專利名稱：作為PDE2抑制劑的吡啶并[2,3－d]嘧啶－2,4－二胺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作PDE 2抑制劑的某些吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、其藥物制劑、其組合及其用途。
背景技術(shù)：
磷酸二酯酶(PDE)家族的酶通過(guò)水解控制來(lái)調(diào)節(jié)第二信使cAMP或cGMP的細(xì)胞內(nèi)含量。磷酸二酯酶II型(PDE 2)具有對(duì)cGMP特異的低親和性催化區(qū)及別構(gòu)區(qū)。低親和性催化部位可以cGMP低于cAMP的表觀KM水解cAMP及cGMP兩者。然而，當(dāng)cGMP結(jié)合至別構(gòu)部位時(shí)，催化部位經(jīng)歷對(duì)cAMP顯示高親和性的構(gòu)象變化。PDE 2在大腦中顯示最高的表達(dá)，但也在許多其它組織中發(fā)現(xiàn)且因而具有廣泛的一系列功能及潛在的治療效用(J.A.Beavo等人，Rev.Physio.Biochem.Pharm.，135，67(1999))。PDE 2功能及治療潛力的實(shí)例有神經(jīng)元生長(zhǎng)、學(xué)習(xí)及記憶(W.C.G.van Staveren等人，Brain Res.，888，275(2001)及J.O’Donnell等人，J.Pharm.Exp.Ther.，302，249(2002))；催乳素及醛固酮的分泌(M.O.Velardez等人，Eur.J.Endo.，143，279(2000)及N.Gallo-Payet等人，Endo.，140，3594(1999))；骨細(xì)胞分化、生長(zhǎng)及骨吸收(C.Allardt-Lamberg等人，Biochem.Pharm.，59，1133(2000)及S.Wakabayashi等人，J.Bone.Miner.Res.，17，249(2002))；免疫反應(yīng)(M.D.Houslay等人，Cell.Signal.，8，97(1996)；脈管的血管生成(T.Keravis等人，J.Vasc.Res.，37，235(2000)；炎性細(xì)胞轉(zhuǎn)化(S.L.Wolda等人，J.Histochem.Cytochem.，47，895(1999)；心臟收縮(R.Fischmeister等人，J.Clin.Invest.，99，2710(1997)、P.Donzeau-Gouge等人，J.Physiol.，533，329(2001)及D.J.Paterson等人，Card.Res.，52，446(2001))；血小板聚集(R.J.Haslam等人，Biochem.J.，323.371(1997)；女性性喚起障礙(FSAD)(C.P.Wayman等人，歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)第EP 1 097 7707號(hào)及第1 0977 06號(hào))及缺氧性肺部血管收縮(J.Haynes等人，J.Pharm.Exp.Ther.，276.752(1996))等方面。已顯示一種有效的腺苷脫胺酶抑制劑EHNA(赤-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤)選擇性地抑制PDE 2，然而由于EHNA抑制PDE 2的低效能及抑制腺苷脫氨酶的高效能而使得其作為基于PDE 2的治療劑的使用受到限制(R.Fischmeister等人，Mol.Pharm.，48，121(1995))。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)下文式(I)的某些吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺衍生物抑制PDE 2，因而適用于治療通過(guò)cAMP或cGMP細(xì)胞信號(hào)途徑介導(dǎo)的生理失調(diào)。
美國(guó)專利第5,547,954號(hào)及第5,710,157號(hào)公開(kāi)了某些2，4-二氨基-5，6-二取代-及5，6，7-三取代-5-脫氮蝶啶、其組合物及其在防治農(nóng)作物中的昆蟲(chóng)方面的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供式(I)的化合物， 其前藥及該化合物或前藥的藥物上可接受的鹽，其中n、X及Y如文中所定義；其藥物組合物；其組合；及其用途。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供式(I)的化合物，
其前藥及該化合物或前藥的藥物上可接受的鹽，其中R1及R2為氫或甲氧基，其限制條件為R1及R2不均為氫或不均為甲氧基；n為1、2、3或4；X為一條鍵、O、S、C＝O、-N(R)-(其中R為氫或-(C1-C3)烷基)、-C(OH)-或-SO2；且Y為苯并_唑基、苯并噻唑基、苯并呋咱基、苯并呋喃基、苯并噻二唑基、苯并異_唑基、苯并異噻唑基、苯并咪唑基、吡啶基、靛紅基(isatinyl)、羥吲哚基、吲唑基、吲哚基、苯基、噻吩基或呋喃基；其中Y任選地獨(dú)立地被一至三個(gè)鹵素、三氟甲基、甲氧基、-C(＝O)CH3、氰基、-C(CH3)2OH、-CH(CH3)OH、-CH(CF3)OH、-C(C＝O)CF3、-SO2NH2、-C(＝O)OCH3、-CH2COOH、 噻唑基或_二唑基取代。
式(I)化合物的通常優(yōu)選亞群包括那些化合物，其中X為一條鍵且Y為苯并呋咱基、噻吩基、吡啶基或苯基，其中苯基任選地獨(dú)立地被一或兩個(gè)鹵素、三氟甲基、甲氧基、-C(＝O)CH3、氰基、-C(CH3)2OH、-CH(CH3)OH、-CH(CF3)OH、-C(C＝O)CF3、-SO2NH2、-C(＝O)OCH3、-CH2COOH、噻唑基或_二唑基取代。
式(I)化合物的尤其優(yōu)選亞群包括那些化合物，其中X為一條鍵，n為2或3，且Y為噻吩基、吡啶基或苯基，其中苯基任選地獨(dú)立地被一或兩個(gè)甲氧基、鹵素、-C(CH3)2OH、CH(CF3)OH或-C(C＝O)CF3取代。
環(huán)狀基團(tuán)可以多于一種的方式鍵合至另一基團(tuán)。若未指明特定鍵舍排列，則涵蓋所有可能的排列。例如，術(shù)語(yǔ)“吡啶基”包括2-、3-或4-吡啶基，術(shù)語(yǔ)“噻吩基”包括2-或3-噻吩基。
本發(fā)明的化合物及中間體可根據(jù)IUPAC(國(guó)際純化學(xué)及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)盟)或CAS(化學(xué)文摘服務(wù)社(Chemical Abstracts Service)，Columbus，OH)命名法系統(tǒng)來(lái)命名。
各種含烴的部分的碳原子含量可通過(guò)標(biāo)明該部分中碳原子最小及最大數(shù)目的前綴來(lái)表示，即前綴“-(Ca-Cb)烷基”表示包括整數(shù)“a”和“b”在內(nèi)的“a”至“b”個(gè)碳原子的烷基部分。
術(shù)語(yǔ)“烷基”表示碳原子的直鏈或支鏈的單價(jià)鏈。烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基及其類(lèi)似基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“鹵素”代表氯、氟、溴及碘。
術(shù)語(yǔ)“前藥”是指作為藥物前體的化合物，其在給藥之后通過(guò)化學(xué)或生理學(xué)過(guò)程(例如通過(guò)使之達(dá)到生理pH或通過(guò)酶活性)于活體內(nèi)釋放藥物。對(duì)于前藥的制備及使用的討論提供于T.Higuchi及W.Stella的“Prodrugs as Novel Delivery Systems”，ACS SymposiumSeries的第14卷和“Bioreversible Carriers in Drug Design”，Edward B.Roche編，American Pharmaceutical Association andPergamon Press(1987)。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”意指包括例如狗、貓、牛、羊、馬及人的動(dòng)物。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物包括任一性別的人。
術(shù)語(yǔ)“鹽”是指式(I)化合物或其前藥的有機(jī)及無(wú)機(jī)鹽。這些鹽可在化合物的最終分離及純化過(guò)程中就地制備或通過(guò)使式(I)的化合物或其前藥與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸或堿獨(dú)立反應(yīng)且分離由此所形成的鹽來(lái)制備。代表性鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、苯磺酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽及月桂基磺酸鹽及其類(lèi)似鹽。其也可包括基于堿金屬及堿土金屬(諸如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類(lèi)似金屬)及無(wú)毒銨，季銨的陽(yáng)離子；及胺陽(yáng)離子，包括，但不限于，銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及其類(lèi)似物。對(duì)于額外實(shí)例參見(jiàn)例如Berge等人，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)。
術(shù)語(yǔ)“經(jīng)取代”意指以不同的原子或分子替代分子上的氫原子。將替代氫原子的原子或分子稱為“取代基”。
本文所用的術(shù)語(yǔ)”治療有效量”意指可治療所述病理癥狀的化合物的量。
術(shù)語(yǔ)“治療”包括預(yù)防性(例如預(yù)防)及減輕性(例如康復(fù)或治愈)治療或提供預(yù)防性或減輕性治療的行為。
式(I)的化合物可含有不對(duì)稱或手性中心，因而其可以不同的立體異構(gòu)形式存在。預(yù)期式(I)化合物和前藥及其混合物的所有立體異構(gòu)形式，包括外消旋混合物，均構(gòu)成本發(fā)明的一部分。另外，本發(fā)明包括所有幾何及位置異構(gòu)體。例如，若式(I)化合物或前藥有一個(gè)(多個(gè))雙鍵，則順式及反式形式及其混合物均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
非對(duì)映異構(gòu)體混合物可基于其物理化學(xué)差異通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法(諸如通過(guò)色譜法和/或分步結(jié)晶法)分離成其個(gè)別非對(duì)映異構(gòu)體。可通過(guò)以下步驟分離對(duì)映異構(gòu)體通過(guò)使對(duì)映異構(gòu)體混合物與合適的旋光化合物(例如醇)反應(yīng)而將其轉(zhuǎn)化為非對(duì)映異構(gòu)體混合物，分離非對(duì)映異構(gòu)體且將個(gè)別非對(duì)映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化(例如水解)成相應(yīng)的純對(duì)映異構(gòu)體。
式(I)的化合物及前藥可與藥物上可接受的溶劑(諸如水、乙醇及其類(lèi)似物)以未溶劑化及溶劑化形式存在，預(yù)期本發(fā)明包括溶劑化及未溶劑化形式。
式(I)的化合物及前藥也可能以平衡的互變異構(gòu)體存在，所有這些形式都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明也包括同位素標(biāo)記的式(I)化合物，除以下事實(shí)外，它們與本文所述者等同，所述的事實(shí)是一或多個(gè)原子被具有不同于天然界通常發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子所替代?？蓳饺胧?I)化合物的同位素實(shí)例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟及氯的同位素，分別諸如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F及36Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的式(I)的化合物、其前藥及這些化合物及前藥的藥物上可接受的鹽意欲包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
某些同位素標(biāo)記的式(I)化合物，例如其中摻入諸如3H及14C的放射性同位素的化合物適用于化合物和/或底物的組織分布測(cè)定。氚化(即3H)及碳-14(即14C)同位素因其制備相對(duì)容易且易于檢測(cè)而尤其優(yōu)選。另外，以諸如氘(即2H)的較重的同位素取代可提供由更高代謝穩(wěn)定性導(dǎo)致的某些治療優(yōu)勢(shì)，例如活體內(nèi)半衰期增加或所需劑量減少，因此在某些情況下可能是優(yōu)選的。同位素標(biāo)記的式(I)化合物通?？赏ㄟ^(guò)實(shí)施類(lèi)似于下文所列流程和/或?qū)嵤├兴龅某绦?、通過(guò)以同位素標(biāo)記的試劑取代非同位素標(biāo)記的試劑來(lái)制備。
在另一方面中，本發(fā)明提供治療需要此治療的哺乳動(dòng)物中由PDE2介導(dǎo)的癥狀、疾病或病癥的方法，該方法包括向哺乳動(dòng)物施用治療有效量的式(I)化合物、其前藥或該化合物或前藥的藥物上可接受的鹽；或包含式(I)的化合物、其前藥或該化合物或前藥的藥物上可接受的鹽及藥物上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的藥物組合物。
