，用相同方法測定血小板凝集率。通過以下算式，由測定的血小板凝集率計算相對于對照的抗血小板凝集活性(％)。
抗血小板凝集活性(％)＝((對照的血小板凝集率-添加試樣時的血小板凝集率)/對照的血小板凝集率)×100試樣是將用于抑制血小板凝集性血栓的組合物用蒸餾水稀釋，制成1.25、2.5、5.0mg/mL進行測定，結(jié)果如表17所示。


上表17的結(jié)果表明在血小板凝集中，本發(fā)明的用于抑制血小板凝集性血栓的組合物抑制在膠原與GpIb之間通過vWF形成交聯(lián)，由此顯示抗血小板凝集效果。還表明增加用于抑制血小板凝集性血栓的組合物的濃度，抗血小板凝集活性也成比例增加。
實施例D’-3用于抑制血小板凝集性血栓的組合物的制備3將蒼耳的干燥的花萼和花瓣粉碎成40目或以下，向150g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，制成400mL。該濃縮液中加入乙醇，制成500mL(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(8500rpm、10分鐘)沉淀物，減壓濃縮上清，然后加入1L蒸餾水再溶解。過濾除去不溶性成分，減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到11.4g本發(fā)明的抑制血小板凝集性血栓的組合物C(收率7.6％)。向同樣得到的濃縮液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60％、80％時的不溶性成分沉淀，進行同樣的操作，分別得到本發(fā)明的預(yù)防血小板凝集的組合物D 8.7g(收率5.8％)、E 5.9g(收率3.9％)。
試驗例D’-2抗血小板凝集活性的確認(rèn)2對于實施例D’-3中得到的用于抑制血小板凝集性血栓的組合物C、D和E，以5.0mg/mL的濃度、按照與試驗例D’-1同樣的方法，測定抗血小板凝集活性。結(jié)果顯示抗血小板凝集活性(％)分別為90.5、91.3和93.4，以及通過用乙醇分離，顯示更高的抗血小板凝集效果。
實施例D’-3中，同樣地對乙醇終濃度為20％下的沉淀成分測定血小板凝集率，計算抗血小板凝集活性，結(jié)果抗血小板凝集活性(％)為9.8，可知抗血小板凝集包含在乙醇可溶性組分中。
實施例E-1血栓形成抑制劑的制備1將匙羹藤干燥粉末粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后過濾，將提取物和殘余物分離。再向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，冷凍干燥，得到28g本發(fā)明的血栓形成抑制劑A。
試驗例E-1抑制血栓形成的效果的確認(rèn)本發(fā)明的血栓形成抑制劑的抗血小板活性如下求出。使用血小板凝集測定儀(アイエスケ一公司制造)，向400μl健康人的血小板懸浮液(富血小板血漿)中添加80μl試樣，然后加入20μl ADP(1mg/mL溶液)作為引發(fā)凝集的物質(zhì)，測定5分鐘后血小板凝集率。
另外，添加水作為對照(試樣濃度0mg/mL)，用相同方法測定血小板凝集率。通過以下算式，由測定的血小板凝集率計算相對于對照的抗血小板活性(％)。
抗血小板活性(％)＝((對照的血小板凝集率-添加試樣時的血小板凝集率)/對照的血小板凝集率)×100表18表示以試樣濃度2.5、5.0、7.5mg/mL測定的結(jié)果。


上表18的結(jié)果表明本發(fā)明的血栓形成抑制劑顯示高的抗血小板活性。還表明增加提取物的濃度，抗血小板活性也成比例增加。
實施例E-2血栓形成抑制劑的制備2將匙羹藤干燥粉末粉碎成40目或以下，向80g該粉末中加入2L蒸餾水，在55℃提取3小時。然后過濾，將提取物和殘余物分離。再向殘余物中加入2L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，減壓濃縮，制成200mL。向該濃縮液中加入乙醇，制成1L(乙醇終濃度為80％)，然后在4℃靜置24小時，使不溶性成分沉淀。
通過離心分離沉淀物和上清，減壓干燥沉淀物，再溶解于2L水，過濾除去不溶性成分，然后將濾液冷凍干燥，得到7g本發(fā)明的80％乙醇不溶性組分——血栓形成抑制劑B。
同樣地處理上清，得到21g 80％乙醇可溶性組分——血栓形成抑制劑C。
試驗例E-2抑制血栓形成的效果的確認(rèn)對于實施例E-2中得到的血栓形成抑制劑B和C，以5.0mg/mL的試樣濃度，與試驗例E-1同樣地測定抗血小板活性。結(jié)果如表19所示。


