專利名稱：用于修復和再生人硬膜的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及大體上無孔的膠原薄片組合物用作移植材料，以修復和/或再生哺乳動物的硬膜組織的用途。更具體地講，本發(fā)明涉及非人來源的膠原薄片組合物作為替代硬膜材料，并且作為硬膜再生的生物基質的用途。
背景技術：
硬膜是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖學中起著重要作用的結構，能形成包被整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膜系統(tǒng)，并且保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受外部影響。
硬膜可能由于多種原因而需要修復，所述原因包括外傷、炎癥或腫瘤過程、手術過程或先天異常。特別是在手術之后以及在存在外傷后瘺管時對封閉硬膜缺陷的需要，提出了對理想的硬膜代用品的需要。上述缺陷可能導致手術后并發(fā)癥，具體地講，腦脊液滲出、感染和結果導致的腦性發(fā)作。一些形式的硬膜移植過程在幾乎30％的顱骨切開術中都是需要的。由于硬膜缺陷的初步閉合通常是失敗的，所以用于避免上述并發(fā)癥的硬膜代用品的有效性具有重要的實際價值。
在顱骨損傷或手術干預以便取出大腦或脊柱中的惡性腫瘤之后，需要對硬膜實現(xiàn)永久性不透液體的閉合，以便避免腦脊液泄漏。神經(jīng)外科醫(yī)生通常使用可再吸收的或不可再吸收的硬膜代用品，并且通常用縫合線和/或血纖蛋白膠將其連接在顱骨或脊柱的硬膜?？稍傥盏牟牧系睦影ㄈ耸w硬膜、人闊筋膜、牛心包膜、異種膠原海綿和來自織物材料的植入物，其由可再吸收的聚酯(polyglactin和/或poly-p-di-oxanon)組成。不可再吸收的硬膜代用品的例子包括由聚四氟乙烯(PTFE)或聚酯型氨基甲酸酯制成的材料。
迄今為止研究過的幾乎所有硬膜移植物都與并發(fā)癥相關，一些相關較大。報道過的主要的并發(fā)癥是慢性炎癥和排斥反應，以及皮質腦膜(corticomeningeal)粘連的形成，其導致了致癲癇的病灶的發(fā)展。還觀察到了血腫和腦脊液瘺管，后者反過來又提供了各種導致疾病的生物的進入點。
在過去幾十年中業(yè)已對多種材料和方法進行了評估，以便尋找理想的硬膜移植物，包括各種金屬、植入物、合成材料、自體組織移植物和保存的人尸體硬膜。上述產(chǎn)品中的大部分是不合適的，這是因為與之相關的手術后并發(fā)癥，其中的某些并發(fā)癥是嚴重的。并發(fā)癥的例子包括慢性炎癥和排斥反應、皮質腦膜粘連的發(fā)展、出血和硬膜移植物封裝在結締組織的厚層中。以前對合適硬膜置換的主題的研究表明，早期的移植物吸收與內(nèi)源新硬膜(neodura)的形成偶聯(lián)，是預示平靜的和永久的硬膜融合的主要因素。
過去，業(yè)已將幾種自體組織用作硬膜代用品。在1911年，Kostling用患者的疝囊形成硬膜移植物。Kostling，W.，Med Wochenschr，58，1042(1911)。從那時候起業(yè)已使用了諸如顳筋膜，闊筋膜和骨膜瓣的其他自體組織。Barrow等用內(nèi)源更大的網(wǎng)膜成功地重建了大的硬膜損傷。Barrow等，J Neurosurg.60；305-1(1987)。自體移植物的優(yōu)點是，不存在病原體傳播或組織排斥的危險。不過，額外的取出組織增加了手術創(chuàng)傷，并且可能延長了復雜手術過程的時間。
多年以來業(yè)已將保存的人尸體硬膜常規(guī)地用作硬膜代用品，用于人受試者的硬膜置換。所述制劑由結締組織纖維組成，所述纖維是像身體自身的硬膜那樣交織的。在人尸體硬膜被用于神經(jīng)外科手術之后，它們被認為形成了不透液體的閉合，類似于身體自身的硬膜，并且在長時間降解過程中最終被身體自身的組織所取代。來自尸體的材料是通過冷凍干燥(凍干)和γ滅菌(Lyodura，B.Braun MelsungenAktiengesellschaft，Melsungen，德國)或通過多階段化學過程(Tutoplastprocess，TutoplastDura，Tutogen Medical GmbH，Neunkirchen am Brand，德國)保存的。不過，人尸體硬膜移植物一直與攜帶病毒和朊病毒的較大風險相關，所述病毒和朊病毒可能導致令人恐怖的疾病海綿狀腦炎(Creutzfeldt-Jakob病或GerstmannStreussler綜合征)。由于在植入人硬膜之后出現(xiàn)了大量的死亡事件，所以在很多國家人尸體硬膜移植物的使用受到了限制或禁止。
也已將人闊筋膜和心包膜制劑用作硬膜代用品材料，它具有比人尸體硬膜更小的傳播傳染劑的危險。盡管這種制劑具有較低的傳播疾病的危險，但是它們再吸收緩慢，需要數(shù)月或數(shù)年的時間，這有可能導致疤痕的形成和硬膜代用品材料的封裝。
硬膜代用品還來源于非人來源，如從皮膚或腱和牛心包膜組織中分離的?；蜇i膠原。與人衍生的來源類似，一些牛硬膜代用品一直被認為能向接受硬膜移植物的患者傳播疾病，即牛海綿狀腦病(BSE)。不過使用豬衍生的硬膜代用品導致了與下層大腦組織的粘連。
