專利名稱：作為抗癌治療靶標的三葉因子3(tff3)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明部分涉及調(diào)節(jié)三葉因子3(trefoil factor 3，TFF3)活性或表達的試劑。本發(fā)明還涉及這些試劑在治療、預(yù)防或診斷癌癥中的用途。
背景技術(shù)：
三葉因子3(TFF3；或腸三葉因子，intestinal trefoil factor(ITF)；或人腸三葉因子，human intestinal trefoil factor(HITF))是一種抗蛋白酶肽，它通常在小腸杯狀細胞中產(chǎn)生，并分泌入腸腔(Thim等，Biochemistry，1995年，34，4757)。TFF3在損傷后上皮的恢復(fù)中發(fā)揮功能(Mashimo等，Science，1996年，274，262和Wong等，Biochemistry，1995年，34，4757)，且被確信可通過多種機制來完成這一功能1)保護上皮細胞，使其免于凋亡(Taupin等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美國，2000年，97，799)；2)誘導(dǎo)邊緣細胞(bordering cell)遷移并覆蓋傷口(Dignass等，J.Clin.Invest.，1994年，94，376)；和3)阻止通過傷口進入上皮細胞的血清補體系統(tǒng)成分的沉積(Andoh等，J Immunol.，2001年，167，3887)?；蚯贸∈蟮谋硇驼?，除了它們腸道受損的情況下，此時它們會死于傷口無法愈合。重組TFF3已被建議用于涉及腸易激綜合征和其它腸疾病的治療中(參見，如，美國專利號6,063,755、6,316,218和美國專利申請公開號20010052483)。目前，TFF3的受體還未知。
腸細胞中TFF3的生理效應(yīng)可被認為有利于癌細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。例如，抗凋亡、誘導(dǎo)遷移和保護免于補體激活被認為是使癌細胞逃避生長調(diào)控、侵入周圍正常組織、和轉(zhuǎn)移或逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視的機制。臨床隨訪數(shù)據(jù)顯示TFF3的表達可與胃癌的不良預(yù)后呈現(xiàn)關(guān)聯(lián)(Yamachika等，Clin.Cancer Res.，2002年，8，1092)。
據(jù)報道，其它蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸也可作為癌癥診斷和治療的有效靶標(參見，如，美國專利號6,261,562、6,337,195、6,465,611、6,476,207和美國專利申請公開號20020192699)。本文所述的組合物和方法有助于滿足目前對癌癥和相關(guān)疾病的新的和更有效治療的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給予患有或易患癌癥的哺乳動物治療有效量的TFF3中和劑，其中該TFF3中和劑為反義分子、RNAi分子、核酶或小分子。
在某些實施方式中，所述癌癥為乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌或胃癌。在某些實施方式中，TFF3在所述癌癥的細胞中差異表達。
在某些實施方式中，中和劑為反義分子，該反義分子包含或重疊與SEQ IDNO5-19中任一個序列相對應(yīng)的序列。在某些實施方式中，中和劑為RNAi分子，該RNAi分子包含或重疊與SEQ ID NO5-19中任一個序列相對應(yīng)的序列。在某些實施方式中，中和劑為特異性結(jié)合TFF3的抗體。
本發(fā)明還提供了治療癌癥的方法，該方法包括給予患有或易患癌癥的哺乳動物治療有效量的TFF3中和劑并對該哺乳動物進行常規(guī)的癌癥治療。在某些實施方式中，常規(guī)的癌癥治療為化學(xué)療法。在某些實施方式中，常規(guī)的癌癥治療為激素消融治療(hormone ablation therapy)。在某些實施方式中，該激素為雄性激素。
本發(fā)明還提供了在細胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，該方法包括將該細胞與TFF3中和劑接觸。在某些實施方式中，該細胞為哺乳動物的細胞。在某些實施方式中，該細胞為癌細胞。在某些實施方式中，該細胞為乳腺、前列腺、結(jié)腸、卵巢或胃的細胞。
在其它實施方式中，本發(fā)明還提供了減小腫瘤體積、減緩腫瘤生長或阻止腫瘤生長的方法，該方法包括將該腫瘤與TFF3中和劑接觸。在某些實施方式中，該腫瘤含有TFF3差異表達的細胞。
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)至少一種與細胞中TFF3表達相關(guān)的生理效應(yīng)的方法，該方法包括將所述細胞與TFF3中和劑接觸。在某些實施方式中，該生理效應(yīng)是提高細胞活力或抗凋亡。
本發(fā)明還提供了抑制細胞遷移、黏著或增殖的方法，該方法包括將所述細胞與TFF3中和劑接觸。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了降低癌細胞侵染力的方法，該方法包括將該癌細胞與TFF3中和劑接觸。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)細胞中TFF3表達的方法，該方法包括將該細胞與TFF3中和劑接觸。
在其它實施方式中，本發(fā)明還提供了在生物樣品中檢測TFF3的方法，該方法包括將該樣品與TFF3中和劑接觸并檢測樣品中TFF3與中和劑的結(jié)合。在某些實施方式中，TFF3中和劑包含可檢測的標記。
同樣，本發(fā)明提供了檢測生物樣品中是否存在癌癥的方法，該方法包括將該生物樣品與TFF3中和劑接觸并檢測生物樣品中TFF3差異表達的跡象。有TFF3差異表達的跡象表明癌癥的存在。
在某些實施方式中，該“檢測”包括將接觸的結(jié)果與對照相比較。在某些實施方式中，TFF3中和劑包含可檢測的標記。
本發(fā)明還提供了測定患者對TFF3中和劑的敏感性的方法，該方法包括檢測患者的癌癥樣品中TFF3差異表達的跡象。TFF3差異表達的跡象顯示了患者對TFF3中和劑的敏感性。在某些實施方式中，TFF3差異表達的跡象是患者的癌癥樣品中TFF3的上調(diào)。在某些實施方式中，患者的癌癥樣品來自于乳腺、前列腺、結(jié)腸、卵巢或胃組織。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供了評估患者中癌癥進展的方法，該方法包括將第一時間點時患者中TFF3的表達與第二時間點時患者中TFF3的表達進行比較。第二時間點時TFF3的表達比第一時間點時有所增加表明癌癥有所進展。在某些實施方式中，“增加的TFF3表達”是指增加了至少約25％、至少約50％、至少約75％或至少約90％的表達。
本發(fā)明還提供了檢測患者中增加的癌癥轉(zhuǎn)移風(fēng)險的方法，該方法包括將第一時間點時患者中TFF3的表達與第二時間點時患者中TFF3的表達進行比較。第二時間點時TFF3的表達比第一時間點時有所增加表明癌癥轉(zhuǎn)移風(fēng)險的增加。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)TFF3表達的反義分子。在某些實施方式中，該反義分子包括或重疊SEQ ID NO5-19中的一種序列。在某些實施方式中，該反義分子包括SEQ ID NO5-19中的任一種。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)TFF3表達的RNAi分子。在某些實施方式中，該RNAi分子包括或重疊SEQ ID NO5-19中的一種序列。在某些實施方式中，該RNAi分子包括SEQ ID NO5-19中的任一種。
本發(fā)明還提供了包含反義分子和/或RNAi分子和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
本發(fā)明還提供了分離的抗TFF3抗體，其中該抗體識別對應(yīng)于SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28的至少一個TFF3序列區(qū)域。在某些實施方式中，該抗體通過以下方法產(chǎn)生a)在噬菌體上合成一個抗體庫；b)通過將該噬菌體與組合物接觸來對樣品進行庫的篩選，該組合物包含對應(yīng)于SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28的至少一個TFF3序列區(qū)域；c)分離與組合物結(jié)合的噬菌體，其中該抗體的特征為它具有與對應(yīng)于SEQ IDNO20、21、22、23、24、25、26、27或28的至少一個TFF3序列區(qū)域相結(jié)合的能力，其結(jié)合親和力至少為1081/；和d)分析該分離的噬菌體以確定結(jié)合有對應(yīng)于SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28的至少一個TFF3序列區(qū)域的氨基酸編碼序列。
在某些實施方式中，該抗體為單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人化的抗體(humanized antibody)、單鏈抗體或Fab片段。在某些實施方式中，該抗體是經(jīng)標記的。在某些實施方式中，該標記為酶、放射性同位素或熒光基團。在某些實施方式中，該抗體對除TFF3以外的多肽的結(jié)合親和力低于約1×105Ka。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生本發(fā)明抗體的分離了的細胞和雜交瘤。
本發(fā)明還提供了分離的多肽，該多肽包含三個或以下的選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO13、20、21、22、23、24、25、26、27或28。在某些實施方式中，該多肽的長度為約8-約80個氨基酸。在某些實施方式中，該多肽特異性地與抗TFF3抗體結(jié)合。
本發(fā)明還提供了使用抗體檢測樣品中TFF3差異表達的方法，該方法包括在允許抗體TFF3復(fù)合物(complex)形成的條件下，將本發(fā)明的抗體與所述樣品混合(combining)；測定復(fù)合物的量；和將復(fù)合物的量與對照比較。樣品中復(fù)合物水平的提高表明TFF3的差異表達。
本發(fā)明還提供了分離的、SEQ ID NO1-4多肽的表位攜帶片段(epitope-bearingfragment)。在某些實施方式中，該片段包含SEQ ID NO1-4的約6-約20個的連續(xù)氨基酸。在某些實施方式中，該片段包含SEQ ID NO1-4的約10個的連續(xù)氨基酸。在某些實施方式中，該多肽為SEQ ID NO2。在某些實施方式中，該片段包含SEQID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28。
同時，本發(fā)明還提供了分離的抗TFF3抗體，該抗體是通過用本發(fā)明的表位攜帶片段來免疫某一對象而得到的。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了藥物組合物中的分離的抗體，該藥物組合物含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。在某些實施方式中，該抗體中和TFF3。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生用于治療癌癥的抗體的方法，該方法包括識別結(jié)合并中和TFF3的抗體，并且在重組表達宿主細胞中表達該抗體。
此外，本發(fā)明還提供了藥物組合物，該藥物組合物含有結(jié)合并中和TFF3的抗體和藥學(xué)上可接受的載體，其中該抗體是使用重組宿主細胞產(chǎn)生的。在某些實施方式中，該重組宿主細胞選自下組中國倉鼠卵巢細胞、骨髓瘤細胞和細菌宿主細胞。
附圖簡述

圖1所示為TFF3mRNA在不同的完整組織中的表達差異。
圖2所示為TFF3在不同細胞系中表達水平的差異。
圖3所示為不同的TFF3反義寡核苷酸在減低結(jié)腸癌細胞中TFF3mRNA表達水平方面的不同效力。
圖4所示為TFF3反義寡核苷酸的特異性。
圖5所示為另一TFF3反義寡核苷酸的特異性。
圖6所示為反義寡核苷酸在癌細胞系中降低TFF3mRNA表達的效力。
圖7所示為反義寡核苷酸在結(jié)腸癌細胞中的細胞毒效果和抗增殖效果。
圖8A和8B所示為反義寡核苷酸在前列腺癌細胞中的細胞毒效果和抗增殖效果。
圖9所示為TFF3反義寡核苷酸在正常細胞中的無毒性。
圖10所示為TFF3反義寡核苷酸對軟瓊脂培養(yǎng)基中前列腺癌細胞集落生長的抑制。
圖11所示為使用抗TFF3抗體對細胞增殖的抑制。將從抗TFF3多克隆抗血清中分離出的IgG成分在含有1％FBS的生長培養(yǎng)基中稀釋到終濃度為50微克/毫升，然后在增殖分析的第0天和第4天加入到4個重復(fù)的孔中。在第7天對細胞增殖程度進行評分。
實施方式詳述本發(fā)明特別提供了TFF3中和劑以及使用這些制劑預(yù)防、治療和檢測癌癥的方法。TFF3多肽可在許多癌組織和癌細胞系(例如，與前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和結(jié)腸癌相關(guān)的)中差異表達(例如，在蛋白質(zhì)或mRNA水平上)。如本文所例示，降低TFF3的表達(例如，通過使用基于寡核苷酸的技術(shù))可造成細胞毒性并抑制非貼壁依賴性的生長(anchorage-independent growth)。因此，使用適合的中和劑在細胞中抑制TFF3多肽的活性或降低TFF3多肽或多核苷酸的表達，可有助于預(yù)防或治療以例如表達TFF3為特征的癌癥。在某些實施方式中，該癌組織可差異表達(例如，顯示出上調(diào)或下調(diào))TFF3。
如本文所用，短語“差異表達”通常是指在癌細胞中以較高或較低水平表達的多肽或多核苷酸，例如，當與相同類型的非癌細胞(正常細胞)相比時發(fā)現(xiàn)，癌細胞中的mRNA所存在的差異(例如，更高或更低)為至少約25％、至少約50％約75％、至少約90％、至少約95％、至少約1.5倍、至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、或者至少約50倍或更多。比較可在兩種組織間進行，例如，如果使用的是原位雜交或另一種可以在組織中的不同細胞類型之間表現(xiàn)出某種程度區(qū)別的試驗方法。比較還可在取自其組織來源的細胞間進行。TFF3是一種在結(jié)腸、乳腺、前列腺和其它癌癥中已表現(xiàn)出差異表達的基因。在某些實施方式中，所觀察到的差異表達高于正常表達。用于確定在某些細胞中差異表達的多肽和多核苷酸的方法在美國專利申請公開號20020192699和美國專利號6,476,207中有進一步的描述。癌變前列腺細胞中差異表達的基因產(chǎn)物在美國序列號號10/310,673中有所描述。
如本文所用，術(shù)語“約”是指某一數(shù)值的+/-10％。
TFF3多肽如本文所用，“TFF3”或“TFF3多肽”是指基本上與人三葉因子3(SEQ ID NO1-4，GenBank gi4507453，Q07654，NP003217，AAH17859，BAA95531，BAB13731)同源的蛋白質(zhì)(多肽)或其片段。本發(fā)明考慮的多肽包括那些由所揭示的TFF3多核苷酸(SEQ ID NO5-8，GenBank gi4507452，BC017859，AF432265)編碼的多肽、以及由于遺傳密碼的簡并，而與所揭示的TFF3多核苷酸序列不同的核酸編碼的多肽。因此，本發(fā)明的范圍中包括由具有本文所提供的多核苷酸序列中的任一種序列的多核苷酸所編碼的多肽、或由其變體所編碼的多肽。在某些實施方式中，TFF3包含SEQ ID NO1-4的氨基酸序列。在某些優(yōu)選的實施方式中，TFF3包含SEQ IDNO2的氨基酸序列。
術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，并且是指任何長度的氨基酸聚合形式，其可包括編碼的或非編碼的氨基酸、化學(xué)或生化修飾或衍生的氨基酸、以及具有經(jīng)修飾的肽骨架的多肽。該術(shù)語包括融合蛋白，包括但不限于與異源氨基酸序列形成的融合蛋白、與異源或同源前導(dǎo)序列形成的融合物，該融合物含有或不含有N末端甲硫氨酸殘基；免疫標記蛋白；等。該術(shù)語還包括“肽”，它是長度為2-約30個氨基酸的多肽。多肽可指由所述多核苷酸(例如，TFF3多核苷酸)編碼的全長多肽、由所述多核苷酸所代表的基因編碼的多肽、及其部分或片段。
“多肽”還包括天然存在的蛋白質(zhì)的變體，其中這些變體與天然存在的蛋白質(zhì)同源或基本上相似，并可與天然存在的蛋白質(zhì)(例如，天然表達所述多肽的人、鼠或某些其它物種，通常為哺乳動物物種)具有相同或不同的物種來源。通常，變體TFF3多肽的序列與本文所述的差異表達的多肽序列具有至少約80％，通常至少約90％，更通常為至少約95％，即，96％、97％、98％或99％的序列同一性，這一同一性可用BLAST通過例如，默認參數(shù)(default parameter)進行測定。該變體多肽可經(jīng)天然或非天然糖基化(即，該多肽的糖基化模式不同于在天然存在的相應(yīng)蛋白質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)的糖基化模式)。
本發(fā)明還包含了TFF3多肽的同源物(homolog，或其片段)，其中這些同源物分離自其它物種，這些物種中天然存在的糖基化TFF3可以包括那些由正常細胞和腫瘤細胞產(chǎn)生的糖基化TFF3，它們可能顯示出不同的糖基化模式，即，存在這種同源物的其它動物或植物種類，通常為哺乳動物物種，如嚙齒類，例如小鼠、大鼠；家畜，如馬、牛、狗、貓；以及人類。“同源物”用來表示與上文所定義的具體蛋白質(zhì)具有至少約35％，通常至少約40％，更通常至少約60％氨基酸序列同一性的多肽，其中序列同一性是用BLAST算法(algorithm)利用例如默認參數(shù)進行測定的。
通常而言，本發(fā)明主題的TFF3多肽提供于非天然存在的環(huán)境，例如，分離自它們天然存在的環(huán)境。在某些實施方式中，該主題蛋白質(zhì)存在于富含該蛋白質(zhì)(與對照相比較)的組合物中。同樣地，提供了純化的多肽，其中“純化的”是指該蛋白質(zhì)存在于基本上不含其它多肽的組合物中，其中“基本上不含”是指該組合物的組成中含有少于約90％，通常少于約60％，或更通常少于50％的其它多肽。
變體也同樣包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)；多肽的變體包括突變體、片段和融合物。突變體可包含氨基酸替代、添加或缺失。該氨基酸替代可為保守的氨基酸替代或去除非基本氨基酸的替代，例如，用于改變糖基化位點、磷酸化位點或乙酰化位點、或通過一個或多個對功能并非必需的半胱氨酸殘基的替代或缺失使錯誤折疊(misfolding)最小化。保守的氨基酸替代是那些保留了被替代氨基酸的總電荷、疏水性/親水性、和/或空間體積的替代?？梢栽O(shè)計變體以保留或增強蛋白質(zhì)特定區(qū)域的生物學(xué)活性(例如，功能結(jié)構(gòu)域和/或，如果該多肽是蛋白質(zhì)家族的一員，其與一致序列相關(guān)的區(qū)域)。用于產(chǎn)生變體的氨基酸改變的選擇可基于該氨基酸的可親性(accessibility，內(nèi)部對于外部)(參見，例如，Go等，Int.J.Peptide Protein Res.1980，15211)、該變體多肽的熱穩(wěn)定性(參見，如，Querol等，Prot.Eng.1996，9265，該文獻以其全文納入本文作為參考)、所需的糖基化位點(參見，如，Olsen和Thomsen，J Gen.Microbiol.1991，137579)、所需的二硫橋(參見，例如，Clarke等，Biochemistry，1993，324322；和Wakarchuk等，Protain Eng.1994，71379)、所需的金屬結(jié)合位點(參見，例如，Toma等，Biochemistry，1991，3097，和Haezerbrouck等，Protein Eng.1993，6643)以及所需的在脯氨酸環(huán)(proline loop)中的替代(參見，例如，Masul等，Appl.Env.Microbiol.，1994，603579，該文獻以其全文納入本文作為參考)。去除所有半胱氨酸的突變蛋白(cysteine-depleted mutein)可用美國專利號4,959,314中所揭示的方法產(chǎn)生，該文獻以其全文納入本文作為參考。
變體還可包括本文所揭示的多肽的片段，尤其是生物學(xué)活性片段和/或與功能結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的片段。感興趣的片段將通常為至少約10氨基酸-至少約15氨基酸的長度，至少約50氨基酸的長度，也可為長達300氨基酸或更長，且在某些實施方式中，其長度不超過約1000氨基酸，其中該片段含有一段延伸的氨基酸，該段氨基酸與由具有本文所提供的任一多核苷酸序列的多核苷酸所編碼的多肽或其變體相同。本文所述的蛋白質(zhì)變體是由本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸所編碼的。該遺傳密碼可用于選擇適當?shù)拿艽a子以構(gòu)建相應(yīng)的變體。具體而言，片段可包括那些含有TFF3蛋白特有區(qū)域或表位的片段。
TFF3多核苷酸在本發(fā)明的某些實施方式中，本發(fā)明涉及對某些癌癥中差異表達的編碼TFF3的TFF3多核苷酸的抑制或檢測，例如，前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌或結(jié)腸癌。在某些實施方式中，TFF3由具有SEQ ID NO5-8核苷酸序列的核酸編碼。在某些優(yōu)選的實施方式中，TFF3由具有SEQ ID NO7的核苷酸序列的核酸編碼。
本發(fā)明的范圍中關(guān)于本文所述的方法中有用的多核苷酸組合物包括但不限于，具有本文所提供的多核苷酸序列中的任何一種序列的多核苷酸(例如，SEQ IDNO2)；通過嚴格條件下(尤其是在高度嚴格的條件下)的雜交，獲自本文所描述的生物材料或其它生物來源(尤其是人源的)的多核苷酸；對應(yīng)于所提供的多核苷酸的基因；所提供多核苷酸的變體和它們的相應(yīng)基因，尤其是保留了編碼基因產(chǎn)物生物學(xué)活性的那些變體(例如，由于基因產(chǎn)物歸屬于某一或某些蛋白質(zhì)家族和/或基于基因產(chǎn)物中所存在的功能結(jié)構(gòu)域的識別，而認為該對應(yīng)于所提供多核苷酸的基因產(chǎn)物具有的生物學(xué)活性)。在提供了本文的揭示后，本發(fā)明所預(yù)期或在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它核酸組合物對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將是很顯而易見的了。除非特別說明，本文用于組合物核酸的“多核苷酸”和“核酸”并不打算對核酸的長度或結(jié)構(gòu)加以限定。
TFF3多核苷酸可在人癌組織中表達，例如，人前列腺、乳腺和結(jié)腸組織。本文所述的尤為感興趣的核酸組合物含有本文所提供的多核苷酸序列中的任一序列或其識別序列?！白R別序列”(identifying sequence)是殘基的毗連(contiguous)序列，其在長度上至少為約10-約20nt，通常長度至少為約50-約100nt，它專一地識別某一多核苷酸序列，如，與任何毗連的大于約20nt的核苷酸序列具有少于90％，通常為少于約80％-約85％的序列同一性。因此，主題核酸組合物包括包含某一毗連核苷酸識別序列的全長eDNA或mRNA，該毗連核苷酸來自于任一本文所提供的多核苷酸序列。
在本文所描述方法中有用的多核苷酸還包括與天然TFF3 DNA具有序列相似性或序列同一性的多核苷酸。其包括相關(guān)的5′和3′非翻譯序列、啟動子和增強子序列以及正義或反義方向的序列。具有序列相似性的核酸可通過在低嚴格條件下的雜交來檢測，例如，在50℃和10×SSC(0.9M鹽水/0.09M檸檬酸鈉)并在55℃下用1×SSC洗滌時仍保持結(jié)合。序列的同一性可通過在嚴格條件下的雜交來檢測，例如，在50℃或更高溫度下，以及0.1×SSC(9mM鹽水/0.9mM檸檬酸鈉)。雜交的方法和條件在本領(lǐng)域中是眾所周知的，參見，例如，美國專利號5,707,829。與所提供的多核苷酸序列基本上相同的核酸(如等位變體(allelic variant)、基因的遺傳改變形式等)在嚴格雜交條件下與所提供的多核苷酸序列結(jié)合。通過使用探針(即經(jīng)特殊標記的DNA序列的探針)，可分離同源的或相關(guān)的基因。同源基因的來源可為任何物種，如靈長類，尤其是人類；嚙齒類，例如，大鼠和小鼠；犬類、貓類、牛、綿羊、馬、酵母、線蟲等。
在某一實施方式中，使用了本文所提供的多核苷酸序列中至少一種的至少15nt毗連核苷酸進行雜交。即，當使用所揭示的多核苷酸序列之一的至少15個毗連核苷酸作為探針時，該探針將優(yōu)選與含有互補序列的核酸雜交，從而使得與所選擇的探針特異性雜交的核酸得到鑒別和回收。如果來自于多于一種本文所提供的多核苷酸序列的探針的來源cDNA對應(yīng)同一mRNA，那么它們就可與同一核酸雜交?？墒褂枚嘤?5nt的探針，如，大小在約18nt、25nt、50nt、75nt或100nt范圍內(nèi)的探針，但通常約15nt的探針足夠代表特異性識別的序列。
本發(fā)明構(gòu)思中的多核苷酸還包括核苷酸序列的天然存在的變體(例如，簡并變體、等位變體等)。本發(fā)明構(gòu)思中的多核苷酸變體是通過將該推定的變體與本文所揭示的核苷酸序列雜交來鑒定的，優(yōu)選在嚴格條件下進行雜交。例如，通過使用適當?shù)南礈鞐l件，可鑒定出本文所述多核苷酸的變體，該等位變體相對于選擇的多核苷酸探針最多顯示出約25-30％堿基對(bp)的誤配。通常而言，等位變體含有約15-約25％bp的誤配，也可含有少至甚至約5-15％，或約2-5％，或約1-2％bp的誤配，以及單個bp的誤配。
本發(fā)明還包含對應(yīng)于本文所提供的TFF3多核苷酸序列的同源物，其中該同源基因的來源可為任何哺乳動物物種，如，靈長類，尤其是人類；嚙齒類，例如大鼠；犬類、貓類、牛、綿羊、馬、酵母、線蟲等。在哺乳動物物種(例如，人類和小鼠)之間，同源物通常與TFF3基因或其部分具有基本的序列相似性，例如，核苷酸序列間至少75％的序列同一性、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。序列相似性是基于參比序列來計算的，該參比序列可位較大序列的子集，較佳為胞外編碼序列，如，作為保守的基序、編碼區(qū)的部分、側(cè)翼區(qū)(flanking region)等。參比序列的長度通常為至少約18個毗連的核苷酸，更通常為至少約30個核苷酸長度，且可延伸至進行對比的完整序列。序列分析的算法在本領(lǐng)域中是已知的，例如使用默認參數(shù)的缺口BLAST(gapped BLAST，在Altschul等，Nucleic Acids Res.1997年，253389-3402中有所描述)。
通常而言，本文所述的TFF3多核苷酸的變體所具的序列同一性大于至少約65％，優(yōu)選至少約75％，更優(yōu)選至少約85％，也可大于至少約90％、95％、96％、98％、99％或更高，該同一性通過在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中執(zhí)行的Smith-Waterman同源搜索算法(homology search algorithm)進行測定。同一性百分比計算方法的一個例子是Smith-Waterman算法，使用如下所述在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中執(zhí)行Smith-Waterman同源搜索算法所測得的整體DNA序列同一性大于65％，在該算法中使用了具下列搜索參數(shù)的精確缺口搜索缺口開放罰分為12；缺口延伸罰分為1。
主題核酸可為cDNA或基因組DNA，也可為其片段，尤其是編碼生物學(xué)活性基因產(chǎn)物和/或在本文所揭示的方法中有用的片段(例如，在診斷中，作為感興趣的差異表達基因的特異性標志等)。本文所用的術(shù)語“cDNA”將包括與天然成熟mRNA種類中的序列元件排列相同的所有核酸，其中序列元件為外顯子和3′及5′非編碼區(qū)。通常，mRNA種類具有毗連的外顯子，其間具有插入的內(nèi)含子，內(nèi)含子存在的話，其在表達時被核RNA剪接去除，從而產(chǎn)生編碼某一多肽的連續(xù)開放閱讀框。mRNA種類也可同時含有外顯子和內(nèi)含子而存在，其中內(nèi)含子可經(jīng)可變剪接(alternativesplicing)被去除。此外，還應(yīng)注意的是，由同一基因組序列編碼的不同種類的mRNA可在細胞中以不同的水平存在，且檢測這些mRNA種類的不同水平可預(yù)示細胞中編碼的基因產(chǎn)物的差異表達。
感興趣的基因組序列包括在起始密碼子和終止密碼子間存在的核酸(如所列序列中所定義)，包括通常存在于天然染色體中的所有內(nèi)含子。它還可包括在成熟mRNA中存在的3′和5′非翻譯區(qū)。它還可包括具體的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，如啟動子、增強子等，在轉(zhuǎn)錄區(qū)的5′或3′端包括約1kb(但可為更長)的側(cè)翼基因組DNA。該基因組DNA可作為100kbp或更小的片段被分離；且基本上不含側(cè)翼染色體序列。側(cè)接編碼區(qū)、3′或5′、或有時在內(nèi)含子中存在的內(nèi)含調(diào)控序列的基因組DNA，含有適當組織、階段特異性或疾病狀態(tài)特異性表達所需的序列。
本發(fā)明主題的核酸可編碼全部或部分的主題TFF3多肽，或可包括非編碼序列(例如，來自基因的5′或3′非編碼區(qū))。如本文所指出的，這些DNA或RNA可為正義或反義方向。根據(jù)常規(guī)方法進行化學(xué)合成寡核苷酸、通過限制性酶切、PCR擴增等，可從DNA序列獲得雙鏈或單鏈片段。本發(fā)明構(gòu)思中的分離的多核苷酸和多核苷酸片段包含選自本文提供的多核苷酸中的至少約10、約15、約20、約35、約50、約100、約150-約200、約250-約300、或約350個毗連的核苷酸。就大部分而言，片段的長度將為至少15nt，通常為至少18nt或25nt，和高達至少約50毗連nt或更多。在某些實施方式中，多核苷酸分子包括選自本文所提供的多核苷酸序列中的任一序列的至少12nt的毗連序列。
TFF3多核苷酸特異性的寡核苷酸探針可用本文所揭示的TFF3多核苷酸序列來產(chǎn)生。該探針優(yōu)選至少約12nt、15nt、16nt、18nt、20nt、22nt、24nt或25nt的片段，該片段為本文提供的任一多核苷酸序列相應(yīng)的毗連序列的片段，且長度可為小于2kb、1kb、0.5kb、0.1kb或0.05kb。該探針可為化學(xué)合成或可為使用限制性酶從較長多核苷酸中產(chǎn)生。該探針可用例如，放射性、生物素化的或熒光標記進行標記。優(yōu)選的是，探針的設(shè)計基于任一本文所提供的多核苷酸序列的識別序列。更優(yōu)選的是，探針的設(shè)計基于任一主題多核苷酸的毗連序列，在對該序列應(yīng)用掩蔽低復(fù)雜性的掩蔽程序(masking program)(例如，XBLAST)后，該序列仍保持未掩蔽，即可以選擇未掩蔽區(qū)，該未掩蔽區(qū)由經(jīng)掩蔽程序產(chǎn)生的掩蔽序列的多聚n延伸外的多核苷酸所顯示。