根據(jù)本方法可治療的優(yōu)選癥狀、疾病或病癥包括骨質(zhì)疏松癥、肺動(dòng)脈高血壓、女性性喚起障礙、記憶或認(rèn)知減退、血小板聚集、脈管的血管生成、癡呆、癌癥、心律失常、血栓癥、骨折和/或骨質(zhì)缺損、延遲愈合或不愈合的骨折、脊椎融合、骨向內(nèi)生長(zhǎng)、顏面重整或缺氧癥。尤其優(yōu)選癥狀為骨折和/或缺損。
在另一方面中，本發(fā)明提供用于抑制需要該抑制的哺乳動(dòng)物中的PDE 2活性的方法，該方法包括向哺乳動(dòng)物施用PDE 2抑制量的式(I)化合物、其前藥或者該化合物或前藥的藥物上可接受的鹽；或包含式(I)的化合物、其前藥或者該化合物或前藥的藥物上可接受的鹽及藥物上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的藥物組合物。
式(I)的化合物、其前藥及這些化合物及前藥的藥物上可接受的鹽可以每天約0.001mg至約200mg范圍內(nèi)的劑量水平施用于哺乳動(dòng)物。對(duì)于體重約70kg的正常成年人，通常優(yōu)選劑量在每kg體重約0.01mg至約100mg范圍內(nèi)，然而，此通常劑量范圍可視所治療患者的年齡及體重、預(yù)期給藥途徑、給藥的特定化合物及其類(lèi)似因素而可能需要某些變化性。用于特定哺乳動(dòng)物受試者的劑量范圍及最佳劑量的確定是在得益于本公開(kāi)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
在又一方面中，本發(fā)明提供包含PDE 2抑制劑、EP2選擇性激動(dòng)劑的組合，及藥物上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的藥物組合物；及使用這些組合物治療骨質(zhì)疏松癥、肺動(dòng)脈高血壓、女性性喚起障礙、記憶或認(rèn)知減退、血小板聚集、脈管的血管生成、癡呆、癌癥、心律失常、血栓癥、骨折和/或骨質(zhì)缺損、延遲愈合或不愈合的骨折、脊椎融合、骨向內(nèi)生長(zhǎng)、顏面重整或骨質(zhì)缺氧癥的方法。尤其優(yōu)選癥狀為骨折和/或骨質(zhì)缺損。
在又一方面中，本發(fā)明提供治療需要該治療的哺乳動(dòng)物中的骨折和/或骨質(zhì)缺損的方法，這些方法包括向哺乳動(dòng)物施用治療有效量的PDE 2抑制劑、其前藥或者所述抑制劑或前藥的藥物上可接受的鹽。
任何PDE 2抑制劑(包括本文的式(I)化合物)可用于本發(fā)明的方法及組合中。已知的PDE2抑制劑實(shí)例包括EHNA、6-(3，4-二甲氧基-芐基)-1-[(1-羥基-乙基)-4-苯基-丁基]-3-甲基-1，5-二氫-吡唑并[3，4-d)嘧啶-4-酮(BAY-60-7550；美國(guó)專利第6,174,884號(hào))，及9-(1-乙酰基-4-苯基-丁基)-2-(3，4-二甲氧基-芐基)-1，9-二氫嘌呤-6-酮(美國(guó)專利第5,861,396號(hào))。PDE 2抑制劑的額外實(shí)例公開(kāi)于美國(guó)專利第5,861,396號(hào)、第5,401,774號(hào)、第6,458,796號(hào)及第6,555,547號(hào)及PCT國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)第98/32755號(hào)中。
任何EP2選擇性受體激動(dòng)劑可用于本發(fā)明的組合方面中，然而，公開(kāi)于共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專利第6,498,172號(hào)中的通常優(yōu)選的EP2選擇性受體激動(dòng)劑種類(lèi)包括式AA的化合物， 式AA其前藥及其藥物上可接受的鹽，其中G、A、B、K、M、Q及Z如該專利中所定義。
通常優(yōu)選的式AA化合物為(3-(((吡啶-3-磺?；?-(4-嘧啶-5-基-芐基)-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((5-苯基-呋喃-2-基甲基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((吡啶-3-磺?；?-(4-嘧啶-2-基-芐基)-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((吡啶-3-磺?；?-(4-噻唑-2-基-芐基)-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((4-吡嗪-2-基-芐基)-(吡啶-3-磺?；?-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((4-環(huán)己基-芐基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸、(3-(((吡啶-3-磺?；?-(4-吡啶-2-基-芐基)-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸、(3-(((吡啶-3-磺酰基)-(4-吡啶-3-基-芐基)-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸、(3-(((吡啶-3-磺酰基)-(4-吡啶-4-基-芐基)-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸、(3-(((吡啶-3-磺酰基)-(4-噻唑-2-基-芐基)-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸、5-(3-((吡啶-3-磺?；?-(4-噻唑-2-基-芐基)-氨基)-丙基)-噻吩-2-羧酸、(3-(((2，3-二氫-苯并[1，4]二氧芑-6-基甲基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸及(3-((苯并呋喃-2-基甲基-(吡啶-3-磺?；?-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((4-丁基-芐基)-(吡啶-3-磺?；?-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-((苯磺?；?(4-丁基-芐基)-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((4-丁基-芐基)-(1-甲基-1H-咪唑-4-磺?；?-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸及(3-(((4-二甲基氨基-芐基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((4-二甲基氨基-芐基)-(吡啶-3-磺?；?-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸及(3-(((4-叔丁基-芐基)-(吡啶-3-磺?；?-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸、反式-(3-(((3-(3，5-二氯-苯基)-烯丙基)-(吡啶-3-磺?；?-氨基)-甲基)-苯基)-乙酸、(3-(((2-(3，5-二氯-苯氧基)-乙基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸，其前藥及這些化合物及前藥的藥物上可接受的鹽。
尤其優(yōu)選的式AA化合物為(3-(((4-叔丁基-芐基)-(吡啶-3-磺酰基)-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸，其前藥或者該化合物或前藥的藥物上可接受的鹽。尤其優(yōu)選的鹽為鈉鹽。
另一通常優(yōu)選的適用于本發(fā)明的組合方面的EP2選擇性受體激動(dòng)劑種類(lèi)包括共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專利第6,288,120號(hào)中所公開(kāi)的式BB的化合物、其前藥及藥物上可接受的鹽，
式BB其中A、B、K、M、Q及Z如該專利中所定義。
通常優(yōu)選的式BB化合物為7-[(2’-羥甲基-聯(lián)苯-4-基甲基)-甲磺酰基-氨基]-庚酸、7-{[4-(3-羥甲基-噻吩-2-基)-芐基]-甲磺?；?氨基}-庚酸、7-[(2’-氯-聯(lián)苯-4-基甲基)-甲磺?；?氨基]-庚酸、7-{[4-(1-羥己基)-芐基]-甲磺?；?氨基}-庚酸、7-[(4-丁基-芐基)-甲磺?；?氨基]-庚酸、7-{[5-(1-羥己基)-噻吩-2-基甲基]-甲磺酰基-氨基}-庚酸、(3-{[(4-丁基-芐基)-甲磺?；?氨基]-甲基}-苯基)-乙酸、7-{[3-(3-氯-苯基)-丙基]-甲磺?；?氨基}-庚酸、7-{[3-(3，5-二氯-苯基)-丙基]-甲磺?；?氨基}-庚酸、5-(3-{[3-(3-氯-苯基)-丙基]-甲磺?；?氨基}-丙基)-噻吩-2-羧酸、7-{[2-(3，5-二氯-苯氧基)-乙基]-甲磺?；?氨基}-庚酸、5-(3-{[2-(3，5-二氯-苯氧基)-乙基]-甲磺?；?氨基}-丙基)-噻吩-2-羧酸、N-[2-(3，5-二氯-苯氧基)-乙基]-N-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-甲磺酰胺、反式-(4-{[3-(3，5-二氯-苯基)-烯丙基]-甲磺?；?氨基}-丁氧基)-乙酸、反式-N-[3-(3，5-二氯-苯基)-烯丙基]-N-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-甲磺酰胺、反式-5-(3-{[3-(3，5-二氯-苯基)-烯丙基]-甲磺?；?氨基}-丙基)-噻吩-2-羧酸、反式-[3-({[3-(3，5-二氯-苯基)-烯丙基]-甲磺?；?氨基}-甲基)-苯基]-乙酸、其前藥及這些化合物及前藥的藥物上可接受的鹽。
尤其優(yōu)選的式BB化合物為7-[(4-丁基-芐基)-甲磺?；?氨基]-庚酸、其前藥或者該化合物或前藥的藥物上可接受的鹽。優(yōu)選的鹽為單鈉鹽。
適用于本發(fā)明的組合方面中的其它EP2選擇性受體激動(dòng)劑包括下列文獻(xiàn)中描述的前列腺素受體激動(dòng)劑美國(guó)專利第6,531,485號(hào)、第6,376,533號(hào)、第6,124,314號(hào)、第5,877,211號(hào)、第5,716,835號(hào)、第5,698,598號(hào)及第5,462,968號(hào)；公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)第2002/187961號(hào)；N.Duckworth等人，Journal ofEndocrinology，172(2)，263-269(2002)；K.Tani等人，Synlett，2，239-242(2002)；K.Tani等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry，10(4)，1107-1114(2002)；K.Tani等人，Bioorganic & MedicinalChemistry，10(4)，1093-1106(2002)；J.Michelet等人，EP 1 175891 A1；K.Tani等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，11(15)，2025-2028(2001)；J.Y.Crider等人，InternationalJournal of Environmental Studies，58(1)，35-46(2000)；J.Y.Crider等人，Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics，17(1)，35-46(2001)；D.F.Woodward等人，Journal of OcularPharmacology and Therapeutics，11(3)，447-54(1995)；A.T.Nials等人，Cardiovascular Drug Reviews，11(2)，165-79(1993)及D.F.Woodward等人，Prostaglandins，46(4)371-83(1993)。
在本發(fā)明的組合方面中，可以每天每kg體重約0.001mg至約100mg的范圍內(nèi)的劑量水平向哺乳動(dòng)物施用EP2選擇性受體激動(dòng)劑。對(duì)于體重約70kg的正常成年人，通常優(yōu)選劑量在約0.01mg/kg至約50mg/kg體重范圍內(nèi)，然而，視所治療受試者的年齡及體重、預(yù)期給藥途徑、給藥的特定化合物及其類(lèi)似因素而定，可能需要通常劑量范圍的某些變化性。用于特定哺乳動(dòng)物受試者的組合劑量范圍及最佳劑量的確定是在得益于本公開(kāi)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
適合非腸道方式注射的藥物組合物可包含藥物上可接受的無(wú)菌含水或非含水溶液、分散液、懸浮液或乳液及臨時(shí)重構(gòu)成無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉劑。合適的含水或非含水載體、賦形劑及稀釋劑的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(諸如丙二醇、聚乙二醇、甘油及其類(lèi)似物)、其合適的混合物、植物油(諸如橄欖油)及諸如油酸乙酯的可注射有機(jī)酯類(lèi)。例如，可通過(guò)使用諸如卵磷脂的涂層，在分散液情況下通過(guò)維持所需粒子大小，及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持合適的流動(dòng)性。