Narotam等，U.S.5,997,895公開了來自處理過的異種膠原的硬膜代用品，它是多孔膠原海綿、氈狀或薄膜形式的。對膠原的處理使病毒和朊病毒污染失活，從而所述代用品不會包含傳染量的病毒和朊病毒。據(jù)公開，硬膜代用品的孔隙率是允許脈管、細胞和腦膜組織滲透硬膜代用品所必需的。不過，在臨床實踐中，現(xiàn)有多孔材料的使用也有缺點，因為形狀穩(wěn)定性和主要的不透液體性并不能總是有保證。Narotam等還公開了硬膜代用品，它是兩種或兩種以上膠原海綿、氈狀或薄膜形式的的夾層，其中，至少一種形式具有足夠的孔，以便腦膜組織向內(nèi)生長。
可再吸收的聚酯還可用于臨床用途，不過具有低彈性和緩慢降解的缺點。在特殊場合下，這些植入物可能導致傷口愈合問題，并且可能增加感染。
業(yè)已將由諸如金、鉑、銀、鎳、鉭或鋼的金屬或諸如聚四氟乙烯(PTFE)或其他聚酯的聚合物組成的薄片或片層用作硬膜代用品。不過這些代用品不能被患者吸收，而是被封裝在結締組織的強韌層中，并且作為異物終生留在患者身體內(nèi)，而不會被身體自身的結構所取代。這可能導致微生物在內(nèi)孔中生長的高風險，由于PTFE薄片膜的多孔結構使得這種微生物生長不能得到身體自身的防御機制的控制。
基于膠原的產(chǎn)品越來越流行?？梢杂没瘜W方法修飾具有高結締組織成分的結構，如心包膜或真皮，從而只有非細胞的無抗原的膠原支架可以保存。可以得到完全由膠原原纖維或膠原包衣的合成材料組成的產(chǎn)品。在這兩種場合下，膠原纖維網(wǎng)絡都起著生長內(nèi)源結締組織的基質的作用。
Chaplin等在動物模型中實驗了從豚鼠皮膚獲得的產(chǎn)品(XenoDerm，Lifecell Corp。，The Woodlands，TX)。Neurosurgery，452，320-7(August 1999)。對照物是自體顱骨膜。在所述生產(chǎn)過程中，將所述表皮、所有細胞成分和其他潛在的抗原性或傳染性成分通過化學方法除去。保持皮膚的膠原纖維和結構體系不變。很快就報道了在存在輕度細胞反應的情況下，所述產(chǎn)品能整合到周圍的硬膜中。入侵性成纖維細胞優(yōu)選在植入部位觀察到。移植物和原始硬膜被認為在為期6個月的手術后研究結束時幾乎無法區(qū)分。
根據(jù)以上結果，Warren等(2000)研究了用AlloDerm(LifeCellCorp.，The Woodlands，TX)在人受試者上進行硬膜置換。Neurosurgery46(6)1391-96(2000)。在本研究中二百位患者接收了AlloDerm硬膜移植物。這種材料是從人真皮中獲得的。其生產(chǎn)方法被認為與XenoDerm相同，產(chǎn)生了非細胞膠原生物基質，它是無主要組織相容性復合體(MHC)抗原的。200位患者中有7位發(fā)展了手術后并發(fā)癥，如感染和腦脊液(CSF)瘺管，但是，沒有一例被報道是由于移植物自身導致的。手術修復被認為顯示了這些患者中無一在硬膜移植部位發(fā)展粘連或排斥反應。所述材料在肉眼檢查時被認為與周圍的硬膜非常相似。目前還沒有本產(chǎn)品的長期研究數(shù)據(jù)。
Filippi等(2001)將溶劑保存的γ滅菌的牛心包膜(Tutopatch，Tutogen Medical GmbH，Neunkirchen，德國)用于在32位受試者中進行硬膜置換的實驗。Filippi等，Neurosurg.Rev，24103-107(2001)。除了一個患者之外，所有患者的手術后過程都被認為是平靜無事的，所述一個患者在手術后不久死于心臟原因。所述移植物被說成是便于操縱、耐用和低成本的。尚沒有排除可能的后期并發(fā)癥的長期研究數(shù)據(jù)。
膠原產(chǎn)品適合用作生物材料取決于多種因素趨化性相互作用，其中，它們促進了內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的快速滲透，后者反過來又產(chǎn)生并且沉積了新的膠原纖維；在周圍結構中的同時發(fā)生的有限的淋巴細胞炎癥反應，促進了膠原生物基質的吸收。膠原還具有止血特性，這一特性被用于治療目的。血小板本身沉積在膠原結構上，分解，并且通過這種方式釋放凝血因子，這種因子結合血漿因子能夠促進血纖蛋白形成。
已知的硬膜代用品材料和使用所述材料的相關的方法，不能提供不透液體的、可再吸收的替代硬膜，所述替代硬膜能夠避免封裝化、硬膜疤痕形成或粘連在大腦組織上，并且，還具有傳播微生物、病毒和朊病毒的較低的風險，所述微生物、病毒或朊病毒可能導致海綿狀腦炎或其他疾病。理想的硬膜置換應當不會導致免疫防御反應，或者導致炎癥并且必須是無毒的。它應當能被快速地吸收，并且與此同時使得可以形成結締組織結構，從而發(fā)展內(nèi)源新硬膜。在這一過程中，所述移植物應當不會與大腦組織或骨粘連或融合。所述材料應當能抗撕裂，保持其形狀，并且阻擋腦脊液滲透。所述置換硬膜還應當是體積和形狀穩(wěn)定的，其中，在植入之后，它能夠抗膨脹或收縮。其他重要的標準是病毒和朊病毒安全性、用戶友善性和經(jīng)濟的生產(chǎn)成本。
發(fā)明概述因此，在本發(fā)明的各個方面，提供了置換硬膜材料，這種材料是可再吸收的、不透液體的、彈性、體積和形狀穩(wěn)定的，并且提供了與疾病傳播的風險相關的出色的安全特性。
因此，簡單地講，本發(fā)明涉及用于在哺乳動物中修復和/或再生硬膜組織的方法。讓所述硬膜組織與包括膠原原纖維的生物基質的馬膠原薄片接觸。所述馬膠原薄片是通過這樣一種方法形成的，其中，使膠原原纖維的懸浮液沉淀，以便形成膠原原纖維薄片，并且，其中，所述膠原原纖維不是通過化學試劑或通過輻射交聯(lián)的。