主題發(fā)明的TFF3多核苷酸可經(jīng)分離并以基本純凈的形式獲得，通常以不同于完整染色體的形式獲得。通常，可獲得基本上不含其它天然存在的核酸序列的多核苷酸(不論是DNA或RNA)，其純度通常為至少約50％，通常至少約90％，且通常為“重組”的，例如，用一個或多個在天然存在的染色體中通常并不與之連接的核苷酸側(cè)接。
本文所述的TFF3多核苷酸可作為線性分子或在環(huán)狀分子中提供，并可在自主復(fù)制分子(載體)中或在不含復(fù)制序列的分子中提供。該多核苷酸的表達可通過它們本身的或通過本領(lǐng)域所知的其它調(diào)控序列進行調(diào)控?？赏ㄟ^使用本領(lǐng)域中多種可用的技術(shù)將該多核苷酸導(dǎo)入到合適的宿主細胞中，這些技術(shù)為例如，鐵傳遞蛋白聚陽離子介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、用裸核酸或包裹的核酸進行的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、DNA包被的乳膠顆粒(latex bead)的胞內(nèi)運輸、原生質(zhì)體融合、病毒感染、電穿孔、基因槍、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等。
本文所描述的核酸組合物可用于例如，產(chǎn)生多肽(其可用于獲得抗TFF3抗體)；作為檢測生物樣品(例如，人細胞提取物)中mRNA的探針以產(chǎn)生該多核苷酸的更多拷貝、用來產(chǎn)生核酶或反義寡核苷酸；以及作為單鏈DNA探針或作為形成三鏈的寡核苷酸。本文所描述的探針可用于，例如，測定樣品中本文提供的任一多核苷酸或其變體的存在與否。這些和其它用途在下文中有進一步的描述。
本文所用的術(shù)語“重疊”(overlap)是指由多于一個多核苷酸或寡核苷酸共享的序列區(qū)。例如，重疊另一寡核苷酸的某一寡核苷酸具有與另一寡核苷酸中某一序列區(qū)基本上對應(yīng)的序列區(qū)。在某些實施方式中，重疊可為至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約50、至少約100、或更長的核苷酸長度。
中和劑本發(fā)明的方法和制品制造中使用或混合了在細胞中調(diào)控TFF3活性或表達的TFF3中和劑。如本文所用，術(shù)語“調(diào)控”是指基因、蛋白質(zhì)或細胞內(nèi)、細胞外或細胞表面上的任何分子的質(zhì)或量的變化。此變化可為表達中或分子水平的上調(diào)或下調(diào)。術(shù)語“調(diào)控”還包括生物功能/活性的質(zhì)或量的改變，這些生物功能/活性為例如，增殖、分泌、黏附、凋亡、細胞-細胞信號傳遞等。在某些實施方式中，活性或表達的調(diào)控可為大于約10％、大于約20％、大于約30％、大于約40％或大于約50％。
本文包含了多種中和劑，如小分子、肽、抗體、反義分子、核酶、RNAi分子等。
小分子中和劑可含有任選地與細胞毒劑(例如本文所述的那些)融合或接合的小分子?？珊Y選出抗TFF3或TFF3表達細胞的小分子庫以鑒別出與該抗原結(jié)合的小分子。根據(jù)眾所周知的方法，還可對該小分子的拮抗或中和特性進行篩選和/或?qū)⑿》肿优c細胞毒劑接合。
肽中和劑也可為通過合理設(shè)計或通過噬菌體表達(參見，例如，W098/35036)而產(chǎn)生的肽。在某一實施方式中，選擇的分子可為基于抗體的CDR設(shè)計的“CDR擬似物”或抗體類似物。雖然此類肽可尤其自身進行拮抗，但是可以任選地將該肽與細胞毒劑融合，從而增加或促進該肽的拮抗特性。肽可含有2-約20、2-約15、或2-約10個氨基酸。
反義寡核苷酸在某些環(huán)境下，可能需要調(diào)控(例如，下調(diào))細胞中TFF3的表達量。因此，在本發(fā)明的另一方面中，可制備出TFF3反義寡核苷酸，并采用某種方法降低細胞對TFF3的表達水平，該方法包括施用一個或多個TFF3反義寡核苷酸。短語“TFF3反義寡核苷酸”指的是含有通過堿基對與涉及TFF3表達的互補核酸序列進行相互作用的核酸序列的寡核苷酸，通過該相互作用使得TFF3表達下調(diào)。優(yōu)選的是，涉及TFF3表達的特異性核酸序列是編碼TFF3的基因組DNA分子或mRNA分子。該基因組DNA分子可包含TFF3基因的調(diào)控區(qū)、和/或成熟TFF3蛋白的編碼序列。
在描述TFF3反義寡核苷酸及其方法時使用的術(shù)語“互補”是指與這一序列充分互補從而允許細胞中與該序列的雜交，即，在生理條件下。該TFF3反義寡核苷酸優(yōu)選含有包含了8-約100核苷酸的序列，更優(yōu)選該反義寡核苷酸包含約15-約30核苷酸或約18-約26核苷酸。
TFF3反義寡核苷酸還可含有多種修飾，這些修飾賦予其對核降解(nucleolyticdegradation)的抗性，例如，經(jīng)修飾的核苷間鏈接[Uhlmann和Peyman，ChemicalReviews 90543-548(1990)；Schneider和Banner，Tetrahedron Lett。31335，(1990)]、經(jīng)修飾的核酸堿基(如5,958,773和其中提及的專利中所揭示)、和/或糖等。下文提供了對修飾的寡核苷酸的進一步描述。
本發(fā)明的范圍包括了本領(lǐng)域已知的廣泛應(yīng)用于反義技術(shù)的反義分子的修飾或改變。這些修飾包括含磷連接的制備(如美國專利5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050和5,958,773中所揭示的)。下文中提供了對修飾的寡核苷酸的進一步描述。
本發(fā)明的反義化合物可包括修飾的堿基。本發(fā)明的反義寡核苷酸也可通過將該寡核苷酸與一個或多個部分或接合物進行化學(xué)連接而修飾，從而促進該反義寡核苷酸的活性、細胞分布、或細胞攝取。該部分或接合物包括脂類，例如，膽固醇、膽汁酸、硫醚、脂肪鏈、磷脂、聚胺、聚乙二醇(PEG)、軟酯酰部分以及其它在例如美國專利5,514,758、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,597,696和5,958,773中所描述的部分或接合物。下文中提供了對修飾堿基和反義寡核苷酸接合物的進一步描述。
在反義領(lǐng)域中，可進行某一程度的常規(guī)試驗來根據(jù)具體的靶標選擇最佳的反義分子。在其設(shè)計中，反義分子可以靶向靶標RNA分子的易接近或暴露的部分。通過mRNA的反轉(zhuǎn)錄并分析cDNA的水平，可在經(jīng)處理和控制的細胞中常規(guī)檢測細胞中mRNA的水平?？梢杂帽绢I(lǐng)域所知的測定細胞生長或活力的方法常規(guī)檢測生物學(xué)效應(yīng)。
通過測試和分析cDNA水平來測定反義活性的專一性是本領(lǐng)域公認的確認反義結(jié)果的方法。例如，來自經(jīng)處理和控制細胞的RNA可經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，并對所得cDNA群進行分析。(Branch，A.D.，T.I.B.S 2345-50(1998))。
本發(fā)明的反義分子包括與TFF3多核苷酸的區(qū)域或部分互補的寡核苷酸，如，具有SEQ ID NO5-8的核苷酸序列的核酸?？蓡为毣蚵?lián)合降低細胞中TFF3表達的某些示例性的反義寡核苷酸包括那些具有下表1所示序列的反義寡核苷酸或其片段。
表1示例TFF3反義寡核苷酸
反義分子的特異性和敏感性已被本領(lǐng)域的技術(shù)人員用于治療用途中。反義寡核苷酸已經(jīng)作為治療性部分而用在動物和人的病狀治療中。反義寡核苷酸已被安全而有效地施用于人類，且許多臨床試驗?zāi)壳罢谶M行中。從而可以確定，寡核苷酸可以作為有效的治療形態(tài)而應(yīng)用于處理細胞、組織和哺乳動物(包括人類)的療法中。
本發(fā)明中有用的反義化合物的某些例子包括含有經(jīng)修飾的骨架或非天然核苷內(nèi)連接的寡核苷酸。具有經(jīng)修飾的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些寡核苷酸和在骨架中不具有磷原子的那些寡核苷酸。出于本說明書的目的，以及有時作為本領(lǐng)域中的參考，在其核苷骨架中不含有磷原子的經(jīng)修飾的寡核苷酸也可被認為是寡核苷酸。
經(jīng)修飾的寡核苷酸骨架的例子包括例如，具有正常3′-5′連接的硼烷-磷酸鹽、硫代磷酸鹽(phosphorothioate)、手性硫代磷酸鹽、二硫代磷酸鹽、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸鹽，包括3′-烯烴基磷酸鹽和手性膦酸鹽、磷酸鹽、氨基磷酸酯包括3′-氨基磷酸酯和氨基烷基磷酸酯、硫逐氨基磷酸鹽、硫逐-烷基磷酸鹽、硫逐烷基磷酸三酯、及它們的2′-5′連接擬似物，以及那些具有反極性的骨架，其中核苷單元的相鄰連接對為3′-5′到5′-3′或2′-5′到5′-2′連接。還包括各種鹽、混合的鹽和游離酸形式。
講授上述含磷連接的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
某些示例性的經(jīng)修飾的不含有磷原子的寡核苷酸骨架具有由下述結(jié)構(gòu)形成的骨架短鏈烷基或環(huán)烷基核苷內(nèi)連接、混有雜原子和烷基或環(huán)烷基的核苷內(nèi)連接、或一種或多種短鏈雜原子的或雜環(huán)的核苷內(nèi)連接。此類包括那些具有嗎啉代連接(部分由核苷的糖基部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、硫氧化物和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；methylene formacetyl和thioformacetyl骨架；含鏈烯的骨架；氨基磺酸鹽骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼骨架；磺酸鹽和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其它具有混合的N、O、S和CH2組成的部分。
講授上述寡核苷酸的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。
在其它寡核苷酸擬似物中，核苷酸單元的糖基和核苷內(nèi)連接(即，骨架)被新的基團替代?？杀Ａ魤A基單元以供與適當?shù)暮怂岚袠嘶衔镫s交。如此的寡聚化合物，即顯示出具有良好雜交特性的寡核苷酸擬似物，被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖基骨架被含酰胺的骨架(尤其是氨乙基甘氨酸骨架)替代。該核堿基被保留并直接或間接與骨架中酰胺部分的氮雜(aza)氮原子結(jié)合。講授上述PNA化合物的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5,539,082；5,714,331；and5,719,262，各專利在此引入作為參考。關(guān)于PNA化合物的進一步講授可在Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500中找到。
在本發(fā)明的其它實施方式中的是具有硫代磷酸鹽骨架的寡核苷酸和具有雜原子骨架的寡核苷酸，例如在美國專利號5,489,677和美國專利號5,602,240中所提供的。還提供的是具有上文參考的美國專利號5,034,506中的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。
經(jīng)修飾的寡核苷酸還可包括單取代或多取代的糖基部分。例如，寡核苷酸可在2′位含有下述基團之一OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-鏈烯基；O-、S-或N-鏈炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、鏈烯基和鏈炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10鏈烯基和鏈炔基。還可在寡核苷酸的其它位點進行類似的修飾，尤其是在3′末端核苷酸或在2′-5′連接的寡核苷酸的糖基的3′位，和在5′末端核苷酸的5′位。寡核苷酸還可含有糖基擬似物，例如用環(huán)丁基部分替代呋喃戊糖。講授上述經(jīng)修飾的糖基結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，它們各自以其全文納入本文作為參考。
寡核苷酸還可包括核堿基(在本領(lǐng)域中通常被簡稱為“堿基”)的修飾或替代。如本文所用，“未經(jīng)修飾的”或“天然的”核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。經(jīng)修飾的核堿基包括其它合成和天然的核堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙烯基尿嘧啶(5-propynyl uracil)和胞嘧啶、6-氮雜尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代尤其是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine)和8-氮腺嘌呤(8-azaadenine)、7-去氮鳥嘌呤(deazaguanine)和7-去氮腺嘌呤(deazaadenine)以及3-去氮鳥嘌呤和3-去氮腺嘌呤。講授上述某些經(jīng)修飾的核堿基以及其它經(jīng)修飾的核堿基的制備的代表性美國專利包括但不限于上文所述的美國專利號3,687,808，以及美國專利號4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941和5,750,692，它們各自以其全文納入本文作為參考。
本發(fā)明的寡核苷酸的其它修飾涉及將該寡核苷酸與可促進其活性、細胞分布或細胞攝取的一個或多個部分或接合物化學(xué)連接。這些部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽汁酸、硫醚如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代膽固醇、脂肪鏈如月桂烷二醇或十一烷基殘基、磷脂如二-十六烷基-rac-甘油或1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-磷酸三乙基-銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、軟脂酰部分、或十八烷基胺或己基氨基-羧基-氧膽固醇部分。講授這些寡核苷酸接合物的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，它們各自納入本文作為參考。
并不需要對給出的化合物的所有位點一律進行修飾，而事實上在單個化合物或甚至在寡核苷酸中的單個核苷中，可整合多于一種的上文所述修飾。
本發(fā)明還包括是嵌合化合物的反義化合物。在本發(fā)明背景中，“嵌合的”反義化合物或“嵌合體”是反義化合物，尤其是寡核苷酸，其含有2個或多個化學(xué)獨立區(qū)(chemically distinct regions)，每個區(qū)域由至少一個單體單元組成，即，在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸。這些寡核苷酸通常含有至少一個區(qū)域，在該區(qū)域中寡核苷酸經(jīng)修飾從而使該寡核苷酸抗核酶降解的抗性增強、細胞攝取增強、和/或與靶標核酸的結(jié)合親和力增強。該寡核苷酸的其它區(qū)域可作為酶的底物，該酶具有解離RNADNA或RNARNA雜交鏈的能力。作為例子，RNase H是細胞的核酸內(nèi)切酶，它可解離RNADNA雙鏈中的RNA鏈。因此，RNaseH的活化，導(dǎo)致了RNA靶標的切割，從而極大促進了寡核苷酸抑制基因表達的效果。因此，在使用嵌合的寡核苷酸時，較短寡核苷酸與靶標區(qū)域的雜交效果可與硫代磷酸鹽脫氧寡核苷酸與同一靶標區(qū)域的雜交效果相媲美。RNA靶標的切割可用凝膠電泳進行常規(guī)檢測，且若需要的話，用本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)(nucleic acid hybridizationtechnique)進行常規(guī)檢測。
本發(fā)明的嵌合反義化合物可作為2個或多個上文所述的寡核苷酸、經(jīng)修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸擬似物的組合結(jié)構(gòu)形成。這些化合物也已在本領(lǐng)域中被稱為雜合物(hybrid)或間隔體(gapmer)。講授這些雜交結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，它們各自以其全文納入本文作為參考。
根據(jù)本發(fā)明使用的反義化合物可用本領(lǐng)域眾所周知的固相合成技術(shù)方便和常規(guī)地制備。這一合成所需的設(shè)備由多家賣方出售，包括例如，Applied Biosystems(Foster City，加利福尼亞)。用于這一合成的本領(lǐng)域所知的任何其它方法可附加或替換使用。眾所周知可使用類似的技術(shù)制備寡核苷酸，例如，硫代磷酸鹽和烷基化衍生物。
本發(fā)明的反義化合物可在體外合成。本發(fā)明的化合物也可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物(例如，脂質(zhì)體、受體靶向的分子、口服、直腸給藥、局部給藥或其它制劑)相混合、包裹、結(jié)合或聯(lián)用，以協(xié)助攝取、分布和/或吸收。講授這些攝取、分布和/或吸收協(xié)助制劑的制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，它們各自納入本文作為參考。
本發(fā)明的反義化合物還包括任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯或這些酯的鹽，或在給予動物(包括人類)后能提供(直接或間接)生物學(xué)活性代謝物或其殘余物的任何其它化合物。因此，例如，所揭示的還包括本發(fā)明反義化合物的前藥和藥學(xué)上可接受的鹽、這些前藥的藥學(xué)上可接受的鹽以及其它生物等效物。
本發(fā)明的反義化合物可用于診斷、治療、預(yù)防以及作為研究試劑和試劑盒。用于治療，可以給疑似患有(可用調(diào)控TFF3表達來治療的)疾病或病癥的動物(尤其是人)施用本發(fā)明的反義化合物來進行治療?？赏ㄟ^將有效量的反義化合物加入到合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中而將本發(fā)明的化合物用在藥學(xué)組合物中。使用本發(fā)明的反義化合物和方法也可有效用于預(yù)防中，例如，預(yù)防或延遲腫瘤的形成或轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的反義化合物可有效用于研究和診斷，這是由于這些化合物可與編碼TFF3的核酸雜交，從而可以方便地建立三明治和其它分析來進行分析。本發(fā)明的反義寡核苷酸和TFF3編碼核酸的雜交可通過本領(lǐng)域已知的方法進行檢測。這些方法可包括將酶與該寡核苷酸結(jié)合、用同位素標記該寡核苷酸或其它任何適合的檢測方法。也可制備出使用這些檢測方法來檢測樣品中TFF3水平的試劑盒。
本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的反義化合物的藥學(xué)組合物和制劑。在某些實施方式中，含有反義分子的組合物可作為乳劑制備和配方。乳劑通常為一種液體以液滴的形式分散于另一種液體中而形成的非均質(zhì)體系，該液滴的直徑通常超過0.1微米。乳劑通常為二相體系，它含有兩種密切混合且彼此分散的不相溶的液相。通常而言，乳劑可為油包水(w/o)或水包油(o/w)類。當一種水相很好地分散開并作為微小液滴分散入大量的油相中時，所得的組合物稱為油包水(w/o)乳劑。相反，當一種油相很好地分散開并作為微小液滴分散入大量的水相中時，所得的組合物稱為水包油(o/w)乳劑。乳劑中除了分散相和活性藥物以外還可含有其它成分，而活性藥物可作為在水相或油相中的溶液或自身作為分散相存在。藥學(xué)上的賦形劑如，乳化劑、穩(wěn)定劑、染料和抗氧化劑也可根據(jù)需要在乳劑中存在。藥物乳劑也可為復(fù)合乳劑，其含有多于2相，例如，油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳劑的情況。這些復(fù)合制劑常能提供單一二元乳劑所不具有的某些優(yōu)點。o/w乳劑的單個油滴包裹小水滴形成的復(fù)合乳劑構(gòu)成了w/o/w乳劑。同樣，穩(wěn)定位于油連續(xù)相中的水滴包裹油滴體系形成了o/w/o乳劑。
在另一相關(guān)的實施方式中，本發(fā)明的方法和組合物可含有一種或多種反義分子，尤其是靶向第一核酸的寡核苷酸和一種或多種靶向第二核酸靶標的其它反義化合物。兩種或多種聯(lián)用化合物可同時使用或順序使用。在某些實施方式中，至少一種靶標核酸編碼TFF3。
核酶中和劑也可為例如，抑制TFF3表達的核酶。核酶通常為具有核糖活性(ribonucleic activity)的催化性RNA分子，它們能夠清除與之具有互補區(qū)域的單鏈核酸(如mRNA)。由于核酶是一種酶，單個核酶分子可切割許多靶標RNA的分子。此外，核酶通常為高度專一性的抑制劑，其抑制的專一性既取決于其與靶標RNA結(jié)合的堿基配對機制，也取決于靶標RNA的切割機制。設(shè)計用來催化切割靶標基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子也可用于防止靶標基因mRNA的翻譯，并從而防止靶標基因產(chǎn)物的表達。(參見，如，WO90/11364和Sarver等，1990，Science 247，1222-1225)。
核酶可設(shè)計用于與靶標RNA中的不同位點進行退火。該結(jié)合臂可與靶位點互補，例如，TFF3多核苷酸。核酶可化學(xué)合成。示例性的合成方法可根據(jù)Usman等，1987，J.Am.Chem.Soc.，109，7845-7854和Scaringe等，1990，Nucleic Acids Res.，18，5433-5441中所述的普通RNA合成的過程進行，并可使用普通的核酸保護和耦合基團，例如在5′-末端加上二甲氧基三苯甲基，和在3′-末端加上氨基磷酸酯。平均逐步耦合產(chǎn)率可為＞98％。發(fā)卡狀核酶也可以分兩部分合成并退火以重構(gòu)成活性核酶(Chowrira和Burke，1992，Nucleic Acids Res.，20，2835-2840)。核酶通過核酶抗性基團(例如，2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-o-甲基、2′-H)的修飾后，可提高穩(wěn)定性(參見，如，Usman和Gedergren，1992，TIBS 17，34，該文獻被納入本文作為參考)。
核酶可用本領(lǐng)域所知的方法進行純化，如凝膠電泳或高壓液相色譜法(HPLC)。
核酶活性可通過對化學(xué)合成的核酶進行修飾來優(yōu)化，該修飾可防止它們被血清核糖核酸酶降解(參見，例如，Eckstein等，WO92/07065；Perrault等，Nature，1990，344565；Pieken等，Science，1991，253314；Usman和Cedergren，Trendsin Biochem.Sci.1992，17334；Usman等，WO93/15187；和Rossi等.，WO91/03162和美國專利號5,652,094，各文獻被納入本文作為參考，它們描述了各種可用于催化性RNA分子糖基部分的化學(xué)修飾。
因此，核酶(例如，發(fā)卡狀、錘頭狀或RNAase P核酶，以及最小酶(minizyme)(McCall，M.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895710-5714)、或其它催化性RNA分子)可用于催化清除TFF3轉(zhuǎn)錄物從而抑制TFF3mRNA的翻譯。對TFF3具有特異性的核酶的設(shè)計可基于TFF3的核苷酸序列，如，本文所提供的人TFF3DNA序列或相關(guān)的多核苷酸。合成核酶的技術(shù)在Cech等，美國專利4,987,071和5,116,742中有所揭示。另外，TFF3mRNA可用于從眾多RNA分子中選擇具有特異性核糖核酸活性的催化性RNA(參見，如，Bartel和Stostak，J.W.，J.Biol.Chem.12611411-1418(1993))。
或者，可用如下方法抑制TFF3的表達，即靶向與TFF3調(diào)控區(qū)(啟動子、增強子)互補的核苷酸序列，以形成三螺旋結(jié)構(gòu)從而防止靶細胞中的轉(zhuǎn)錄。(參見，如，Helene等，Annal.NYAcad Sci.66027-36(1992))。
根據(jù)某些實施方式，中和劑為錘頭狀核酶。錘頭狀核酶被確信為可在由側(cè)翼區(qū)指導(dǎo)的位置，通過與靶mRNA形成互補堿基對，從而切割mRNA。使用錘頭狀核酶的一個特性是靶mRNA具有下述的二堿基序列5′-UG-3′。錘頭狀核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并在Myers，1995，分子生物學(xué)和生物技術(shù)(MolecularBiology and Biotechnology)完全操作參考(A Comprehensive Desk Reference)，VCHPublishers，New York中有所描述，(參見，特別是圖.4，第833頁)和Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334585-591。
根據(jù)某些實施方式，核酶經(jīng)工程化以使得切割識別位點靠近靶基因mRNA的5′末端，如，從而提高效率和使非功能性的mRNA轉(zhuǎn)錄的胞內(nèi)累積最小化。
本發(fā)明的核酶還包括RNA核酸內(nèi)切酶(下文中的“Cech-型核酶”)，例如在Tetrahymena thermophila中天然存在的核酶(已知為IVS或L-19 IVS RNA)，它已由Thomas Cech及其合作者詳加描述(Zaug等，1984，Science，224574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231470-475；Zaug等，1986，Nature，324429-433；由University Patents Inc.出版的國際專利申請?zhí)朩O88/04300；Been和Cech，1986，Cell，47207-216)。Cech-型核酶通常具有8個堿基對的活性位點，該活性位點可與靶RNA雜交，然后發(fā)生對該靶RNA的切割。
可直接加入核酶，或?qū)⒑嗣概c陽離子化的脂類復(fù)合、脂質(zhì)體包裹或用其它方式遞送到靶細胞。該RNA或RNA復(fù)合物可在其整合或不整合到生物聚合物中時，體外局部給予到相應(yīng)組織、或通過注射、氣霧劑吸入、輸液泵或移植片進行體內(nèi)給藥。
核酶可通過多種熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的方法來施予細胞，這些方法包括但不限于，包裹在脂質(zhì)體中、通過離子電滲、或通過將其整合到其它載體中，例如水凝膠、環(huán)糊精、生物可降解的納米膠囊和生物粘附性的微球。出于某些指示，核酶可在使用或不使用上述載體的情況下，直接體外遞送到細胞或組織。此外，RNA/載體組合物可通過直接注射或使用導(dǎo)管、輸液泵或移植片局部遞送。其它常規(guī)的遞送方式包括但不限于血管內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或關(guān)節(jié)注射、氣霧劑吸入、口服(片劑或丸劑劑型)、局部、系統(tǒng)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)和/或鞘內(nèi)遞送。關(guān)于核酶遞送和給藥的更詳細描述在Sullivan等，WO94/02595中提供，該文獻以其全文納入本文作為參考。
在細胞內(nèi)累積高濃度核酶的另一種方法可涉及將核酶編碼序列整合到DNA表達載體中。該核酶序列的轉(zhuǎn)錄可由真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的啟動子所驅(qū)動。在所有細胞中，由pol II或pol III啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄都將以高水平表達；在給定細胞類型中的給定pol II啟動子的水平取決于附近所存在的基因調(diào)控序列的性質(zhì)(增強子、沉默子等)。也可使用原核RNA聚合酶啟動子，前提是該原核RNA聚合酶在適當?shù)募毎斜磉_(Elroy-Stein，O.和Moss，B.，1990，Proc。Natl.Acad.Sci.USA，87，6743-7；Gao，X.和Huang；L，1993，NucleicAcids Res.，21，2867-72；Lieber，A.等，1993，Methods Enzymol.，217，47-66；Zhou，Y.等，1990，Mol.Cell.Biol.，10，4529-37)。多名研究者已論證了由此類啟動子驅(qū)動表達的核酶可在哺乳動物細胞中行使功能(例如(Kashani-Sabet，M.等，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Ojwang，J.O.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen，C.J.等，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Yu，M.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6340-4；L′Huillier，P.J.等，19921，EMBO J.，11，4411-8；Lisziewicz，J.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，8000-4))。上述核酶轉(zhuǎn)錄單元可整合到多種載體中以引入哺乳動物細胞，包括但不限于質(zhì)粒DNA載體、病毒DNA載體(例如腺病毒或腺相關(guān)載體)、或病毒RNA載體(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒、Semliki森林病毒、辛德畢斯病毒載體)。