本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含助劑，諸如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑及分散劑。本發(fā)明組合物微生物污染的預(yù)防可以用各種抗細(xì)菌劑及抗真菌劑來(lái)完成，諸如對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類(lèi)似物。包括等滲劑，例如糖類(lèi)、氯化鈉及其類(lèi)似物可能也比較理想?？勺⑸渌幬锝M合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)使用例如單硬脂酸鋁及明膠的能延遲吸收的物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、粉劑及顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣的至少一種惰性常規(guī)藥物賦形劑(或載體)混合，或與以下物質(zhì)混合(a)填充劑或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇及硅酸；(b)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖及阿拉伯膠；(c)濕潤(rùn)劑，例如甘油；(d)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸的某些復(fù)合硅酸鹽及碳酸鈉；(e)溶液阻滯劑，例如石蠟；(f)吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物；(g)潤(rùn)濕劑，例如十六烷醇及單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如高嶺土及膨潤(rùn)土和/或(i)潤(rùn)滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉或其混合物。在膠囊劑及片劑的情況下，這些劑型可進(jìn)一步包含緩沖劑。
類(lèi)似類(lèi)型的固體組合物也可作為填充劑用于使用諸如乳糖或奶糖的賦形劑及高分子量的聚乙二醇及其類(lèi)似物的軟質(zhì)或硬質(zhì)填充的明膠膠囊劑中。
固體劑型諸如片劑、糖衣藥丸、膠囊劑及顆粒劑可以涂層及外殼，諸如腸衣及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的其它物質(zhì)來(lái)制備。這些固體劑型也可包含遮光劑且也可為以延時(shí)、持續(xù)或受控方式釋放活性化合物的組合物?？墒褂玫陌窠M合物的實(shí)例為聚合物質(zhì)及蠟。若合適，則活性化合物也可為具有一或多種上文提及的賦形劑的微膠囊形式。
用于口服給藥的液體劑型包括藥物上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿劑及酏劑。除活性化合物外，液體劑型還可含有本領(lǐng)域中通用的惰性稀釋劑，諸如水或其它溶劑；增溶劑及乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(lèi)(尤其為棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻籽油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及失水山梨糖醇脂肪酸酯類(lèi)，或這些物質(zhì)的混合物及其類(lèi)似物。
除這些惰性稀釋劑外，藥物組合物也可包括助劑，諸如潤(rùn)濕劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑及香味劑。
除活性化合物外，懸浮液可進(jìn)一步包含懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇及山梨糖醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁，膨潤(rùn)土、瓊脂及黃蓍膠，或上文提及物質(zhì)的混合物及其類(lèi)似物。
用于直腸或陰道給藥的組合物優(yōu)選包括栓劑，其可通過(guò)將活性化合物與合適的非刺激性賦形劑或載體混合來(lái)制備，這些賦形劑或載體諸如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟，其在正常室溫下為固體，但在體溫下為液體，因此融化于直腸或陰道腔中由此釋放活性成分。
用于局部給藥的劑型可包括軟膏、粉劑、噴霧劑及吸入劑?；钚詣┰跓o(wú)菌條件下與藥物上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑及可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)劑混合。
用于施用PDE 2抑制劑，包括式(I)化合物，以及包含PDE 2抑制劑及EP2選擇性受體激動(dòng)劑的組合治療骨折的通常優(yōu)選的組合物包括可注射的流動(dòng)性組合物，其通過(guò)形成生物可降解固體或凝膠積存物、基質(zhì)或植入物而在局部注射部位提供持續(xù)釋放。該給藥系統(tǒng)的實(shí)例包括緩釋性、基于生物可降解聚合物的遞送系統(tǒng)。參見(jiàn)例如美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)第2003-0104031 A1號(hào)。
該基于聚合物的遞送系統(tǒng)通常包含溶解或分散于流動(dòng)性、生物可降解的熱塑性聚合物于有機(jī)溶劑中的溶液或分散液中的治療有效劑。在注射組合物后，有機(jī)溶劑立即自注射部位擴(kuò)散掉，引起聚合物沉淀或膠凝，從而使藥劑截留于緩釋性積存物中。隨后藥劑通過(guò)自聚合物基質(zhì)擴(kuò)散及聚合物基質(zhì)的侵蝕而加以釋放。該基質(zhì)通過(guò)水解作用緩慢受侵蝕且最終自給藥部位消失。聚合物的分子量及濃度可控制藥劑的活體內(nèi)釋放及基質(zhì)的降解速率。
該基于聚合物的遞送系統(tǒng)在需要此系統(tǒng)的患者中以最小或降低的爆裂量，持續(xù)一段時(shí)間提供活性劑的持續(xù)釋放。大爆裂量的藥劑會(huì)因局部作用(例如刺激)而導(dǎo)致不良的局部耐受性且將會(huì)使可提供功效的藥量最小化。該給藥方法提供的優(yōu)點(diǎn)在于其最小化或降低初始爆裂量，但仍在單一局部注射后持久地以有效量來(lái)釋放藥劑。
該聚合物系統(tǒng)是通過(guò)使流動(dòng)性組合物與膠凝介質(zhì)接觸以使組合物凝結(jié)或膠凝成固體、微孔狀聚合物基質(zhì)或凝膠聚合物基質(zhì)來(lái)制備。流動(dòng)性組合物含有與合適的溶劑相組合的熱塑性聚合物或共聚物。形成基質(zhì)體的聚合物或共聚物為基本上不溶(優(yōu)選為基本上完全不溶)于水及體液?；|(zhì)體的不溶性使其能夠作為用于藥劑的受控釋放的單一部位起作用。聚合物或共聚物在動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)體內(nèi)也為生物相容的及生物可降解的和/或生物可侵蝕的。生物降解使患者能夠代謝且排泄聚合物基質(zhì)，從而無(wú)需外科手術(shù)移除。由于流動(dòng)性組合物及聚合物系統(tǒng)是生物相容的，因此聚合物系統(tǒng)的體內(nèi)插入過(guò)程及存在不會(huì)在植入部位引起實(shí)質(zhì)性組織刺激或壞死。本發(fā)明的組合物作為流動(dòng)性組合物直接施用至身體組織。
用于摻入控釋系統(tǒng)的固體基質(zhì)中的合適熱塑性聚合物為通過(guò)細(xì)胞作用和/或通過(guò)體液作用而呈藥物相容及生物可降解的固體。適當(dāng)熱塑性聚合物的實(shí)例包括二醇及二羧酸或羥基羧酸的聚酯，諸如聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物。更優(yōu)選聚合物包括在水解時(shí)會(huì)產(chǎn)生乳酸及乙醇酸的共聚物，聚乳酸共乙醇酸(縮寫(xiě)為PLGH)。該共聚物的釋放爆裂量可通過(guò)添加聚乙二醇(PEG)以形成PEG封端的PLGH而進(jìn)一步加以最小化。
優(yōu)選材料包括聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物。使用這些聚合物可有利于聚合物系統(tǒng)，部分原因是由于其顯示極佳的生物相容性。這些聚合物引起(即便有)很少組織刺激、炎癥、壞死或毒性。在水的存在下，聚合物分別產(chǎn)生易于代謝的乳酸及乙醇酸。聚丙交酯也可結(jié)合乙交酯單體以提高所產(chǎn)生的聚合物降解。這些聚合物因其有效控制藥劑自聚合物系統(tǒng)的釋放速率，且因其導(dǎo)致藥劑在給藥部位的局部保留而也是優(yōu)選的。
熱塑性聚合物于組合物的有機(jī)溶劑中的溶解性或可混溶性將依據(jù)諸如結(jié)晶性、親水性、氫鍵合能力及聚合物的分子量等因素而變化。因此，調(diào)節(jié)聚合物的分子量及在溶劑中的濃度以達(dá)到對(duì)于摻入的藥劑所期望的可混溶性及所期望的釋放速率。
熱塑性聚合物、溶劑及藥劑的流動(dòng)性組合物包含穩(wěn)定的流動(dòng)性物質(zhì)。優(yōu)選地生成藥劑于有機(jī)溶劑中的均質(zhì)溶液。熱塑性聚合物基本上可溶于有機(jī)溶劑中。將流動(dòng)性組合物置于體內(nèi)后，溶劑消散且聚合物固化或膠凝形成在固體或凝膠聚合物基質(zhì)中具有藥劑的聚合物系統(tǒng)。
對(duì)于某些優(yōu)選聚合物，將聚合物或共聚物的分子量調(diào)節(jié)至約0.2至約0.4的固有粘度(I.V.以分升/克為單位)范圍內(nèi)用于有效持續(xù)釋放促進(jìn)骨生長(zhǎng)的化合物。摻入的藥劑的典型釋放速率在約0.2(約8,000至約16,000分子量)或約0.3(約23,000至約45,000分子量)的I.V.下出現(xiàn)，但其可視組合物的特定組分而變化。對(duì)于多數(shù)系統(tǒng)，優(yōu)選的是將聚合物分子量調(diào)節(jié)至約0.2 I.V.，以有效持續(xù)釋放藥劑。
對(duì)于聚(DL-丙交酯)或丙交酯-共-乙交酯聚合物系統(tǒng)，所期望的分子量范圍為約0.2至約0.4 I.V.，優(yōu)選為約0.2的I.V.。聚合物的分子量可通過(guò)常規(guī)方法調(diào)節(jié)。
尤其優(yōu)選的市售熱塑性聚合物包括如下固有粘度為約0.2dl/g乳酸及乙醇酸呈1∶1比例的PLGH共聚物(可以Copolymer RESOMER_RG502 H購(gòu)自Boehringer Ingelheim)(約12,000分子量)、固有粘度為約0.3dl/g、乳酸及乙醇酸呈1∶1比例的PLGH共聚物(可以CopolymerRESOMER_RG 503 H購(gòu)自Boehringer Ingelheim)(約37,000的分子量)、固有粘度為約0.4dl/g、乳酸及乙醇酸呈1∶1比例的PLGH共聚物(可以Copolymer RESOMER_RG 504 H購(gòu)自BoehringerIngelheim)(約47,000的分子量)及固有粘度為約0.79dl/g、乳酸及乙醇酸呈1∶1比例的經(jīng)聚乙二醇(PEG)封端的PLGH共聚物(可以PLG-PEG購(gòu)自Boehringer Ingelheim)(約52,000的分子量)。
熱塑性組合物中使用的溶劑優(yōu)選為藥物上可接受的、生物相容的，且將就地消散于體液中，可按照它們?cè)谒械娜芙庑苑秶愿呖扇苄灾敛豢扇苄詠?lái)分類(lèi)。這些溶劑優(yōu)選在注射及植入部位引起(若有的話)相對(duì)很少的組織刺激或壞死。優(yōu)選地，溶劑將具有至少最小程度的水溶性。當(dāng)有機(jī)溶劑為水不溶性或最低限度地溶解于水中時(shí)，該溶劑將自流動(dòng)性聚合物組合物緩慢分散。結(jié)果將成為在其壽命期中可含有變化量的殘余溶劑的植入物。優(yōu)選地，有機(jī)溶劑具有中等至高程度的水溶性以使其將易于自聚合物組合物分散至體液中。最優(yōu)選地，溶劑自聚合物組合物迅速分散以快速形成固體植入物。伴隨著溶劑的分散，熱塑性聚合物凝結(jié)或膠凝成固體聚合物系統(tǒng)。優(yōu)選地，當(dāng)熱塑性聚合物凝結(jié)時(shí)，溶劑分散引起聚合物系統(tǒng)內(nèi)小孔的形成。因此，含有熱塑性聚合物、溶劑及藥劑的流動(dòng)性組合物將形成多孔的固體聚合物系統(tǒng)。同樣，當(dāng)溶劑為微溶于水或不溶于水時(shí)，溶劑分散也可導(dǎo)致固體多孔植入物的形成，或者若某溶劑留存于植入物，則結(jié)果可形成具有較少孔或無(wú)孔的凝膠植入物。
合適的溶劑包括符合前述標(biāo)準(zhǔn)的液體有機(jī)化合物。通常優(yōu)選溶劑包括N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。
用于熱塑性聚合物的流動(dòng)性組合物的溶劑根據(jù)聚合物及溶劑的相容性及合適的溶解性加以選擇。較低分子量的熱塑性聚合物將通常比高分子量的聚合物更易溶解于溶劑中。因此，溶解于各種溶劑中的熱塑性聚合物的濃度視聚合物的類(lèi)型及其分子量的不同而不同。反之，較高分子量的熱塑性聚合物將比極低分子量的熱塑性聚合物更快趨于凝結(jié)、膠凝或固化。另外，較高分子量的聚合物比低分子量材料趨于產(chǎn)生更高的溶液粘度。因此，為了有利的注射功效，除有利的釋放速率外，還要控制聚合物的分子量及在溶劑中的濃度。
自流動(dòng)性組合物形成聚合物系統(tǒng)后，藥劑逐漸摻入聚合物基質(zhì)中。在插入流動(dòng)性組合物以形成聚合物系統(tǒng)以后，藥劑通過(guò)擴(kuò)散及降解機(jī)制自基質(zhì)釋放至相鄰組織或流體中。這些機(jī)制的操縱也可影響藥劑以受控速率至環(huán)境中的釋放。例如，聚合物基質(zhì)可以被配制成在有效和/或?qū)嵸|(zhì)量的藥劑自基質(zhì)中釋放以后而降解。因此，藥劑自基質(zhì)中的釋放可根據(jù)(例如)藥劑在水中的溶解性、促進(jìn)骨生長(zhǎng)的化合物在基質(zhì)內(nèi)的分布或聚合物基質(zhì)的尺寸、形狀、多孔性、溶解性及生物可降解性及其它因素而變化。藥劑自基質(zhì)中的釋放通過(guò)改變聚合物分子量而相對(duì)于其固有速率加以控制，從而提供所期望的釋放持續(xù)時(shí)間及速率。