另一方面，本發(fā)明涉及用于修復哺乳動物硬膜組織的方法，包括讓硬膜組織與包括膠原原纖維的非天然存在的生物基質的大體上無孔的馬膠原薄片接觸，其中，所述馬膠原薄片基本上由非細胞成分組成，并且，其中，所述膠原原纖維不是通過化學試劑或輻射交聯(lián)的。
另一方面，本發(fā)明涉及用于在哺乳動物中修復和/或再生硬膜組織的方法，包括讓硬膜組織與基本上由膠原生物基質組成的大體上無孔的馬膠原薄片接觸，其中，所述膠原生物基質不是通過化學試劑或輻射交聯(lián)的。
本發(fā)明的其他方面和特征部分是顯而易見的，部分將在下文指出。
附圖簡述

圖1是顯示干燥的馬膠原薄片表面的SEM(掃描電子顯微鏡)照片。清楚地示出了膠原原纖維。從照片上可以明顯看出所述表面大體上的無孔性。
圖2A和2B是在ESEM(環(huán)境掃描電子顯微鏡術)條件下拍攝的照片，這意味著是在略微潮濕的氣氛中的接近天然的條件，示出了從馬膠原薄片側面看上去的上表面。從照片上可以明顯看出大體上的無孔性。
圖3A和3B是在ESEM條件下拍攝的照片，示出了馬膠原薄片的下表面。膠原原纖維如圖3A所示。從照片上可以明顯看出所述表面大體上的無孔性。
圖4是表示水合的馬膠原薄片表面的SEM照片。在圖4中清楚地示出了膠原原纖維。從照片上可以明顯看出所述表面大體上的無孔性。
圖5A、5B和5C是在ESEM條件(潮濕氣氛)下拍攝的照片，示出了馬膠原薄片的橫截面。所述材料示出的結構類似于非常緊密地堆積在一起的一疊片層。在照片中示出了膠原層之間的間隙。
圖6A和6B是表示干燥的馬膠原薄片橫截面的SEM照片。在照片中示出了多層膠原和膠原層之間的間隙。
圖7是表示在插入馬膠原薄片之后左側硬膜缺陷的手術內(nèi)面貌的照片，周圍的硬膜邊緣由血凝塊覆蓋。
圖8是表示手術部位的Trichrom染色顯微視圖(額切面)的照片，示出了皮層結構和用兩種移植物(位于右側的馬膠原薄片；位于左側的TutoplastDura)覆蓋的硬膜(8X放大率)。
圖9是表示在手術之后八周的硬膜移植物的照片。在左側，TutoplastDura尸體硬膜移植物看上去沒有改變，具有清晰可見的邊緣。可以看見覆蓋移植物的薄的結締組織膜的剩余部分。在右側，馬膠原薄片生物基質移植物看上去完全整合到了周圍的硬膜中。暗色斑點是由新硬膜中的小的血凝塊殘余物引起的。
圖10是表示手術之后八周朝向皮層的馬膠原薄片生物基質移植物的肉眼檢查面貌的照片。所述移植物看上去光滑，可以移動，并且完全整合到了周圍的硬膜中?？床坏狡訐p傷。
圖11是表示手術之后八周朝向皮層的TutoplastDura尸體硬膜移植物的肉眼檢查面貌的照片。所述移植物看上去光滑并且均勻，但沒有出現(xiàn)移植物整合的跡象。沒有皮質腦膜粘連。
圖12是表示手術之后兩周兩個多核巨大細胞的照片，所述細胞具有馬膠原薄片生物基質移植物的細胞內(nèi)片段(蘇木精(hematoxillin)-曙紅(HE)染色；800X放大率)。
圖13是表示在手術之后四周滲透了馬膠原薄片生物基質移植物的成纖維細胞和吞噬細胞的照片。還可以看到具有紅細胞的新毛細管(neocapillary)(HE染色，600X放大率)。
圖14是表示手術之后四周由吞噬細胞和溫和的淋巴細胞炎癥包圍的馬膠原薄片生物基質移植物的片段的照片(HE染色，600X放大率)。
圖15是表示手術之后四周TutoplastDura尸體硬膜的照片。所述尸體硬膜表現(xiàn)出最低的細胞滲透或移植物重塑跡象。在移植物上面和下面發(fā)現(xiàn)了致密的淋巴細胞炎癥反應(HE染色，250X放大率)。
圖16是手術之后八周新硬膜的顯微面貌的照片，示出了新形成的膠原纖維、成纖維細胞以及馬膠原薄片生物基質移植物的殘余物層(Trichrom染色，150X放大率)。
圖17是植入馬膠原薄片之后十六周新硬膜的顯微面貌的照片，示出了致密的膠原纖維和新形成的毛細管，其中充滿了紅細胞(van Gieson染色，200X放大率)。
圖18是表示用于測量置換硬膜材料的不透水性、抗張強度和彈性/柔韌性的測試裝置的圖。測量由特定水柱高度得到的所述材料的凸出程度，以便確定彈性/柔韌性水平。測量加壓通過所述測試材料的水的量，以便測定不透水性。
圖19是表示在增加的靜水壓力(水柱高度)下馬膠原薄片(膠原含量5.6mg/cm2)的凸出程度的曲線圖。
圖20是表示在增加的靜水壓力(水柱高度)下膠原薄片(膠原含量4mg/cm2)的凸出程度的曲線圖。
圖21是表示在增加的靜水壓力(水柱高度)下DuraGen的凸出程度的曲線圖。DuraGen在200cm H2O靜水壓力下破裂。
圖22是表示在增加的靜水壓力(水柱高度)下幾種硬膜置換產(chǎn)品的凸出程度的曲線圖。
圖23是表示在增加的靜水壓力(水柱高度)下，馬膠原薄片(膠原含量5.6mg/cm2)的凸出程度和水的喪失的曲線圖。
圖24是表示在增加的靜水壓力(水柱高度)下，膠原薄片(膠原含量4mg/cm2)的凸出程度和水的喪失的曲線圖。
圖25是表示增加的靜水壓力(水柱高度)下，DuraGen的凸出程度和水的喪失的曲線圖。
圖26是表示增加的靜水壓力(水柱高度)下，若干種硬膜置換產(chǎn)品的凸出程度和水的喪失的曲線圖。
圖27是表示幾種膠原植入物的抗撕強度/極限張力的曲線圖。樣品E是馬膠原薄片。
優(yōu)選實施方案的詳細說明根據(jù)本發(fā)明已驚奇地發(fā)現(xiàn)，在非天然存在的生物基質中由馬膠原原纖維組成的大體上無孔的薄片可有效地用作可再吸收的硬膜代用品，以用于哺乳動物的硬膜修復、再生和復原，所述哺乳動物包括人、實驗室動物等。本發(fā)明的馬膠原薄片是不透液體的，并且提供了防止病毒或朊病毒傳播的風險的高的安全特征。另外，所述馬膠原薄片實際上是柔韌性和彈性的，同時保持了高的抗張強度。這種薄片，以下稱之為“馬膠原薄片”，在植入時，與人類硬膜的重要特性一致。所述馬膠原薄片起著生物基質的支架的作用，用于體內(nèi)細胞的向內(nèi)生長，并且在再生和復原期間被新硬膜所取代。