根據(jù)某些實施方式，表達切割靶RNA(例如，TFF3mRNA)的發(fā)卡形核酶的轉(zhuǎn)錄單元可插入到質(zhì)粒DNA載體中或腺病毒或腺相關(guān)DNA病毒載體中。兩種病毒載體都已被用于將基因傳遞到肺部，且兩種載體都可導(dǎo)致瞬時基因表達(Zabner等，1993 Cell 75，207；Carter，1992 Curr.Opin.Biotech.3，533)。腺病毒載體是作為重組腺病毒微粒來遞送的?？蓪NA單獨遞送或與載體(如上對RNA的描述)復(fù)合遞送。DNA、DNA/載體復(fù)合物，或重組腺病毒顆?？删植拷o予到治療部位，如，通過使用注射導(dǎo)管、移植片或輸液泵或在體外直接加入到細胞或組織中。
RNAi分子RNA干擾(RNAi)是一種革命性地保守基因沉默機制，最早是在對線蟲Caenorhabditis elegans的研究中發(fā)現(xiàn)的(Lee等，Cell 75843(1993)；Reinhart等，Nature 403901(2000))。該機制被確信為是通過將dsRNA(雙鏈RNA)引入到表達適合的分子機器的細胞中而誘發(fā)的，然后降解相應(yīng)的內(nèi)源mRNA。該機制涉及將dsRNA轉(zhuǎn)化為短RNA，該短RNA將核糖核酸酶指引到同源的mRNA靶標上(概述于Ruvkun，Science 2294797(2001)中，該文獻納入本文作為參考)。該過程涉及對病毒的正常防御和轉(zhuǎn)位子的動員。以dsRNA進行治療已成為分析基因功能性有機體的更為普遍的方式。RNA干擾或“RNAi”是最初由Fire和同事們提出的術(shù)語，他們用該術(shù)語描述所觀察到的當雙鏈RNA(dsRNA)被引入線蟲后，其可封閉基因表達的現(xiàn)象(Fire等(1998)Nature 391，806-811)。
用于實現(xiàn)RNAi介導(dǎo)的基因表達調(diào)控的RNAi分子可包括單鏈或多鏈的聚合核糖核苷酸。它可包含任何數(shù)目的修飾，例如上文所述的對反義分子的修飾，包括對磷酸鹽-糖基骨架、對糖基、或核堿基的修飾，以增強穩(wěn)定性或結(jié)合親合力。例如，天然RNA的磷酸二酯鍵可經(jīng)修飾以含有至少一個氮或硫雜原子。在避免某些組織中由dsRNA產(chǎn)生的普通應(yīng)急反應(yīng)時，可特意調(diào)整RNA結(jié)構(gòu)中的修飾以使得特異性基因得到抑制。同樣，也可對堿基進行修飾以封閉腺苷脫氨酶的活性。RNA可通過酶促產(chǎn)生或通過部分/全部有機合成產(chǎn)生。通過體外酶促或有機合成，可將任何經(jīng)修飾的核糖核苷酸整合到RNA中。RNAi分子可為dsRNA分子。
根據(jù)需要抑制其表達的主題多核苷酸的尺寸，可用的RNAi分子的尺寸也會有所變化，且該RNAi分子應(yīng)當足夠長而能在細胞中降低主題多核苷酸的表達。通常而言，該RNA為至少約10-約15核苷酸長。在某些應(yīng)用中，該RNA的長度為小于約20、21、22、23、24或25個核苷酸。在其它情況下，該RNA的長度為至少約50、100、150或200個核苷酸。在某些其它應(yīng)用中，該RNA可更長，例如，至少約300、400、500或600個多核苷酸。典型地，該RNA少于約3000個核苷酸。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需使用過多的試驗即可確定任何具體主題多核苷酸的優(yōu)化尺寸，其方法是以系統(tǒng)化的方式改變RNA的尺寸并確定所選擇的尺寸是否能有效干擾主題多核苷酸的表達。
該RNAi分子可以能使得每一細胞遞送到至少一個拷貝的RNAi的量引入。較高劑量(例如，至少5、10、100、500或1000個拷貝/細胞)的雙鏈材料可獲得較有效的抑制；較低劑量也可用于具體的應(yīng)用中。抑制是序列特異性的，即對應(yīng)于該RNA雙鏈區(qū)的核苷酸序列是基因抑制的靶標。在組織中引入足夠的RNA，以造成靶基因表達的可檢測變化(假定候選基因是在引入該RNA的細胞中實際表達的)，使用可得的檢測方法。因此，在某些情況下，與未引入該RNA的細胞相比，引入足夠的RNA以獲得候選基因表達的至少約5-約10％的降低。在其它情況下，抑制至少為約20、30、40或50％。在還有的其它情況下，該抑制至少為約60、70、80、90或95％。在某些情況下的表達基本上完全抑制到低于可檢測水平。
引入RNA的量取決于各種因素，例如，給藥所使用的模式、RNA的大小、RNA所給入的細胞數(shù)、以及若將dsRNA引入某一動物，該動物的年齡和大小。例如，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過最初給予多個不同濃度的RNA而確定合適的給藥量。在某些情況下，當把RNA引入到培養(yǎng)細胞中的時候，引入細胞的RNA的量可在約0.5-約微克/106個細胞間變化。
對于檢測候選基因表達的干擾(即，檢測候選基因的沉默)有多種選擇可供使用。通常而言，可通過檢測由候選基因編碼的蛋白質(zhì)的水平的降低、測定由該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的水平和/或檢測與候選基因表達相關(guān)的表型變化來檢測表達中的抑制。
含有基本上與靶基因(例如，TFF3多核苷酸)的部分相同的核苷酸序列的RNA可用于RNA抑制。相對于靶序列具有插入、缺失和單個位點突變的RNA序列也可有效用于抑制。因此，如本領(lǐng)域中眾所周知的，可以對序列同一性進行優(yōu)化，優(yōu)化的方法為通過序列比對和陣列算法以及計算核苷酸序列間的百分比差異，例如在BESTFIT軟件程序中使用默認參數(shù)執(zhí)行的Smith-Waterman算法(例如，University ofWisconsin Genetic Computing Group)。在某些實施方式中，抑制RNA和靶基因的部分間的序列同一性可大于90％，或甚至達到約100％。另外，RNA的雙鏈區(qū)可被功能性界定為能與靶基因轉(zhuǎn)錄物部分雜交的核苷酸序列(例如，400mM NaCl，40mMPIPES pH 6.4，1mM EDTA，在50C或70℃下雜交12-16小時；然后洗滌)。該RNA核苷酸序列的長度可為至少約15、20、25、50、100、200、300或400堿基。
如本文所揭示的，RNA和靶基因間100％的序列同一性在實踐本發(fā)明時是不需要的。因此，本發(fā)明具有可耐受序列差異性的優(yōu)點，該序列差異性可為基因突變、鏈多態(tài)性或進化趨異所導(dǎo)致。然而，根據(jù)某些實施方式，在抑制RNA和靶基因的部分間存在100％的序列同一性。此外，具有大于約70％、80％、90％或95％序列同一性的RNA可用于本發(fā)明，由此可耐受預(yù)計由基因突變、鏈多態(tài)性或進化趨異所導(dǎo)致的序列差異性。
RNA可在體內(nèi)或體外合成。細胞的內(nèi)源性RNA聚合酶可介導(dǎo)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，或克隆的RNA聚合酶可用于體內(nèi)或體外的轉(zhuǎn)錄。為了在體內(nèi)或表達構(gòu)建體中從轉(zhuǎn)基因進行轉(zhuǎn)錄，可使用調(diào)控區(qū)(例如，啟動子、增強子、沉默子、接合供體和受體、多聚腺苷酸)來轉(zhuǎn)錄一條或多條RNA鏈?？赏ㄟ^器官、組織或細胞類型中的特異性轉(zhuǎn)錄來靶向抑制；環(huán)境條件的刺激(例如，感染、壓力、溫度、化學(xué)誘導(dǎo)劑)；和/或在發(fā)展階段或年齡進行工程化轉(zhuǎn)錄。RNA鏈可任選地被多聚腺苷化；RNA鏈可任選地能夠通過細胞的翻譯部件翻譯成多肽。RNA還可通過人工的或自動化的反應(yīng)化學(xué)或酶促合成。該RNA可由細胞RNA聚合酶或細菌噬菌體RNA聚合酶合成(例如，T3、T7、SP6)。表達構(gòu)建體的使用和生產(chǎn)在本領(lǐng)域中是已知的(參見，如，WO97/32016；美國專利號5,593,874；5,698,425；5,712,135；5,789,214和5,804,693)。若RNA是化學(xué)合成的或是在體外通過酶促合成的，則該RNA可在引入細胞前被純化。例如，可從混合物中用溶劑或樹脂萃取、沉淀、電泳、色譜法或其組合方法來純化RNA。此外，RNA可不經(jīng)純化或經(jīng)最少的純化而使用，以避免由于樣品處理而造成的損失。RNA可經(jīng)干燥以供儲存或溶于水性溶液中。該溶液可含有緩沖劑或鹽以促進退火，和/或使雙鏈穩(wěn)定。
根據(jù)本發(fā)明，具有與TFF3多核苷酸序列的某一區(qū)域相似或基本上相同的序列的RNA可用于在細胞中調(diào)控TFF3多肽的表達，例如通過RNA-干擾機制。靶序列區(qū)域的選擇可根據(jù)上述反義調(diào)控TFF3表達的任何標準來進行。在某些實施方式中，RNA可包含與SEQ ID NO5-19中任一序列基本上相同或基本上互補的序列。RNA還可重疊對應(yīng)于SEQ ID NO5-19中任一序列中某一部分的序列或其互補序列。
可將RNA給予如本文所述的給予反義分子的器官或患者上。根據(jù)某些實施方式，RNA可直接引入細胞(即，胞內(nèi))；或由胞外引入腔體、空隙、引入生物體的循環(huán)、口服引入或可通過將生物體浸入含有RNA的溶液中而引入RNA?？诜氲姆椒òㄖ苯訉NA與生物體的食物混合，以及使用工程化途徑，即使作為食物的物種工程化地表達RNA，然后將其喂食給要引入RNA的生物體。也可使用物理方法引入核酸，例如，直接注射入細胞或胞外注射入生物體。血管內(nèi)或血管外循環(huán)、血液或淋巴系統(tǒng)、韌皮部、根和腦脊液均可為RNA引入的位點。可通過將構(gòu)建體引入來源于適合生物體的合子、胚胎干細胞或其它多能干細胞，而產(chǎn)生由重組構(gòu)建體表達RNA的轉(zhuǎn)基因生物體。
引入核酸的物理方法包括注射含有RNA的溶液、用RNA包被的微粒轟擊、將細胞或生物體浸入RNA溶液中、或在RNA存在的情況下對細胞膜進行電穿孔。包裹入病毒顆粒的病毒構(gòu)建體可達到將表達構(gòu)建體有效引入細胞和轉(zhuǎn)錄由表達構(gòu)建體編碼的RNA的目的?？墒褂闷渌绢I(lǐng)域所知的將核酸引入到細胞中的方法，例如脂質(zhì)體介導(dǎo)的載體運輸、化學(xué)物介導(dǎo)的運輸，例如磷酸鈣等。因此，RNA可與具有一種或多種下述活性的成分共同引入增強細胞對RNA的攝取、促進雙鏈的退火、穩(wěn)定退火的雙鏈或此外增強對靶基因的抑制。
靶基因表達抑制的檢驗可通過以下方法來進行觀察或檢測由靶基因編碼的蛋白質(zhì)水平的缺乏或可觀察到的下降(其可通過例如特異性抗體或其它本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的方法來檢測)；和/或觀察或檢測靶基因的mRNA產(chǎn)物(其可通過例如，雜交研究來檢測)；和/或觀察或檢測與基因表達相關(guān)的表型。在藥物治療背景下，對靶基因表達抑制的檢驗可通過觀察對象疾病狀態(tài)的變化(例如癥狀的減輕、消失、疾病狀態(tài)的變化等)來進行。根據(jù)某些實施方式，疾病狀態(tài)的變化可為腫瘤生長的減緩、腫瘤體積的減小、細胞活動性的減小、細胞侵染力的減小等。優(yōu)選地，該抑制是特異性的，即，靶基因的抑制不會對細胞的其它基因造成顯著的影響。
給予哺乳動物用于有效進行基因抑制的RNA的量可根據(jù)許多因素發(fā)生變化，包括給藥的途徑、該哺乳動物的年齡、大小和狀況、所要抑制的基因、所要治療的疾病或失調(diào)等。根據(jù)某些實施方式，可給予dsRNA以在每一細胞中提供0.1-400皮克，優(yōu)選1-40皮克或更優(yōu)選1-20皮克的dsRNA。
通過外源加入或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄而使用RNAi的方法在本領(lǐng)域中是已知的(分別參見Schubiger和Edgar，Methods in Cell Biology(1994)44697-713，和PCT申請WO99/32619，這些文獻各自納入本文作為參考)，例如，在C.elegans中，RNAi在外陰前體細胞中已顯示出對腫瘤抑制基因的敲除(Lu和Horvitz，Cell(1998)95981-991，該文獻以其全文引入本文作為參考)。
美國專利號6,506,559和美國專利申請公開號20030027783(涉及哺乳動物中的基因表達抑制)進一步提供了使用RNAi來降低或抑制某些基因產(chǎn)物表達的方法，各文獻以其全文引入本文作為參考。
抗體中和劑也可為免疫球蛋白，例如，可與TFF3蛋白結(jié)合的抗體或其片段。免疫球蛋白可包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。后一種類型的多肽為，例如，由淋巴系統(tǒng)以低水平產(chǎn)生而由骨髓瘤高水平產(chǎn)生的多肽。
“天然抗體和免疫球蛋白”通常為約150,000道爾頓的異四聚化糖蛋白，它含有兩個相同的輕(L)鏈和二個相同的重(H)鏈。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與一條重鏈相連接，重鏈間二硫鍵的數(shù)量在不同的同型免疫球蛋白中有所不同。各重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間距的鏈內(nèi)二硫橋。各重鏈在一端具有可變區(qū)(VH)，其后為許多恒定區(qū)。
來自任一脊椎動物種類的抗體(免疫球蛋白)，其“輕鏈”可被指定為兩種明顯不同的型中的一種(稱為κ和λ)，這是基于它們恒定區(qū)的氨基酸序列而定的。基于它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，完整的抗體可被指定為不同的“類”。
各輕鏈在其一端具有可變區(qū)(VL)在其另一端具有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)排成一行，而輕鏈的可變區(qū)則與重鏈的可變區(qū)排成一行。特殊的氨基酸殘基被確信為可在輕鏈和重鏈的可變區(qū)間形成界面(Chothia等，J.Mol.Biol.186651(1985；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.30 824592(1985)；Chothia等，Nature 342877-883(1989))。
術(shù)語“抗體”使用的是其最廣泛的含義，并且涵蓋了完全裝配的多克隆抗體和單克隆抗體，以及能結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab′、F′(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙體(diabody))。
本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即，組成該群體的抗體個體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。
下文所描述的示例性技術(shù)用來產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明使用的抗體中和劑。
抗體被稱為“特異性結(jié)合”，如果1)它們顯示出結(jié)合活性的閾水平，和/或2)它們不與已知的相關(guān)多肽分子發(fā)生顯著的交叉反應(yīng)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很方便地測定抗體的結(jié)合親合力，例如，通過Scatchard分析(Scatchard，Ann.NYAcad.Sci.51660-672，1949)。在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體與TFF3的結(jié)合高于其它TFF3相關(guān)蛋白至少103倍，更優(yōu)選至少104倍，更優(yōu)選至少105倍，以及甚至更優(yōu)選至少106倍。
在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體不與已知的相關(guān)的多肽分子特異性結(jié)合(或識別)，例如，若使用標準的Western印跡分析(Ausubel等)，它們與TFF3多肽結(jié)合但不與已知的相關(guān)多肽結(jié)合。在某些實施方式中，可從已知相關(guān)多肽中篩選出抗體，以分離出特異性結(jié)合TFF3多肽的抗體群。例如，在適當?shù)木彌_條件下，特異性結(jié)合TFF3多肽的抗體可流過含有附著在不溶性基質(zhì)上的TFF3家族多肽(不含TFF3)的柱。這一篩選使得不與密切相關(guān)的多肽發(fā)生交叉反應(yīng)的多克隆和單克隆抗體得以分離(抗體(Antibodies)實驗手冊，Harlow和Lane(編)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988；Current Protocols in Immunology，Cooligan等(編)，Naional Institutesof Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995)。特異性抗體的篩選和分離在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參見，基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，Paul(編)，RavenPress，1993；Getzoff等，Adv.in Immunol.431-98，1988；單克隆抗體(Monoclonal Antibodies)原則和實踐(Principles and Practice)，Goding，J.W.(編)，Academic Press Ltd.，1996；Benjamin等.，Ann.Rev.Immunol.267-101，1984)。這些分析的典型例子包括同步免疫電泳(concurrent immunoelectrophoresis)、放射性免疫分析(RIA)、放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、點雜交或Western印記分析、抑制或競爭分析和三明治分析法。
在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體對于TFF3的親和力比已知的相關(guān)家族成員至少高約1000倍，至少高約10,000倍。在某些實施方式中，本發(fā)明抗體對除了TFF3以外的相關(guān)多肽的結(jié)合親合力小于1×105Ka，小于約1×104Ka，且優(yōu)選為小于1×103Ka。
多克隆抗體通過多次皮下(sc)、腹腔內(nèi)(ip)或肌內(nèi)(im)注射相關(guān)抗原和助劑，可在動物中產(chǎn)生多克隆抗體。將相關(guān)抗原與蛋白質(zhì)(在要免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì))結(jié)合是有利的，如，與鎖眼型血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白結(jié)合、或與大豆胰蛋白酶抑制劑相結(jié)合，所用的雙功能劑或衍生劑例如，馬來酰亞胺苯甲酰磺基琥珀酰亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfo succinimideester(通過半胱氨酸殘基結(jié)合))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基結(jié)合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOC12或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基團。將動物以抗原、免疫原性結(jié)合物、或衍生物進行免疫，方法是將例如，100皮克蛋白質(zhì)或結(jié)合物(分別對兔或小鼠)與3體積的弗氏完全助劑混合，并在多位點皮內(nèi)注射該溶液。一個月后，用初始量1/5-1/10的肽或結(jié)合物在弗氏完全助劑中通過多位點皮下注射對該動物進行加強免疫。7-14天后，將該動物放血，并對血清進行抗體滴度分析。對動物進行增強免疫直至滴度達到平臺期。優(yōu)選地，該動物用同一抗原與不同蛋白質(zhì)的結(jié)合物和/或通過不同的交叉反應(yīng)試劑進行增強免疫。結(jié)合物還可在重組培養(yǎng)細胞中作為蛋白質(zhì)融合物產(chǎn)生。同樣，聚合劑(aggregating agent)，例如明礬，也適合用于促進免疫應(yīng)答。
單克隆抗體單克隆抗體獲自基本上同源的抗體群，即，組成該群體的抗體個體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語“單克隆的”是指該抗體的性質(zhì)不是離散抗體的混合物。例如，可用雜交瘤法制備單克隆抗體，該方法最早由Kohler等描述(Nature，256495(1975))或可用重組DNA法(美國專利號4,816,567)制備。
在雜交瘤法中，對小鼠或其它適合的宿主動物(例如兔或倉鼠)按照上文所述進行免疫，以刺激淋巴細胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生會特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)的抗體。另外，可在體外對淋巴細胞進行免疫。然后使用適合的融合試劑(例如，聚乙二醇)，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞[Goding，單克隆抗體(MonoclonalAntibodies)原則和實踐(Principles and Practice)，59-103頁(Academic Press，1986)]。
由此制得的雜交瘤細胞被接種并生長在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細胞的生長和存活的物質(zhì)。例如，若親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，該雜交瘤培養(yǎng)基中通常會含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT基質(zhì))，這些物質(zhì)組織了HGPRT缺陷型細胞的生長。
代表性的骨髓瘤細胞是有效融合、通過選擇的抗體產(chǎn)生細胞支持抗體的穩(wěn)定高水平產(chǎn)生、且對培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基基質(zhì))敏感的那些骨髓瘤細胞，包括骨髓瘤細胞系，例如鼠類的骨髓瘤細胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細胞系(可購自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亞哥，加利福尼亞，美國)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653細胞(可購自American Type Culture Collection，洛克維爾，馬里蘭，美國)。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細胞系也已被描述用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用(Monoclonal Antibodies Production Techniques andApplications)，51-63頁(Marcel Dekker，Inc.，紐約，1987)]。
對雜交瘤細胞生長于其中的培養(yǎng)基進行分析以檢測具有所需特異性的單克隆抗體的產(chǎn)生，如，通過體外結(jié)合分析例如，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表達抗體的細胞的位置可用FACS進行檢測。然后，可將雜交瘤克隆通過有限稀釋步驟形成亞克隆(subcloned)，并通過標準方法生長(Goding，單克隆抗體(Monoclonal Antibodies)原則和實踐(Principles and Practice)，AcademicPress(1986)59-103頁)。為了達到這一目的而使用的適合的培養(yǎng)基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞可在動物體內(nèi)作為腹水瘤生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水或血清中通過常規(guī)的免疫球蛋白純化工藝適當?shù)氐玫椒蛛x，這些純化工藝為例如，蛋白A-瓊脂糖法(proteinA-Sepharose)、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
編碼單克隆抗體的DNA可使用常規(guī)的工藝很容易地得到分離和測序(例如，通過使用寡核苷酸探針，該探針可特異性地與鼠類抗體的重鏈和輕鏈的編碼基因相結(jié)合)。該雜交瘤細胞作為這些DNA的來源。該DNA一經(jīng)分離就可被置入表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中(例如，大腸桿菌(E.coli)細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生其它免疫球蛋白的骨髓瘤細胞)，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于細菌中編碼抗體的DNA表達的綜述文獻包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Phickthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在其它實施方式中，從抗體噬菌體庫中分離抗體或抗體片段，該抗體噬菌體庫是用以下文獻中所記載的技術(shù)產(chǎn)生的McCafferty等，Nature，348552-554(1990)。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體庫對小鼠和人抗體的分離。其后的出版物描述了通過鏈替換(chain shuffling)生產(chǎn)高親和力(nM數(shù)量級)的人抗體的方法(Marks等，BiolTechnology，10779-783(1992)，該文獻全文納入本文作為參考)、以及以組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建極大噬菌體庫的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993)，該文獻全文納入本文作為參考)。因此，這些技術(shù)能可行地替代傳統(tǒng)的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)而用于分離單克隆抗體。
DNA也可被修飾，例如，通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列置換同源的小鼠序列(美國專利號4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，816851(1984)，以其全文納入本文作為參考)，或通過在免疫球蛋白編碼序列上共價連接非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。通常這些非免疫球蛋白多肽用于置換抗體的恒定區(qū)，或它們用于置換抗體一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)，從而產(chǎn)生嵌合的二價抗體，該二價抗體含有對某一抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點和對另一不同抗原具有特異性的另一抗原結(jié)合位點。
此外，抗TFF3的重組抗體可在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，如，在多個專利中所描述的。例如，重組抗體可在轉(zhuǎn)基因動物(如，嚙齒類)中表達，如在下述任一美國專利中所揭示的美國專利號5,877,397；5,874,299；5,814,318；5,789,650；5,770,429；5,661,016；5,633,425；5,625,126；5,569,825；5,545,806；6,162,963；6,150,584；6,130,364；6,114,598；6,091,001；5,939,598。此外，重組抗體可在轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中表達，如美國專利號5,849,992或5,827,690中所討論的。
人化的抗體用于將非人抗體人化的方法在本領(lǐng)域中已有描述。優(yōu)選地，人化的抗體具有引入其中的一個或多個非人源氨基酸殘基。這些非人源氨基酸殘基常被稱為“輸入”(import)殘基，其通常取自于“輸入”可變區(qū)。人化反應(yīng)基本上可根據(jù)Winter及其同事揭示的方法通過置換相應(yīng)的人抗體序列的超變區(qū)實施操作序列(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))。因此，這些“人化”抗體為嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中基本上少于一個完整的人可變區(qū)被由非人物種來源的相應(yīng)序列所置換。在實踐中，人化抗體通常為人抗體，其中某些超變區(qū)殘基和可能的某些FR殘基被來源于嚙齒動物抗體中類似位點的殘基所取代。
用于制備人化抗體的人可變區(qū)(輕鏈和重鏈)的選擇影響到抗原性。根據(jù)所謂的“最適”方法，可對整個已知的人可變區(qū)序列文庫篩選嚙齒類抗體的可變區(qū)序列。與嚙齒類序列最接近的人序列就被接受作為人化抗體的人框架區(qū)(frameworkregion，F(xiàn)R)(Sims等，J.Immunol，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol，196901(1987))。另一種方法使用的特殊框架區(qū)衍生自具有某種特定亞型的輕鏈或重鏈的所有人抗體的共有序列。相同的框架區(qū)可用于多個不同的人化抗體(Carter等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，JImmunol，1512623(1993))。