例如，藥劑的優(yōu)選劑型包括在給藥前將用PLGH于NMP中的溶液來(lái)重構(gòu)的凍干物(lyophile)。由一個(gè)注射器(注射器A)中的凍干化合物及第二個(gè)注射器(注射器B)中的PLGH于NMP中的溶液組成的該劑型稱作A/B重構(gòu)系統(tǒng)。兩個(gè)注射器的內(nèi)容物在部位處或接近部位處給藥前立即混合在一起。重構(gòu)以后，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至用于釋放的帶刻度給藥注射器中。所施用劑型將為溶液且將導(dǎo)致具有PLGH的化合物于NMP中以所期望的濃度分散，所期望的濃度例如為5和50mgA/ml(mgA/ml是指藥劑的鈉鹽形式的游離酸當(dāng)量)。劑型為用于局部給藥的非腸道(例如皮下、肌內(nèi)或髓內(nèi))持續(xù)釋放性注射劑。設(shè)計(jì)緩釋性聚合物基質(zhì)中的該化合物(長(zhǎng)效注射劑)用于在部位處或接近部位處給藥，并非旨在用于靜脈內(nèi)給藥。為提供劑型的足夠儲(chǔ)藏期穩(wěn)定性，優(yōu)選可以化合物的鈉鹽形式使用上述雙注射器系統(tǒng)(A/B)。單相制劑(優(yōu)選具有化合物的游離酸形式)是優(yōu)選的替代制劑。基于藥劑及聚合物的穩(wěn)定性，藥劑的無(wú)菌過(guò)濾及聚合物溶液的輻射優(yōu)選可用于制造穩(wěn)定的無(wú)菌產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑型可以裝有注射器的獨(dú)立鋁袋來(lái)制造及運(yùn)輸，在一個(gè)小袋中是裝有凍干物形式的藥劑的注射器而在另一個(gè)小袋中是裝有聚合物溶液的注射器。用于凍干骨生長(zhǎng)促進(jìn)化合物的遞送容器、系統(tǒng)及方法在公開(kāi)的PCT國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)第WO 01/73363號(hào)中有描述。其它給藥方法包括通過(guò)注射至特定部位的局部給藥或通過(guò)導(dǎo)管至某一部位的遞送。額外實(shí)例可在2001年11月30日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/335,156號(hào)中找到。
在此公開(kāi)的所有美國(guó)專利號(hào)中的教導(dǎo)均全文以引用方式并入本文中。
式(I)的化合物、其前藥及這些化合物及前藥的藥物上可接受的鹽可按照以下流程及實(shí)施例中所公開(kāi)的示范性合成途徑，以及通過(guò)相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的或根據(jù)本公開(kāi)顯而易見(jiàn)的其它常規(guī)的有機(jī)制備方法加以制備。本流程中所公開(kāi)的方法意在用于例示本發(fā)明的目的且不以任何方式理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
流程1 在流程1步驟1中，2，4-二氯-吡啶并[2，3-d]嘧啶(IV)與經(jīng)適度取代的芐胺(V)在諸如三乙胺(TEA)或二異丙基乙胺(DIPEA)的三取代胺堿或者諸如吡啶的芳族堿的存在下反應(yīng)。該反應(yīng)通常于諸如甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)或異丙醇(IPA)的極性醇溶劑中在約0℃至約100℃范圍的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，該反應(yīng)在DIPEA的存在下，于乙醇中，于約室溫(RT)下進(jìn)行。在步驟2中，所得縮合產(chǎn)物(VI)隨后與經(jīng)適度取代的胺(VII)在諸如TEA或DIPEA的三取代胺堿或者諸如吡啶的芳族堿的存在下反應(yīng)以獲得化合物(I)。該反應(yīng)通常在極性非質(zhì)子性溶劑諸如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮或環(huán)丁砜的存在下，于約60℃至約250℃范圍的高溫下進(jìn)行。優(yōu)選地，該反應(yīng)在DIPEA的存在下，于DMSO中，于約90℃至約120℃之間進(jìn)行。
雖然流程1已作為分開(kāi)的兩步驟過(guò)程加以描述，其中中間體(VI)被分離且隨后與胺(VII)反應(yīng)，但是也發(fā)現(xiàn)可方便地以單一步驟制備(IV)和使其與胺(VII)就地反應(yīng)。在該過(guò)程中，使用非質(zhì)子性溶劑，優(yōu)選為DMSO。該反應(yīng)也在DIPEA的存在下，于DMSO中，于約90℃至約120℃之間的溫度下進(jìn)行。
制備實(shí)驗(yàn)除非另有說(shuō)明，否則所用的所有試劑均自市面購(gòu)得。除非另有說(shuō)明，否則下列實(shí)驗(yàn)性縮寫(xiě)具有指定含義AcOH-乙酸dec-分解DMAP-4-二甲基氨基吡啶EtOAc-乙酸乙酯hr-小時(shí)LAH-氫化鋰鋁min-分鐘MS-質(zhì)譜分析NMR-核磁共振THF-四氫呋喃p-TsOH-對(duì)甲苯磺酸制備1(2-氯-吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-基)-(3，5-二甲氧基-芐基)-胺在室溫下向2，4-二氯-吡啶并[2，3-d]嘧啶(1.3g，6.7mmol)及3，5-二甲氧基芐胺(1.1g，6.7mmol)于30mL EtOH中的經(jīng)攪拌溶液中添加TEA(4mL，28.7mmol)。過(guò)濾所形成的沉淀物且用冷EtOH繼之用己烷洗滌以產(chǎn)生1.8g的固體狀標(biāo)題化合物(82％)。mp185℃(dec)。1H-NMR(DMSO-d6)δ9.5(t，1H)、8.9(dd，1H)、8.7(dd，1H)、7.5(m，1H)、6.5(d，2H)、6.4(t，1H)、4.6(d，2H)、3.7(s，6H)。MS(m/z，％)331(100)。
制備2(2-氯-吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-基)-(3，4-二甲氧基-芐基)-胺該化合物以類(lèi)似于制備1中所述的方式使用合適的起始物質(zhì)制備。1H-NMR(DMSO-d6)δ9.5(t，1H)、8.9(dd，1H)、8.7(dd，1H)、7.0(s，1H)、6.9(d，2H)、4.6(d，2H)、3.7(s，3H)、3.7(s，3H)。MS(m/z，％)331(100)。
制備32-(4-氨基甲基-苯基)-丙-2-醇在0℃下向4-(1-羥基-1-甲基-乙基)-芐腈(2.0g，12.4mmol)于30mL THF中的經(jīng)攪拌溶液中逐滴添加于THF(26mL，26.1mmol)中的1.0N LAN。允許混合物溫?zé)嶂潦覝厍医又亓?0min。然后將混合物冷卻至0℃且以逐滴添加的5mL MeOH猝滅。用300mL氯仿稀釋混合物且用水(1×80mL)洗滌、經(jīng)硫酸鎂干燥且濃縮以產(chǎn)生1.9g(95％)固體狀的標(biāo)題化合物。1H-NMR(CDCl3)δ7.45(d，2H)、7.26(d，2H)、3.83(s，2H)、1.57(s，6H)。GC-MS(m/e，％)164(M+，15)、150(80)、132(75)、106(100)。
制備43-(4-乙?；?苯基)-丙腈在75℃下將4-(2-溴乙基)苯乙酮(2.0g，8.8mmol)與KCN(0.6g，8.8mmol)于30mL DMSO中的混合物加熱4hr。用水稀釋混合物且用EtOAc萃取。用水及鹽水相繼洗滌有機(jī)萃取物、干燥且濃縮以產(chǎn)生油狀物。在硅膠上進(jìn)行色譜，用40％EtOAc/己烷洗脫，產(chǎn)生0.8g的油狀物。1H-NMR(CD3OD)δ7.9(d，2H)、7.4(d，2H)、3.3(t，2H)、2.8(t，2H)、2.6(s，3H)。GC-MS(m/e，％)173(M+，20)、158(100)。
制備53-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基)-苯基]-丙腈在-40℃下向3M甲基氯化鎂于THF(3.3mL，9.8mmol)中的、進(jìn)一步用10mL THF稀釋的經(jīng)攪拌溶液中逐滴添加3-(4-乙?；?苯基)-丙腈(0.7g，3.9mmol)于10mL THF中的溶液。允許反應(yīng)混合物緩慢溫?zé)嶂潦覝剡^(guò)夜，冷卻至0℃，然后以逐滴添加的含水AcOH猝滅。反應(yīng)混合物用水洗滌且用EtOAc萃取。用水及鹽水相繼洗滌有機(jī)萃取物、干燥且濃縮以產(chǎn)生0.8g的油狀物。1H-NMR(CD3OD)δ7.4(d，2H)、7.2(d，2H)、2.9(t，2H)、2.7(t，2H)、1.5(s，6H)。GC-MS(m/e，％)189(M+，5)、174(100)。
制備62-[4-(3-氨基-丙基)-苯基]-丙-2-醇在0℃下向1M LAH于THF中的、進(jìn)一步用20mL THF稀釋的經(jīng)攪拌溶液中逐滴添加3-[4-(1-羥基-1-甲基-乙基)-苯基]丙腈(0.8g，4.0mmol)于10mL THF中的溶液。允許反應(yīng)物緩慢溫?zé)嶂潦覝兀又亓?hr。反應(yīng)混合物然后冷卻至0℃且用緩慢地逐滴添加的MeOH猝滅?；旌衔镉寐确孪♂屒矣盟礈?。有機(jī)萃取物通過(guò)硅藻土過(guò)濾，濃縮濾液，然后用乙酸乙酯稀釋、干燥且濃縮以產(chǎn)生0.5g的油狀物。1H-NMR(CD3OD)δ7.4(d，2H)、7.1(d，2H)、2.6(m，4H)、1.7(m，2H)、1.5(s，6H)。MS(m/e，％)194(M++1，100)、176(90)。
制備73-[4-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙腈將3-(4-乙?；?苯基)丙腈(2.2g，13mmol)、乙二醇(2.8mL，51mmol)與催化量的p-TsOH(約200mg)于100mL甲苯中的混合物經(jīng)Dean-Stark分水器回流18hr。混合物用EtOAc稀釋且用5％碳酸氫鈉溶液、水及鹽水相繼洗滌、干燥(MgSO4)且濃縮以產(chǎn)生油狀物。在硅膠上進(jìn)行色譜，用EtOAc/己烷溶液洗脫，產(chǎn)生2.5g的油狀物。1H-NMR(CDCl3)δ7.4(d，2H)、7.2(d，2H)、4.0(m，2H)、3.8(m，2H)、2.9(t，2H)、2.6(t，2H)、1.6(s，3H)。MS(m/e，％)216(M+-1，1)、202(100)。
制備83-[4-(2-甲基[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙胺向3-[4-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙腈(2.4g，11mmol)于30mL THF的經(jīng)攪拌溶液中逐滴添加1M LAH于THF中的溶液。允許混合物溫?zé)嶂潦覝?，然后回?hr。將混合物冷卻至0℃然后用逐滴添加的MeOH猝滅?；旌衔镉寐确孪♂屒矣盟礈臁Ｋ脩腋∫和ㄟ^(guò)硅藻土過(guò)濾且分離濾液層。有機(jī)萃取物經(jīng)MgSO4干燥且濃縮以產(chǎn)生2.4g的油狀物，1H-NMR(CDCl3)δ7.4(m，2H)、7.1(d，2H)、4.0(m，2H)、3.8(m，2H)、2.7(m，2H)、2.6(m，2H)、1.7(m，2H)、1.6(s，3H)。MS(m/e，％)221(M+，10)、206(60)、189(100)。
制備92，2，2-三氟-1-(4-碘-苯基)-乙醇在室溫下向4-碘苯甲醛(2.0g，8.6mmol)于20mL THF的經(jīng)攪拌溶液中添加三甲基(三氟甲基)硅烷于THF(19mL，9.5mmol)中的0.5M溶液，繼之添加四丁基氟化銨(112mg，0.4mmol)?；旌衔镉谑覝叵聰嚢柽^(guò)夜，傾入0.1N鹽酸中且用EtOAc萃取。有機(jī)萃取物依次用水及鹽水洗滌、干燥(MgSO4)且濃縮以產(chǎn)生2.6g的油狀物。1H-NMR(CDCl3)δ7.7(d，2H)、7.2(d，2H)、5.0(m，1H)、2.7(d，1H)。MS(m/e，％)302(M+，100)、233(100)。
制備102-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮在室溫下向2，2，2-三氟-1-(4-碘-苯基)-乙醇(2.6g，8.5mmol)、N-炔丙基鄰苯二甲酰亞胺(1.6g，8.5mmol)、二氯雙(三苯基膦)鈀(298mg，0.43mmol)及碘化銅(I)(82mg，0.43mmol)于20mL THF的經(jīng)攪拌懸浮液中添加5ml TEA。混合物于氮?dú)饬飨露虝撼タ諝馇胰缓蠡亓?hr?；旌衔镉寐确孪♂?、用水洗滌、經(jīng)MgSO4干燥且濃縮以產(chǎn)生固體。該固體用EtOAc研制以產(chǎn)生2.2g的固體。1H-NMR(CDCl3)δ7.9(m，2H)、7.7(m，2H)、7.5(d，2H)、7.4(d，2H)、5.0(m，1H)、4.7(s，2H)。MS(m/e，％)359(M+，100)。
制備112-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮在室溫下將2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮(2.2g，6.1mmol)及10％Pd/C(220mg)于150mL EtOH及150mL THF中的混合物在50psi氫氣條件下于Parr裝置中振蕩2hr。然后添加額外的220mg的10％Pd/C，在室溫、50psi氫氣條件下振蕩混合物另外的2hr。隨后添加額外的220mg的10％Pd/C，在室溫、50psi氫氣條件下振蕩混合物過(guò)夜。混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾且濃縮濾液以產(chǎn)生油狀物。在硅膠上進(jìn)行色譜，用EtOAc/己烷洗脫，產(chǎn)生1.8g的油狀物。1H-NMR(CDCl3)δ7.8(m，2H)、7.7(m，2H)、7.3(d，2H)、7.2(d，2H)、4.9(m，1H)、3.7(t，2H)、2.7(t，2H)、2.0(m，2H)。MS(m/e，％)363(M+，15)、345(35)、325(50)、161(100)。