在一種實施方案中，所述馬膠原薄片生物基質由基本上由膠原原纖維組成的結締組織蛋白組成。優(yōu)選的是，所述馬膠原薄片生物基質由結締組織蛋白組成，所述結締組織蛋白由膠原原纖維組成。更優(yōu)選的是，所述馬膠原薄片生物基質由結締組織蛋白組成，所述結締組織蛋白由I型膠原原纖維組成。
除了由膠原原纖維組成之外，所述馬膠原薄片還可以包括賦形劑、防腐劑、生長因子或有助于最終產(chǎn)品的柔韌性和彈性的添加劑。
馬膠原薄片本發(fā)明的馬膠原薄片是處理過的膠原原纖維的生物基質，通過處理除去了細胞成分，并且形成了膠原原纖維片層。
用于本發(fā)明一種實施方案中的馬膠原薄片是非天然存在的多層膠原膜，其由多個多方向相互纏繞的膠原原纖維組成。在圖1中示出了干燥的馬膠原薄片的圖。所述顯微照片(SEM)表示馬膠原薄片的表面，其中，包埋有膠原原纖維。在圖2A-2B中可以看到在ESEM(環(huán)境掃描電子顯微鏡術)條件下的馬膠原薄片上表面的照片，其中，略微潮濕的氣氛提供了接近自然的條件。所述膠原原纖維在所述表面上可以看到。所述表面看上去是光滑的和大體上無孔的。在圖3A和3B中提供了馬膠原薄片下表面的照片(ESEM)。所述下表面照片也示出了馬膠原薄片的大體上的無孔性。
在使用所述馬膠原薄片修復哺乳動物的硬膜組織之前，所述干燥的馬膠原薄片材料可以是水合的。圖4是表示水合的馬膠原薄片的表面的SEM照片，其中，清楚地示出了膠原原纖維。從照片上可以看出所述表面大體上的無孔性。
在所述多層中二維方向中獨特取向的膠原纖維即使在高靜水壓力下也主要負責不透液體性，并且提供了具有高彈性的高的強度。由于馬膠原薄片的多個平行取向的薄的膠原原纖維層，所以這種材料適合臨時取代身體自身的硬膜，用于在植入之后覆蓋缺陷，以便獲得不透液體的腦脊液泄漏的閉合，并且提供供細胞向內(nèi)生長的生物基質支架，以用于形成新硬膜。這種特性在傷口愈合過程中是重要的，因為它降低了患者發(fā)展腦脊液溢狀況的風險。
馬膠原薄片結構和再吸收特征所述馬膠原薄片是其所植入的哺乳動物可再吸收的。據(jù)信，通過馬膠原薄片的結構可以增強這一特性。用于產(chǎn)生馬膠原薄片的方法，形成了膠原原纖維的疊層。在每一層之間是間隙，患者的細胞和脈管系統(tǒng)可以遷移到這些間隙中，并且形成新硬膜組織。
每一層膠原原纖維大體上是無孔的?？赡艽嬖诘纳贁?shù)幾個孔通常是彼此分離的，并且不會通過多層膠原原纖維彼此連接。本發(fā)明的多層結構增強了馬膠原薄片的不透液體的特征。圖1-4所示掃描電子顯微鏡照片示出了馬膠原薄片的無孔的性質。
盡管馬膠原薄片是大體上無孔的，但在膠原原纖維層之間存在間隙。在圖5A、5B和5C中可以方便地看出所述間隙和層狀特征，所述圖是馬膠原薄片在ESEM條件(潮濕氣氛)下的橫截面照片。圖6A和6B是干燥的馬膠原薄片的SEM照片。因此，馬膠原薄片類似于一疊紙張，其中，每一層紙是大體是光滑的和無孔的，在每一層紙之間具有間隙。在它的干燥形式(圖6A和6B)下，所述間隙更為明顯。當在略微潮濕氣氛的接近天然的條件下觀察馬膠原薄片時，所述間隙變小。圖5A、5B和5C是在潮濕氣氛中馬膠原薄片的橫截面的照片，其中，示出了所述馬膠原薄片的間隙的縮小。
除了促進不透液體的特性之外，馬膠原薄片的多個平行取向的薄的膠原原纖維層同時起著供細胞向內(nèi)生長的生物基質支架的作用，以便從頭構建身體自身的硬膜。以前，普遍認為多孔支架結構是促進自主組織和脈管系統(tǒng)向內(nèi)生長到置換硬膜組織中所必需的。業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，馬膠原薄片的無孔的層狀結構能促進細胞、脈管系統(tǒng)向內(nèi)生長，并且促進穿過馬膠原薄片且在存在于其多層之間的間隙中形成新的膠原結構，從而形成新硬膜，其在植入數(shù)周之內(nèi)具有天然硬膜的一般的層狀結構。正如在下文和實施例1中所進一步描述的，細胞、脈管系統(tǒng)的向內(nèi)生長，以及新的膠原結構在手術之后數(shù)周內(nèi)是如此廣泛，以至于新硬膜變得難于與以前存在的患者的硬膜組織區(qū)分。在手術之后大約4-8周，腦膜細胞的細胞組織為大約40％-70％。大約十六周之后，所述移植物是完全有組織的(100％)。
動物實驗表明了在多層馬膠原薄片區(qū)域的快速細胞滲透。從組織學角度看，在植入之后14天，觀察到了淋巴細胞、巨噬細胞和成纖維細胞對膠原生物基質的密集的滲透。隨后在移植物上形成了毛細管。由于膠原纖維的新生而出現(xiàn)的馬膠原薄片和周圍的硬膜之間的連續(xù)的轉變是顯而易見的。在僅僅4周之后，所述馬膠原薄片就部分被身體自身的疏松的結構組織所取代。在24周之后，難以區(qū)分以前存在的患者的硬膜和取代缺陷區(qū)域的植入的馬膠原薄片的新形成的新硬膜-樣結締組織結構。
疾病傳播/免疫反應使用本發(fā)明的馬膠原薄片的顯著優(yōu)點是具有對其所植入的患者明顯較低的傳播疾病的危險。在生產(chǎn)過程中用酸(例如，鹽酸、乙酸等)，和堿，如氫氧化鈉處理膠原原纖維，以便產(chǎn)生這樣的馬膠原薄片，這可有利地將可能存在的細菌、病毒和朊病毒滅活或降低其感染水平。用鹽酸、氫氧化鈉、氧化乙烯(ETO)等處理生物材料的做法業(yè)已得到了政府機構的認可，作為藥物和生物材料管理中使朊病毒和病毒失活的許可的方法。在某些管理中，所述處理能夠降低成批測定馬膠原薄片的管理要求。因此，在生產(chǎn)過程中對膠原原纖維的處理提高了產(chǎn)品安全性，并且降低了將疾病傳播給患者的風險。