可在保持對抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性的情況下，對抗體進行人化。為達到這一目的，根據(jù)某些實施方式，通過使用母序列和人化序列的三維模型分析母序列和各種構(gòu)思的人化產(chǎn)物來制備人化抗體。三維免疫球蛋白模型是商業(yè)化可獲得的，且為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知?？少彽糜嬎銠C程序用以闡明和展示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對這些顯示進行檢查即可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能發(fā)揮中可能起到的作用，即，對能夠影響到候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的殘基進行分析。通過這一方法，可從受體(recipient)和輸入序列中選擇并組合FR殘基，從而獲得所需的抗體性質(zhì)(例如，對靶抗原親和性的提高)。通常而言，超變區(qū)的殘基直接和最根本地涉及對抗原結(jié)合的影響。
人抗體作為人化反應(yīng)的替代，可產(chǎn)生人抗體。如上文所討論的，在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生抗體(尤其是人抗體)是已知的。例如，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)，在對這些動物免疫后，其可產(chǎn)生完整的人抗體庫，而不產(chǎn)生內(nèi)源性的免疫球蛋白。例如，已描述了在嵌合體和生殖系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈結(jié)合區(qū)(JH)基因的純合性缺失可導(dǎo)致內(nèi)源抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人生殖系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種生殖系突變小鼠，這樣可在抗原刺激(challenge)時產(chǎn)生人抗體。參見，例如，Jakobovits等，Proc.Mad.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.，733(1993)；和美國專利號5,591,669、5,589,369和5,545,807。另外，噬菌體展示技術(shù)(phage displaytechnology)(McCafferty等，Nature 348552-553(1990)，該文獻以其全文納入本文作為參考)可用于在體外從來自未經(jīng)免疫的供體獲得的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫中產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)這一技術(shù)，抗體V區(qū)基因可同步(in-frame)克隆入絲狀噬菌體(filamentous bacteriophage)的主要或次要衣殼蛋白基因中，例如M13或fd，并在噬菌體顆粒表面上作為功能性抗體片段展示。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇也可選擇到編碼顯示出那些特性的抗體的基因。因此，該噬菌體模擬了B細胞的某些特性。噬菌體展示可以多種形式進行；關(guān)于它們的綜述參見，如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3564-571(1993)。多種來源的V基因片段可用于噬菌體展示中。Clackson等，Nature，352624-628(1991)，從來源于免疫小鼠脾臟的V基因隨機組合小文庫中分離出不同系列的抗噁唑酮抗體。可以構(gòu)建來自未免疫人供體的V基因庫，且對應(yīng)于不同系列抗原(包括半抗原)的抗體可根據(jù)下述文獻所述的技術(shù)被實質(zhì)性地分離Marks等，J Mol.Biol.222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)。也可參見美國專利號5,565,332和5,573,905。人抗體也可通過體外活化的B細胞產(chǎn)生(參見美國專利號5,567,610和5,229,275)。
抗體片段已開發(fā)了多種技術(shù)來生產(chǎn)抗體片段。常規(guī)而言，這些片段是通過完整抗體的蛋白水解消化衍生而來的(參見，例如，Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science，22981(1985))。然而，這些片段也可由重組宿主細胞直接產(chǎn)生。例如，該抗體片段可從上文所討論的抗體噬菌體庫中分離得到。另外，F(xiàn)ab′-SH片段可從大腸桿菌(E.coli)中直接回收并經(jīng)過化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段[Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992)，該文獻以其全文納入本文作為參考]。按照另一途徑，F(xiàn)(ab′)2片段可直接從培養(yǎng)的重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離獲得。用于產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)對于熟練的從業(yè)者是顯而易見的。在其它實施方式中，所選的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見，WO93/16185；美國專利號5,571,894；和美國專利號5,587,458。該抗體片段也可以是“線性抗體”，例如，如美國專利5,641,870所述的。這些線性抗體片段可為單一特異性的或雙特異性(bispecific)的。此外，從噬菌體展示庫中識別抗體片段，可以對其編碼核酸克隆、測序并工程化成為編碼且可表達任何同型抗原全長抗體的核酸的一部分。
雙特異性抗體用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。產(chǎn)生全長雙特異性抗體的常規(guī)方法是以兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達為基礎(chǔ)的，其中這兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature，305537-539(1983)該文獻以其全文納入本文作為參考)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分選，這些雜交瘤(細胞雜交瘤，quadromas)會產(chǎn)生由10種不同抗體分子組成的可能的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。純化該正確的分子(可通過親和層析步驟進行)十分麻煩，且產(chǎn)物的產(chǎn)率低。類似的工藝在WO93/08829，和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)中有所描述。
按照不同的途徑，具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點)與免疫球蛋白的恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)之間進行，該恒定區(qū)含有至少部分的鉸鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū)。在某些實施方式中，含有輕鏈結(jié)合所需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)在融合物中至少存在一個。如果需要的話，可以編碼免疫球蛋白重鏈融合物的DNA和編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同的表達載體中，并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物體中。這樣，在不等比地使用三種多肽片段進行構(gòu)建時，這種方法在實施方式中對調(diào)節(jié)三個多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性，以此提供優(yōu)化產(chǎn)率。然而，當?shù)缺壤闹辽賰蓷l多肽鏈可獲得高產(chǎn)率時，或當該比例不是特別重要時，可以在同一表達載體中插入兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列。
在某些實施方式中，雙特異性抗體在某一臂中含有具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈而在另一臂中含有雜合的免疫球蛋白重鏈輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)。研究發(fā)現(xiàn)，由于僅在該雙特異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈，這就為分離提供了便利的方法，這一不對稱結(jié)構(gòu)使得將所需雙特異性化合物從不需要的免疫球蛋白鏈組合物中的分離更易進行。該方法在WO94/04690中有所揭示。關(guān)于生產(chǎn)雙特異性抗體的進一步描述，參見，例如，Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
按照另一在美國專利號5,731,168中所述，抗體分子對之間的界面可經(jīng)工程化以獲得最大化的異二聚體百分比，該異二聚體是從重組細胞培養(yǎng)物中回收的。在某些實施方式中，該界面可含有抗體恒定區(qū)的CH3區(qū)的至少一部分。在該方法中，來自于第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈可由較大的側(cè)鏈所替代(例如酪氨酸或色氨酸)。對大側(cè)鏈的相同或類似大小的代償性“空腔”(Compensatory″cavities″)可通過在第二抗體分子的界面上用較小的氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替代大氨基酸側(cè)鏈來形成。這就為提高異二聚體的產(chǎn)率(相對于其它非所需終產(chǎn)物(例如同型二聚體))提供了一種機制。
雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異接合”(heteroconjugate)抗體。例如，在異接合中的一種抗體可與抗生物素蛋白偶聯(lián)，而另一抗體則與生物素偶聯(lián)。這種抗體已被，例如，提議用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不需要的細胞，(美國專利號4,676,980)，和用于治療HIV感染(WO91/00360和WO92/200373)。異結(jié)合抗體的制備可采用任何便利的交聯(lián)方法。適合的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的，且在美國專利號4,676,980中連同許多交聯(lián)技術(shù)一起被公開。
從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)也已在文獻中有所描述。例如，可使用化學(xué)交聯(lián)制備雙特異性抗體。Brennan等，Science，22981(1985)，描述了將完整抗體經(jīng)蛋白酶水解切割產(chǎn)生F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在的情況下被還原，已穩(wěn)定鄰近的二巰基化物和防止分子間二硫化物的形成。然后將所產(chǎn)生的Fab′片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate，TNB)衍生物。然后通過用巰基乙胺還原將Fab′-TNB衍生物之一轉(zhuǎn)化為Fab′-硫醇，并與等量的另一Fab′-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定試劑。
目前的進展使得直接從大腸桿菌(E.coli)中回收Fab′-SH片段變得方便，該Fab′-SH片段可經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等在J.Exp.Med.，175217-225(1992)中描述了全長人化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。各Fab′片段獨立地從大腸桿菌(E.coli)中分泌出，并將其直接在體外進行化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。因此，所形成的雙特異性抗體能夠與過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結(jié)合，并引發(fā)人細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤靶標的裂解活性。
多種從重組細胞培養(yǎng)物中直接制備和分離雙特異性抗體片段的方法也已被描述。例如，使用亮氨酸拉鏈已生產(chǎn)出雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。通過基因融合將來自于Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分連接。該抗體同型二聚體在鉸鏈區(qū)經(jīng)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。該方法也可用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述了該“雙特異抗體”(diabody)技術(shù)，該技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的另一種機制。該片段包含通過連接序列與輕鏈可變區(qū)(VL)連接的重鏈可變區(qū)(VH)，該連接序列短到不能在同一鏈的兩個區(qū)域之間形成配對。
因此，片段的VH和VL區(qū)被迫與另一片段的互補VL和VH配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。另一通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的策略也已有報道。參見Gruber等，J.Immunol.，1525368(1994)。所構(gòu)思的是高于二價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760(1991)。
中和劑的結(jié)合和其它修飾本文方法中使用或制品中含有的中和劑可以任選地與細胞毒素或治療劑結(jié)合。例子包括化療劑。這些化療劑在治療特定的癌癥中具有確定的效果。
中和劑與一個或多個小分子毒素(如刺孢霉素、美登素(美國專利號5,208,020)、單端孢菌素(trichothene)和CCl065)的結(jié)合物也在本文的預(yù)期中。根據(jù)某些實施方式，中和劑與一個或多個美登素分子結(jié)合(如每個中和劑分子與約1-約10個美登素分子結(jié)合)。美登素可以，例如，轉(zhuǎn)變?yōu)镸ay-SS-Me，它可還原為May-SH3并與修飾過的中和劑(Chari等，Cancer Research 52127-131(1992))生成美登素樣-中和劑(maytansinoid-neutralizing agent)結(jié)合物。
此外，中和劑可與一個或多個刺孢毒素分子結(jié)合?？股氐拇替叨舅丶易迥茉趤?皮摩爾濃度下產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。刺孢毒素的結(jié)構(gòu)相似物也是已知的。(Hinman等，Cancer Research 533336-3342(1993)和Lode等，Cancer Research 582925-2928(1998))。
可用的具有酶活性的毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非連接活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、石竹素蛋白、美國商陸蛋白(Phytolaca americana protein，PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制因子(momordica charantia inhibitor)、瀉果素、巴豆毒素、鼠尾草抑制因子(sapaonaria officinalis inhibitor)、白樹毒素、絲裂素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。參見如WO 93/21232。
本發(fā)明還包含了與具有溶核活性的化合物結(jié)合的中和劑(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)。多種放射性同位素可用于制備放射性結(jié)合的中和劑。舉例包括Y90、At211、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。中和劑和細胞毒素的結(jié)合物可以使用多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑進行制備，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-二硫代吡啶-)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫羥烷(巰醇亞胺，iminothiolane，IT)、亞氨酯的雙功能衍生物(例如，二甲基乙二酰亞胺HCL)，活性酯(例如，二琥珀酰亞胺辛二酯)，aidehydes(例如，glutareldehyde)，雙疊氮基化合物(例如，雙(對-疊氮苯甲?；?己二胺)，雙-重氮鹽衍生物(例如，雙-(對-重氮基苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸鹽或酯(例如，甲苯2，6-二異氰酸酯)，和雙活性的氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻蛋白免疫毒素可按Vitetta等，Science 2381098(1987)描述的方法制備。碳-14標記的1-異硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種用于將放射性核苷酸與中和劑結(jié)合的典型螯合劑。參見，如W094/11026。連接序列可以是“可切割的連接序列”，其易于在細胞中釋放細胞毒藥物。例如，可以使用酸不穩(wěn)定的連接序列、肽酶敏感的連接序列、二甲基連接序列或含二硫化物的連接序列(Chari等，Cancer Research 52127-131(1992))?；蛘?，可以通過例如重組技術(shù)或肽合成技術(shù)制備包含中和劑和細胞毒劑的融合蛋白。
在某些實施方式中，中和劑可與“受體”(如抗生蛋白鏈菌素)結(jié)合以用于腫瘤中的預(yù)靶向(pretargeting)，其中將該中和劑-受體結(jié)合物給予患者，接著用澄清劑去除循環(huán)中未結(jié)合的結(jié)合物，然后給予與細胞毒劑(例如放射性核苷酸)結(jié)合的“配體”(例如抗生物素蛋白)。本發(fā)明的中和劑也可與前藥活化酶相結(jié)合，該酶可將前藥(例如，肽基化療劑，參見W081/01145)轉(zhuǎn)化為活性的抗癌藥物。參見，例如，WO88/07378和美國專利號4,975,278。
這類結(jié)合物中的酶成分包括能作用于前藥的任何酶，其作用途徑是將前藥轉(zhuǎn)化為比前藥更具活性和毒性的形式。可用于本發(fā)明方法的有用的酶包括但不限于堿性磷酸酶，用于將含磷酸鹽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；芳香基硫酸酯酶，用于將含硫酸酯的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；胞嘧啶脫氨基酶，用于將無毒性的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如靈桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B和L)，用于將含肽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；D-丙氨酰羧肽酶，用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前藥；糖裂解酶，例如b-半乳糖苷酶和唾液酸苷酶，用于將糖基化的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；(3-內(nèi)酰胺酶，用于將藥物與(3-內(nèi)酰胺衍生成為游離藥物；以及青霉素(脫)酰胺酶，例如，青霉素V(脫)酰胺酶或青霉素G(脫)酰胺酶，用于將在胺氮處用苯氧乙?；虮揭阴；鶊F衍生的藥物分別轉(zhuǎn)化為游離藥物。或者，具有酶活性的抗體(在本領(lǐng)域中也稱為“抗體酶”)，可用于將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)化為活性藥物(參見，例如，Massey，Nature 328457-458(1987))?？梢匀绫疚乃龇椒ㄖ苽渲泻蛣?抗體酶接合物用來將抗體酶遞送到腫瘤細胞群中。
酶也可與TFF3中和劑通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如利用上文所討論的異雙功能交聯(lián)劑)共價結(jié)合。或者，可使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建與至少一個本發(fā)明的酶的功能活性部分相連接的融合蛋白，該融合蛋白含有至少一個本發(fā)明中和劑的抗原結(jié)合區(qū)[參見，例如，Neuberger等，Nature，312604-608(1984)]。
本文也包含了中和劑的其它修飾。例如，中和劑可與多種非蛋白性的聚合物中的一種連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧烯烴或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。本文所揭示的中和劑也可配制為脂質(zhì)體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法制備含有中和劑的脂質(zhì)體，例如在下述文獻中描述的Epstein等，Proc.Mad.Acad Sci.USA，823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，774030(1980)；美國專利號4,485,045和4,544,545；以及W097/38731。具有延長的循環(huán)時間的脂質(zhì)體在美國專利號5,013,556中有所揭示。
可通過反相蒸發(fā)方法用含有磷酸卵磷酯、膽固醇和PEG化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物產(chǎn)生尤為有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體通過限定孔徑的過濾器進行過濾，以獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab′片段可通過二硫化物互換反應(yīng)與脂質(zhì)體結(jié)合(如Martin等，J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所描述)?；焺┛扇芜x地包含在脂質(zhì)體中。參見Gabizon等J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。預(yù)期了對于本文所描述的蛋白質(zhì)或肽中和劑的氨基酸序列加以修飾。例如，可能希望提高中和劑的結(jié)合親和力和/或其它生物特性。
中和劑的氨基酸序列變體的制備是通過在中和劑核酸中引入適合的核苷酸變化、或通過肽合成進行的。這些修飾包括但不限于對中和劑氨基酸序列中的殘基進行缺失、和/或插入、和/或替代?？梢詫嵤┤笔А⒉迦牒吞娲娜魏谓M合以得到正式的構(gòu)建體，前提是最終的構(gòu)建體具有所需的性質(zhì)。氨基酸的變化還可改變中和劑的翻譯后過程，例如改變糖基化位點的數(shù)量或位置。
鑒別中和劑中作為誘變位點的殘基或區(qū)域的有效方法被稱為“丙氨酸掃描誘變”(alanine scanning mutagenesis)，如Cunningham和Wells在Science，2441081-1085(1989)中所描述。此處，鑒別單個殘基或靶殘基組(例如，帶電荷的殘基如arg，asp，his，lys，和glu)，并用中性或電負性氨基酸(最優(yōu)選為丙氨酸或多聚丙氨酸)加以替代，從而影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在替代位點或?qū)μ娲稽c引入更多或其它變化，以精煉那些對替代表現(xiàn)出功能性敏感的氨基酸位點。因此，當引入氨基酸序列變化的位點是預(yù)設(shè)的時候，該突變本身的性質(zhì)則無需預(yù)設(shè)。例如，為了分析給定位點上突變的作用，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，并對表達的中和劑變體進行所需活性的篩選。
氨基酸序列插入包括長度范圍為1個殘基-含有100或更多殘基多肽的氨基端和/或羧基端的融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括帶有N-端甲硫氨酸殘基的中和劑或與細胞毒多肽融合的中和劑。中和劑的其它插入變體包括酶或能提高該中和劑血清半壽期的多肽與中和劑的N-或C-末端的融合體。
另一種變體是氨基酸的替代變體。這些變體中至少一個中和劑分子中的氨基酸殘基被不同的殘基所替代。抗體中和劑的替代誘變的最感興趣位點包括超變區(qū)，然而也設(shè)想了FR的改變。
通過選擇對以下效果具有明顯差異的替代，來完成對中和劑生物學(xué)特性的替代修飾，這些效果為(i)保持替代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，作為折疊或螺旋構(gòu)象，(ii)在靶位點保持該分子的帶電性或疏水性，或(iii)保持側(cè)鏈的空間占位。根據(jù)通常的側(cè)鏈特性，將天然存在的殘基劃分為以下各組疏水性的原亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；中性親水性的cys、ser、thr；酸性的asp、glu；堿性的asn、gln、his、lys、arg；影響鏈空間取向的殘基gly、pro；和芳香族的trp、tyr、phe。
非保守替代是用這些類別中某一類的其中一種氨基酸替代另一類別中的一種氨基酸。保守替代涉及同一類別內(nèi)氨基酸的互換。
任何不涉及維持中和劑正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可被替代(通常是用絲氨酸替代)，以提高分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。反之，可在中和劑中加入半胱氨酸鍵以提高它的穩(wěn)定性(尤其是當該中和劑是抗體片段時，例如Fv片段)。
在某些實施方式中，一類替代變體涉及替代親本抗體的一個或多個超變區(qū)殘基。通常而言，被選擇用于進一步開發(fā)的所得變體相對于產(chǎn)生該變體的親本抗體具有更好的生物特性。產(chǎn)生這種替代變體的一種便利的方法是使用噬菌體展示進行親和成熟。簡而言之，對數(shù)個超變區(qū)位點(例如，6-7個位點)進行突變以在各位點產(chǎn)生所有可能的氨基替代。將由此產(chǎn)生的抗體變體以單價形式從絲狀噬菌體顆粒中展示出來，其與M13基因III產(chǎn)物形成融合物而包裹在各顆粒中。然后按本文的揭示對噬菌展示的變體的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和性)進行篩選。為了鑒定出用于修飾的候選超變區(qū)位點，可進行丙氨酸掃描誘變以鑒定出對抗原結(jié)合具有突出貢獻的超變區(qū)殘基。或者，或此外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和抗原間的接觸點也可能是有利的。根據(jù)本文詳細描述的技術(shù)，這種接觸殘基和相鄰的殘基是替代的候選殘基。一旦這種變體產(chǎn)生，就按照本文所述對這些變體進行篩選，并選擇出在一個或多個相關(guān)檢驗中具有較好特性的抗體以供進一步開發(fā)。
本文所述中和劑的另一類氨基酸變體改變了中和劑的原始糖基化模式。“改變”是指去掉一個或多個可在中和劑中找到的糖基部分，和/或加入一個或多個原本不存在于中和劑中的糖基化位點。
多肽的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接是指糖基部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈間的連接。三肽序列，即天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X為除了脯氨酸以外的任何氨基酸)，是將糖基部分與天冬酰胺側(cè)鏈進行酶促連接的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列中任一序列的存在都形成潛在的糖基化位點。O-連接糖基化是指N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖或木糖中的一種與羥基氨基酸的連接，最常用的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。通過改變氨基酸序列從而使其含有一種或多種上述的三肽序列(對于N-連接糖基化位點)，可以達到增加中和劑中糖基化位點的目的。也可通過在原始的中和劑序列中加入一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基或用一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基替代其它殘基來達到改變目的(對于O-連接的糖基化位點)。
可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備編碼中和劑氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但不限于，從天然來源(在氨基酸序列變體天然存在的情況下)中分離、或通過對早期制備的中和劑變體或中和劑的非變體形式進行寡核苷酸介導(dǎo)(或位點指導(dǎo)的)的誘變、PCR誘變、和盒式誘變來進行制備。