制備121-[4-(3-氨基-丙基)-苯基]-2，2，2-三氟-乙醇在室溫下向2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮(1.8g，5.0mmol)于50mL MeOH中的經(jīng)攪拌懸浮液中添加水合肼(0.46ml，15.0mmol)。在室溫下攪拌混合物18hr。過(guò)濾反應(yīng)混合物且濃縮濾液以產(chǎn)生油狀物。該油狀物用氯仿研制、過(guò)濾且濃縮濾液以產(chǎn)生1.0g的油狀物。1H-NMR(CDCl3)δ7.3(d，2H)、7.2(d，2H)、5.0(m，1H)、2.6(m，2H)、2.5(m，2H)、1.6(m，2H)。MS(m/e，％)363(M+，10)、216(100)。
制備13三氟-甲磺酸苯并[1，2，5]_二唑-5-基酯在-78℃下向5-羥基苯并呋咱(1.8g，13.0mmol)、TEA(2.4mL，33.0mmol)及DMAP(79mg，7.0mmol)于40mL二氯甲烷的經(jīng)攪拌溶液中逐滴添加三氟甲磺酸酐(2.8mL，17.0mmol)于10mL二氯甲烷中的溶液。允許混合物經(jīng)3hr緩慢溫?zé)嶂潦覝?，用二氯甲烷稀釋且用水洗滌。干燥有機(jī)萃取物且濃縮以產(chǎn)生油狀物。在硅膠上進(jìn)行色譜，用二氯甲烷洗脫，得到3.1g的油狀物。1H-NMR(CDCl3)δ8.0(dd，1H)、7.8(dd，1H)、7.3(dd，1H)。MS(m/e，％)268(M+，60)、146(60)、69(100)。
制備14
2-(苯并[1，2，5]_二唑-5-基-丙-2-炔基)-異吲哚-1，3-二酮該化合物以類(lèi)似于制備10的方式使用合適的起始物質(zhì)加以制備。1H-NMR(CDCl3)δ8.2(s，1H)、8.0(dd，1H)、7.9(m，2H)、7.8(m，2H)、7.5(dd，2H)、4.7(s，2H)。MS(m/e，％)303(M+，100)。
制備152-(3-苯并[1，2，5]_二唑-5-基-丙基)-異吲哚-1，3二酮該化合物以類(lèi)似于制備11的方式使用合適的起始物質(zhì)制備。1H-NMR(CDCl3)δ7.8(m，2H)、7.7(m，3H)、7.6(s，1H)、7.2(m，1H)、3.8(t，3H)、2.8(t，2H)、2.1(m，2H)。MS(m/e，％)307(M+，40)、290(30)、272(20)、160(100)。
制備163-苯并[1，2，5]_二唑-5-基-丙胺該化合物以類(lèi)似于制備12的方式使用合適的起始物質(zhì)制備。1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9(m，2H)、7.7(m，1H)、7.5(m，1H)、2.7(m，2H)、2.5(m，2H)、1.7(m，2H)。MS(m/e，％)177(M+，40)、160(100)。
制備17三氟-甲磺酸苯并噻唑-6-基酯該化合物以類(lèi)似于制備13的方式使用合適的起始物質(zhì)制備。1H-NMR(CDCl3)δ9.1(s，1H)、8.2(d，1H)、7.9(d，1H)、7.4(dd，1H)。MS(m/e，％)283(M+，80)、150(100)。
制備182-(3-苯并噻唑-6-基-丙-2-炔基)-異吲哚-1，3-二酮該化合物以類(lèi)似于制備10的方式用三氟-甲磺酸苯并噻唑-6-基酯(制備17)代替2，2，2-三氟-1-(4-碘-苯基)-乙醇來(lái)制備。1H-NMR(d6-DMSO)δ9.4(s，1H)、8.3(d，1H)、8.0(d，2H)、7.9(m，1H)、7.8(m，2H)、7.5(dd，1H)、4.6(s，2H)。MS(m/e，％)318(M+，100)。
制備192-(3-苯并噻唑-6-基-丙基)-異吲哚-1，3-二酮該化合物以類(lèi)似于制備11的方式用2-(3-苯并噻唑-6-基-丙-2-炔基)-異吲哚-1，3-二酮(制備18)代替2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮(制備10)來(lái)制備。1H-NMR(CDCl3)δ8.9(s，1H)、8.0(d，1H)、7.8(m，2H)、7.7(m，2H)、7.3(dd，1H)、3.8(t，2H)、2.8(t，2H)、2.1(m，2H)。MS(m/e，％)322(M+，80)、174(40)、162(100)。
制備203-苯并噻唑-6-基-丙胺該化合物以類(lèi)似于制備12的方式用2-(3-苯并噻唑-6-基-丙基)-異吲哚-1，3-二酮(制備19)替代2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮(制備11)來(lái)制備。MS(m/e，％)192(M+，20)、175(100)。
制備212-(3-碘-苯基)-2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)將3-碘苯乙酮(3.0g，12mmol)、乙二醇(2.7mL，48mmol)及對(duì)甲苯磺酸(30mg)于50mL甲苯中的混合物在Dean-Stark分水器內(nèi)回流18hr?；旌衔镉肊tOAc稀釋且用5％碳酸氫鈉溶液、水及鹽水相繼洗滌、經(jīng)MgSO4干燥且濃縮以產(chǎn)生油狀物。在硅膠上進(jìn)行色譜，用EtOAc/己烷洗脫，產(chǎn)生3.1g的油狀物。1H-NMR(CDCl3)δ7.8(m，1H)、7.6(dd，1H)、7.4(dd，1H)、7.0(m，1H)、4.0(m，2H)、3.7(m，2H)、1.6(s，3H)。MS(m/e，％)290(M+，20)、275(100)。
制備222-{3-[3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮該化合物以類(lèi)似于制備10的方式用2-(3-碘-苯基)-2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)(制備21)代替2，2，2-三氟-1-(4-碘-苯基)-乙醇來(lái)制備。1H-NMR(CDCl3)δ7.9(m，2H)、7.7(m，2H)、7.5(s，1H)、7.4(m，1H)、7.3(m，1H)，7.2(m，1H)、4.7(s，2H)、4.0(m，2H)、3.7(m，2H)、1.6(s，6H)。MS(m/e，％)347(M+，15)、332(100)。
制備232-{3-[3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮該化合物以類(lèi)似于制備11的方式用2-{3-[3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮(制備22)代替2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮(制備10)來(lái)制備。1H-NMR(CDCl3)δ7.8(m，2H)、7.7(m，2H)、7.2(m，4H)、7.1(d，1H)、4.0(m，2H)、3.7(m，4H)、2.6(t，2H)、2.0(m，2H)、1.6(s，3H)。MS(m/e，％)351(M+，5)、336(100)。
制備243-[3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙胺該化合物以類(lèi)似于制備12的方式用2-{3-[3-(2-甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮(制備23)代替2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮來(lái)制備。1H-NMR(CDCl3)δ7.3(m，3H)、7.1(dd，1H)、4.0(m，2H)、3.8(m，2H)、2.7(t，2H)、2.6(t，2H)、1.8(m，2H)、1.6(s，3H)。MS(m/e，％)221(M+，20)、206(60)、189(100)。
制備252-(3-碘-苯基)-丙-2-醇在0℃下向甲基氯化鎂(65mmol)于100mL THF的經(jīng)攪拌溶液中逐滴添加3-碘苯乙酮(4.0g，16.3mmol)。允許反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?，然后冷卻至0℃，添加額外的等量甲基氯化鎂。允許混合物溫?zé)嶂潦覝厍覕嚢?hr。反應(yīng)混合物用MeOH猝滅、用水稀釋、用冰AcOH酸化且用二氯甲烷萃取。用5％碳酸氫鈉溶液洗滌有機(jī)萃取物，然后濃縮。在硅膠上進(jìn)行色譜，用二氯甲烷洗脫，產(chǎn)生油狀物，其經(jīng)靜置而凝固。MS(m/e，％)262(M+，80)、247(100)。
制備262-{3-[3-(1-羥基-1-甲基-乙基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮該化合物以類(lèi)似于制備10的方式用2-(3-碘-苯基)-丙-2-醇(制備25)代替2，2，2-三氟-1-(4-碘-苯基)-乙醇來(lái)制備。MS(m/e，％)319(M+，90)、301(80)、160(100)。
制備272-{3-[3-(1-羥基-甲基-乙基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮該化合物以類(lèi)似于制備11的方式用2-{3-[3-(1-羥基-1-甲基-乙基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮(制備26)代替2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮(制備10)來(lái)制備。MS(m/e，％)305(M+-H2O，80)、145(100)。
制備282-[3-(3-氨基-丙基)-苯基]-丙-2-醇該化合物以類(lèi)似于制備12的方式用2-{3-[3-(1-羥基-1-甲基-乙基)-苯基)-丙基}-異吲哚-1，3-二酮(制備27)代替2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮來(lái)制備。MS(m/e，％)193(M+，30)、162(60)、145(100)。
制備294-[3-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙-1-炔基]-芐腈該化合物以類(lèi)似于制備10的方式使用合適的起始物質(zhì)來(lái)制備。1H-NMR(CDCl3)δ7.8(m，6H)、7.6(d，2H)、4.6(s，2H)。MS(m/e，％)286(M+，100)。
制備304-[3-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙基]-芐腈該化合物以類(lèi)似于制備11的方式用4-[3-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙-1-炔基]-芐腈(制備29)代替2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙-2-炔基}-異吲哚-1，3-二酮(制備10)來(lái)制備。1H-NMR(CDCl3)δ7.8(dd，2H)、7.7(dd，2H)、7.5(d，2H)、7.3(d，2H)、3.7(t，2H)、2.7(t，2H)、2.0(m，2H)。MS(m/e，％)290(M+，60)、161(100)。
制備31
4-(3-氨基-丙基)-芐腈該化合物以類(lèi)似于制備12的方式用4-[3-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙基]-芐腈(制備30)代替2-{3-[4-(2，2，2-三氟-1-羥基-乙基)-苯基]-丙基}-異吲哚-1，3-二酮來(lái)制備。1H-NMR(CDCl3)δ7.5(d，2H)，7.3(d，2H)，2.7(m，4H)，1.8(m，2H)。MS(m/e，％)160(M+，20)、143(100)。
制備322-氯-3，4-二甲氧基-苯甲醛肟將2-氯-3，4-二甲氧基苯甲醛(1.5g，7.5mmol)、鹽酸羥胺(650mg，9.4mmol)及乙酸鈉(1.5g，18.8mmol)于30ml MeOH及15ml水中的混合物在65℃下加熱18hr。該混合物用水稀釋且用EtOAc萃取。有機(jī)萃取物用水及鹽水相繼洗滌，經(jīng)MgSO4干燥且濃縮以產(chǎn)生1.7g的固體。1H-NMR(CDCl3)δ8.5(s，1H)、7.6(d，1H)、6.8(d，1H)、3.9(s，3H)、3.8(s，3H)。MS(m/e，％)215(M+，40)、199(100)。
制備332-氯-3，4-二甲氧基-芐胺在0℃下向制備32的產(chǎn)物(1.7g，7.8mmol)于40mL THF中的經(jīng)攪拌溶液中緩慢地逐滴添加LAH于THF中的1M溶液(17mL，17mmol)。允許混合物緩慢溫?zé)嶂潦覝?，然后回?hr。將混合物冷卻至0℃且用緩慢地逐滴添加的MeOH來(lái)猝滅反應(yīng)?；旌衔镉盟♂屒矣寐确螺腿　Ｋ萌橐和ㄟ^(guò)硅藻土過(guò)濾且分離濾液層。有機(jī)萃取物用水洗滌、干燥(MgSO4)且濃縮以產(chǎn)生1.1g的油狀物。MS(m/e，％)202(M+，100)。
制備343-乙氧基-4-甲氧基-苯甲醛肟該化合物以類(lèi)似于制備32的方式使用合適的起始物質(zhì)制備。1H-NMR(CDCl3)δ8.1(s，1H)、7.2(d，1H)、7.0(m，1H)、6.8(d，1H)、4.1(q，2H)、3.9(s，3H)、1.5(t，3H)。MS(m/e，％)195(M+，100)。
制備353-乙氧基-4-甲氧基-芐胺該化合物以類(lèi)似于制備33的方式使用合適的起始物質(zhì)制備。1H-NMR(CDCl3)δ6.9(s，1H)、6.8(s，2H)、4.1(q，2H)、3.8(s，2H)、1.5(t，3H)。MS(m/e，％)181(M+，100)。