上表19的結(jié)果可知80％乙醇可溶性組分的抗血小板活性高。
實施例F-1預(yù)防外源性凝血的組合物的制備1將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到23.8g本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物A(收率23.8％)。
試驗例F-1抗外源性凝血活性的確認(rèn)1本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物的抗外源性凝血活性如下求出。使用血凝分析儀(シスメツクス公司制造)，向40μl健康人的血小板懸浮液(富血小板血漿)中添加10μl將標(biāo)準(zhǔn)肝素用蒸餾水稀釋調(diào)節(jié)至0、0.05、0.1、0.2和0.3U/mL的肝素試劑的試樣，在37℃反應(yīng)1分鐘。然后加入100μl PT試劑(國際試藥公司制造)，測定血漿凝固所需的時間，測定PT。由該肝素試劑的濃度和與PT的關(guān)系求出下述類肝素活性值(U/mg)的計算式。
類肝素活性值(U/mg)＝(2.0438×Log(試樣的PT)-4.8867)/試樣濃度(mg/mL)用蒸餾水稀釋調(diào)節(jié)試樣，使本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物A的濃度按照固體成分濃度表示為0.078、0.156、0.313、0.625、1.25mg/mL，用相同方法測定PT，帶入上述計算式，求出各試樣濃度相對于肝素(1U/mL)的類肝素活性值。
以0mg/mL肝素試劑濃度為對照，通過下式計算各試樣濃度下的PT比。
PT比＝添加試樣時的PT/對照(肝素試劑濃度0mg/mL)的PT這些結(jié)果如表20和表21所示。



表21的結(jié)果表明，本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物A換算成可用作抗血液凝固劑的肝素得到的類肝素活性值平均為1.77U/mg，較高，另外隨著預(yù)防外源性凝血的組合物濃度的增加，PT和抗外源性凝血活性也成比例增加。
實施例F-2預(yù)防外源性凝血的組合物的制備2將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向200g該粉末中加入6L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入6L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，減壓濃縮，制成400mL。向該濃縮液中加入乙醇，制成500mL(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(8500rpm、10分鐘)沉淀物，向該沉淀物中加入1L蒸餾水，再溶解，過濾除去不溶性成分。減壓濃縮該濾液，冷凍干燥，得到32.8g本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物B(收率16.4％)。向同樣得到的濃縮液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60％、80％時的不溶性成分沉淀，進行同樣的操作，分別得到本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物C 28.4g(收率14.2％)和D 21.2g(收率10.6％)。還向乙醇終濃度為60％的上清中加入乙醇，使乙醇的終濃度為80％，產(chǎn)生沉淀，進行同樣的操作，得到2.8g本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物E(收率1.4％)。
實施例F-3預(yù)防外源性凝血的組合物的制備3將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入3L 50％的乙醇水溶液，在室溫下放置3天，提取。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到21.1g本發(fā)明的預(yù)防外源性凝血的組合物F(收率21.1％)。
試驗例F-2抗外源性凝血活性的確認(rèn)2對于試驗例F-1得到的預(yù)防外源性凝血的組合物A、實施例F-2得到的預(yù)防外源性凝血的組合物B、C、D、E和實施例F-3得到的預(yù)防外源性凝血的組合物F，以固體成分濃度0.2mg/mL的濃度測定PT。帶入實施例F-1的類肝素活性值(U/mg)的計算式，求出各預(yù)防外源性凝血的組合物的類肝素活性值和PT比。對于實施例F-2中80％乙醇的上清組分也同樣，調(diào)節(jié)試樣，求出類肝素活性值和PT比。結(jié)果如表22所示。