在某些實施方式中，考慮到效應(yīng)子的功能，可能需要對本發(fā)明的中和劑進行修飾，如從而促進中和劑的抗原依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒作用(CDC)。這些可通過在抗體中和劑的Fc區(qū)中引入一個或多個氨基酸替代來實現(xiàn)?；蛘呋虼送?，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而在這一區(qū)域形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚抗體可具有改善的細胞內(nèi)攝能力和/或提高的補體介導(dǎo)的細胞殺傷作用和抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。參見Caron等，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可使用Wolff在Cancer Research 532560-2565(1993)中所描述的異雙功能交聯(lián)劑(heterobifunetional cross-linkers)制備具有增強了的抗腫瘤活性的同型二聚抗體?；蛘撸蓪哂袃蓚€Fc區(qū)的抗體進行工程化，并可由此得到增強了的補體溶胞作用和ADCC能力。參見Stevenson等的Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
要提高中和劑在血清中的半衰期，可按如美國專利5,739,277描述的方法，將補救受體結(jié)合表位(salvage receptor binding epitope)整合到中和劑(特別是抗體片段)。如本文所用，術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)域的表位，該表位起到提高IgG分子在體內(nèi)血清中半衰期的作用。
本發(fā)明還提供了用于鑒定具有預(yù)期治療或診斷特性的抗TFF3抗體的篩選方法。篩選方法包括鑒別影響腫瘤細胞增殖和/或粘附的抗TFF3抗體的分析、ADCC或CDC活性分析、抗凋亡分析、細胞周期檢測點分析和對轉(zhuǎn)基因的非人動物(如小鼠和其它嚙齒類動物)的體內(nèi)分析。本發(fā)明也包含了用以鑒別與如上所述蛋白質(zhì)的特定部位相結(jié)合的抗體的篩選方法，這些抗體具有所需的特性，如阻斷鈣結(jié)合、阻斷二聚體形成、阻斷鏈形成和/或干擾TFF3區(qū)的排列?？梢詫λ峁┑目筎FF3蛋白或其片段的抗體群鑒別出如上所述的抗體。
其它形式的中和劑中和劑也可采用前藥的形式。術(shù)語“前藥”指一種以無活性形式制備的治療劑，其在體內(nèi)或體內(nèi)的細胞中，受內(nèi)源性酶或其它化學(xué)藥品和/或條件的作用，而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?即藥物)。具體而言，含核酸的中和劑(如反義寡核苷酸、核酶和RNAi分子等)的前藥形式可按WO93/24510或WO94/26764和美國專利號5,770,713揭示的方法制備成SATE[(S-乙?；?2-硫代乙基)磷酸酯]的衍生物。
中和劑也可采用藥學(xué)上可接受的鹽的形式。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的生理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽即保留母體化合物所需的生物學(xué)活性且不會給其帶來其它不需要的毒性效果的鹽。對含核酸的中和劑而言(如反義寡核苷酸、核酶、RNAi分子等)，藥學(xué)上可接受的鹽的例子包括但不限于，(a)與陽離子形成的鹽，如鈉、鉀、銨、鎂離子、鈣、聚胺如精胺和亞精胺等；(b)與無機酸形成的酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；(c)與有機酸形成的鹽，例如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、棕櫚酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對-甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；和(d)與元素的陰離子形成的鹽，如氯、溴和碘。
多核苷酸構(gòu)建體可以將編碼TFF3、TFF3片段或TFF3中和劑(如抗體)的多核苷酸分子插入多核苷酸構(gòu)建體內(nèi)，如DNA或RNA構(gòu)建體。本發(fā)明的多核苷酸分子可以用在，例如，表達構(gòu)建體中而在宿主細胞內(nèi)表達部分或全部的蛋白質(zhì)、變異體、融合蛋白或單鏈抗體。表達構(gòu)建體包括一個在所選擇的宿主細胞中具有功能的啟動子。熟練的技術(shù)人員可以很容易地從本領(lǐng)域已知并使用的大量細胞類型特異性啟動子中選擇合適的啟動子。表達構(gòu)建體也可以含有一個在宿主細胞內(nèi)具有功能的轉(zhuǎn)錄終止子。表達構(gòu)建體包含了編碼部分或全部目標蛋白的多核苷酸片段。該多核苷酸片段位于啟動子的下游。多核苷酸片段的轉(zhuǎn)錄起始于啟動子。表達構(gòu)建體可以是線性的或環(huán)狀的，如有需要還可以含有自主復(fù)制所需的序列。
宿主細胞可以將編碼TFF3或TFF3中和劑的表達構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)。含有表達構(gòu)建體的宿主細胞可以是任何合適的原核或真核細胞。細菌中的表達系統(tǒng)包括Chang等，Nature 275615(1978)；Goeddel等，Nature 281544(1979)；Goeddeletal.，Nucleic Acids Res.84057(1980)；EP 36，776；美國專利4,551,433；deBoer等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 8021-25(1983)；和Siebenlist等，Cell20269(1980)中描述的系統(tǒng)。
酵母中的表達系統(tǒng)包括Hinnnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929(1978)；Ito等，JBacteriol 153163(1983)；Kurtz等，Mol.Cell.Biol.6142(1986)；Kunze等，J BasicMicrobiol.25141(1985)；Gleeson等，JGen.Microbiol.1323459(1986)，Roggenkamp等，Mol.Gen.Genet.202302(1986))；Das等，JBacteriol.1581165(1984)；De Louvencourt等，J Bacteriol.154737(1983)，Vanden Berg等，Bio/Technology 8135(1990)；Kunze等，J.Basic Microbiol.25141(1985)；Cregg等，Mol.Cell.Biol.53376(1985)；美國專利4,837,148；美國專利4,929,555；Beach和Nurse，Nature 300706(1981)；Davidow等，Curr.Genet.10380(1985)；Gaillardin等，Curr.Genet.1049(1985)；Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.112284-289(1983)；Tilburn等，Gene 26205-22(1983)；Yelton等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 811470-1474(1984)；Kelly和Hynes，EMBO J.4475479(1985)；EP 244，234；以及WO 91/00357中所描述的系統(tǒng)。
可以用美國專利4,745,051；《桿狀病毒的分子生物學(xué)》(THE MOLECULARBIOLOGY OF BACULOVIRUSES，W.Doerfler，編)中，F(xiàn)riesen等(1986)“桿狀病毒基因表達的調(diào)控”(The Regulation of Baculovirus Gene Expression)；EP127，839；EP 155，476；Vlak等，J.Gen.Virol.69765-776(1988)；Miller等，Ann.Rev.Microbiol.42177(1988)；Carbonell等，Gene 73409(1988)；Maeda等，Nature 315592-594(1985)；Lebacq-Verheyden等，Mol.Cell Biol.83129(1988)；Smith等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 828404(1985)；Miyajima等，Gene58273(1987)；和Martin等，DNA 799(1988)所描述的方法來實現(xiàn)昆蟲內(nèi)異種基因的表達。多種桿狀病毒株和變異體及其對應(yīng)的來自宿主的受納昆蟲宿主細胞描述于Luckow等，Bio/Technology(1988)647-55，Miller等中，見《遺傳工程》(GENETIC ENGINEERING，Setlow，J.K.等編)，第8卷，277-279頁(Plenum出版，1986)；以及Maeda等Nature，315592-594(1985)。
可以如Dijkema等，EMBO J.4761(1985)；Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 796777(1982b)；Boshart等，Cell 41521(1985)；和美國專利4,399,216所描述的來實現(xiàn)哺乳動物表達?？梢匀鏗am和Wallace，Meth Enz.5844(1979)；Barnes和Sato，Anal.Biochem.102255(1980)；美國專利4,767,704；美國專利4,657,866；美國專利4,927,762；美國專利4,560655；WO 90/103430，WO87/00195，和美國專利RE 30,985所描述的來促進哺乳動物表達的其它特征。
可以使用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)將表達構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)。這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚陽離子介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、用裸露或包裹的核酸進行轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞融合、DNA包被的乳膠珠(latex bead)的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、原生質(zhì)體融合、病毒感染、電穿孔、“基因槍”、和磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
藥物制劑根據(jù)本發(fā)明的TFF3中和劑治療制劑，可通過將具有所需純度的中和劑與任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington′s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))相混合來制備并用于儲存，其形式為凍干制劑或水溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度下對受試者是無毒的，并且含有緩沖液如磷酸、檸檬酸以及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如氯化十八烷基二甲芐氨；氯己雙銨；氯芐烷銨、氯化芐乙氧銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基對苯，如甲基或丙基對苯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(少于大約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖、二糖、以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽的反離子如鈉；金屬絡(luò)合物(例如鋅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子型表面活性劑如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。此外，可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑不干擾中和劑的活性。
制劑還可以含有超過一種的活性化合物。在某些實施方式中，活性化合物所具有的補充活性不會相互起負面影響。例如，可能希望進一步提供一種細胞毒性劑、化療劑或細胞因子。這些其它制劑的有效量有賴于制劑中存在的中和劑的量、癌癥治療的類型、以及其它如前所述的因素。通常，以相同的劑量使用這些化合物并且使用本文前面使用的給藥途徑，或者約為以前使用劑量的1％至99％。
活性組分也可以包埋于制備的微囊內(nèi)，例如，采用凝聚技術(shù)或采用界面聚合如羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基甲基丙烯酸)微囊，分別用于膠質(zhì)藥物給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳、納米微粒和納米膠囊)或用于巨乳劑(macroemulsion)。這些技術(shù)揭示于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.編(1980)。
也可以制備持續(xù)釋放的制劑。持續(xù)釋放制劑的恰當?shù)膶嵗ê兄泻蛣┑墓虘B(tài)疏水聚合物的半透性基質(zhì)，這樣的基質(zhì)具有成型的形式，如膜或微囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、不能降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸羥基乙酸共聚物(lactic acid glycolic acidcopolymer)和亮氨酰脯氨酸醋酸鹽或酯組成的可注射的微球)和聚-D-(-)-3-羥丁酸。
在一些實施方式中，可以通過使用無菌可注射的藥物組合物的方式給藥。本文使用的短語“可注射的藥物組合物”，或其變體，是指滿足美國藥典“可注射劑”要求的藥物組合物，即無菌、無熱原和微粒、以及具有特定pH和滲透壓值?？梢杂脽o菌濾膜過濾的方法來得到無菌溶液制劑。
用中和劑進行治療可以對患有癌癥或易患癌癥的哺乳動物(例如，人)施以治療有效量的TFF3中和劑來進行癌癥的治療和預(yù)防。同樣地，可以用類似的方法來實現(xiàn)減小腫瘤體積、減緩腫瘤生長、和/或預(yù)防腫瘤生長。
本文使用的術(shù)語“治療(treatment、treating、treat)”等通常是指獲得期望的藥理和/或生理效果。該效果可以是以完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀的方式而達到的預(yù)防性效果，和/或可以是對疾病和/或歸因于該疾病的不良效果達到部分或完全穩(wěn)定或治療效果的治療性效果。本文使用的“治療”涵蓋了對哺乳動物，尤其是人所進行的任何治療，其包括(a)預(yù)防對象出現(xiàn)疾病或癥狀，該對象可能易患該疾病或癥狀，但還沒有被診斷出來患有該疾病或癥狀；(b)抑制疾病癥狀，即阻滯其發(fā)展；或緩解疾病癥狀，即引起疾病或癥狀的消退(regression)，如結(jié)腸或其它消化道癌癥，例如胃癌或肝癌、或乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌。
術(shù)語“個體”、“對象”、“宿主”、和“患者”可以交換使用，指的是任何需要進行診斷、處理、或治療的哺乳動物對象，尤其是人。其它的對象可以包括牛、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等等。
可以用與良好的醫(yī)療實踐相一致的方式對含有TFF3中和劑的組合物，例如，抗體、肽、反義分子、RNAi分子、核酶、或小分子，進行制劑、制定劑量，并給藥。例如，TFF3中和劑是能夠抑制TFF3活性的人、嵌合或人化的抗-TFF3抗體的scFv、抗體片段、肽、或小分子；或是能夠抑制TFF3表達的反義寡核苷酸、RNAi分子、或核酶。本文中考慮的因素包括接受治療的特定的癌癥、接受治療的特定的哺乳動物、患者個體的臨床情況、疾病或病癥的起因、制劑的釋藥部位、給藥方法、給藥進程、以及其它醫(yī)務(wù)人員所知的因素。考慮這些因素來確定給藥的中和劑的治療有效量。
中和劑的治療有效量是足以在接受中和劑治療的患者體內(nèi)改善或減輕疾病或病癥相關(guān)癥狀的劑量。在某些實施方式中，治療有效量是能夠減輕癌癥癥狀的中和劑用量，如通過阻止腫瘤生長、減慢腫瘤生長、減小腫瘤體積、降低癌細胞的侵襲性、抑制癌細胞的遷徙、粘附、和/或增殖，等等。確定中和劑的治療有效量和評估其治療效果的方法是本領(lǐng)域已知的，并在本文中做進一步描述。
以胃腸道外方式給藥的治療有效量的中和劑，其每次的劑量可以是，例如，在大約0.1至30mg/kg患者體重每天的范圍內(nèi)，典型的所使用中和劑的起始范圍在約2至10mg/kg內(nèi)。然而，如上所述，這些中和劑的推薦用量隨很多治療考慮因素而變動。如上所述，選擇合適劑量和進程的一個因素是所要得到的結(jié)果。例如，在治療惡化的或急性疾病時，開始可能需要較高的劑量。為了獲得最有效的結(jié)果，根據(jù)疾病或病癥，中和劑的施用應(yīng)盡可能的接近疾病或病癥的第一個征兆、診斷、出現(xiàn)、或發(fā)生時，或在疾病或病癥的復(fù)發(fā)過程中。
可用任何合適的方法施用中和劑，包括胃腸道外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、和鼻內(nèi)給藥，以及如果局部的免疫抑制治療需要，則進行病灶內(nèi)(intralesional)給藥。胃腸道外灌輸包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下給藥。
此外，可用脈沖灌輸對中和劑進行合適地給藥，例如，漸次降低中和劑的劑量。優(yōu)選地，注射方式給藥，靜脈內(nèi)或皮下注射最優(yōu)，部分取決于給藥是暫時的還是長期的。
本文的中和劑也可以與其它化合物一起施用，如細胞毒性劑、化療劑、免疫抑制劑和/或細胞因子。聯(lián)合給藥包括共同給藥、使用單獨的制劑或用單一的藥物制劑、以及以任一方式持續(xù)釋放，其中優(yōu)選地，在一段時間兩種(或所有的)活性制劑同時發(fā)揮其生物學(xué)活性。
本領(lǐng)域中有很多體內(nèi)和離體將核酸(如反義分子、RNAi分子、或核酶(任選地包含在載體中))插入患者細胞的方法，。對于體內(nèi)釋藥，核酸可直接注射入患者，通常是注射在需要中和劑的部位。對于離體治療，分離出患者細胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細胞內(nèi)，并將修飾過的細胞直接對施用給患者或者如包裹在多孔膜內(nèi)植入患者中(參見美國專利號4,892,538和5,283,187)。已經(jīng)有很多將核酸導(dǎo)入活細胞的技術(shù)。根據(jù)核酸是在體外轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)細胞內(nèi)，還是體內(nèi)轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)，這些技術(shù)有所不同。適合于將核酸體外轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞內(nèi)的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀方法，等等。用于離體遞送基因的常用載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。核酸也可以用水壓釋藥(增加壓力的靜脈內(nèi)注射)來給藥。
體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)的一個實例包括用病毒載體進行轉(zhuǎn)染(如腺病毒、單純皰疹病毒I、或腺相關(guān)病毒)和脂基系統(tǒng)(用于脂類介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)如，DOTMA、DOPE和DC-Chol)。在某些情況下，需要給核酸源提供可以靶向到目標細胞的制劑，如對細胞表面膜蛋白或靶向細胞具有特異性的抗體，靶向細胞上受體的配體等等。采用脂質(zhì)體時，可以使用與胞吞作用相關(guān)的細胞表面膜蛋白相結(jié)合的蛋白來靶向和/或利于細胞攝取，例如，對某特定細胞類型具有趨向性的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)過程中經(jīng)歷內(nèi)化的蛋白的抗體，以及靶向細胞內(nèi)部位和增強細胞內(nèi)半衰期的蛋白。受體介導(dǎo)的胞吞作用的技術(shù)由，例如，Wu等，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873410-3414(1990)描述。
根據(jù)本發(fā)明，治療還可以包括聯(lián)合療法。本文使用的“聯(lián)合療法”是指對需要一種藥物的患者與中和劑聯(lián)合進行治療或施用另一種藥物治療疾病。聯(lián)合療法可以是順序療法，即先用一種或多種藥物治療患者，然后再施用另一種，或者同時施用兩種或多種藥物。一些可以用在聯(lián)合療法中的藥物實例包括化療劑(順鉑、阿霉素、danurubicin、他莫西芬(tamoxiphen)、紫杉醇、氨甲喋呤等)、芳香酶抑制劑、施用血管生成抑制劑、特異地和非特異地免疫調(diào)節(jié)劑、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRMs)、集落刺激因子(CSFs)、干擾素、白細胞介素、自體同源腫瘤細胞疫苗、激素，等等。優(yōu)選地，聯(lián)合施用的藥物或其它制劑不干擾中和劑的治療活性。
在某些實施方式中，中和劑的給藥可以和傳統(tǒng)的癌癥治療相結(jié)合。優(yōu)選地，傳統(tǒng)的癌癥治療不干擾或降低中和劑的有效性。一些傳統(tǒng)的癌癥治療的實例包括手術(shù)(包括，例如冷凍手術(shù)、部分切除手術(shù)、根治性前列腺切除術(shù)、腫塊切除術(shù)、乳房切除術(shù)，等等)，化療，放療(例如，內(nèi)部放療、外粒子束放療)，近距離放射療法(例如，將輻射直接對原發(fā)腫瘤部位作用并使用單個導(dǎo)管減少放療時間進行乳腺癌治療)，激素切除療法(降低激素水平)，等等。
本發(fā)明進一步提供了通過使腫瘤與TFF3中和劑相接觸而減小腫瘤體積、減緩腫瘤生長、和/或阻止腫瘤生長的方法。接觸的實施可以，例如，在體內(nèi)進行，使用任何合適的方法使腫瘤暴露在TFF3中和劑下。例如，可以直接對腫瘤注射含有TFF3中和劑的組合物，或者用含有TFF3中和劑的組合物包被腫瘤，或者可以對患有腫瘤的對象或患者施用TFF3中和劑。可以用本領(lǐng)域已知的方法很容易地測定腫瘤體積及其生長率。
此外，可以通過對患者施用TFF3中和劑或?qū)⒓毎cTFF3中和劑相接觸來調(diào)控TFF3在組織或細胞內(nèi)的生理學(xué)效應(yīng)(如過量表達TFF3)。上文討論了由于TFF3表達而帶來的幾種生理學(xué)效應(yīng)，包括，例如，細胞運動性(例如，遷移能力)的增強以及對凋亡的抗性。
可以用一個試驗來評估細胞的活力、遷移、和潛在的侵襲力，該試驗包括創(chuàng)傷匯合生長的一皿細胞，并測量細胞向傷口的遷移(例如，通過延時攝影顯微術(shù)或者通過填入傷口的時間檢測)。其它兩種試驗使用了跨孔(transwell)濾膜，試驗中將細胞鋪于多孔跨孔插入物的頂端，并對遷移到底井或遷移到纖維結(jié)合蛋白包被的濾膜上的細胞進行計數(shù)。后面的這兩個試驗是“博伊登室”試驗的改良?？梢赃M一步改良跨孔試驗來測定趨化性(通過將化學(xué)引誘物置于底孔)，化學(xué)促活作用(通過將誘導(dǎo)運動性的化學(xué)物質(zhì)放置在孔的頂部和底部)以及侵襲力(通過用再生的細胞外基質(zhì)(如matrigel)包被孔)。
可以用任何常用的細胞毒性試驗來檢測凋亡和對凋亡的抗性。本領(lǐng)域已知很多種方法，如細胞形態(tài)、特征性的180bp DNA梯形帶型在瓊脂糖凝膠上的出現(xiàn)情況、TUNEL(TdT-介導(dǎo)的dUTP切口末端標記)試驗、流式細胞分析、DNA片段ELISA、以及細胞膜生物物理特性的改變。半胱氨酸蛋白酶中的caspase家族也已經(jīng)被鑒定為細胞自殺途徑的通用介體，caspase的活性試驗也已經(jīng)加入到用于檢測凋亡的方法庫中。乳酸脫氫酶(LDH)外漏試驗也用于檢測或測量凋亡?？梢再徺I到實施這些方法中多種試驗的試劑盒。
細胞，如差異表達TFF3的細胞，可以與TFF3中和劑在體外、體內(nèi)、或離體條件下互相接觸。可以用本文所述的任何制劑/給藥方法來實施接觸，或者采用，例如，將細胞暴露于含有TFF3中和劑的培養(yǎng)基的方法。例如，洗滌細胞、培養(yǎng)、或懸浮在溶液或瓊脂培養(yǎng)基中一定時間，使TFF3中和劑足以至少部分穿透細胞膜，和/或與細胞內(nèi)的TFF3多肽或TFF3多核苷酸相接觸。
制劑、劑量、藥物組合物可以根據(jù)期望的是局部還是系統(tǒng)治療以及根據(jù)需要治療的部位而以多種方法施用本發(fā)明的藥物組合物。給藥可以是局部(包括眼部或粘膜如陰道和直腸釋藥)，經(jīng)肺，例如通過吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮)，口服或胃腸道外。胃腸道外給藥包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或灌輸；或者顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給藥。
用于局部給藥的藥物組合物和制劑可以包括透皮的貼劑、藥膏、乳液、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體和粉末?？赡苄枰蚱谕褂贸Ｒ?guī)的藥物載體、水、粉末或油性的基質(zhì)、增稠劑等等。也可以使用包被的橡皮套、手套等等。
用于口服給藥的組合物和制劑包括粉末或顆粒、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、囊劑(sachets)或片劑?？赡苄枰褂迷龀韯?、矯臭劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑。
用于胃腸道外、顱內(nèi)或腦室內(nèi)給藥的組合物和制劑可以包括滅菌水溶液，其也可以含有緩沖液、稀釋劑以及其它合適的添加劑，如但不限于，滲透促進劑、載體化合物和其它藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明中的藥物組合物包括，但不限于，溶液、乳劑、和含有脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以由一系列組分產(chǎn)生，包括，但不限于，預(yù)先制備的液體、自乳化的固體和自乳化的半固體。
本發(fā)明的藥學(xué)物制劑可以方便地用單位劑量的形式表示，可以根據(jù)制藥工業(yè)熟知的傳統(tǒng)技術(shù)加以制備。這些技術(shù)包括將活性組分與藥學(xué)載體或賦形劑相接觸的步驟。通常是使活性組分與液體載體或細顆粒的固相載體或兩者一起，相互混勻并密切接觸，以此來制備制劑，如果需要，再對制品塑形。
可以將本發(fā)明的組合物制劑成多種可用劑型中的任一種，如但不限于，片劑、膠囊、囊片、液體糖漿、軟膠囊、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物也可以制劑配制為水、非水或混合介質(zhì)中的懸浮液。水相懸浮液可用進一步包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，包括如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮液也可含有穩(wěn)定劑。
在一些實施方式中，可以將藥物組合物配制成泡沫加以使用。藥物泡沫包括的制劑如，但不限于，乳劑、微乳劑、乳膏、凝膠和脂質(zhì)體。盡管這些制劑本質(zhì)上基本相似，它們的組分和最終產(chǎn)物的濃度(consistency)卻有所不同。這些組合物和制劑的制備通常是藥學(xué)和制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的，可以應(yīng)用到本發(fā)明的制劑和組合物中。
“藥學(xué)載體”或“賦形劑”是藥學(xué)可接受的溶劑、懸浮劑或任何其它的藥理學(xué)惰性的運載體，它們用于將一種或多種核酸遞送至動物中。賦形劑可以是液體的或固體的，選擇時則考慮到給藥的預(yù)定方式，以使其在與核酸及其它給定藥物組合物聯(lián)合施用時達到期望的用量、濃度(bulk，consistency)等。典型的藥學(xué)載體包括，但不限于，粘合劑(例如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙甲纖維素)；填料(例如乳糖和其它糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸鹽或酯或磷酸氫鈣等等)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、硅、膠體二氧化硅、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉，等等)；崩解劑(例如淀粉、淀粉羥乙酸鈉(sodium starchglycolate)等等)；以及濕潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉等等)。
不與核酸發(fā)生有害反應(yīng)的適用于胃腸道外給藥的藥學(xué)可接受的有機或無機賦形劑也可以用于本發(fā)明組合物的制劑。合適的藥學(xué)可接受載體包括，但不限于，水、鹽溶液、酒精、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
用于局部施用核酸的制劑可用包括滅菌的和不滅菌的水溶液或溶解于常用溶劑(如酒精)中的非水溶液，或者是在液體或固體油性基質(zhì)中的核酸溶液。溶液還可以含有緩沖液、稀釋劑和其它合適的添加劑?？梢允褂貌慌c核酸發(fā)生有害反應(yīng)的適用于胃腸道外給藥的藥學(xué)可接受的有機和無機賦形劑。
合適的藥學(xué)可接受賦形劑包括，但不限于，水、鹽溶液、酒精、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