制備362-(3-吡啶-4-基-丙基)-異吲哚-1，3-二酮在0℃下向4-吡啶丙醇(2.0g，14.5mmol)、鄰苯二甲酰亞胺(2.1g，14.5mmol)及三苯基膦(4.9g，15.2mmol)于50mL THF中的經(jīng)攪拌溶液中逐滴添加偶氮二羧酸二乙酯(2.5mL，16.0mmol)。允許混合物緩慢溫?zé)嶂潦覝?，然后攪拌過(guò)夜。混合物用0.1N的鹽酸稀釋且用乙醚洗滌。含水萃取物以6N氫氧化鈉來(lái)堿化且用EtOAc萃取。有機(jī)萃取物用1N氫氧化鈉及水洗滌、經(jīng)MgSO4干燥且濃縮以產(chǎn)生1.8g固體。1H-NMR(CDCl3)δ8.5(s，2H)、7.8(m，2H)、7.7(m，2H)、7.2(m，2H)、3.7(t，2H)、2.7(t，2H)、2.0(m，2H)。
制備373-吡啶-4-基-丙胺該化合物以類(lèi)似于制備12的方式使用制備36的標(biāo)題化合物制備。1H-NMR(CDCl3)δ8.4(m，2H)、7.1(m，2H)、2.7(t，2H)、2.6(t，2H)、1.8(m，2H)。MS(m/e，％)136(M+，30)、119(35)、107(100)。
式(I)的化合物如下列實(shí)施例中所述來(lái)制備。
實(shí)施例1N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-吡啶-2-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺在90℃下將制備1的標(biāo)題化合物(174mg，0.5mmol)、2-(2-氨基乙基)-吡啶(386mg，3.2mmol)及DIPEA(0.2mL，1.1mmol)于1mL的DMSO中的混合物加熱18hr。將混合物傾入水中且用二氯甲烷萃取。有機(jī)萃取物用鹽水洗滌、經(jīng)MgSO4干燥且濃縮。所得殘余物用EtOAc研制以產(chǎn)生83mg(40％)的標(biāo)題化合物。m.p.157-8℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.6(dd，1H)、8.5(d，1H)、8.4(dd，1H)、7.7(m，1H)、7.2(m，1H)、7.0(m，2H)、6.5(m，2H)、6.3(m，1H)、4.6(m，2H)、3.7(8，6H)、3.6(n，2H)、3.0(m，2H)。MS(m/z，％)417(100)。C23H24N6O2分析的計(jì)算值C，66.3；H，5.8；N，20.2。實(shí)測(cè)值C，65.3；H，6.3；N，18.3。
實(shí)施例2至5的化合物以類(lèi)似于實(shí)施例1中所述的方式使用合適的起始物質(zhì)制備。
實(shí)施例2N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-吡啶-3-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.185-6℃。C23H24N6O2分析的計(jì)算值C，66.3；H，5.8N，20.2。實(shí)測(cè)值C，64.5；H，5.6；N，19.6。
實(shí)施例3N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-吡啶-4-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.234-5℃。C23H24N6O2分析的計(jì)算值C，66.3；H，5.8；N，20.2。實(shí)測(cè)值C，66.0；H，5.6；N，20.0。
實(shí)施例4N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-2-吡啶-3-基甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.222-3℃。C22H22N6O2分析的計(jì)算值C，65.7；H，5.5；N，20.9。實(shí)測(cè)值C，65.5；H，5.5；N，20.8。
實(shí)施例5N2-N4-雙-(3，5-二甲氧基-芐基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.159-160℃。C25H27N5O4分析的計(jì)算值C，65.1；H，5.9；N，15.2。實(shí)測(cè)值C，65.3；H，5.9；N，15.1。
實(shí)施例6N4(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺在90℃下將制備1的標(biāo)題化合物(100mg，0.5mmol)、對(duì)甲氧基苯乙胺(89μL，0.61mmol)及DIPEA(105μL，0.61mmol)于0.8mL的DMSO中的混合物加熱18hr。通過(guò)直接注射于反相制備性HPLC(Shimadzu Corp.；Kyoto，Japan)上、使用含0.1％氫氧化銨的乙腈/水的階式梯度作為洗脫液自粗反應(yīng)混合物中分離及純化該化合物。將含所期望產(chǎn)物的級(jí)分合并、濃縮且自IPA中再結(jié)晶殘余物，產(chǎn)生80mg(60％)的標(biāo)題化合物。m.p.88-9℃。C25H27N5O3分析的計(jì)算值C，67.4；H，6.1；N，15.7。實(shí)測(cè)值C，67.0；H，6.3；N，15.2。
實(shí)施例7至31的化合物以類(lèi)似于實(shí)施例6中所述的方式使用合適的起始物質(zhì)制備。注意所用的反應(yīng)和/或純化條件的具體例外情況。
實(shí)施例7N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺1H-NMR(DMSO-d6)8.6(dd，1H)、8.4(d，1H)、7.2(m，br，3H)、7.1(m，br，2H)、7.0(m，br，1H)、6.5(s，br，2H)、6.3(s，br，1H)、4.6(m，br，2H)、3.7(s，br，6H)、2.6(m，br，2H)、1.8(m，br，2H)、1.7(m，br，2H)。MS(m/z，％)417(100)。MS(m/z，％)430(100)。
實(shí)施例8N2-[2-(4-氯-苯基)-乙基]-N4-(3，5-二甲氧基-芐基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.85-90℃。C24H24N5O2Cl分析的計(jì)算值C，64.1；H，5.4；N，15.6。實(shí)測(cè)值C，63.6；H，5.7N，15.3。
實(shí)施例9N2-芐基-N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2.4-二胺m.p.84-85℃。C23H23N5O2分析的計(jì)算值C，68.8；H，5.8；N，17.4。實(shí)測(cè)值C，68.5；H，6.0N，17.4。
實(shí)施例10N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-噻吩-2-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.120-1℃。C22H23N5O2S分析的計(jì)算值C，62.7；H，5.5；N，16.6。實(shí)測(cè)值C，62.2；H，6.0N，15.6。
實(shí)施例112-(4-{[4-(3，5-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-甲基}-苯基)-丙-2-醇m.p.105-9℃。C26H29N5O3分析的計(jì)算值C，68.0；H，6.4；N，15.2。實(shí)測(cè)值C，67.7H，6.6N，14.4。
實(shí)施例12N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-2-苯乙基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.112-4℃。C24H25N5O2分析的計(jì)算值C，69.4，H，6.1；N，16.9。實(shí)測(cè)值C，68.5；H，6.9；N，15.3。
實(shí)施例13N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-[2-(3，5-二甲氧基-苯基)-乙基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.95-100℃。C26H29N5O4分析的計(jì)算值C，65.7；H，6.2；N，14.7。實(shí)測(cè)值C，65.5；H，6.6；N，14.5。
實(shí)施例14N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-[2-(3-氟-苯基)-乙基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.227-8℃。C24H24N5O2F分析的計(jì)算值C，66.5；H，5.6；N，16.2。實(shí)測(cè)值C，66.6；H，5.6；N，16.2。
實(shí)施例15N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-[2-(2-氟-苯基)-乙基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.220-2℃。C24H24N5O2F分析的計(jì)算值C，66.5；H，5.6；N，16.2。實(shí)測(cè)值C，66.4；H，5.5；N，16.1。
實(shí)施例16
N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-[2-(4-氟-苯基)-乙基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.225-6℃。C24H24N5O2F分析的計(jì)算值C，66.5；H，5.6；N，16.2。實(shí)測(cè)值C，66.4；H，5.6；N，16.2。
實(shí)施例17N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-苯乙基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.217-8℃。C24H25N5O2分析的計(jì)算值C，69.4；H，6.1；N，16.9。實(shí)測(cè)值C，69.4；H，6.0；N，16.8。
實(shí)施例18N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(4-苯基-丁基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.194-5℃。C26H29N5O2分析的計(jì)算值C，70.4；H，6.6；N，15.8。實(shí)測(cè)值C，70.5；H，6.6；N，15.9。
實(shí)施例19N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(2-苯氧基-乙基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.227-8℃。C24H25N5O3分析的計(jì)算值C，66.8；H，5.8；N，16.2。實(shí)測(cè)值C，66.7；H，5.7；N，16.2。
實(shí)施例20N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(2-三氟甲基-芐基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺m.p.227-8℃。C24H22N5O2F3分析的計(jì)算值C，61.4；H，4.7；N，14.9。實(shí)測(cè)值C，60.6；H，4.9；N，14.8。
實(shí)施例212-(4-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-丙-2-醇濃縮含所期望粗產(chǎn)物的反相制備性HPLC級(jí)份且自EtOAc中再結(jié)晶殘余物。m.p.198-9℃。C28H33N5O3分析的計(jì)算值C，69.0；H，6.8；N，14.4。實(shí)測(cè)值C，68.7；H，6.9；N，14.3。
實(shí)施例222-(4-{3-[4-(3，5-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-丙-2-醇(非晶形固體)m.p.70-5℃。1H-NMR(DMSO-d6)8.6(dd，1H)、8.4(d，1H)、7.3(m，br，2H)、7.1(m，br，2H)、7.0(m，br，2H)、6.5(s，br，2H)、6.3(s，br，1H)、4.6(m，br，2H)、3.7(s，br，6H)、2.6(m，br，2H)、1.8(m，br，2H)、1.7(m，br，2H)、1.4(s，6H)。MS(m/z，％)430(100)。MS(m/z，％)488(M++1，100)、470(50)。C28H33N5O3分析的計(jì)算值C，69.0；H，6.8；N，14.4。實(shí)測(cè)值C，67.1；H，7.0；N，12.1。
實(shí)施例231-(4-{[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-甲基}-苯基)-2，2，2-三氟-乙醇濃縮含所期望粗產(chǎn)物的反相制備性HPLC級(jí)分且自乙腈/水中再結(jié)晶殘余物。m.p.121-2℃。C25H24N5O3F3分析的計(jì)算值C，60.1H，4.8；N，14.0。實(shí)測(cè)值C，58.0；H，5.0；N，13.4。
實(shí)施例241-(4-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶2-基氨基]-丙基}-苯基)-乙酮將含粗產(chǎn)物的反應(yīng)混合物傾入水中且過(guò)濾所得沉淀物。將殘余物溶解于30mL的MeOH中且添加10mL的1N鹽酸。在室溫下將混合物攪拌4hr、濃縮、用5％的碳酸氫鈉溶液中和且用二氯甲烷萃取。合并有機(jī)萃取物且用鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥且濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)如實(shí)施例6中所述的反相HPLC純化。將含所期望產(chǎn)物的級(jí)分合并、濃縮且自乙腈/水中再結(jié)晶殘余物以產(chǎn)生固體，m.p.184-5℃。C27H29N5O3分析的計(jì)算值C，68.8；H，6.2；N，14.9。實(shí)測(cè)值C，8.7；H，6.0；N，14.6。