表22表明實施例F-2中得到的乙醇沉淀成分顯示高的類肝素活性，可知優(yōu)異的抗外源性凝固效果包含在乙醇沉淀部分中。
實施例F’-1預(yù)防血栓的組合物的制備1將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到23.8g本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物A。收率為23.8％。
試驗例F’-1預(yù)防血栓的效果的確認(rèn)利用從人血液中分離的貧血小板血漿(PPP)，用血凝分析儀測定APTT，評價本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物A的預(yù)防血栓的效果。
向反應(yīng)管中加入10μl將本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物A的濃度調(diào)節(jié)至以固體成分濃度計為0.075、0.15、0.3和0.5mg/mL的試樣和40μlPPP，在37℃反應(yīng)1分鐘。然后加入50μl APTT試劑(國際試藥公司制造)，再在37℃反應(yīng)2分鐘，之后，加入50μl 25mM的氯化鈣，測定血漿凝固所需的時間(秒)，以此作為APTT。結(jié)果如下表23所示。
此時，使用調(diào)節(jié)至0.05、0.1、0.2和0.3U/mL的肝素作為對照試樣，用相同方法測定APTT。由該肝素的濃度和肝素與APTT的關(guān)系求出類肝素活性值(U/mg)的計算式，帶入該計算式，求出各試樣濃度下相對于肝素(1U/mL)的類肝素活性值。結(jié)果如下表24所示。
類肝素活性值(U/mg)＝(0.1648×Log(試樣的APTT))/試樣濃度(mg/mL)[表23]


表24的結(jié)果表明本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物A隨著預(yù)防血栓的組合物濃度的增加，APTT也增加，換算成可用作抗血液凝固劑的肝素得到的類肝素活性值平均為0.36U/mg，顯示高的抗凝血效果。
實施例F’-2預(yù)防血栓的組合物的制備2將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向200g該粉末中加入6L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。向殘余物中加入6L蒸餾水，再在相同條件下重復(fù)提取一次，將各提取液合并，減壓濃縮，制成400mL。向該濃縮液中加入乙醇，制成500mL(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(8500rpm、10分鐘)沉淀物，向該沉淀物中加入1L蒸餾水，再溶解，過濾除去不溶性成分。減壓濃縮該濾液，冷凍干燥，得到16.4g本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物B。向同樣得到的濃縮液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60％、80％時的不溶性成分沉淀，進行同樣的操作，分別得到本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物C 21.4g和D 25.2g。還向乙醇終濃度為60％的上清中加入乙醇，使乙醇的終濃度為80％，產(chǎn)生沉淀，進行同樣的操作，得到2.8g本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物E。
實施例F’-3預(yù)防血栓的組合物的制備3將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入3L 50％的乙醇水溶液，在室溫下放置3天，提取。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到21.1g本發(fā)明的預(yù)防血栓的組合物F。收率21.1％。
試驗例F’-2預(yù)防血栓的效果的確認(rèn)對于實施例F’-1得到的預(yù)防血栓的組合物A、實施例F’-2得到的預(yù)防血栓的組合物B、D、E和實施例F’-3得到的預(yù)防血栓的組合物F，以固體成分濃度0.2mg/mL的濃度、與試驗例F’-1同樣地測定APTT。帶入試驗例F’-1的類肝素活性值(U/mg)的計算式，求出各預(yù)防血栓的組合物的類肝素活性值。對于實施例F’-2中80％乙醇提取的上清組分也同樣，調(diào)節(jié)試樣，求出類肝素活性值。結(jié)果如表25所示。