本發(fā)明的組合物還可以含有其它的常見于藥物組合物的附加組分，其劑量水平為該領(lǐng)域制定的水平。因此，例如，組合物可用含有其它的、相容的、藥學(xué)活性材料，如止癢藥、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可以含有其它在對本發(fā)明的組合物進行各種劑型的物理制劑時有用的材料，如染料、矯臭劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，在添加這些材料時，它們應(yīng)當不會過度地干擾本發(fā)明組合物組分的生物學(xué)活性。可以對制劑進行滅菌，如果需要也可以與輔助劑相混合，例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖液、著色劑、矯臭劑和/或芳香物質(zhì)等等，它們不會與制劑的核酸發(fā)生有害的相互作用。
水性懸浮劑可含有增強懸浮劑粘度的物質(zhì)，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮劑也可以含有穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的一些實施方式提供的藥物組合物含有(a)一種或多種反義化合物和(b)通過非反義機制發(fā)揮作用的一種或多種其它化療劑。這樣的化療劑的實例包括，但不限于，抗癌藥物，如柔紅霉素、更生霉素、阿霉素、博萊霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、長春新堿、長春花堿、依托泊甙、替尼泊甙、順鉑和己烯雌酚(DES)。通常參見The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版，Berkow等，編，1987，Rahway，N.J.，1206-1228頁)?？寡姿?，包括但不限于非甾體抗炎藥和皮質(zhì)甾類，以及抗病毒藥物，包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和甘昔洛韋，也可用與本發(fā)明的組合物聯(lián)合使用。通常參見The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，第15版，Berkow等，編，1987，Rahway，N.J.，分別為2499-2506頁和46-49頁)。其它非反義化療劑也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢砸黄鹗褂没蝽樞蚴褂脙煞N或更多的化合物的組合。
癌癥的診斷、預(yù)后、療法的評估(治療法)以及控制本文所述的TFF3多核苷酸及其基因產(chǎn)物可以進一步作為遺傳或生化標記(例如血液或組織中)，用來檢測致癌途徑上的最早期的變化和/或監(jiān)控各種療法和預(yù)防干預(yù)的療效。例如，TFF3的表達水平可以是更差預(yù)后的跡象，因此就需要給患者施用更具攻擊性的化療或放療，或者反之。新穎的替代腫瘤特異性特征與對治療的反應(yīng)和患者得到的治療結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)性能夠確立預(yù)后的指示指標，這樣就能根據(jù)腫瘤的分子圖譜設(shè)計出合適的療法。這些療法包括抗體靶向、中和劑(例如小分子)和基因治療。確定TFF3的表達并將患者的圖譜與已知的正常組織和疾病變體中的表達相比較就可以確定對于該患者可能的最佳治療方案，這不僅是指治療的特異性方面，也指患者的舒適水平方面。替代腫瘤標記(surrogate tumor marker)，如多核苷酸表達，也可以用來更好地對癌癥的不同形式及疾病狀態(tài)加以分類。腫瘤學(xué)中廣泛使用的兩種分類方法都可以從本文所述的對多核苷酸對應(yīng)的基因表達水平的鑒定中獲益，借此它們可以對癌癥病癥加以分期，并對癌組織的性質(zhì)進行分級。
測量TFF3的表達在對患有或易患癌癥的患者的監(jiān)控方面有價值，可以在總體形態(tài)學(xué)水平下檢測不到的情況下從分子水平檢測到潛在的惡性事件。此外，TFF3多核苷酸以及對應(yīng)于這些多核苷酸的基因可以作為治療法而起作用，例如使用多核苷酸或它們編碼的基因產(chǎn)物來評估療效，如評估治療之前、中、后患者的腫瘤負荷(tumor burden)。
此外，鑒定為在一種類型的癌癥中差異表達的基因所對應(yīng)的多核苷酸，其也可能指示著其它類型癌癥的發(fā)展或發(fā)展的危險性也具有關(guān)聯(lián)，例如，當多核苷酸代表了一種基因在各種不同癌癥類型中具有差異表達。因此，例如對應(yīng)于一個基因的某種多核苷酸，其表達與轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌具有臨床關(guān)聯(lián)，它也可能同樣對胃癌或子宮內(nèi)膜癌具有臨床關(guān)聯(lián)。
分期分期是醫(yī)生用來描述患者癌癥狀態(tài)進程的一個方法，分期幫助醫(yī)生確定預(yù)后、計劃治療以及評估這種治療的效果。分期系統(tǒng)隨癌癥類型的不同而有所差異，但是通常包括以下“TNM”系統(tǒng)腫瘤類型，由T表示；癌癥是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移到臨近淋巴結(jié)，由N表示；以及癌癥是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移到身體的更遠部分，由M表示。通常，如果僅在原發(fā)病灶部位檢測到癌癥，而其并沒有擴散到任何淋巴結(jié)，這就稱為I期。如果其僅擴散到最近的淋巴結(jié)，則稱為II期。在III期中，癌癥通常已經(jīng)擴散到了原發(fā)病灶部位臨近的淋巴結(jié)。已經(jīng)擴散到身體較遠部分(如肝、骨、大腦或其它部位)的癌癥為IV期，也就是最晚期。
本文所述的多核苷酸能夠通過識別腫瘤侵占性(aggressiveness)的標記如潛在的轉(zhuǎn)移性，而起到與身體不同部位出現(xiàn)癌癥相同的有規(guī)則的分期過程。因此，如果II期癌癥伴隨有一種預(yù)示著高度潛在轉(zhuǎn)移性癌癥的多核苷酸，可以將邊界的II期腫瘤轉(zhuǎn)變成III期腫瘤，則需要更具攻擊性的療法。相反，如果存在一種預(yù)示著更低潛在轉(zhuǎn)移性的多核苷酸，那么就可以對腫瘤做出較為保守的分期。
癌癥分級級別(grade)是一個用以描述腫瘤與其相同類型的正常組織具有怎樣相似程度的術(shù)語。根據(jù)細胞形態(tài)、細胞組織以及其它分化標志，用顯微鏡下的腫瘤外觀來識別腫瘤級別。作為通常的規(guī)則，腫瘤的級別對應(yīng)于其生長率或侵占性，未分化或高級別的腫瘤通常比充分分化的或低級別的腫瘤更具攻擊性。通常將以下的指導(dǎo)方針用于腫瘤分級1)GX不能評估級別；2)G1充分分化；G2中度分化；3)G3不充分分化；4)G4未分化。本發(fā)明考慮的多核苷酸在確定腫瘤級別時尤其有用，因為它們不僅可以輔助確定腫瘤細胞的分化狀態(tài)，也可以識別分化以外的在確定腫瘤的侵占性方面有用的其它因素，如潛在轉(zhuǎn)移性。
癌癥的檢測可以用TFF3表達模式來檢測對象體內(nèi)的癌癥，尤其是結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌。結(jié)直腸癌是人類最常見的腫瘤之一，也可能是遺傳性腫瘤形成最常發(fā)生的形式。預(yù)防和早期檢測是控制并治愈結(jié)直腸癌的關(guān)鍵要素。結(jié)直腸癌起始于息肉，息肉是很小的在結(jié)腸內(nèi)壁上形成的細胞良性生長。在幾年的時間內(nèi)，這些息肉中的一些積累了更多的突變并發(fā)生癌變。已經(jīng)鑒定了多發(fā)性家族結(jié)直腸癌，總結(jié)如下1)家族腺瘤性息肉(FAP)；2)加德納綜合征(Gardner′ssyndrome)；3)遺傳性非息肉結(jié)腸癌(HNPCC)；和4)北歐猶太教徒中的家族性結(jié)直腸癌。合適的多核苷酸的表達可以用在診斷、預(yù)后和癌癥控制中。癌癥檢測的確定可以單獨使用TFF3序列的表達水平或與其它基因聯(lián)合使用。可以通過比較本文所述多核苷酸對應(yīng)的一種或多種基因產(chǎn)物的水平，并比較另一已知在癌組織中有差異的序列的總水平來確定結(jié)腸癌的攻擊性和/或潛在轉(zhuǎn)移性，例如，p53的表達，DCC、ras、FAP(參見，例如Fearon ER，等，Cell(1990)61(5)759；Hamilton SR等，Cancer(1993)72957；Bodmer W，等，Nat Genet.(1994)4(3)217；Fearon ER，Ann N YAcad Sci.(1995)768101)。例如，可以將對應(yīng)于本文所述多核苷酸的TFF3的表達水平與癌基因(例如，ras)或腫瘤抑制基因(例如，F(xiàn)AP或p53)的水平相比較來檢測癌癥的發(fā)展情況。因此，特異性標記的多核苷酸的表達可以用于區(qū)分正常的和癌變的結(jié)腸組織，用于區(qū)分細胞來源不同的癌癥，用于區(qū)分具有不同的潛在轉(zhuǎn)移率的癌癥等等。對于癌癥標記的綜述，參見，例如Hanahan等(2000)Cell 10057-70，全文引入本文作為參考。
癌癥的治療本發(fā)明提供了以TFF3的表達為特征的抑制癌細胞生長和/或調(diào)控癌癥粘附、遷移和/或轉(zhuǎn)移的方法。其實例包括消化道癌癥，如結(jié)腸癌、胃癌和肝癌，以及其它癌癥，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。在某些實施方式中，癌癥表現(xiàn)出不同的TFF3表達水平。在另一些實施方式中，TFF3在癌中表達上調(diào)。在還有一些實施方式中，癌癥不是結(jié)腸癌，在另一些實施方式中，癌癥不是前列腺癌。
本發(fā)明包括了任何癌癥的治療，其中TFF3中和劑的施用調(diào)控(例如，抑制)以下至少一種情況癌細胞的增殖、癌細胞遷移、癌細胞粘附和/或轉(zhuǎn)移。如同實施例中所示，TFF3中和劑已經(jīng)顯示出對于癌細胞粘附和癌細胞增殖的抑制。對粘附的抑制可以通過抑制癌細胞對原發(fā)腫瘤以外部位的粘附并發(fā)展成腫瘤而對轉(zhuǎn)移具有調(diào)控效果。通常，該方法包括將癌細胞與調(diào)控以下方面的物質(zhì)相接觸(1)對應(yīng)于TFF3的多核苷酸的表達；或(2)TFF3多肽的水平和/或活性。這些方法降低了TFF3在癌細胞中的表達或降低了TFF3的水平和/或活性。這種抑制可以降低癌細胞的增殖、遷移和/或粘附，降低腫瘤生長，減小腫瘤體積，降低腫瘤的侵襲性等等。
“降低腫瘤或癌細胞的生長”包括，但不限于，降低癌(或腫瘤)細胞的增殖，并且降低非癌細胞轉(zhuǎn)變成癌細胞的發(fā)生率?？梢杂萌魏我阎脑囼灪苋菀椎卮_定癌細胞的生長是否有所降低，這樣的試驗包括，但不限于，[3H]-胸苷整合；在一段時間內(nèi)對細胞進行計數(shù)；檢測和/或測量結(jié)腸癌相關(guān)的標記(例如，CEA，CA19-9，和LASA)，等等。
本發(fā)明特別提供了治療TFF3相關(guān)癌癥的方法，如結(jié)腸癌、乳腺癌和/或前列腺癌，該方法包括對有需要的個體施用降低癌細胞生長的物質(zhì)，施用劑量足以降低癌細胞的生長和治療癌癥?？梢杂靡阎囊幌盗邪┌Y診斷試驗中的任何一種來評估某種物質(zhì)，或該物質(zhì)的某個具體用量是否能夠有效地治療患者的癌癥，這些診斷試驗包括，但不限于，乙狀結(jié)腸鏡檢查、直腸鏡檢查、直腸檢查、活組織結(jié)腸鏡檢查，對比放射造影研究、CAT掃描、血管造影術(shù)、以及個體血液中與結(jié)腸癌相關(guān)的腫瘤標記的檢查。可以系統(tǒng)地或局部施用該物質(zhì)。局部施用可以在治療如實體瘤時有效。
涉及TFF3的診斷以及其它檢測方法本發(fā)明提供了將本文所述的TFF3中和劑、TFF3多肽、和TFF3多核苷酸用于診斷目的的方法和其它一些方法。在具體的但非限制性的實施方式中，這些方法在檢測TFF3相關(guān)的癌細胞方面有用，如結(jié)腸、乳腺、卵巢、胃、和前列腺癌細胞，這些方法還利于對對象體內(nèi)癌癥及其嚴重性的診斷(例如，腫瘤級別、腫瘤負荷，等等)，以及利于確定對象的預(yù)后和評估對象對療法的應(yīng)答(例如，通過提供對療效的測量，例如，通過評估化療中和化療后的腫瘤負荷)。檢測可以建立在細胞內(nèi)TFF3的水平上，例如結(jié)腸癌細胞和/或?qū)Π┘毎麅?nèi)的TFF3多肽的檢測。本發(fā)明的檢測方法可以在體外或體內(nèi)進行，可以是對分離細胞的檢測，或者是對完整的組織或體液(例如血液、血漿、血清、尿液等等)的檢測。
因此，本發(fā)明提供了檢測生物樣品中TFF3的方法，通過接觸樣品并檢測樣品中TFF3差異化表達的跡象，來檢測生物樣品中癌癥的存在情況。跡象的表現(xiàn)形式可以是TFF3中和劑與樣品中的TFF3相結(jié)合。本領(lǐng)域已知多種檢測和測量結(jié)合水平的方法，包括如基于ELISA的試驗等等?？梢詫⒔Y(jié)合水平與標準樣品加以比較而顯示TFF3的表達是低于還是高于正常樣品中的水平。在一些實施方式中，檢測到的TFF3表達高于正常水平指示存在癌癥。
本發(fā)明進一步提供了通過檢測患者癌樣品中TFF3的差異表達跡象來確定患者對TFF3中和劑敏感性的方法患者。本文使用的術(shù)語“敏感性”用于描述施用TFF3中和劑對其為可接受治療方法的患者，也就是，該術(shù)語描述的患者可能對TFF3中和劑的治療做出積極地應(yīng)答。與對治療不敏感的患者相比，對本發(fā)明的治療方法敏感的癌癥患者可能表現(xiàn)出TFF3的差異表達，例如在疾病組織中。
本發(fā)明的檢測方法可以作為試劑盒的一部分。因此，本發(fā)明進一步提供了檢測癌細胞中TFF3的存在情況和/或其表達水平的試劑盒(例如，通過檢測由感興趣的差異表達基因編碼的mRNA)，和/或提供了檢測生物樣品內(nèi)TFF3編碼的多肽的存在情況和/或其表達水平的試劑盒。這些試劑盒的使用程序可以由臨床實驗室、實驗室、醫(yī)務(wù)工作者或私人單獨進行操作。本發(fā)明的用于檢測多核苷酸(其在結(jié)腸癌細胞中差異表達)編碼的多肽的試劑盒含有一個特異地與多肽結(jié)合的部分，它可以是特異的抗體、反義分子、RNAi分子、核酶或小分子。本發(fā)明的用以檢測在癌細胞中差異表達的多核苷酸的試劑盒含有一個與該多核苷酸特異雜交的部分。該試劑盒可以任選提供其它在操作中有用的組分，包括但不限于，緩沖液、顯影劑、標記、反應(yīng)表面、檢測手段、對照樣品、標準、指導(dǎo)和說明信息。
檢測癌細胞中的TFF3多肽在某些實施方式中，提供了通過檢測TFF3過表達細胞來檢測TFF3相關(guān)癌癥的方法。已知的一系列方法中的任一種都可以用于檢測，包括但不限于，免疫分析，使用對所編碼多肽具特異性的抗體，如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)等等；以及對于所編碼多肽的功能試驗，例如結(jié)合活性或酶活。
例如，可以在不事先分離編碼多肽的情況下對細胞實施免疫熒光試驗。先將細胞固定到固相支持物上，如顯微鏡載玻片或微量滴定孔。該固定步驟可以使細胞膜具有通透性。細胞膜的通透性允許多肽特異性的抗體結(jié)合上去。然后，將固定的細胞暴露于所編碼的多肽特異性的抗體中。為了增加試驗的靈敏度，可以進一步將細胞暴露于第二抗體中，二抗已經(jīng)進行標記并結(jié)合在一抗上，而一抗則對所編碼的多肽具有特異性。通常，可以對二抗的標記進行檢測，例如，用熒光標記進行標記。表達編碼多肽的細胞就會被熒光標記上，并且在顯微鏡下很容易觀察到。參見，例如Hashido等(1992)Biochem.Bioplzys.Res.Comm.1871241-1248。
在閱讀本說明書后，普通的技術(shù)人員很容易明白本文所述的檢測方法和其它方法可以方便地做出變動。這樣的變動屬于本發(fā)明的目的范圍內(nèi)。例如，在上述的檢測方案中，用于檢測的探針可以固定在固相支持物上，將待測樣品與固定化的探針相接觸。然后，可以用一系列方法檢測待測樣品與探針的結(jié)合，例如，通過檢測與待測樣品相結(jié)合的可檢測標記，以利于檢測待測樣品-固定化探針的復(fù)合物。
本發(fā)明進一步提供了檢測生物樣品中TFF3多肽存在情況和/或測量TFF3多肽水平的方法，使用的是TFF3特異性的抗體。這樣的方法通常包括a)將樣品與TFF3特異性的抗體相接觸；和b)檢測抗體和樣品分子之間的結(jié)合情況。
如果與合適的對照相比較檢測到TFF3特異性抗體的特異結(jié)合，則表示樣品中存在TFF3。合適的對照包括已知不含有TFF3的樣品；和與對于所編碼的多肽非特異性的抗體相接觸的樣品，例如，抗個體基因型抗體。本領(lǐng)域已知一系列檢測特異性抗體-抗原相互作用的方法，都可以用于本方法中，包括，但不限于，標準的免疫組化方法、免疫沉淀、酶免疫分析和放射免疫分析。通常特異性的抗體直接或間接地連有可檢測的標記。直接連接的標記包括放射性同位素；可以檢測到其產(chǎn)物的酶(例如熒光素酶、半乳糖苷酶等等)；熒光標記(例如異硫氰酸熒光系、羅丹明、藻紅蛋白等等)；熒光發(fā)射金屬，例如152Eu，或其它的鑭系元素，可通過金屬螯合基團如EDTA連接到抗體上；化學(xué)發(fā)光化合物，例如，魯米諾、異魯米諾(isoluminol)、吖啶鹽類，等等；生物發(fā)光化合物，例如，熒光素、水母發(fā)光蛋白(綠色熒光蛋白)，等等?？梢詫⒖贵w連接(耦合)到不溶性的支持物上，如聚苯乙烯板或珠。間接標記包括對編碼的多肽具特異性的抗體(“第一特異性抗體”)的二抗，其中對二抗用上述的方法進行標記；以及特異結(jié)合對的成員，例如，生物素-抗生物素蛋白，等等。可以將生物樣品接觸并固定在固相支持物或載體上，如硝基纖維素，其能固定化細胞、細胞顆?；蚩扇苄缘鞍住Ｈ缓罂梢杂煤线m的緩沖液洗滌支持物，再與連有可檢測標記的第一特異性抗體相接觸。檢測方法是本領(lǐng)域已知的，并選擇對可檢測標記所發(fā)出的信號合適的檢測方法。通常與合適的對照、以及合適的標準相比較來完成檢測。
在某些實施方式中，改動這些方法以適應(yīng)體內(nèi)使用的需要，例如，以定位或識別存在TFF3結(jié)合癌細胞的部位。在這些實施方式中，將連有可檢測標記的部分，例如，將TFF3特異性的抗體施用于給個體(例如，用注射的方法)，并用標準的成像技術(shù)對標記的細胞進行定位，這樣的成像技術(shù)包括，但不限于，磁共振成像、X射線電子計算機斷層掃描攝影術(shù)，等等。這樣，表達TFF3的細胞則有不同的標記。
檢測癌細胞中的TFF3多核苷酸提供了通過檢測癌細胞中TFF3轉(zhuǎn)錄物在細胞內(nèi)的表達情況而檢測TFF3癌細胞的方法。一系列已知方法中的任一種都可以用于檢測，包括，但不限于，用與TFF3多核苷酸雜交的多核苷酸進行雜交并檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；使用特異的寡核苷酸引物用聚合酶鏈式反應(yīng)來檢測轉(zhuǎn)錄物；使用與結(jié)腸癌細胞內(nèi)差異表達的基因雜交的多核苷酸作為探針進行原位雜交。可以使用這些方法檢測和/或測量癌細胞內(nèi)TFF3基因表達的mRNA水平。在某些實施方式中，這些方法包括a)在允許雜交的條件下將樣品與TFF3多核苷酸相接觸；和b)如果存在的話，檢測雜交情況。
如果與合適的對照相比較檢測到差異雜交，則表示在樣品中存在癌細胞內(nèi)差異表達的多核苷酸。合適的對照包括，例如，已知含有TFF3多核苷酸的樣品。允許雜交的條件是本領(lǐng)域已知的?？梢匀魏我阎姆椒ㄊ褂眠B有合適標記的多核苷酸完成檢測，包括，但不限于，原位雜交、PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-PCR)、和“Northern”或RNA雜交、或這些技術(shù)的組合。本領(lǐng)域已知一系列的標記和多核苷酸的標記方法，都可以用在本發(fā)明的試驗方法中?？梢酝ㄟ^與合適對照的比較來確定特異性雜交。
本發(fā)明提供了通常含有TFF3多核苷酸中至少12個毗鄰核苷酸的多核苷酸，可以用于一系列的目的，如作為檢測和/或測量在結(jié)腸癌細胞內(nèi)差異表達的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄水平的探針。與本文揭示的多核苷酸特異性雜交的探針應(yīng)當比背景雜交的檢測信號至少高5-、10-、或20-倍，背景雜交是由其它不相關(guān)的序列提供的。值得指出的是本文使用的“探針”是指用于檢測待測樣品中TFF3基因產(chǎn)物的多核苷酸序列。普通的技術(shù)人員很容易理解的是，可以給探針添加可檢測的標記，并與，例如含有來自待測樣品(例如，mRNA)的固定化多肽的微陣列相接觸。或者可以將探針固定化在微陣列上，而對待測樣品添加可檢測的標記。本發(fā)明方法的這些以及其它的變化形式都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可以用核苷酸探針來檢測與所提供的多核苷酸相對應(yīng)的基因的表達。在Northern雜交中，電泳分離mRNA，并與探針接觸。檢測與一定大小的mRNA種類雜交的探針?？梢杂嬃侩s交的量來確定表達的相對量，例如在特定的條件下，在與細胞的原位雜交中使用探針來檢測表達。探針也可用于體內(nèi)而對雜交序列做診斷性檢測。通常用放射性同位素標記探針。也可使用其它類型的可檢測標記，如發(fā)色基團、熒光基團和酶。核苷酸雜交試驗的其它實施例描述于WO92/02526和美國專利號5,124,246。
PCR是另一種檢測少量目標核酸的方法(參見，例如，Mullis等，Meth.Enzymol.(1987)155335；美國專利號4,683,195和4,683,202)。使用兩種與目標核酸雜交的引物多肽核苷酸來啟動反應(yīng)。引物可以含有本文揭示的多核苷酸內(nèi)3′或5′區(qū)域的一段序列。或者，如果引物就是這些多核苷酸的3′和5′部分，它們不需要雜交或互補。在用熱穩(wěn)定的聚合酶擴增目標后，可以用本領(lǐng)域已知的方法檢測擴增的目標核酸，例如，Southern雜交。也可以用傳統(tǒng)的雜交技術(shù)(例如，Southern雜交、Northern雜交，等等)來檢測mRNA或cDNA，描述于Sambrook等，″Molecular CloningA Laboratory Manual″New York，Cold Spring HarborLaboratory，1989)(例如，不進行PCR擴增)。通常，mRNA或使用聚合酶由mRNA產(chǎn)生的cDNA可以進行純化，并用凝膠電泳進行分離，再轉(zhuǎn)移到固相支持物上，如硝基纖維素。將固相支持物暴露于標記過的探針中，洗滌以去除任何未雜交的探針，檢測含有標記過探針的雙鏈。
可以對來自單個細胞的DNA進行使用PCR擴增的方法，盡管更方便使用至少約105細胞。聚合酶鏈式反應(yīng)的使用描述于Saiki等(1985)Science 239487，可以在Sambrook，等Molecular Cloning.A Laboratory Manual，CSH Press 1989，pp.14.2-14.33，中找到目前技術(shù)的綜述，兩者均引入本文作為參考?？梢栽跀U增反應(yīng)中加入可檢測的標記。合適的可檢測標記包括熒光基團(例如，異硫氰酸熒光系(FITC)、羅丹明、德克薩斯紅、藻紅蛋白、別藻藍蛋白、6-羧基熒光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基熒光素、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA))，放射性標記(例如，32P、35S、3H，等等)，等等。標記可以是雙階段的系統(tǒng)，其中將多核苷酸綴合到生物素、半抗原等等上，具有一個高度親和結(jié)合的部分，例如，抗生物素蛋白、特異性抗體等等，其中的結(jié)合部分綴合在可檢測的標記上。標記可以綴合到一種或兩種引物上?；蛘?，可以標記擴增中所用的核苷酸庫，而將標記整合到擴增產(chǎn)物中去。
微陣列多核苷酸微陣列提供了可以檢測樣品中大量多核苷酸或多肽的高通量技術(shù)。該技術(shù)可以用做檢測差異表達的工具。本領(lǐng)域已知一系列的生產(chǎn)微陣列的方法以及這些方法的變化形式可在本發(fā)明中考慮使用。例如，可以將多核苷酸探針點到二維基質(zhì)的底片上(例如，玻璃、硝基纖維素，等等)來生產(chǎn)微陣列，或者用結(jié)合有探針的微陣列來生產(chǎn)。探針與底片的結(jié)合可以用共價鍵也可以用非特異相互作用，如疏水作用?？梢詫Χ嗪塑账徇B接可檢測的標記(例如，使用放射性或熒光標記)，然后再與探針雜交。在樣品的未結(jié)合部分被洗滌掉后即可檢測到雙鏈多核苷酸，其包含結(jié)合到探針多核苷酸的標記樣品多核苷酸?；蛘?，可以將待測樣品的多核苷酸固定在微陣列上，而對探針進行可檢測的標記。構(gòu)建微陣列的技術(shù)和使用這些微陣列的方法描述于，例如，Schena等(1996)ProcNatl Acad SciU S A.93(20)10614-9；Schena等(1995)Science 270(5235)467-70；Shalon等(1996)Genome Res.6(7)639-45，美國專利號5,807,522，EP799 897；WO 97/29212；WO 97/27317；EP785280；WO 97/02357；美國專利號5,593,839；美國專利號5,578,832；EP 728 520；美國專利號5,599,695；EP 721016；美國專利號5,556,752；WO95/22058；和美國專利號5,631,734。
微陣列可用于，例如，檢測基因的差異表達，也可以用來檢測基因功能。例如，可以使用微陣列來檢測TFF3基因的差異表達，其中對待測細胞和對照細胞(例如，癌細胞和正常細胞)的表達進行比較。例如，癌細胞中特定mRNA的高表達，而在對應(yīng)的正常細胞中并未觀察到這一現(xiàn)象，則指示為癌癥特異性基因產(chǎn)物。微陣列的典型用途進一步描述于，例如，Pappalarado等，Sem.RadiationOncol.(1998)8217；和Ramsay Nature Biotechnol.(1998)1640。此外，使用微陣列的檢測方法的很多變化形式也都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可以將待測樣品固定在固相支持物上，然后再用探針接觸，而不是將探針固定在固相支持物上。
制品在本發(fā)明的其它實施方式中，提供了含有(對治療本文所述的疾病或病癥有用的)TFF3中和劑的制品。該制品含有一個容器和一個插入其中或與之相連的標記或包裝。合適的容器包括，例如，瓶、小藥水瓶、注射器等等。可以用多種材料形成容器，如玻璃或塑料。容器裝有或含有的組合物對治療所選的疾病或病癥有效，也可以含有滅菌的取藥通道(例如，容器可以是一個靜脈內(nèi)輸液袋或一個小藥水瓶，其含有可以由皮下注射針刺透的塞子)。組合物中至少一種活性制劑是TFF3中和劑，如TFF3反義分子、RNAi分子、核酶、小分子或抗體。標記或包裝插頁表明該組合物用于治療患有或易患癌癥的患者，例如，結(jié)腸、乳腺或前列腺癌。制品可以進一步含有第二個容器，其內(nèi)含有藥學(xué)可接受的稀釋緩沖液、如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸緩沖鹽溶液、Ringer′s溶液和右旋糖溶液。它還可以進一步含有其它從商業(yè)和使用者角度有益的材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、針和注射器。
用以下非限制性的實施例來闡明本發(fā)明的更具體的細節(jié)。說明書中所有公開的引文都明確地將全文引入本文作為參考。
實施例列出以下實施例來為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員提供有關(guān)如何制備和使用本發(fā)明的詳盡揭示和描述，但這并不意味著對發(fā)明者認為的他們發(fā)明的范圍做出限制，也不代表以下的實驗是所進行的全部或僅有的實驗。我們努力確保數(shù)據(jù)的準確性(例如，數(shù)量、溫度等等)，但是需要說明可能有一些實驗誤差和偏差。除非另外說明，分數(shù)是指質(zhì)量分數(shù)，分子量是平均分子質(zhì)量，溫度的單位為℃，壓力則為大氣壓或接近大氣壓。
實施例1生物材料的來源用于試驗中以實現(xiàn)本發(fā)明的生物材料描述如下。
患者組織樣品的來源使用激光捕獲顯微切割(LCM)技術(shù)從患者體內(nèi)采集正常和癌變的組織，這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，Ohyama等(2000)Biotechniques 29530-6；Curran等(2000)Mol.Pathol.5364-8；Suarez-Quian等(1999)Biotechniques 26328-35；Simone等(1998)Trends Genet 14272-6；Conia等(1997)J.Clin.Lab.Anal.1128-38；Emmert-Buck等(1996)Science 274998-1001).以下的表2提供了每個患者的信息，從他們身上分離出前列腺組織樣品，包括1)“患者ID”，是出于辨別目的而給患者指定的號碼；2)“組織類型；和3)腫瘤的“Gleason級別”。所有原發(fā)腫瘤的組織病理學(xué)表明腫瘤是腺癌。
表2.前列腺患者數(shù)據(jù)
實施例2使用微陣列檢測差異表達從實施例1所述的患者細胞內(nèi)分離總RNA，并由此制備cDNA探針。由于LCM能夠分離出特異的細胞類型，所以就能提供基本上均質(zhì)的細胞樣品，這樣就得到近似純的RNA樣品。
先用含有T7 RNA聚合酶啟動子的引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著進行第二條DNA鏈的合成。然后使用T7啟動子介導(dǎo)的表達對cDNA進行體外轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生反義RNA(參見，例如，Luo等(1999)Nature Med 5117-122)，再將反義RNA轉(zhuǎn)變成cDNA。再使用T7啟動子將第二組的cDNA體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA。任選地，再將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA，允許多達三輪的T7介導(dǎo)的擴增以產(chǎn)生更多的反義RNA。這樣，該步驟提供了2或3輪的體外轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生用于熒光標記的終RNA。
先把對照RNA加入反義RNA混合物中，再從RNA起始材料產(chǎn)生熒光標記的cDNA，以此生產(chǎn)探針。將產(chǎn)自腫瘤RNA樣品的熒光標記cDNA與從正常細胞RNA樣品制備的熒光標記cDNA相比較。例如，用Cy3熒光染料(綠色)標記來自正常細胞的cDNA探針，而從腫瘤細胞制備的cDNA探針則用Cy5熒光染料(紅色)標記，反之亦可。
每一個使用的微陣列都有相同的空間排列和對照點組。對于每個總點數(shù)約為9,216的微陣列，每個微陣列分為兩個部分，每個部分具有的微陣列在每一半含有12組32×12點。兩個部分點樣相同，這樣每個微陣列至少對每個克隆都有兩個重復(fù)。