實(shí)施例251-(4-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-2，2，2-三氟-乙醇m.p.222-4℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.6(dd，1H)、8.4(dd，1H)、7.4(m，br，2H)、7.3(m，1H)、7.0(m，br，2H)、6.8(s，br，2H)、6.7(d，1H)、5.0(m，br，1H)、4.6(s，br，2H)、3.7(m，6H)、3.3(m，2H)、2.6(m，br，2H)、1.8(m，br，2H)。MS(m/z，％)528(M+，100)。
實(shí)施例26N2-3-(苯并[1，2，5]_二唑-5-基-丙基)-N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺該產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜法通過(guò)用于2N氨水/二氯甲烷中的2.5％MeOH洗脫分離以產(chǎn)生粗固體。用EtOAc研制產(chǎn)生固體。m.p.191-3℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.6(dd，1H)、8.4(dd，1H)、7.9(m，br，1H)、7.7(m，1H)、7.5(m，br，1H)、7.0(m，br，2H)、6.8(m，2H)、4.6(m，br，2H)、3.7(m，6H)、3.4(m，2H)、2.7(m，br，2H)、1.9(m，br，2H)。MS(m/z，％)472(M+，100)。
實(shí)施例27N2-3-(苯并噻唑-6-基-丙基)-N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺該產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜法通過(guò)用于2N氨水/二氯甲烷中的2.5％MeOH洗脫分離以產(chǎn)生固體。mp 191-3℃。MS(m/z，％)487(M+，100)。C26H26N6O2S分析的計(jì)算值C，64.2；H，5.4；N，17.3。實(shí)測(cè)值C，64.5；H，5.5；N，16.8。
實(shí)施例28N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-{3-[3-(2-甲基-[1，3]-二氧戊環(huán)-2-基)-苯基]-丙基}-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺1H-NMR(DMSO-d6)δ8.6(d，1H)、8.3(d，1H)、7.2(m，br，3H)、7.0(m，br，3H)、6.9(m，br，2H)、4.6(m，br，2H)、4.1(m，2H)、3.9(m，2H)、3.7(m，br，8H)、2.6(m，br，2H)、1.8(m，br，2H)、1.5(s，3H)。MS(m/z，％)516(M++1，100)。
實(shí)施例29
2-(3-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-丙-2-醇m.p.204-5℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.6(d，1H)、8.3(d，1H)、7.3(m，br，1H)、7.2(m，br，1H)、7.1(m，br，1H)、7.0(m，br，3H)、6.8(s，br，2H)、4.6(s，br，2H)、3.7(m，br，6H)、3.3(m，br，2H)、2.6(m，br，2H)、1.8(m，br，2H)、1.4(s，6H)。MS(m/z，％)488(M++1，100)。
實(shí)施例304-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-芐腈m.p.220-2℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ8.6(d，1H)、8.3(d，1H)、7.7(m，br，2H)、7.4(m，br，2H)、7.0(m，br，2H)、6.8(s，br，2H)、4.6(s，br，2H)、3.7(m，br，6H)、3.3(m，br，2H)、2.7(m，br，2H)、1.8(m，br，2H)。MS(m/z，％)455(M++1，100)。
實(shí)施例31N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(3-吡啶-4-基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺1H-NMR(CD2Cl2)δ9.1(d，1H)、8.9(m，br，1H)、8.4(m，br，3H)、7.2(m，br，2H)、7.1(m，br，1H)、7.0(s，br，1H)、6.9(d，1H)、6.6(d，1H)、4.8(d，2H)、3.7(s，3H)、3.7(s，3H)、3.6(m，2H)、2.7(m，2H)、2.0(m，2H)。MS(m/z，％)432(M++1，20)、256(15)、237(30)、216(100)。
實(shí)施例32-35的化合物按照下列概述的程序制備。注意所用的反應(yīng)和/或純化條件的具體例外情況。
在室溫下向2，4-二氯-吡啶并[2，3-d]嘧啶(0.75mmol)及DIPEA(1.5mmol)于3mL DMSO中的經(jīng)攪拌溶液中添加0.75mmol對(duì)應(yīng)于流程1步驟1中式(V)的胺。將混合物在室溫下攪拌1hr，然后添加2.25mmol對(duì)應(yīng)于流程1步驟2中式(VII)的胺及額外的DIPEA(2.25mmol)，且在90℃下加熱混合物兩小時(shí)。
實(shí)施例32N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺通過(guò)直接注射于反相制備性HPLC上使用含0.1％氫氧化銨的乙腈/水的階式梯度作為洗脫液自粗反應(yīng)混合物中分離及純化該化合物。將含該化合物的級(jí)分合并且濃縮以產(chǎn)生固體，m.p.190-2℃。1H-NMR(d6-DMSO)δ8.6(dd，1H)、8.4(dd，1H)、7.2(m，br，3H)、7.1(m，br，2H)、7.0(m，br，2H)、6.8(m，br，2H)、4.6(m，br，2H)、3.7(d，br，6H)、3.3(m，br，2H)、2.6(m，br，2H)、1.8(m，2H)。MS(m/e，％)431(M++1，50)、430(M+，100)。
實(shí)施例33N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯氧基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺通過(guò)直接注射于反相制備性HPLC上使用含0.1％氫氧化銨的乙腈/水的階式梯度作為洗脫液自粗反應(yīng)混合物中分離及純化該化合物。將含該化合物的級(jí)分合并、濃縮且自IPA/水中再結(jié)晶殘余物。m.p.165-7℃。1H-NMR(d6-DMSO)8.6(dd，1H)、8.4(d，1H)、7.2(m，br，3H)、7.1(m，br，2H)、7.0(m，1H)、6.9(m，br，2H)、6.8(m，br，1H)、6.5(d，2H)、6.4(s，1H)、4.6(m，br，2H)、4.0(m，br，2H)、3.7(m，br，8H)。MS(m/e，％)433(M++1，50)、432(M+，100)。
實(shí)施例34N4-(3-乙氧基-4-甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺通過(guò)直接注射于反相制備性HPLC上使用含0.1％氫氧化銨的乙腈/水的階式梯度作為洗脫液自粗反應(yīng)混合物中分離及純化該化合物。將含該化合物的級(jí)分合并、濃縮且自乙腈/水中再結(jié)晶。m.p.181-2℃。C26H29N5O2分析的計(jì)算值C，70.4；H，6.6；N，15.8。實(shí)測(cè)值C，70.7；H，6.9；N，15.9。
實(shí)施例35
2-(4-{3-[4-(3-乙氧基-4-甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}苯基)-丙-2-醇通過(guò)直接注射于反相制備性HPLC上使用含0.1％氫氧化銨的乙腈/水的階式梯度作為洗脫液自粗反應(yīng)混合物中分離及純化該化合物。將含所期望化合物的級(jí)分合并、濃縮且自乙腈/水中再結(jié)晶。m.p.150-2℃。C29H35N5O3分析的計(jì)算值C，69.4；H，7.0；N，13.7。實(shí)測(cè)值C，69.1；H，6.9；N，13.7。
實(shí)施例361-(4-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-2，2，2-三氟-乙酮在室溫下向?qū)嵤├?5的標(biāo)題化合物(150mg，0.28mmol)于15mL二氯甲烷中的經(jīng)攪拌溶液中添加1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氫-1，2-苯并碘氧雜環(huán)戊(benziodoxol)-3(1H)-酮(180mg，0.43mmol)。將混合物在室溫下攪拌六小時(shí)，然后添加額外份數(shù)的1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氫-1，2-苯并碘氧雜環(huán)戊-3-(1H)-酮(180mg，0.43mmol)且在室溫下攪拌混合物過(guò)夜?；旌衔镉寐确孪♂?、用水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥且濃縮以產(chǎn)生油狀物。于硅膠上色譜，用5％MeOH 2N于氨水/二氯甲烷中的溶液洗脫得到油狀物。用EtOAc研制產(chǎn)生45mg的固體。m.p.198-200℃。1H-NMR(d6-DMSO)δ8.6(dd，1H)、8.4(dd，1H)、7.9(m，br，2H)、7.5(m，br，2H)、7.0(m，br，2H)、6.8(m，br，2H)、4.6(m，2H)、3.7(m，6H)、3.3(m，2H)、2.7(m，br，2H)、1.9(m，br，2H)。MS(m/e，％)526(M+，100)。
實(shí)施例371-(3-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-乙酮在室溫下將制備27的標(biāo)題化合物(419mg，0.81mmol)于含10ml6N鹽酸的8mL THF中的混合物攪拌6hr。反應(yīng)混合物用EtOAc萃取，有機(jī)萃取物用5％碳酸氫鈉溶液洗滌且然后濃縮以產(chǎn)生固體。m.p.152-5℃。1H-NMR(d6-DMSO)8.8(d，1H)、8.7(d，1H)、7.7(m，2H)、7.4(m，3H)、7.0(s，1H)、6.8(m，2H)、4.6(d，2H)、3.7(s，3H)、3.6(s，3H)、3.5(m，2H)、2.7(m，2H)、2.5(s，3H)、1.9(m，2H)。MS(m/e，％)471(M+，30)、470(100)。
生物學(xué)方法PDE 2酶的分離用來(lái)自多個(gè)捐贈(zèng)者的用于制造血小板小球的約1.4L血液，從人類(lèi)血小板中分離PDE 2酶。將血小板再懸浮于約75mL的裂解緩沖液[20mM Tris pH 7.2、5mM MgCl2、250mM蔗糖、1mM DTT、1μL/2mLSigma蛋白酶抑制劑#8340；Sigma-Aldrich；St.Louis，MO]中且在4℃下通過(guò)超聲處理來(lái)裂解，進(jìn)行3輪1分鐘裂解，然后以100,000xg于4℃下旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。將澄清裂解液以25mL的平均加樣體積裝載至以-連串三次色譜分離的AKTA Explorer FPLC(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)中。使用5mL HiTrap Q陰離子交換柱(AmershamBiosciences)。將A緩沖液[20mM Tris pH 7.2、5mM MgCl2、1μl/2mLSigma蛋白酶抑制劑#8340]與經(jīng)20柱體積而自0％的初始B緩沖液濃度至100％的最終濃度梯度的B緩沖液[20mM Tris pH 7.2、500mM NaCl、5mM MgCl2、1μl/2mL Sigma蛋白酶抑制劑#8340]混合。cGMP-水解峰以在低鹽-125mM NaCl(PDE 5)及高鹽-325mM NaCl(PDE 2)下的平均分辨率記錄。分離且單獨(dú)合并兩個(gè)主要的cGMP活性級(jí)分(PDE 5及PDE2)。合并有PDE 2的級(jí)分總量大約為40mL，將其以200μl/小瓶分配于耐凍小瓶(cryovial)中且置于-80℃下儲(chǔ)存。
PDE 2酶結(jié)合測(cè)定式(I)化合物對(duì)重組或分離的PDE 2及其它PDE的抑制活性是使用購(gòu)自Amersham International(Little Chalfont，England)的[3H]cAMP閃爍親近測(cè)定法(SPA)試劑盒來(lái)測(cè)定的。SPA測(cè)定使用96孔平板進(jìn)行。與環(huán)狀核苷酸cGMP相比，PDE SPA硅酸釔珠粒(AmershamBiosciences)優(yōu)先結(jié)合至線性核苷酸GMP。添加3H-cGMP至該反應(yīng)中，且當(dāng)產(chǎn)物3H-cGMP緊密接近珠粒時(shí)，激發(fā)珠粒內(nèi)的閃爍體，該閃爍體使用Packard閃爍計(jì)數(shù)器(Perkin-Elmer Life Sciences；Boston，MA)來(lái)檢測(cè)。所用的酶濃度是在線性范圍內(nèi)，測(cè)定酶的Km(15μM)。最終底物濃度為＜1/3Km(1μM)以使得IC50值接近Ki值。在測(cè)試化合物之前該測(cè)定使用文獻(xiàn)化合物作為對(duì)照物驗(yàn)證。隨后，比較在測(cè)試化合物的存在下獲得的及在缺乏測(cè)試化合物下獲得的PDE催化活性測(cè)量值且測(cè)定IC50值。