業(yè)已進行過上述生產(chǎn)過程處理的馬的材料沒有發(fā)現(xiàn)能夠將任何病原體傳播給患者。因此，除了生產(chǎn)過程之外，基于馬的膠原的利用還避免了傳播海綿狀腦炎的危險，這種病以前一直與人尸體代用品相關。使用源于馬來源的膠原，例如源于馬跟腱的膠原，避免了傳播傳染性海綿狀腦病(TSE)的風險，這種病又被稱作牛海綿狀腦病(BSE)或瘙癢病。這種病的傳播一直與使用從反芻動物來源獲得的生物學材料相關(例如，來自牛、山羊、綿羊等的生物材料)。
本發(fā)明的馬膠原薄片額外地降低了引起免疫反應的風險，其中，所述膠原來自馬來源并且處理過(例如，用酶)。業(yè)已報道了在將基于馬的膠原用于組織置換方法(置換除了硬膜以外的組織)的超過10年的時間段中沒有出現(xiàn)免疫反應。
來源于馬的膠原薄片還導致了減弱了的炎癥反應。與包括來自諸如人闊筋膜的來源的膠原的硬膜代用品相比，由于植入替代馬膠原薄片而導致的炎癥細胞的數(shù)目明顯更少。與來自其他來源的置換硬膜器械相比，通過植入馬膠原薄片所引起的炎癥過程的持續(xù)時間同樣更短。上述特性顯著降低了由患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的對馬膠原薄片的移植物排斥的風險，從而提高了需要硬膜置換的神經(jīng)外科手術的成功率。
體積/尺寸穩(wěn)定性如果在水合時置換硬膜明顯膨脹或收縮的話，可能會產(chǎn)生問題。在某些場合下，現(xiàn)有技術的多孔膠原硬膜置換產(chǎn)品在水合之后傾向于明顯收縮。在這種場合下，置換硬膜可能拖拉將它連接在患者硬膜上的縫合線，從而導致對植入物和對自體硬膜和手術部位的損傷。其他并發(fā)癥包括如果在植入置換硬膜之后所述置換硬膜持續(xù)膨脹的話，在手術部位產(chǎn)生的壓力，從而會在相鄰的神經(jīng)組織上產(chǎn)生不希望的壓力。
在水合時本發(fā)明的馬膠原薄片的體積變化較小或微不足道。與多孔置換產(chǎn)品相反，所述馬膠原薄片在水合后大體上能保持其尺寸和形狀，具有良好的形狀穩(wěn)定性，即使在水合之后也能保持生物穩(wěn)定，并且在植入之后不會在大腦中產(chǎn)生膨脹或收縮問題。一旦水合并且植入，馬膠原薄片就不會在面積或厚度方面顯著膨脹或收縮到會撕開手術縫合線或破壞將馬膠原薄片保持在患者硬膜上的血纖蛋白膠密封的程度。
在一種實施方案中，在完全水合時，干燥的馬膠原薄片的面積的收縮或膨脹可以在大約-5％-大約20％范圍內(nèi)。在另一種實施方案中，在完全水合時，干燥的馬膠原薄片的面積可以在大約-5％-大約10％范圍內(nèi)。在另一種實施方案中，在完全水合時，干燥的馬膠原薄片的面積在大約-5％-大約5％。在另一種實施方案中，在完全水合時，干燥的馬膠原薄片的面積增加不超過大約4％。
在一種實施方案中，在完全水合時，所述馬膠原薄片增加到其干燥厚度的最多大約4倍。在另一種實施方案中，在完全水合時，所述馬膠原薄片增加到其干燥厚度的最多大約3倍。在另一個實施方案中，在完全水合時，所述馬膠原薄片增加到其干燥厚度的大約2倍。
以顱骨為基礎，成年人硬膜的厚度為大約0.5mm-大約2.0mm。硬膜的厚度也可以依賴于患者的年齡而改變，其中，預計嬰兒和兒童的硬膜組織一般比成年人的更薄。本發(fā)明的馬膠原薄片的厚度可以制備成根據(jù)需要的使用面積和治療的患者而改變。
在一種實施方案中，本發(fā)明的馬膠原薄片在它的干燥形式下的厚度為大約0.01mm-大約3.0mm。在另一種實施方案中，所述馬膠原薄片的厚度為大約0.02mm-大約2.0mm。在另一種實施方案中，所述馬膠原薄片的厚度為大約0.03mm-大約1.5mm。在另一種實施方案中，所述馬膠原薄片的厚度為大約0.05mm-大約1mm。在另一種實施方案中，所述馬膠原薄片的厚度為大約1.0mm或以下。
膠原薄片的干重取決于它的理想厚度。在一種實施方案中，馬膠原薄片的干重為大約1mg/cm2-大約50mg/cm2。在另一種實施方案中，馬膠原薄片的干重為大約1.5mg/cm2-大約30mg/cm2。在另一種實施方案中，馬膠原薄片的干重為大約2mg/cm2-大約20mg/cm2。在另一種實施方案中，馬膠原薄片的干重為大約2.5mg/cm2-大約15mg/cm2。在另一種實施方案中，馬膠原薄片的干重為大約3mg/cm2-大約10mg/cm2。
在一種實施方案中，在水合后馬膠原薄片的重量增加到其干重的最多大約15倍。在另一種實施方案中，在水合后馬膠原薄片的重量增加到其干重的最多大約10倍。在另一種實施方案中，在水合后馬膠原薄片的重量增加到其干重的最多大約7倍。在另一種實施方案中，在水合后馬膠原薄片的重量增加到其干燥狀態(tài)的最多大約5倍。
為了用作合適的硬膜置換代用品，植入的硬膜代用品即使在水合時也應當不會變得不結實，相反，應當具有相當高的穩(wěn)定性/抗張強度。本發(fā)明的馬膠原薄片有利地具有高的抗張強度，這能夠改善并且支撐在手術應用中對馬膠原薄片的處理，并且提供在植入之后的增加的機械穩(wěn)定性。在下面的實施例中提供了對照實驗，其中，所述馬膠原薄片的抗張強度與多孔膠原制劑(例如，膠原泡沫)相比更好。另外，增加馬膠原薄片的厚度，能夠顯著提高抗張強度。