用在微陣列上的多核苷酸都來自公共信息源和從如上所述的選定細胞系和患者組織產(chǎn)生的cDNA庫。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，使用Molecular Dynamics GenIII點樣儀將這些來源的長度在約0.5kb至2.0kb的PCR擴增產(chǎn)物點到微陣列上。微陣列上24個部分中的每一個的第一排都約有32個對照點，包括4個陰性對照和8個待測多核苷酸。在標記反應(yīng)前，將待測多核苷酸點進每個樣品中，濃度范圍在2-600pg/每片，比例為1∶1。對于每個微陣列設(shè)計，用兩片都與標記反應(yīng)中反向標記的待測樣品進行雜交。這樣每個克隆就約有4個重復(fù)檢測，對于每個樣品兩個為一種顏色，兩個為另一顏色。
差異表達試驗的實施方法如下，將等量的來自同一患者腫瘤細胞和正常細胞的探針相混合。在60℃條件下，將微陣列置于5X SSC/0.2％ SDS/1mM EDTA中孵育2小時進行預(yù)雜交，然后在水中洗滌三次，在異丙醇中洗滌兩次。微陣列預(yù)雜交之后，再用探針混合物與微陣列雜交，采用高度嚴格的雜交條件(42℃，在50％甲酰胺、5X SSC和0.2％SDS中雜交過夜)。雜交后，在55℃條件下如下洗滌三次1)先在1X SSC/0.2％ SDS中洗滌；2)然后在0.1X SSC/0.2％ SDS中洗滌；以及3)在0.1X SSC洗滌。
然后使用Molecular Dynamics Generation III雙色激光掃描/檢測儀掃描微陣列，檢測綠色和紅色的熒光。使用BioDiscovery Autogene軟件處理圖像，將來自每次掃描組的數(shù)據(jù)標準化以提供相對正常值的表達比率。根據(jù)美國專利序列號60/252,358所述的算法分析微陣列實驗所得的數(shù)據(jù)，該申請由E.J.Moler，M.A.Boyle，和F.M.Randazzo提交于2000年11月20日，題為“cDNA微陣列數(shù)據(jù)的精度與準確性”(Precision and accuracy in cDNA microarray data)，該申請?zhí)貏e引入本文作為參考。
對試驗進行重復(fù)，這次對兩種探針用相反的顏色進行標記，這樣就在兩個“顏色方向”進行實驗。有時每個實驗都重復(fù)兩片甚至更多片(每個顏色方向一片)。微陣列上每個序列的熒光水平都表示為來自4片微陣列的8個重復(fù)點/基因或來自2片微陣列的4個重復(fù)點/基因或其它排列的幾何平均值的比率。對位于每個重復(fù)部分的點樣陽性對照數(shù)據(jù)進行標準化，標準化的精確度包含在最終確定的每個差異的顯著性中。也可將每個點的熒光強度與每個重復(fù)部分中的陰性對照加以比較，以確定每個樣品中哪些點具有可檢測的顯著表達水平。
對每組重復(fù)點應(yīng)用熒光強度統(tǒng)計分析，以評估每個差異檢測的精確度和顯著性，所得的p值用來檢驗無效假設(shè)——即在每個患者的腫瘤和正常樣品之間不存在表達差異。在最初分析微陣列時，如果p＞10-3，則接受假設(shè)，而對那些點的差異比率定為1.000。其它所有的點在腫瘤和正常樣品之間的表達都存在顯著的差異。如果腫瘤樣品具有可檢測的表達而正常樣品沒有，則比率定在1000，因為正常樣品中的表達值應(yīng)為0，而比率不能為一個數(shù)學(xué)上的有效值(例如，無限大)。如果正常樣品具有可檢測的表達而腫瘤樣品沒有，則將比率定在0.001，因為腫瘤樣品中的表達值應(yīng)當為0，而比率不能為一個數(shù)學(xué)上的有效值。這后兩種情況在本文中稱為“開/關(guān)”。
實施例3細胞中TFF3的表達癌中TFF3 mRNA的上調(diào)用激光捕獲顯微切割法從每個癌癥患者樣品中采集腫瘤樣品的癌細胞及其鄰近的正常細胞(有關(guān)組織樣品的來源，參見實施例1)。從每個樣品的RNA制備標記的探針，并用于檢測cDNA微陣列芯片(參見實施例2)。將每個微陣列芯片同時與患者個體的正常和癌癥探針雜交(正常和癌癥探針用不同的熒光試劑加以標記)。對每個患者樣品，所確定的表達水平表示為癌細胞中的表達與正常細胞中的表達之比值。表3列出的是在至少20％的所檢測的患者中，出現(xiàn)癌細胞與正常上皮細胞的表達比值高于2倍(＞2x)、高于5倍(＞5x)或低于一半(＜0.5x)的患者百分比。
表3癌癥中TFF3 mRNA的上調(diào)
正常組織對TFF3的表達用實時定量PCR確定正常(N)和癌癥(C)組織中TFF3 mRNA在全組織中的表達(例如，非激光捕獲切割的樣品，以此代表組織樣品的所有細胞類型)。結(jié)果列于圖1，以全組織中的HPRT對數(shù)值進行標準化。Y軸上mRNA表達水平的數(shù)值是用HPRT作為標準化對照得出的相對值。癌癥樣品代表來自8個患者個體的腫瘤樣品庫(有關(guān)生物材料的來源，參見實施例1)。術(shù)語″3+3″是指Gleason級別6，而″4+3″是指Gleason級別7。同樣值得指出的是，在正常的肺組織(同結(jié)腸組織一樣)，TFF3由杯狀細胞表達并與粘液一起分泌。(參見，例如，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，1999，159，1330)。
癌癥患者中TFF3的免疫組化(IHC)檢測用免疫親和性的純化兔抗人TFF3多克隆抗體對乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、和前列腺癌(CA)患者個體以及正常組織對照(NL)的組織樣品切片(組織的總數(shù)#)進行染色。此外，也對幾個重要的正常器官的樣品進行染色。表4列出了對TFF3存在情況顯示為陰性(-)和陽性(+)的樣品數(shù)目，以及每個類型中TFF3陽性樣品的百分比。
表4IHC總結(jié)
細胞系中TFF3的表達用實時定量PCR確定某些細胞系中TFF3 mRNA的表達。結(jié)果列于圖2。表達水平值是用β-肌動蛋白作為標準化對照得到的相對值。同樣注意，Y軸是對數(shù)尺度，表示TFF3在不同的細胞系中的表達差別很大。細胞系包括HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細胞)、BMEC-1(腦微血管內(nèi)皮細胞)、Du145(人前列腺癌細胞)、PC3(人前列腺癌細胞)、LnCap(人前列腺癌細胞)、MDAPca2B(人前列腺癌細胞)、22rV1(人前列腺癌細胞)、HPV7(人前列腺癌細胞)、HPV10(人前列腺癌細胞)、RWPE-1(人前列腺上皮細胞)、RWPE-2(惡性人前列腺上皮細胞)、PrEC(人前列腺上皮細胞)、NIH 3T3(成纖維細胞)、HT29(人結(jié)腸癌)、SW620(人結(jié)腸癌)、Colo320(人結(jié)腸癌)、MDA231(乳腺癌)、MDA435(乳腺癌)、和MCF7(乳腺癌)。
實施例4基因表達的反義調(diào)控由癌細胞中多核苷酸代表的差異表達的基因，其表達可用反義敲除技術(shù)進行分析，以確定腫瘤發(fā)生中，例如在促進轉(zhuǎn)移表型的情況下，基因產(chǎn)物的作用和功能。
可以設(shè)計很多不同的與本文所述的差異表達基因產(chǎn)生的mRNA互補的寡核苷酸，作為反義寡核苷酸，并測定它們抑制基因表達的能力。使用與差異表達的基因?qū)?yīng)的多核苷酸序列和軟件程序HYBsimulator第4版(可用于Windows95/Windows NT或Power Macintosh，RNAture，Inc.1003 Health Sciences Road，West，Irvine，CA 92612美國)對每個候選目標設(shè)計特異性的反義寡核苷酸組。在設(shè)計反義寡核苷酸時考慮的因素包括1)寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)；2)目標基因的二級結(jié)構(gòu)；3)特異性，與其它表達基因沒有或僅有最低的交叉雜交；4)穩(wěn)定性；5)長度和6)末端GC含量。這樣設(shè)計反義寡核苷酸就能使它們在生理溫度(例如，培養(yǎng)細胞提供細胞內(nèi)雜交的最佳溫度，例如約37℃)和高度嚴格的條件下與其目標序列雜交，而形成的同型二聚體最少。
使用寡聚體組和HYBsimulator程序，設(shè)計出3至10個反義寡核苷酸及其它們的反向?qū)φ?，并對每個候選mRNA轉(zhuǎn)錄物加以合成，這些轉(zhuǎn)錄物來自與感興趣的目標多核苷酸序列相對應(yīng)的基因。一旦合成并定量，在一系列癌細胞系中對寡聚體進行篩選，篩選其對轉(zhuǎn)錄物的敲除效率。使用光周期計(lightcycler)定量分析mRNA的水平以確定敲除效率。選擇轉(zhuǎn)錄物敲除水平最高的寡聚體用在基于細胞的增殖試驗、非固定依賴性生長試驗(anchorage independent growthassay)和凋亡試驗中，其中敲除水平至少約為50％，優(yōu)選約80-90％，高達95％或更高達到檢測不出mRNA。
可以通過轉(zhuǎn)染入LNCaP，PC3，22Rvl，MDA-PCA-2b，或DU145前列腺癌細胞來測定每個設(shè)計的反義寡核苷酸抑制基因表達的能力。對于每個轉(zhuǎn)染混合物，將載體分子(如脂類、脂類衍生物、類脂分子、膽固醇、膽固醇衍生物或類膽固醇分子)在水中制備成0.5mM的工作濃度，超聲形成均一的溶液，并用0.45μm的PVDF膜加以過濾。然后在滅菌Millipore水中將反義或?qū)φ展押塑账嶂苽錇?00μM的工作濃度。將寡核苷酸進一步用OptiMEMTM(Gibco/BRL)稀釋，在微量離心管中稀釋到2μM，或大約20μg寡核苷酸/ml OptiMEMTM。在另一個微量離心管中，將載體分子，用量通常是大約1.5-2nmol載體/μg反義寡核苷酸，稀釋在與稀釋寡核苷酸所用的相同體積的OptiMEMTM中。將稀釋的反義寡核苷酸迅速加到稀釋的載體中，并上下吹吸混合。加入細胞的寡核苷酸最終濃度為30nM。
使用Roche LightCycler實時PCR儀或PerkinElmer GeneAmp儀對癌細胞系中轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)感興趣的目標基因所對應(yīng)的目標mRNA的水平進行定量。將目標mRNA的值相對內(nèi)部對照(例如，β-肌動蛋白)進行標準化。對于每個20μl的反應(yīng)體系，將提取的RNA(通?？偣?.2-1μg)置于滅菌的0.5或1.5ml微量離心管內(nèi)，加水至總體積達到12.5μl。每管中加入7.5μl的緩沖液/酶混合液，該混合液的制備方法如下，(按順序)混合2.5μl H2O、2.0μl 10X反應(yīng)緩沖液、10μl寡聚dT(20pmol)、1.0μl dNTP混合物(每種10mM)、0.5μl RNAsin(20u)(Ambion，Inc.，Hialeah，F(xiàn)L)、和0.5μl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(50u)(Ambion，Inc.)。上下吹吸以混合內(nèi)含物，并在42℃條件下孵育反應(yīng)混合液1小時。將各管的內(nèi)含物在擴增前先離心。
以下列順序混合制備擴增混合物1X PCR緩沖液II，3mM MgCl2，140μM每種dNTP，0.175pmol每種寡聚體，SYBR Green的1∶50,000稀釋液，0.25mg/ml BSA，1單位Taq聚合酶，和H2O至20μl。(PCR緩沖液II的濃度為10X，購自Perkin-Elmer，Norwalk，CT)。在1X的濃度，其含有10mM Tris pH 8.3和50mM KCl。SYBR Green(Molecular Probes，Eugene，OR)是一種在與雙鏈DNA結(jié)合時發(fā)出熒光的染料。在擴增過程中產(chǎn)生雙鏈PCR產(chǎn)物，來自SYBR Green的熒光即增強。對于每個20μl量的擴增混合物，加入2μl的模板RT，并根據(jù)標準方案進行擴增。結(jié)果表示為相對于未轉(zhuǎn)染細胞、僅用載體轉(zhuǎn)染(空白轉(zhuǎn)染)細胞或用反向?qū)φ展押塑账徂D(zhuǎn)染的細胞，對應(yīng)基因產(chǎn)物表達量降低的百分比。
實施例5TFF3表達的反義調(diào)控反義寡核苷酸根據(jù)實施例4中列出的步驟設(shè)計了多種反義(AS)寡核苷酸，制備并測定了它們在SW620細胞(一種高水平表達TFF3的結(jié)腸癌細胞系)中調(diào)控TFF3 mRNA水平的能力。上面的表1列出了寡核苷酸。具有相對較高降低活性的反義寡核苷酸包括具有SEQ ID NO9，10，15，16，17和18的寡核苷酸。對于其中的每一個，都合成了反向序列的寡核苷酸用作對照(RC)以表示反義特異性。
使用AS降低TFF3 mRNA將每個寡核苷酸轉(zhuǎn)染入SW620細胞并在轉(zhuǎn)染后約36個小時使用實時定量PCR檢測剩余TFF3 mRNA的水平，以此測定TFF3反義寡核苷酸的有效性。
圖3描述了起初篩選對應(yīng)于SEQ ID NO9-18的AS寡核苷酸所得的結(jié)果。對應(yīng)于SEQ ID NO9和10的AS寡核苷酸顯示最為有效。設(shè)計作為對照1和對照2的AS寡核苷酸代表不相關(guān)的AS序列，并用作對照來評估對TFF3 mRNA的特異性降低。
圖4和5描述了將對應(yīng)于SEQ ID NO9，10和15的AS寡核苷酸與它們的反向?qū)φ?RC)向比較所得的結(jié)果?？梢姡珹S寡核苷酸顯示出預(yù)期的特異性。
圖6進一步描述了對應(yīng)于SEQ ID NO10，15，17和18的AS寡核苷酸在降低TFF3 mRNA表達的效力。術(shù)語“UT”表示未轉(zhuǎn)染的SW620。
實施例6表達對增殖的效果可以在惡性乳腺癌細胞系(MDA-MB-231(″231″))；SW620結(jié)腸直腸癌細胞；SKOV3細胞(一種人卵巢癌細胞系)；或LNCaP，PC3，22Rvl，MDA-PCA-2b，或DU145前列腺癌細胞中評估基因表達對抑制細胞增殖的效果。
將細胞在96孔板中鋪板至約60-80％匯合(confluence)。將反義或反向?qū)φ展押塑账嵩贠ptiMEMTM中稀釋至2μM。然后，可以將寡核苷酸-OptiMEMTM加入送運載體，選擇的送運載體可以對試驗中使用的特定細胞類型達到最佳效果。然后，進一步將寡聚體/送運載體混合物稀釋進細胞上含血清的培養(yǎng)基中。用于所有實驗的寡核苷酸的最終濃度可以約為300nM。
用上述方法制備反義寡核苷酸(參見實施例4和5)。在37℃條件下轉(zhuǎn)染細胞過夜，第二天早晨再用新鮮培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染混合物。如上述實施例4和5所述的方法實施轉(zhuǎn)染。
那些能夠抑制SW620細胞增殖的反義寡核苷酸對應(yīng)的基因在產(chǎn)生和維持癌變的結(jié)腸細胞的癌癥表型方面起作用。那些能夠抑制SKOV3細胞增殖的反義寡核苷酸對應(yīng)的基因在產(chǎn)生和維持癌變的乳腺細胞的癌癥表型方面起作用。那些能夠抑制MDA-MB-231細胞增殖的反義寡核苷酸對應(yīng)的基因在產(chǎn)生和維持癌變的卵巢細胞的癌癥表型方面起作用。那些能夠抑制LNCaP，PC3，22Rvl，MDA-PCA-2b或DU145細胞增殖的反義寡核苷酸對應(yīng)的基因在產(chǎn)生和維持癌變的前列腺細胞的癌癥表型方面起作用。
實施例7通過耗盡mRNA來耗盡多肽從而對細胞死亡進行的誘導(dǎo)為了評估耗盡目標mRNA對細胞死亡的作用，可以轉(zhuǎn)染LNCaP，PC3，22Rvl，MDA-PCA-2b或DU145細胞，或來源于感興趣癌癥的其它細胞用于增殖試驗。對于存在順鉑(cis)情況下的細胞毒性效果，使用相同的方案，只是細胞存在于含有2μM藥物的培養(yǎng)基中。每天，通過測量因為細胞膜損壞而釋放到培養(yǎng)基中的LDH酶的數(shù)量來檢測細胞毒性。使用Roche Molecular Biochemicals提供的細胞毒性檢測試劑盒來測量LDH的活性。所得數(shù)據(jù)表示為在相同的時間點和相同的處理條件下釋放到培養(yǎng)基中的LDH與存在于孔中的總LDH的比值(rLDH/tLDH)。包括使用BCL2(一個已知的抗凋亡基因)的反義和反向控制寡核苷酸作為陽性對照；相對于對照寡核苷酸(由于轉(zhuǎn)染引起的背景細胞毒性)，BCL2 mRNA的損失造成細胞死亡的增加。
實施例8TFF3反義寡核苷酸的細胞毒性和抗增殖效果在癌細胞中的效果在用AS和RC寡核苷酸(實施例4和5)轉(zhuǎn)染后的不同時間點，根據(jù)實施例6和7的步驟在SW620細胞中測定TFF3反義寡核苷酸的細胞毒性和抗增殖效果。測量釋放到培養(yǎng)基中的LDH(乳酸脫氫酶)與總LDH的比值來確定細胞毒性。完整貼壁細胞中的LDH水平則表示增殖的情況。同樣用Bcl-2特異性的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細胞作為陽性對照。Bcl-2是已知的抗凋亡蛋白，阻斷該基因的表達會使凋亡增加。結(jié)果表示于圖7中。
還在不同的培養(yǎng)條件的前列腺癌細胞(Pca2B)中觀察細胞毒性效果。結(jié)果示于圖8中。對前列腺癌細胞CU145和22Rvl得到類似的效果。在PC3和LNCaP細胞中觀察到較弱的效果。用已知能夠抑制TFF3表達的反義寡核苷酸及其反向序列用做對照。
正常細胞用不表達TFF3的正常成纖維細胞(MRC9)和正常乳腺上皮細胞(184B5)作為對照來測定AS寡核苷酸的非特異性細胞毒性效果。結(jié)果示于圖9中。這些結(jié)果表明TFF3 AS對表達TFF3的細胞具有特異的效果，而不是由于AS寡核苷酸帶來的總體毒性。
實施例9基因表達對細胞遷移的影響可以在LNCaP，PC3，22Rvl，MDA-PCA-2b，或DU145前列腺癌細胞中評估基因表達對細胞遷移的抑制效果，使用靜態(tài)內(nèi)皮細胞結(jié)合試驗、非靜態(tài)的內(nèi)皮細胞結(jié)合試驗和遷移試驗。
對于靜態(tài)內(nèi)皮細胞結(jié)合試驗，如上文所述(參見實施例4和5)制備反義寡核苷酸。使用前兩天，用上文所述方法(參見實施例4和5)將前列腺癌細胞(CaP)鋪板，并用反義寡核苷酸進行轉(zhuǎn)染。使用前一天，用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，在使用當天，用含有2μM CellTracker green CMFDA(Molecular Probes，Inc.)的新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，并且孵育細胞30min。孵育后，用新鮮培養(yǎng)基(不含CMFDA)替換CaP培養(yǎng)基，再孵育細胞30-60min。使用CMF PBS/2.5mM EDTA或胰蛋白酶使細胞脫壁，離心并重新懸浮在pH 7.0的DMEM/1％BSA/10mMHEPES中。最后，對CaP細胞進行計數(shù)，并以1×106細胞/ml的濃度重新懸浮。
使用前三天，將內(nèi)皮細胞(EC)鋪到96孔板上，達到40-50％匯合(confluence)。使用當天，用PBS洗滌1次，并在每個孔中加入50λpH 7的DMDM/1％BSA/10mM HEPES。然后，在每個孔中pH 7的DMEM/1％BSA/10mMHEPES中加入50K(50λ)CaP細胞。再孵育培養(yǎng)板30min，并用含有Ca++和Mg++的5X PBS洗滌。最后一次洗滌以后，在每個孔中加入100μL PBS，并在熒光讀板儀中讀出熒光強度(Ab492/Em 516nm)。
對于非靜態(tài)內(nèi)皮細胞結(jié)合試驗，如上文所述制備CaP。使用前三天，將EC鋪到24孔板上，達到30-40％匯合(confluence)。使用當天，用細胞因子處理一部分細胞6小時，再用2X PBS洗滌。然后，在每個孔中加入在pH 7DMEM/1％BSA/10mM HEPES的150K-200K CaP細胞。將培養(yǎng)板置于搖床上(70RPM)30分鐘，再用含有Ca++和Mg++的3X PBS洗滌。最后一次洗滌以后，在每個孔中加入500μL PBS，并在熒光讀板儀中讀出熒光強度(Ab492/Em516nm)。
對于轉(zhuǎn)移試驗，如上文所述制備CaP，有以下改動。使用當天，用含有5μM CellTracker green CMFDA(Molecular Probes，Inc.)的新鮮培養(yǎng)基替換CaP培養(yǎng)基，并且孵育細胞30min。孵育后，用新鮮培養(yǎng)基(不含CMFDA)替換CaP培養(yǎng)基，再孵育細胞30-60min。使用CMF PBS/2.5mM EDTA或胰蛋白酶使CaP細胞脫壁，離心并重新懸浮在EGM-2-MV培養(yǎng)基中。最后，對CaP細胞進行計數(shù)，并以1×106細胞/ml的濃度重新懸浮。
使用前5-7天，將EC鋪到Fluorblok transwell上，達到30-40％匯合(confluence)。使用前三天和使用當天，用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。然后，在每個transwell中加入50K標記的CaP細胞。第一次熒光讀數(shù)前30min，向鋪有EC的濾膜上加上10μg的FITC-葡聚糖(10K MW)。然后在多個時間點在熒光讀板儀中讀出熒光強度(Ab492/Em 516nm)。
那些能夠抑制LNCaP，PC3，22Rvl，MDA-PCA-2b或DU145前列腺癌細胞結(jié)合到內(nèi)皮細胞的反義寡核苷酸表明其對應(yīng)的基因可能在產(chǎn)生和維持癌變的前列腺細胞的癌癥表型方面起作用。那些能夠抑制LNCaP，PC3，22Rvl，MDA-PCA-2b或DU145前列腺癌細胞遷移的反義寡核苷酸表明其對應(yīng)的基因可能在產(chǎn)生和維持癌變的前列腺細胞的癌癥表型方面起作用。
實施例10基因表達對集落形成的效果可以在軟瓊脂試驗中測定基因表達對SW620細胞，SKOV3細胞，MD-MBA-231細胞，LNCaP細胞，PC3細胞，22Rvl細胞，MDA-PCA-2b細胞和DU145細胞的集落形成的效果。軟瓊脂試驗的操作方法如下首先，在細胞鋪層的幾小時內(nèi)，鋪一層2ml的0.6％瓊脂溶于培養(yǎng)基的底層。細胞層形成在底層上，用上文所述方法使用0.05％胰蛋白酶并在培養(yǎng)基中洗滌兩次以從培養(yǎng)皿上去除轉(zhuǎn)染的細胞。在Coulter計數(shù)器對細胞進行計數(shù)，并重新懸浮在培養(yǎng)基中，濃度為每ml 106。將10μl的液體與培養(yǎng)基一起加入96孔板中(以用WST1檢驗計數(shù))，或進一步稀釋用于軟瓊脂試驗。在0.6％的底層瓊脂上加上在800μ1 0.4％的瓊脂中的2000個細胞，設(shè)置重復(fù)孔。在細胞層凝固后，在上面滴上2ml培養(yǎng)基，并且不使用運送載體而加上反義或反向?qū)φ展丫垠w。(用實施例3中所述方法制備)每3-4天加入新鮮培養(yǎng)基和寡聚體。10天至3周內(nèi)形成集落。用肉眼對集落區(qū)域進行計數(shù)。Wst-1代謝值可以用來補償起始細胞數(shù)目的細小差異。可以對更大的區(qū)域進行掃描來記錄視覺差異。
那些能夠抑制SW620細胞的集落形成的反義寡核苷酸表明其對應(yīng)的基因在產(chǎn)生和維持癌變的結(jié)腸細胞的癌癥表型方面起作用。那些能夠抑制SKOV3細胞的集落形成的反義寡核苷酸表明其對應(yīng)的基因在產(chǎn)生和維持癌變的乳腺細胞的癌癥表型方面起作用。那些能夠抑制MDA-MB-231細胞的集落形成的反義寡核苷酸表明其對應(yīng)的基因在產(chǎn)生和維持癌變的卵巢細胞的癌癥表型方面起作用。那些能夠抑制LNCaP，PC3，22Rvl，MDA-PCA-2b，或DU145細胞的集落形成的反義寡核苷酸表明其對應(yīng)的基因在產(chǎn)生和維持癌變的前列腺細胞的癌癥表型方面起作用。
實施例11反義寡核苷酸對癌細胞的非固定依賴性生長的抑制用TFF3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞系MDA Pca-2b(如圖10所示；有關(guān)反義寡核苷酸的制備，參見實施例4和5)在96孔板中培養(yǎng)每孔1000或500個細胞(如圖10所示)，并在含有軟瓊脂的培養(yǎng)基中懸浮生長7天。根據(jù)細胞攝入的Alamar藍來檢測軟瓊脂細胞集落的生長。結(jié)果表明對照AS(C79-7)和TFF3 AS寡核苷酸(但不是單獨的RC寡核苷酸)顯著地抑制前列腺癌細胞系的非固定依賴性生長。對前列腺癌細胞系PC3也得到了類似的結(jié)果。
實施例12患者中前列腺癌內(nèi)檢驗產(chǎn)物差異表達的功能分析可以進一步分析癌細胞中差異表達基因序列的基因產(chǎn)物(如TFF3)以確定基因產(chǎn)物在腫瘤發(fā)生中的作用和功能，例如，促進或抑制癌變表型的發(fā)展。例如，可以通過阻斷基因產(chǎn)物在細胞中的功能來評估與本文鑒定的基因相對應(yīng)的基因產(chǎn)物的功能。例如，在基因產(chǎn)物是分泌型的或與細胞膜相結(jié)合的情況下，可以產(chǎn)生阻斷抗體并加入細胞以檢測其對細胞表型的效果，如細胞轉(zhuǎn)化為癌變細胞的情況下，尤其是癌變的表型。為了產(chǎn)生抗體，選擇對應(yīng)于所選基因產(chǎn)物的克隆，并獲得代表完整編碼序列的部分或全部的序列，并產(chǎn)生抗體。然后，將抗體與細胞結(jié)合，并評估其對腫瘤發(fā)生的效果。
當本文所鑒定的差異表達的基因，其基因產(chǎn)物與已知功能的蛋白表現(xiàn)出序列同源性時(例如與特定的激酶或蛋白酶)和/或與已知功能的蛋白家族表型出同源性時(例如含有存在于蛋白酶家族或激酶家族的結(jié)構(gòu)域或其它共有序列)，可以使用抑制或增強對應(yīng)蛋白或蛋白家族功能的小分子來檢測該基因產(chǎn)物在腫瘤發(fā)生中的作用以及該基因產(chǎn)物的活性。
其它的功能試驗包括，但不限于，那些分析對應(yīng)基因表達對細胞周期和細胞遷移效果的試驗。實施這些試驗的方法是本領(lǐng)域所熟知的。
實施例13毗連群比對(contig assembly)和其它基因表征本發(fā)明提供的多核苷酸的序列(例如TFF3)可以用來擴展多核苷酸所對應(yīng)的基因序列信息(例如，具有本文所述多核苷酸序列的一個基因或由基因編碼的mRNA)。該擴展的序列信息可以反過來用于進一步表征所對應(yīng)的基因，這又反過來提供有關(guān)基因產(chǎn)物本質(zhì)的額外信息(例如，基因產(chǎn)物的正常功能)。這些額外信息又能為基因產(chǎn)物用做治療靶位提供額外的證據(jù)，并為能夠調(diào)控其活性的制劑類型提供進一步的指導(dǎo)。
在一個實施例中，使用存在于一個克隆中的本發(fā)明的多核苷酸的一個序列進行毗連群比對?！芭B群”是從具有重疊的(例如共有或基本相似)序列信息的核酸序列中比對所得的核苷酸的連續(xù)序列。Chiron合成的公共可得的ESTs(表達序列標記)序列和來自于多個cDNA文庫的各種克隆的序列都可以用在毗連群比對中。
使用軟件程序Sequencher，4.05版，根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)進行毗連群比對，以此產(chǎn)生了毗連群ed序列的總體比對。然后，可以用毗連群比對中所得的序列信息用Sequencher程序獲得來源于毗連群的共同序列。共同序列用作在TeraBLASTN中搜尋DGTI Double Twist Gene Index(Double Twist，Inc.，Oakland，CA)的查詢序列，后者包含了公共數(shù)據(jù)庫中的所有EST和非冗余序列。
通過毗連群比對和使用同源性搜尋軟件程序，本文提供的序列信息可以很容易地加以擴增來確定或確定預(yù)測的具有本發(fā)明所述多核苷酸序列的基因。所得的信息可以進一步用來鑒定本文所述多核苷酸對應(yīng)的基因產(chǎn)物的功能。盡管對于本發(fā)明的操作并不是必須的，對于所對應(yīng)的基因的鑒定卻可以在靶向調(diào)控其活性和調(diào)控癌癥表型(例如抑制癌變、增殖等等)的基因治療的設(shè)計中提供指導(dǎo)。
實施例14TFF3中和劑的體內(nèi)檢測可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的候選藥物的臨床前評估程序來檢測TFF3中和劑在動物模型中的抗腫瘤活性。合適的動物模型包括用于前列腺癌的TRAMP小鼠(購自NCI-Frederick Mouse Models of Human Cancer Consortium Repository或The Jackson Laboratory)和用于結(jié)腸癌的Min小鼠(購自The Jackson Laboratory)。用于其它癌癥的動物模型是本領(lǐng)域所熟知的。
實施例15TFF3表位可以用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任一種來鑒定用于抗體識別和產(chǎn)生的TFF3線性表位。一些作為實施例的方法包括探測來源于抗原氨基酸序列的肽的抗體結(jié)合能力?？梢允褂肂IACORE或ELISA方法來評估結(jié)合情況。其它技術(shù)包括在平面固相支持物(“芯片”)上將肽文庫暴露于抗體，并用固相篩選領(lǐng)域所使用的多種方法中的任何一種來檢測結(jié)合情況。此外，噬菌體展示可以用來篩選肽文庫以在幾輪生物淘汰(biopanning)后選擇到表位。根據(jù)本發(fā)明的合適的抗體中和劑能夠識別線性或構(gòu)象的表位，或其組合。
下表5提供了已經(jīng)鑒定為線性表位的TFF3部位，其適合抗TFF3抗體的識別。
表5
實施例16抗TFF3的多克隆抗體抑制腫瘤細胞的生長A.多克隆抗體的生產(chǎn)麻醉新西蘭白兔并在第0天和第28天使用編碼人TFF3的DNA表達載體進行免疫。具體地，對于每次免疫，對每只兔肌肉內(nèi)注射0.6mg的DNA表達載體，并對注射部位短暫地施用溫和的電流以刺激該部位內(nèi)肌肉細胞攝取DNA。然后，每月給兔肌肉內(nèi)注射重組人TFF3蛋白以加強免疫，重組蛋白在MF-59佐劑中或在不完全弗氏佐劑中乳化。每次免疫后14天采集血樣，用ELISA試驗測定由血樣產(chǎn)生的血清以確定對重組人TFF3蛋白產(chǎn)生的抗體反應(yīng)的滴度。然后，采用層析的方法通過蛋白A柱分離血清組分，從而在每個樣品中純化IgG抗體組分。
B.SW620增殖試驗為了測定兔多克隆抗體能否影響癌細胞的存活，將取自免疫兔的純化IgGs的系列稀釋液加入癌細胞系(SW620)，Western雜交顯示這些癌細胞系分泌TFF3蛋白。用于此試驗，先以600細胞/孔的濃度將SW620細胞加入96孔板中，細胞生長在含有10％的胎牛血清(FBS)的生長培養(yǎng)基中。24小時后(第0天)，棄去培養(yǎng)基，然后加入含有1％FBS和不同濃度來自免疫或預(yù)免疫兔的IgG的新鮮生長培養(yǎng)基。每種IgG的濃度都在四個重復(fù)孔中加以測定。在第4天，再從板中棄去培養(yǎng)基，向孔中加入含有1％FBS和各IgG組分的部分。在第0，1，4，5，6和7天，使用“細胞滴度單溶液細胞增殖試驗”(Promega)測定每個孔中細胞的相對數(shù)目。
對于來自一種免疫兔(兔707)的IgG抗體，這樣一個試驗的結(jié)果列于圖11中。該圖將第7天檢測到的含IgG孔中的增殖數(shù)量加以比較，將所含的IgG取自第一次免疫之前兔的孔(免疫前)與取自幾輪免疫之后的(“免疫日156”)做比較。含有“免疫日156”IgG的孔顯示出的增殖顯著低于含有“免疫前”IgG的孔。