使用RACK-BETA 1219液體閃爍計(jì)數(shù)器(LKB Wallac；Freiburg，F(xiàn)RG)定量測(cè)定這些放射性底物及PDE反應(yīng)產(chǎn)物。以1μM cAMP或cGMP使用峰級(jí)分來(lái)測(cè)定IC50值(50％抑制的濃度)。借助于S形對(duì)數(shù)函數(shù)以四個(gè)參數(shù)擬合該數(shù)據(jù)。
使用先前所述自人類(lèi)血小板中分離的PDE 2酶及用于測(cè)定測(cè)試化合物對(duì)酶的抑制的方法，測(cè)得EHNA的IC50為1.7μM。另外，也使用上文提及的方法測(cè)得9-(1-乙?；?4-苯基-丁基)-2-(3，4-二甲氧基-芐基)-1，9-二氫嘌呤-6-酮的IC50為3nM。
式(I)的化合物通常展現(xiàn)抑制活性，以針對(duì)PDE 2的IC50來(lái)表示，其為＜1,000nM。實(shí)施例1-37中式(I)化合物的PDE 2抑制活性范圍在表1中給出。
表1

PDE 2抑制+++(IC50＜50nM)，++(IC5050-250nM)，+(IC50250-1,000nM)包括式(I)化合物的PDE 2抑制劑治療骨折和/或缺損或促進(jìn)骨向內(nèi)生長(zhǎng)的能力可依據(jù)下列方案加以證實(shí)。
大鼠股骨橫向折斷模型使用3至4月大的雄性Sprague-Dawley大鼠。這些動(dòng)物用開(kāi)他敏及甲苯噻嗪各以100及10mg/kg的劑量麻醉。剃刮且清潔各大鼠的右后肢。正好在膝蓋骨的側(cè)面形成1cm的切口且暴露股骨髁。將Kirschner鋼絲(直徑0.045”)通過(guò)髁間部分引入髓內(nèi)管以作為內(nèi)部穩(wěn)定器。肌肉切口用vicryl(一種可吸收的縫合材料)閉合且皮膚切口用不銹鋼閉合夾閉合。經(jīng)釘住的股骨的中間骨干借助于由落重驅(qū)動(dòng)的三點(diǎn)彎曲裝置來(lái)折斷。在麻醉清醒后允許大鼠完全負(fù)重且自由活動(dòng)。手術(shù)后通過(guò)經(jīng)皮注射至折斷部位上于不同天數(shù)給予測(cè)試化合物。處理后處死動(dòng)物且收集股骨用于分析。折斷愈合通過(guò)使用放射線照相術(shù)、組織學(xué)及生物機(jī)械學(xué)測(cè)試來(lái)評(píng)估(F.Bonnarens等人，Journal ofOrthopaedic Research，2，97-101(1984))。
大鼠股骨橫向折斷模型中的研究方案及結(jié)果在通常麻醉下使三個(gè)月大的雄性大鼠經(jīng)受其右股骨橫向折斷。單劑量(5mg)的N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺于折斷形成完全時(shí)經(jīng)皮注射至折斷部位。注射三周后，處死大鼠且收集右股骨并分析。與用安慰劑處理的股骨相比較，用N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺處理的股骨中，折斷力(force-to-failure)及勁度(骨強(qiáng)度指數(shù))分別增加了19％及62％。
大鼠骨膜注射模型在安置于通風(fēng)櫥中的傳導(dǎo)室中以異氟烷麻醉大鼠(2-3min)。剃刮且清潔各大鼠的右后肢。附于注射器上的25號(hào)針頭預(yù)填充用于局部注射的測(cè)試化合物的制劑。該制劑以5-15μL的體積注射于股骨的骨膜下達(dá)14天。定量給藥后處死大鼠，收集股骨，然后通過(guò)放射線照相術(shù)及雙能量X射線吸收分析法(DEXA)來(lái)分析。
大鼠骨膜注射模型中的研究方案及結(jié)果三周大的雄性Sprague-Dawley大鼠的右股骨接受每日注射賦形劑或測(cè)試化合物，每周五次，持續(xù)兩周。在第15天，處死所有大鼠且收集右股骨用于分析。使用放射線照相術(shù)及DEXA評(píng)估骨膜的骨誘導(dǎo)。放射線照相術(shù)顯示定位于用測(cè)試化合物處理的所有股骨的注射部位上的新骨形成。股骨注射區(qū)(股骨的小轉(zhuǎn)子與中間骨干之間的區(qū)域)的骨礦物質(zhì)含量(BMC)通過(guò)DEXA分析將用測(cè)試化合物處理的大鼠與僅用賦形劑處理者相比較來(lái)進(jìn)行評(píng)估。在該模型中，N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-吡啶-4-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、2-(3-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-丙-2-醇及N 4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺分別增加了BMC 34％、49％及33％。另外，9-(1-乙酰基-4-苯基-丁基)-2-(3，4-二甲氧基-芐基)-1，9-二氫嘌呤-6-酮在上述模型中增加了BMC 20％。
權(quán)利要求
1.一種式(I)的化合物， 其前藥及所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽，其中R1及R2為氫或甲氧基，其限制條件為R1及R2不均為氫或不均為甲氧基；n為1、2、3或4；X為一條鍵、O、S、C＝O、-N(R)-，其中R為氫或-(C1-C3)烷基、-C(OH)-或-SO2；且Y為苯并_唑基、苯并噻唑基、苯并呋咱基、苯并呋喃基、苯并噻二唑基、苯并異_唑基、苯并異噻唑基、苯并咪唑基、吡啶基、靛紅基、羥吲哚基、吲唑基、吲哚基、苯基、噻吩基或呋喃基；其中Y任選地獨(dú)立地被一至三個(gè)下列基團(tuán)取代鹵素、三氟甲基、甲氧基、-C(＝O)CH3、氰基、-C(CH3)2OH、-CH(CH3)OH、-CH(CF3)OH、-C(C＝O)CF3、-SO2NH2、-C(＝O)OCH3、-CH2COOH、 噻唑基或_二唑基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中X為一條鍵且Y為苯并呋咱基、噻吩基、吡啶基或苯基，其中苯基任選地獨(dú)立地被一或兩個(gè)下列基團(tuán)取代鹵素、三氟甲基、甲氧基、-C(＝O)CH3、氰基、-C(CH3)2OH、-CH(CH3)OH、-CH(CF3)OH、-C(C＝O)CF3、-SO2NH2、-C(＝O)OCH3、-CH2COOH、噻唑基或_二唑基。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中X為一條鍵，n為2或3，且Y為噻吩基、吡啶基或苯基，其中苯基任選地獨(dú)立地被一或兩個(gè)甲氧基、鹵素、-C(CH3)2OH、CH(CF3)OH或-C(C＝O)CF3取代。
4.化合物N2，N4-雙-(3，5-二甲氧基-芐基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-吡啶-4-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-噻吩-2-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-2-苯乙基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-[2-(3，5-二甲氧基-苯基)-乙基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、2-(3-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-丙-2-醇、N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-[2-(4-氟-苯基)-乙基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-苯乙基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺或N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺；其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽。
5.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的式(I)化合物、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽，及藥物上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
6.一種治療需要這種治療的哺乳動(dòng)物中由PDE 2介導(dǎo)的癥狀、疾病或病癥的方法，該方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的式(I)化合物、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽；或包含所述式(I)化合物、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽及藥物上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的藥物組合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述癥狀、疾病或病癥為骨質(zhì)疏松癥、肺動(dòng)脈高血壓、女性性喚起障礙、記憶或認(rèn)知減退、血小板聚集、脈管的血管生成、癡呆、癌癥、心律失常、血栓癥、骨折和/或骨質(zhì)缺損、延遲愈合或不愈合的骨折、脊椎融合、骨向內(nèi)生長(zhǎng)、顏面重整或缺氧癥，該方法包括向需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1的式(I)化合物、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽；或包含所述化合物、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽的藥物組合物。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述癥狀為骨折和/或骨質(zhì)缺損。
9.一種藥物組合物，其包含PDE 2抑制劑、EP2選擇性受體激動(dòng)劑及藥物上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述PDE 2抑制劑為N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-吡啶-4-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、2-(3-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-丙-2-醇、N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽。
11.權(quán)利要求9或10的組合物，其中所述EP2選擇性受體激動(dòng)劑為(3-(((4-叔丁基-芐基)-(吡啶-3-磺?；?-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽。
12.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的EP2選擇性受體激動(dòng)劑或包含權(quán)利要求1的所述式(I)化合物與所述EP2選擇性受體激動(dòng)劑的組合的藥物組合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述PDE 2抑制劑為N4-(3，5-二甲氧基-芐基)-N2-(2-吡啶-4-基-乙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、2-(3-{3-[4-(3，4-二甲氧基-芐基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-丙基}-苯基)-丙-2-醇、N4-(3，4-二甲氧基-芐基)-N2-(3-苯基-丙基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述EP2選擇性受體激動(dòng)劑為(3-(((4-叔丁基-芐基)-(吡啶-3-磺?；?-氨基)-甲基)-苯氧基)-乙酸、其前藥或者所述化合物或前藥的藥物上可接受的鹽。
15.一種治療需要這種治療的哺乳動(dòng)物中骨折和/或骨質(zhì)缺損的方法，該方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的PDE 2抑制劑、其前藥或者所述抑制劑或前藥的藥物上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供式(I)的化合物，其前藥及這些化合物或前藥的藥物上可接受的鹽，其中n、X及Y是如文中所定義；其藥物組合物；其組合；及其用途。
文檔編號(hào)A61P19/10GK1894245SQ200480037674
公開(kāi)日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2004年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者T·A·貝爾, R·J·錢(qián)伯斯, K·林, 李玫, A·I·摩瑞爾, D·D·湯普森 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司