馬膠原薄片材料在施加的壓力下被撕裂的傾向可以被測量為它的“極限拉伸載荷”或“極限張力”，以下稱之為“極限張力”。馬膠原薄片的極限張力可以通過對具有特定寬度的一條馬膠原薄片施加壓力，并且測定導致所述馬膠原薄片破壞(例如，撕裂或破裂)所施加的壓力的量而確定。可以用以下等式對極限張力進行定量“極限張力”＝所施加的力/馬膠原薄片條的寬度＝牛頓/cm-條。
在一種實施方案中，所述馬膠原薄片的極限張力為大約1-大約30牛頓/cm-條，優(yōu)選大約1.5-大約15牛頓/cm-條，優(yōu)選大約2-大約10牛頓/cm-條，更優(yōu)選大約3-大約6牛頓/cm-條。
盡管本發(fā)明的馬膠原薄片具有高的抗張強度，在水合時它也能保持彈性和柔韌性。這一特征使得所述馬膠原薄片最好地適合于出現(xiàn)在植入部位的解剖學條件(例如，彎曲)。
在它的水合狀態(tài)下，所述馬膠原薄片能夠容易地在手術部位周圍移動，并且可最佳地進行模造為其所植入的缺陷的形狀。一旦植入，所述馬膠原薄片移植物就保持光滑和可移動性。隨著時間推移，細胞和脈管系統(tǒng)遷移通過所述馬膠原薄片，最終用硬膜樣的新硬膜取代它。在與硬膜細胞發(fā)生細胞的組織之后，所述馬膠原薄片不會粘連在神經(jīng)、大腦、顱骨或脊柱組織上。
馬膠原薄片的制備本發(fā)明的馬膠原薄片可以通過受控制的干燥方法用高分子量膠原原纖維的懸浮液制備。膠原原纖維懸浮液的分級沉淀是由于水的蒸發(fā)和pH的同時升高所導致的。所述受控制的干燥方法產(chǎn)生了膠原薄片的多層結構，這種多層結構可以由神經(jīng)外科醫(yī)生作為人硬膜代用品植入。所述多層膠原薄片結構提供了在硬膜代用品中有利的多種上述特性，并且提供作為生物基質以再生活的硬膜組織。
在一種實施方案中，用于生產(chǎn)本發(fā)明的馬膠原薄片的方法去除了生產(chǎn)膠原原纖維的馬膠原薄片的所有細胞成分，所述薄片基本上是由非細胞成分組成的。
利用膠原化學中建立的方法，將含有膠原的組織用作原材料以用于制備本發(fā)明的馬膠原薄片。在一種實施方案中，將馬腱用作原材料。在另一種實施方案中，將馬跟腱用作原材料。
在一種實施方案中，所述原材料，例如馬跟腱首先被粉碎，并且用1N氫氧化鈉處理至少1小時，并且用鹽酸中和。在pH 2的酸性條件下處理所述膠原原材料。所用的酸可以是鹽酸、乙酸等。然后，對存在于所述原材料中的非膠原蛋白和分子間交聯(lián)鍵用胃蛋白酶進行酶促降解，以便形成膠原懸浮液。
然后中和所述懸浮液。在一種實施方案中，將所述懸浮液中和到大約pH 6.5-大約pH 8.0。在另一種實施方案中，將所述懸浮液中和到大約pH 6.9-大約pH 7.5。在另一種實施方案中，將所述懸浮液中和到大約pH 7。
對所述膠原懸浮液進行離心，去掉上清液，并且將沉淀重新懸浮在大約pH 2-4.5乙酸中。因此從膠原懸浮液中成功地去掉了非膠原蛋白。
可以根據(jù)所需重復上述步驟，以便除去存在于沉淀中的殘余的非膠原蛋白。
所述馬膠原薄片的生產(chǎn)方法的驚人的結果是，膠原在乙酸中的懸浮液的受控制的pH升高是由于通過長時間，例如，24小時的蒸發(fā)特定地去除水而實現(xiàn)的。所述pH的特定升高導致了多方向纏繞的膠原原纖維在二維方向的層中的沉淀，從而形成了所述馬膠原薄片的多層結構。在一種實施方案中，所述過程是在大約20℃-大約55℃的溫度下在干燥烘箱中進行的，其中用設備除去蒸汽，同時對乙酸進行蒸汽中和。在另一種實施方案中，所述過程是在溫度為大約30℃-大約45℃的溫度的干燥烘箱中進行的。
來自所述生產(chǎn)過程的所述馬膠原薄片當檢測不到水分的進一步喪失或者水分的進一步喪失可忽略不計時被認為處在它的干燥形式。馬膠原薄片的“干燥形式”的含水量通常為以重量百分比計算的大約2％-大約18％。在所述馬膠原薄片的“干燥形式”中存在相對高的殘余含水量阻止或限制了構成所述馬膠原薄片的膠原分子的變性。
上述過程決定著膠原原纖維從懸浮液中的沉淀，這是因為具有低可溶性的成分在低的pH值升高過程開始時沉降(fall out)。這種技術在水分蒸發(fā)和同時的pH升高期間導致了膠原原纖維的沉淀。
在所述沉淀過程中，隨著所述原纖維從所述溶液中沉淀出來，所述膠原原纖維會發(fā)生天然交聯(lián)，從而形成膠原薄片。與使用化學試劑或輻射(例如，電離或紫外線輻射)的膠原原纖維交聯(lián)不同，這可能導致增加了再吸收時間，使得膠原原纖維天然交聯(lián)能促進當所述馬膠原薄片被植入時較短的再吸收時間。用于本發(fā)明的膠原薄片中的原纖維的天然交聯(lián)可以通過天然、生理學樣方式進行。首先，這種天然交聯(lián)是通過非共價相互作用(例如，范德華相互作用或偶極-偶極相互作用)或通過在膠原分子的氨基酸側鏈之間形成容易解離的希夫堿鍵實現(xiàn)。膠原的分子間交聯(lián)決定物理和化學穩(wěn)定性。膠原交聯(lián)形成的關鍵步驟取決于賴氨酸或羥賴氨酸殘基的酶促轉化，并且產(chǎn)生了醛、ε-醛賴氨酸和6-醛基羥賴氨酸。所述醛基能自發(fā)地與活性氨基基團起反應，導致了包括具有不穩(wěn)定的醛亞胺鍵(-CH＝N-)的不穩(wěn)定的醛醇縮合產(chǎn)物的希夫堿成分的形成。因此，本發(fā)明產(chǎn)品的原纖維可以通過用諸如弱酸的處理而解離。通過使用化學交聯(lián)劑而產(chǎn)生的交聯(lián)可以根據(jù)穩(wěn)定的共價交聯(lián)的交聯(lián)部分的存在進行檢測。