盡管本發(fā)明是參照其具體的實施方式加以描述的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解的是可以在不背離本發(fā)明精神實質(zhì)和范圍的前提下對其做出很多改動，也可以用等價物加以替換。此外，可以對本發(fā)明的目的、精神和范圍做出很多修改以適應(yīng)特定的情形、材料、物質(zhì)組成、過程、程序步驟或各步驟。所有這樣的修改都在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>希龍公司(CHIRON CORPORATION)M.J加納塔普(Janatpour，Mary，J.)C.萊因哈德(Reinhard，Christoph)P.加西亞(Garcia，Pablo)<120>作為抗癌治療靶標的三葉因子3(TFF3)<130>CHIR0003-500(19154.005)<150>US 60/493,173<151>2003-08-07<150>US 60/498,438<151>2003-08-28<160>28<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>74<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Leu Gly Leu Val Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu1 5 10 15Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg20 25 30Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg35 40 45Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys50 55 60Pro Leu Thr Arg Lys Thr Glu Cys Thr Phe65 70<210>2<211>73<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Leu Gly Leu Val Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu1 5 10 15Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg20 25 30Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg35 40 45
Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys50 55 60Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe65 70<210>3<211>80<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Met Ala Ala Arg Ala Leu Cys Met Leu Gly Leu Val Leu Ala Leu Leu1 5 10 15Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu Tyr Val Gly Leu Ser Ala Arg Gly Cys20 25 30Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr35 40 45Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro50 55 60Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe65 70 75 80<210>4<211>130<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Gln Glu Arg Thr Gly Ala Ala Thr Ala Arg Arg Glu Ser Leu Pro1 5 10 15Gln Ala Asn Asn Pro Glu Gln Leu Cys Lys Gln Arg Cys Ile Asn Glu20 25 30Ala Ser Trp Thr Met Lys Arg Val Leu Ser Cys Val Pro Glu Pro Thr35 40 45Val Val Met Ala Ala Arg Ala Leu Cys Met Leu Gly Leu Val Leu Ala50 55 60Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn65 70 75 80
Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys Gly Tyr Pro His85 90 95Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg100 105 110Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys115 120 125Thr Phe130<210>5<211>398<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5gatgctgggg ctggtcctgg ccttgctgtc ctccagctct gctgaggagt acgtgggcct 60gtctgcaaac cagtgtgccg tgccggccaa ggacagggtg gactgcggct acccccatgt120cacccccaag gagtgcaaca accggggctg ctgctttgac tccaggatcc ctggagtgcc180ttggtgtttc aagcccctga ctaggaagac agaatgcacc ttctgaggca cctccagctg240cccctgggat gcaggctgag cacccttgcc cggctgtgat tgctgccagg cactgttcat300ctcagttttt ctgtcccttt gctcccggca agctttctgc tgaaagttca tatctggagc360ctgatgtctt aacgaataaa ggtcccatgc tccacccg398<210>6<211>685<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6gccaaaacag tgggggctga actgacctct cccctttggg agagaaaaac tgtctgggag 60cttgacaaag gcatgcagga gagaacagga gcagccacag ccaggaggga gagccttccc120caagcaaaca atccagagca gctgtgcaaa caacggtgca taaatgaggc ctcctggacc180atgaagcgag tcctgagctg cgtcccggag cccacggtgg tcatggctgc cagagcgctc240tgcatgctgg ggctggtcct ggccttgctg tcctccagct ctgctgagga gtacgtgggc300ctgtctgcaa accagtgtgc cgtgccagcc aaggacaggg tggactgcgg ctacccccat360gtcaccccca aggagtgcaa caaccggggc tgctgctttg actccaggat ccctggagtg420ccttggtgtt tcaagcccct gcaggaagca gaatgcacct tctgaggcac ctccagctgc480ccccggccgg gggatgcgag gctcggagca cccttgcccg gctgtgattg ctgccaggca540ctgttcatct cagcttttct gtccctttgc tcccggcaag cgcttctgct gaaagttcat600atctggagcc tgatgtctta acgaataaag gtcccatgct ccacccgagg acagttcttc660
gtgcctgaaa aaaaaaaaaa aaaaa 685<210>7<211>491<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7ggagtcctga gctgcgtccc ggagcccacg gtggtcatgg ctgccagagc gctctgcatg 60ctggggctgg tcctggcctt gctgtcctcc agctctgctg aggagtacgt gggcctgtct120gcaaaccagt gtgccgtgcc agccaaggac agggtggact gcggctaccc ccatgtcacc180cccaaggagt gcaacaaccg gggctgctgc tttgactcca ggatccctgg agtgccttgg240tgtttcaagc ccctgcagga agcagaatgc accttctgag gcacctccag ctgcccccgg300ccgggggatg cgaggctcgg agcacccttg cccggctgtg attgctgcca ggcactgttc360atctcagctt ttctgtccct ttgctcccgg caagcgcttc tgctgaaagt tcatatctgg420agcctgatgt cttaacgaat aaaggtccca tgctccaccc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa480aaaaaaaaaa a 491<210>8<211>432<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>8cgctccccag tagaggaccc ggaaccagaa ctggaatccg cccttaccgc ttgctgccaa 60aacagtgggg gctgaactga cctctcccct ttgggagaga aaaactgtct gggagcttga120caaaggcatg caggagagaa caggagcagc cacagccagg agggagagcc ttccccaagc180aaacaatcca gagcagctgt gcaaacaacg gtgcataaat gaggcctcct ggaccatgaa240gcgagtcctg agctgcgtcc cggagcccac ggtggtcatg gctgccagag cgctctgcat300gctggggctg gtcctggcct tgctgtcctc cagctctgct gaggagtacg tgggcctgtc360tgcaaaccag tgtgccgtgc cagccaagga cagggtggac tgcggctacc cccatgtcac420ccccaaggag tg432<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>9tccttggctg gcacggcaca ct 22
<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>10cgggagcaaa gggacagaaa agc23<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>11gaagaactgt cctcgggtgg agc23<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>12tcagaaagtc tcaggcacga agaac 25<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>13gcagcagaaa taaagcacaa cctca 25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>14aacagtagcg agagtggttg tgaaa 25<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>15cggcacggca cactggtttg ca22<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>16ggtgcattct gtcttcctag tcagg 25<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>17ggctccagat atgaactttc agcag 25<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>18ggtggagcat gggaccttta ttcgt 25<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TFF3反義寡核苷酸<400>19tggcacggca cactggtttg ca22<210>20<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽
<400>20Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val1 5<210>21<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽<400>21Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽<400>22Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp1 5<210>23<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽<400>23Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys1 5<210>24<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽<400>24Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu1 5<210>25<211>9
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽<400>25Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu1 5<210>26<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽<400>26Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu1 5<210>27<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽<400>27Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys1 5<210>28<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>化學(xué)合成的肽<400>28Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys1 權(quán)利要求
1.TFF3中和劑在制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述TFF3中和劑包含核酸。
3.如權(quán)利要求1和2中任一項所述的用途，其特征在于，所述癌癥是乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌或胃癌。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的用途，其特征在于，TFF3在所述癌癥的細胞中差異表達。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述中和劑包含反義分子。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述反義分子包含或重疊SEQ IDNO5-19中的任何一個序列。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述中和劑包含RNAi分子。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述RNAi分子包含或重疊對應(yīng)于SEQ ID NO5-19中的任何一個序列。
9.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述TFF3中和劑包含抗體，所述抗體特異性地與TFF3結(jié)合。
10.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌癥不是結(jié)腸癌或前列腺癌。
11.TFF3中和劑在制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途，所述藥物與常規(guī)癌癥治療聯(lián)合使用。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，所述常規(guī)的癌癥治療是化學(xué)療法。
13.如權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于，所述常規(guī)的癌癥治療是激素消融治療。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述激素是雄性激素。
15.TFF3中和劑在制備調(diào)控細胞中凋亡的藥物中的用途。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，所述細胞是哺乳動物的細胞。
17.如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，所述細胞是癌細胞。
18.如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，所述細胞是乳腺、前列腺、結(jié)腸、卵巢或胃的細胞。
19.TFF3中和劑在制備抑制腫瘤生長或減小腫瘤體積的藥物中的用途。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述腫瘤包含TFF3在其中差異表達的細胞。
21.TFF3中和劑在制備用于調(diào)控細胞中與TFF3表達相關(guān)的至少一種生理效應(yīng)的藥物中的用途。
22.如權(quán)利要求21所述的用途，其特征在于，所述生理效應(yīng)是提高細胞運動能力或抗凋亡。
23.TFF3中和劑在制備用于抑制細胞遷移、粘附或增殖的藥物中的用途。
24.TFF3中和劑在制備用于降低癌細胞侵染力的藥物中的用途。
25.TFF3中和劑在制備用于調(diào)控細胞中TFF3表達的藥物中的用途。
26.一種在生物樣品中檢測TFF3的方法，所述方法包括將所述樣品與TFF3中和劑接觸，并檢測所述中和劑和所述樣品中TFF3間的結(jié)合。
27.一種在生物樣品中檢測癌癥的存在的方法，所述方法包括將所述生物樣品與TFF3中和劑接觸，并檢測所述生物樣品中TFF3差異表達的跡象，其中TFF3差異表達的跡象指示了癌癥的存在。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述檢測包括將所述接觸的結(jié)果與對照進行比較。
29.一種檢測患者對TFF3中和劑敏感性的方法，所述方法包括檢測TFF3在所述患者的癌癥樣品中的差異表達，其中TFF3差異表達的跡象指示了該患者對所述TFF3中和劑敏感。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述TFF3的差異表達的跡象是在患者癌癥樣品中TFF3的上調(diào)。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述患者的癌癥樣品來自于乳腺、前列腺、結(jié)腸、卵巢或胃組織。
32.一種評估患者中癌癥進展的方法，所述方法包括將第一時間點時患者中TFF3的表達與第二時間點時TFF3的表達進行比較，其中第二時間點時TFF3的表達比第一時間點時有所增加指示了所述癌癥的進展。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述提高了的TFF3表達提高了至少約25％的表達。
34.一種檢測患者中癌癥轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加的方法，所述方法包括將第一時間點時患者中TFF3的表達與第二時間點時TFF3的表達進行比較，其中第二時間點時TFF3的表達相對于第一時間點時有所增加指示了所述轉(zhuǎn)移風(fēng)險的增加。
35.如權(quán)利要求1-34中任一項所述的方法，其特征在于，所述TFF3中和劑包含可檢測的標記。
36.如權(quán)利要求1-35中任一項所述的方法，其特征在于，所述TFF3中和劑包含放射性標記。
37.如權(quán)利要求11-36中任一項所述的用途，其特征在于，所述TFF3中和劑包括抗體、核酸、反義分子或RNAi分子。
38.一種反義分子，所述反義分子調(diào)控TFF3的表達。
39.權(quán)利要求38所述的反義分子，其特征在于，所述反義分子包含或重疊SEQID NO5-19中的任一序列。
40.權(quán)利要求38所述的反義分子，其特征在于，所述反義分子包含SEQ ID NO5-19中的任何序列。
41.一種RNAi分子，所述RNAi分子調(diào)控TFF3的表達。
42.如權(quán)利要求41所述的RNAi分子，其特征在于，所述RNAi分子包含或或重疊SEQ ID NO5-19中的任一序列。
43.一種組合物，所述組合物含有權(quán)利要求38所述的反義分子和藥學(xué)上可接受的載體。
44.一種組合物，所述組合物含有權(quán)利要求43所述的RNAi分子和藥學(xué)上可接受的載體。
45.一種分離的抗TFF3抗體，其特征在于，所述抗體識別對應(yīng)于SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28的TFF3序列的至少一個區(qū)域。
46.如權(quán)利要求47所述的抗體，其特征在于所述抗體通過包含下述步驟的方法產(chǎn)生a)在噬菌體上合成一個抗體庫；b)通過將該噬菌體與組合物接觸來對樣品進行庫的篩選，該組合物包含對應(yīng)于SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28的TFF3序列的至少一個區(qū)域；c)分離與所述組合物結(jié)合的噬菌體，其中該抗體的特征為它具有與對應(yīng)于SEQID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28的TFF3序列的至少一個區(qū)域相結(jié)合的能力，其結(jié)合親合力至少為1081/；和d)分析該分離的噬菌體以確定結(jié)合有對應(yīng)于SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28的TFF3序列的至少一個區(qū)域的氨基酸編碼序列。
47.如權(quán)利要求45所述的抗體，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體抗體。
48.如權(quán)利要求45所述的抗體，其特征在于，所述抗體是多克隆抗體抗體。
49.如權(quán)利要求45所述的抗體，其特征在于，所述抗體是嵌合抗體。
50.如權(quán)利要求45所述的抗體，其特征在于，所述抗體是人化的抗體。
51.如權(quán)利要求45所述的抗體，其特征在于，所述抗體是單鏈抗體。
52.如權(quán)利要求45所述的抗體，其特征在于，所述抗體是Fab片段。
53.如權(quán)利要求45所述的抗體，其特征在于，所述抗體是經(jīng)標記的。
54.如權(quán)利要求53所述的抗體，其特征在于，所述標記是酶、放射性同位素或熒光基團。
55.如權(quán)利要求45所述的抗體，其特征在于，所述抗體對除TFF3以外的多肽的結(jié)合親合力低于約1×105Ka。
56.一種分離了的細胞，所述細胞用于產(chǎn)生權(quán)利要求45所述的抗體。
57.一種雜交瘤，所述雜交瘤用于產(chǎn)生權(quán)利要求45所述的抗體。
58.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求45所述的抗TFF3抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
59.TFF3中和劑在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途，其特征在于，所述中和劑是權(quán)利要求45所述的抗體。
60.TFF3中和劑在制備治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途，其特征在于，所述藥物與常規(guī)的癌癥治療聯(lián)合使用，其中所述TFF3中和劑是權(quán)利要求45所述的抗體。
61.如權(quán)利要求60所述的用途，其特征在于，所述常規(guī)的癌癥治療是化學(xué)療法。
62.如權(quán)利要求60所述的用途，其特征在于，所述常規(guī)的癌癥治療是激素消融治療。
63.如權(quán)利要求62所述的用途，其特征在于，所述激素是雄性激素。
64.TFF3中和劑在制備誘導(dǎo)凋亡的藥物中的用途，其特征在于，所述中和劑是權(quán)利要求45所述的抗體。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述細胞是哺乳動物細胞。
66.如權(quán)利要求64所述的用途，其特征在于，所述細胞是癌細胞。
67.TFF3中和劑在制備用于減小腫瘤體積、防止腫瘤生長或抑制腫瘤生長的藥物中的用途，其特征在于，所述TFF3中和劑是權(quán)利要求45所述的抗體。
68.如權(quán)利要求67所述的用途，其特征在于，所述腫瘤包含TFF3在其中差異表達的細胞。
69.TFF3中和劑在制備用于調(diào)控細胞中與TFF3表達相關(guān)的至少一種生理效應(yīng)的藥物中的用途，其特征在于，所述TFF3中和劑是權(quán)利要求45所述的抗體。
70.如權(quán)利要求69所述的用途，其特征在于，所述生理效應(yīng)是提高細胞運動能力或抗凋亡。
71.TFF3中和劑在制備用于抑制細胞遷移、粘附或增殖的藥物中的用途，其特征在于，所述TFF3中和劑是權(quán)利要求45所述的抗體。
72.TFF3中和劑在制備用于降低癌細胞侵染力的藥物中的用途，其特征在于，所述TFF3中和劑是權(quán)利要求45所述的抗體。
73.一種在生物樣品中檢測TFF3的方法，所述方法包括將所述樣品與權(quán)利要求45所述的抗體接觸，并檢測所述中和劑和所述樣品中TFF3間的結(jié)合。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其特征在于，所述TFF3中和劑包含可檢測的標記。
75.一種在生物樣品中檢測癌癥的存在的方法，所述方法包括將所述生物樣品與權(quán)利要求45所述的抗體接觸，并檢測所述生物樣品中TFF3差異表達的跡象，其中TFF3差異表達的跡象指示了癌癥的存在。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其特征在于，所述檢測包括將所述接觸的結(jié)果與對照進行比較。
77.如權(quán)利要求75所述的方法，其特征在于，所述TFF3中和劑包含可檢測的標記。
78.一種分離的多肽，所述多肽包含三個或更少的選自SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
79.如權(quán)利要求78所述的肽，其特征在于，所述多肽的長度為約8-約80氨基酸。
80.如權(quán)利要求78所述的肽，其特征在于，所述多肽特異性地與抗TFF3抗體結(jié)合。
81.一種使用抗體檢測樣品中TFF3差異表達的方法，所述方法包括a)在允許抗體TFF3復(fù)合物形成的條件下，將權(quán)利要求45所述的抗體與所述樣品結(jié)合；b)測定所述復(fù)合物的量；和c)將所述復(fù)合物的量與對照比較，其中所述樣品中復(fù)合物水平的提高指示TFF3的差異表達。
82.一種分離的SEQ ID NO1-4的多肽的表位攜帶片段。
83.如權(quán)利要求82所述的表位攜帶片段，所述片段包含SEQ ID NO1-4中約6-約20個連續(xù)氨基酸。
84.如權(quán)利要求83所述的表位攜帶片段，所述片段包含SEQ ID NO1-4中的約10個連續(xù)氨基酸。
85.如權(quán)利要求82所述的表位攜帶片段，所述片段包含SEQ ID NO2中的約6-約20個連續(xù)氨基酸。
86.如權(quán)利要求83所述的表位攜帶片段，所述片段包含SEQ ID NO2中的約10個連續(xù)氨基酸。
87.如權(quán)利要求83所述的表位攜帶片段，所述片段包含SEQ ID NO20、21、22、23、24、25、26、27或28。
88.一種分離的抗TFF3抗體，所述抗體是通過用權(quán)利要求83所述的表位攜帶片段免疫某一對象而得到的。
89.一種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求45所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
90.如權(quán)利要求89所述的藥物組合物，其特征在于，所述抗體中和TFF3。
91.一種產(chǎn)生用于治療癌癥的抗體的方法，所述方法包括識別能夠結(jié)合并中和TFF3的抗體，并且在重組表達宿主細胞中表達該抗體。
92.一種藥物組合物，所述組合物包含結(jié)合并中和TFF3的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體，其特征在于，所述抗體是使用重組宿主細胞產(chǎn)生的。
93.如權(quán)利要求92所述的藥物組合物，其特征在于，所述重組宿主細胞選自下組中國倉鼠卵巢細胞、骨髓瘤細胞和細菌宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療和預(yù)防癌癥的方法，例如以差異表達的三葉因子3(TFF3)為特征的癌癥。該方法包括給予患者可調(diào)節(jié)TFF3活性或表達的制劑。本發(fā)明還涉及降低細胞中TFF3表達的生理效應(yīng)，其生理效應(yīng)包括抑制細胞活力和抗凋亡。本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)TFF3表達或活性的寡核苷酸和抗體。
文檔編號A61K48/00GK1871033SQ200480022516
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月7日
發(fā)明者M·J·加納塔普, P·加西亞, C·萊因哈德 申請人:希龍公司