表25表明實施例F’-2中得到的乙醇沉淀成分顯示高的類肝素活性值，可知優(yōu)異的抗凝血效果包含在水提取物的乙醇沉淀部分中。
實施例F”-1用于預(yù)防血栓的組合物的制備1將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入3L蒸餾水，再加入0.1g蛋白酶，在55℃提取3小時。然后在90℃使酶失活30分鐘。離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將濾液噴霧干燥，得到29.4g本發(fā)明的用于預(yù)防血栓的組合物A。收率為29.4％。
試驗例F”-1預(yù)防血栓的效果的確認(rèn)利用從人血液中分離的貧血小板血漿(PPP)，用血凝分析儀(シスメツクス公司制造)測定APTT，評價本發(fā)明的用于預(yù)防血栓的組合物A的預(yù)防血栓的效果。
向反應(yīng)管中加入10μl將本發(fā)明的用于預(yù)防血栓的組合物A的濃度調(diào)節(jié)至以固體成分濃度計為0.075、0.15、0.3和0.5mg/mL的試樣和40μl PPP，在37℃反應(yīng)1分鐘。然后加入50μl APTT試劑(國際試藥公司制造)，再在37℃反應(yīng)2分鐘，之后，加入50μl 25mM的氯化鈣，測定血漿凝固所需的時間(秒)，以此作為APTT。結(jié)果如下表26所示。
此時，使用調(diào)節(jié)至0.05、0.1、0.2和0.3U/mL的肝素作為對照試樣，用相同方法測定APTT。由該肝素的濃度和肝素與APTT的關(guān)系求出類肝素活性值(U/mg)的計算式，帶入該計算式，求出各試樣濃度下相對于肝素(1U/mL)的類肝素活性值。結(jié)果如下表27所示。
類肝素活性值(U/mg)＝(0.1648×Ln(試樣的APTT)-0.5487)/試樣濃度(mg/mL)[表26]


表27的結(jié)果表明本發(fā)明的用于預(yù)防血栓的組合物A隨著用于預(yù)防血栓的組合物濃度的增加，APTT也增加，換算成可用作抗血液凝固劑的肝素得到的類肝素活性值平均為0.52U/mg，顯示高的抗凝血效果。
實施例F”-2預(yù)防血栓的組合物的制備2將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入3L蒸餾水，再加入0.1g蛋白酶，在55℃提取3小時。然后在90℃使酶失活30分鐘。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，減壓濃縮濾液，制成200mL。向該濃縮液中加入乙醇，制成250mL(乙醇終濃度為20％)，然后在室溫下靜置24小時，使不溶性成分沉淀。通過離心分離(8500rpm、10分鐘)沉淀物，向該沉淀物中加入1L蒸餾水，再溶解，過濾除去不溶性成分。減壓濃縮該濾液，冷凍干燥，得到24.5g本發(fā)明的用于預(yù)防血栓的組合物B。向同樣得到的濃縮液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60％時的不溶性成分沉淀，進行同樣的操作，分別得到21.4g本發(fā)明的用于預(yù)防血栓的組合物C。
比較例F”-1比較組合物的制備將干燥羊棲菜粉碎成40目或以下，向100g該粉末中加入3L蒸餾水，在100℃提取3小時。然后離心分離(8500rpm、10分鐘)，過濾其上清，將提取物和殘余物分離。減壓濃縮濾液，然后冷凍干燥，得到23.8g比較組合物。
試驗例F”-2預(yù)防血栓的效果的確認(rèn)對于實施例F”-1得到的用于預(yù)防血栓的組合物A、實施例F”-2得到的用于預(yù)防血栓的組合物B、C和比較例F”-1得到的比較組合物，以固體成分濃度0.2mg/mL的濃度、與試驗例F”-1同樣地測定APTT。帶入試驗例F”-1的類肝素活性值(U/mg)的計算式，求出各用于預(yù)防血栓的組合物的類肝素活性值。結(jié)果如表28所示。