一般，這一目的是通過使用希夫-堿試劑(例如，戊二醛)形成希夫堿反應產(chǎn)物，然后通過Amadori重排或還原條件穩(wěn)定所述鍵而實現(xiàn)的。另外，膠原可以通過各種雙功能碳二亞胺試劑進行交聯(lián)。通過使用輻射而產(chǎn)生的交聯(lián)可以通過膠原原纖維之間穩(wěn)定的共價鍵的存在進行檢測，這種共價鍵是通過在輻射期間產(chǎn)生的自由基部分的反應而產(chǎn)生的。另一方面，本發(fā)明產(chǎn)品中的原纖維大體上不與任何穩(wěn)定的共價鍵交聯(lián)，并且沒有用化學或輻射方法處理。因此，本發(fā)明產(chǎn)品中原纖維之間的任何結合大體上是非共價的或容易逆轉的，并且不是穩(wěn)定交聯(lián)的。以往業(yè)已將諸如氰氨、戊二醛、甲醛、丙烯酰胺、碳二亞胺二酮、二亞氨酸酯(diimidates)、雙丙烯酰胺等之類的化學試劑用于將膠原原纖維化學交聯(lián)在硬膜代用品中。不過，使用這種化學試劑，可能導致與腦組織意外接觸硬膜代用品中的殘余化學試劑相關的毒性風險。因此，這種沉淀方法避免了交聯(lián)化學試劑的毒性風險，以及與用化學試劑或輻射交聯(lián)膠原原纖維相關的較長的再吸收時間。
所得到的干燥的、沉淀的膠原組合物形成了由高分子量多層膠原膜組成的馬膠原薄片，所述膠原膜由多個多方向天然纏繞的膠原原纖維組成。所述馬膠原薄片主要包括間隙的I型膠原。所述馬膠原薄片基本上是無孔的，并且主要是不透液體的?？梢栽谒霎a(chǎn)品上進行免疫擴散實驗，以便確保不存在異源蛋白。
用來生產(chǎn)用于本發(fā)明的所述馬膠原薄片的上述方法還被ResorbaWundversorgung GmbH & Co.KG，Nuremberg，德國用于生產(chǎn)由Baxter AG，Vienna，奧地利商業(yè)出售的膠原薄片。所述商業(yè)化薄片被標明可用作止血劑，用作臨時組織代用品，用于覆蓋傷口，并且用作血纖蛋白封閉劑載體物質。
用于本發(fā)明的馬膠原薄片的厚度可以根據(jù)特定應用的需要而改變。例如，在修復兒科硬膜組織時，可以使用較薄的馬膠原薄片，而在修復成年人硬膜組織時，可以使用較厚的馬膠原薄片。
通過改變用于生產(chǎn)特定尺寸馬膠原薄片的原材料的量，可以控制馬膠原薄片的厚度。
用氧化乙烯(ETO)或類似的滅菌氣體或通過輻射對所述馬膠原薄片進行氣體滅菌。
附著方法在使用之前，可以使干燥的馬膠原薄片水合，例如，在生理鹽水中水合。在一種實施方案中，所述生理鹽水包括0.9％氯化鈉溶液。在另一種實施方案中，所述馬膠原薄片是在賦形劑或含有藥物的溶液中水合的。使所述馬膠原薄片水合所需要的時間長度與所述薄片的厚度相關。使所述馬膠原薄片水合，直到它的厚度在整個面積上是均勻的。在一種實施方案中，在生理鹽水中使所述馬膠原薄片水合大約5秒-大約1小時。在另一種實施方案中，在生理鹽水中使所述馬膠原薄片水合大約5秒-大約30分鐘。在另一種實施方案中，在生理鹽水中使所述馬膠原薄片水合大約5秒-大約20分鐘。在另一種實施方案中，在生理鹽水中使所述馬膠原薄片水合大約5秒-大約10分鐘。在另一種實施方案中，在生理鹽水中使所述馬膠原薄片水合大約1分鐘-大約6分鐘。在另一種實施方案中，在生理鹽水中使所述馬膠原薄片水合大約5分鐘。在另一種實施方案中，在植入之前不對所述馬膠原薄片進行水合。
所述馬膠原薄片可以通過確定的外科技術附著在患者硬膜上，例如，通過血纖蛋白封閉劑、組織膠、手術縫合線或通過壓力配合手術技術。另外，可以利用馬膠原薄片和硬膜組織之間的天然吸引力將所述馬膠原薄片附著在硬膜組織上，而不用使用任何封閉劑、膠、縫合線或壓力配合技術。一旦水合，所述馬膠原薄片可以被切割成略微比患者硬膜上的手術開口大一些。因此，將所述馬膠原薄片略微疊蓋在其所附著的患者硬膜上。在一種實施方案中，水合的馬膠原薄片的尺寸與硬膜重疊大約0.5cm-大約1cm。重疊的量可以根據(jù)神經(jīng)外科醫(yī)生的偏好和技能而改變。
在一種實施方案中，根據(jù)眾所周知的膠原與血纖蛋白的相互作用，可以使用得到批準的可用于神經(jīng)學用途的血纖蛋白封閉劑將所述馬膠原薄片附著在硬膜上。被批準可用于神經(jīng)學用途的血纖蛋白封閉劑的例子包括Tissucol和Tisseel血纖蛋白封閉劑(Baxter AG，Vienna，奧地利)。另外，還可以使用被批準用于神經(jīng)學用途的組織膠。血纖蛋白封閉劑或組織膠可以以圍繞疊蓋硬膜的馬膠原薄片部分的連續(xù)線條的形式使用，以便形成不透液體的密封。如上文所述，不透液體的密封是有利的，因為它避免了與腦脊液喪失相關的并發(fā)癥，如腦脊液溢。
在另一種實施方案中，所述馬膠原薄片在通過連續(xù)的血纖蛋白封閉劑或組織膠的線與自體的硬膜附著時，產(chǎn)生了不透液體的密封。
在另一種實施方案中，疊蓋硬膜的所述馬膠原薄片可以用斑點狀使用的血纖蛋白封閉劑或組織膠附著在硬膜上。
在另一種實施方案中，所述馬膠原薄片一旦被放置在理想的植入部位，就通過手術縫合附著在硬膜上。盡管該實施方案可用于將所述馬膠原薄片附著在患者的自體的硬膜上，但所述縫合線可能導致分支的管，后者反過來又可能導致瘺管，并導致腦脊液泄漏。如果縫合所述馬膠原薄片的話，必須使用無張力縫合技術，以便避免撕裂所述薄片。推薦密封縫合線，例如，使用血纖蛋白封閉劑。
在另一種實施方案中，所述馬膠原薄片是按照本領域已知的壓力配合技術定位和植入的。在該技術中，將所述馬膠原薄片放置在需要的植入部位，并且通過存在于顱骨或脊柱中的天然內(nèi)部壓力保持在適當位置。因此，在不使用手術縫合線、血纖蛋白封閉劑或組織膠的情況下移植物仍保持在適當位置。