表28表明對水提取羊棲菜進行酶處理，再進行醇分離處理，顯示更高的類肝素活性值。
實施例G-1抗血栓劑的制備1將10g市場銷售的ι-角叉菜聚糖(サンカラNo.208；太陽化學(xué)株式會社制造)溶解于1L的80℃熱水中，然后過濾，減壓濃縮，冷凍干燥，得到本發(fā)明的抗血栓劑A。
同樣地，使用κ-角叉菜聚糖(サンカラNo.1572；太陽化學(xué)株式會社制造)、λ-角叉菜聚糖(サンカラNo.1057；太陽化學(xué)株式會社制造)，得到本發(fā)明的抗血栓劑B、C。
試驗例G-1抗血栓效果的確認(rèn)利用從人血液中分離的貧血小板血漿(PPP)，用血凝分析儀(シスメツクス公司制造)測定本發(fā)明的抗血栓劑的抗凝血活性。
向反應(yīng)管中加入10μl試樣、25μl APTT試劑(國際試藥公司制造)，25μl 10％腦磷脂，在37℃反應(yīng)3分鐘，然后加入50μl PPP，反應(yīng)2分鐘。最后，加入50μl 25mmol的氯化鈣，使其凝固，測定血漿凝固所需的時間(秒)，以此作為APTT。
此時，向?qū)φ罩屑尤胨?，用同樣的方法測定APTT。通過以下算式，由測定的試樣的APTT計算相對于對照的抗凝血活性(％)。
抗凝血活性(％)＝((試樣的APTT-對照的APTT)/對照的APTT)×100為確認(rèn)本發(fā)明的抗血栓劑的濃度與抗凝血活性的關(guān)系，使用固體成分濃度為0(對照)、1、3、5mg/mL的本發(fā)明的抗血栓劑，測定其活性。結(jié)果如下表29所示。


上表29的結(jié)果表明本發(fā)明的抗血栓劑顯示高的抗凝血活性。還表明隨著提取物濃度的增加，抗凝血活性也成比例增加。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明提供含有具血栓形成抑制作用的規(guī)定的植物成分的用于抑制血栓形成的組合物。本發(fā)明的用于抑制血栓形成的組合物例如可用于飲料食品、準(zhǔn)藥、藥物、飼料。
權(quán)利要求
1.抗血栓組合物，其特征在于含有選自印度醋栗的果實、果汁以及它們的提取物的至少一種。
2.抑制血纖維蛋白形成的組合物，其特征在于含有選自印度醋栗的果實、果汁以及它們的提取物的至少一種。
3.抗血小板凝集組合物，其特征在于含有選自印度醋栗的果實、果汁以及它們的提取物的至少一種。
4.抑制血小板凝集的組合物，其特征在于含有選自印度醋栗的果實、果汁以及它們的提取物的至少一種。
5.用于抗血栓的組合物，其特征在于含有茶的提取物。
6.用于抗血小板凝集的組合物，其特征在于含有茶的提取物。
7.抗血液凝固組合物，其特征在于含有選自木槿的果實、果汁、葉以及它們的提取物的至少一種。
8.預(yù)防血小板凝集的組合物，其特征在于含有選自木槿的果實、果汁、葉以及它們的提取物的至少一種。
9.用于預(yù)防血小板凝集的組合物，其特征在于含有選自木槿的果實、果汁、葉以及它們的提取物的至少一種。
10.抑制血小板凝集性血栓的組合物，其特征在于含有選自蒼耳的果實、果汁、種子以及它們的提取物的至少一種。
11.用于抑制血小板凝集性血栓的組合物，其特征在于含有選自蒼耳的果實、果汁、種子以及它們的提取物的至少一種。
12.血栓形成抑制劑，其特征在于含有匙羹藤、其提取物或它們的混合物。
13.預(yù)防外源性凝血的組合物，其特征在于含有羊棲菜、其提取物或它們的混合物。
14.預(yù)防血栓的組合物，其特征在于含有羊棲菜、其提取物或它們的混合物。
15.用于預(yù)防血栓的組合物，其特征在于含有羊棲菜、其提取物或它們的混合物的酶處理物。
16.抗血栓劑，其特征在于含有角叉菜聚糖。
全文摘要
本發(fā)明提供可用于飲料食品、準(zhǔn)藥、藥物、飼料的，含有來自印度醋栗、茶、木槿、蒼耳、匙羹藤、羊棲菜、角叉菜聚糖的規(guī)定植物成份而成的用于抑制血栓形成的組合物。
文檔編號A61P7/00GK1913909SQ200480041388
公開日2007年2月14日 申請日期2004年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月4日
發(fā)明者坂口騰, 杉野豪俊, 大久保勉, 伊藤俊宏, 紀(jì)平智彥, 尹先柱, T·P·拉奧, H·赫拉赫拉, L·R·祖尼賈 申請人:太陽化學(xué)株式會社