在另一種實施方案中，在不使用任何封閉劑、膠、縫合線或壓力配合技術的情況下對所述馬膠原薄片進行定位和植入。在該技術中，將所述馬膠原薄片放置在需要的植入部位，并且通過所述馬膠原薄片和硬膜組織之間的天然吸引力或附著力保持在適當位置。
本發(fā)明的馬膠原薄片可以用作置換硬膜移植物以修復由于先天狀況、出生缺陷、疾病、損傷、腫瘤切除或可能破壞或穿透患者硬膜的其他手術過程，或需要修復硬膜的任何其他狀況而導致的人類硬膜組織。所述馬膠原薄片還可用于修復其他哺乳動物的硬膜組織，包括，但不局限于羊、猴、馬、實驗室動物或其他哺乳動物。所述馬膠原薄片可用于修復顱骨或沿著脊柱的硬膜組織。
本發(fā)明還涉及包括馬膠原薄片和指導它的制備和用作置換硬膜的說明書的試劑盒。
禁忌癥已知對馬或馬產(chǎn)品具有變態(tài)反應的患者禁止接受馬膠原薄片。
其他禁忌癥可以包括在手術之后不久進行放射治療的患者。例如，在腦腫瘤切除手術之后不久接受放射治療的患者，不是接收本發(fā)明的馬膠原薄片的好的候選人。所述放射治療可能延緩或抑制新硬膜的生長，所述新硬膜是由快速分裂的細胞組成的，其中，所述馬膠原薄片被再吸收。在這種場合下，不可再吸收的置換硬膜，如Teflon可能更適合。不過，熟練的外科醫(yī)生能夠辨認需要不可再吸收的置換的治療。
定義“馬膠原薄片”表示馬膠原原纖維的生物基質(即生物相容材料的基質)，對它進行了處理以便除去細胞成分，以便形成膠原原纖維片層。術語“馬膠原薄片”不包括結合在一個或多個多孔膠原片層上的一個或多個大體上無孔的膠原原纖維片層的復合薄片。
“硬膜組織”表示哺乳動物的自體的硬膜組織。
“非天然存在的生物基質”表示制造的基質或支架，其包括由以下各項形成的膠原原纖維(1)天然存在的材料(即，天然材料)，業(yè)已通過一定方式對它進行過處理或加工，其中使得所述天然材料中所包含的膠原原纖維業(yè)已相對在天然材料的膠原結構中的天然排列發(fā)生了移動或復位；或(2)用膠原原纖維處理或加工過的非天然存在的材料(即，非天然材料)。例如，非天然存在的生物基質可以用包括已進行了機械或化學處理(例如，粉碎、切碎等)的膠原的原材料制成。相反，通過以一定方式處理或加工原材料而制成的膠原生物基質不是非天然存在的生物基質，所述方式保持膠原支架的結構(例如，對表皮組織進行處理，以便除掉細胞成分，同時保持天然存在的膠原結構)。
“大體上無孔的”表示存在于馬膠原薄片上的任何孔是形成膠原片層的膠原原纖維沉淀的結果，它們主要是彼此隔離的?？梢韵嗷ミB接的孔不是以穿過馬膠原薄片的厚度的形式相互連接的。在所述馬膠原薄片上形成孔的機械穿孔不是孔。優(yōu)選的是，看上去大體上無孔的材料在使用掃描電子顯微鏡以1500x放大率檢查時可以看到孔。
下面的實施例將進一步說明本發(fā)明。
實施例1本實施例提供了用羊進行的評估馬膠原薄片作為硬膜代用品用于修復硬膜組織以及作為生物基質用于硬膜再生的合適性的實驗結果。
進行實驗，以便評估馬膠原薄片用作顱骨硬膜代用品的特性，如用羊模型進行研究的。所述馬膠原薄片包括從切碎的馬跟腱中純化的天然馬膠原原纖維(5.6mg/cm2)并且不包括細胞成分。
所使用的參考產(chǎn)品是保存的人尸體硬膜(TutoplastDura)。僅使用血纖蛋白膠(Tissucol Duo S Immuno，Baxter AG，Vienna，奧地利)將這兩種產(chǎn)品附著在適當位置。
研究了以下項目這兩種移植物整合的肉眼檢查面貌；相鄰的組織結構的反應(炎癥、粘連、纖維化、壞死)；和對整合過程和結締組織的組織進行的組織學評估用于生產(chǎn)馬膠原薄片的純化過程開始于用氫氧化鈉溶液處理所述腱原材料至少1小時，然后用鹽酸中和。然后用胃蛋白酶分解所述腱。由此產(chǎn)生的膠體狀膠原以原纖維形式沉淀。然后通過干燥和氣體滅菌產(chǎn)生了馬膠原薄片，其中每平方厘米具有5.6mg的天然膠原原纖維。不添加任何其他成分，并且不通過人工方法進行交聯(lián)(即涉及化學試劑或輻射)。免疫擴散測試確保不存在外源蛋白。
材料和方法實驗動物本研究是用25只成年羊進行的。所述羊是用于農(nóng)業(yè)的混種(mixed-breed)家畜。在手術時這些動物的平均體重為53.0kg，且它們的平均年齡為2歲。所有動物都是雌性。這些動物保持在LuebeckMedical University的動物圍欄中，所述圍欄裝有屋頂結構和露天圍欄。為這些動物提供常規(guī)混合飼料。將這些動物分成五組進行組織學實驗，并且對移植物整合的不同階段進行表征(第一組-第五組)。每組的存活時間為2、4、8、16和24周。
研究產(chǎn)品研究的馬膠原薄片是用天然馬膠原原纖維制成的(主要為間隙的I型膠原)。一平方厘米的材料包括5.6毫克膠原原纖維，不含細胞成分。對照物(TutoplastDura，Tutogen Medical CmbH，Neunkirchen a.Brand，德國)是通過組織節(jié)約方法保存的人尸體硬膜。
將血纖蛋白膠，Tissucol Duo S，用于將移植物附著在硬膜上。這種生物學雙組份膠由預先填充的裝有人血漿蛋白、血纖蛋白原、凝血因子XIII、血漿纖連蛋白和抑肽酶的注射器，和裝有凝血酶和氯化鈣的另一個預先填充的注射器組成。
麻醉通過以注射混合物肌內(nèi)注射下述成分對所述動物進行手術前用藥鹽酸甲苯噻嗪(鹽酸甲苯噻嗪2％，Bayer AG，Leverkusen，德國)，劑量0.1mg/kg體重，(S)-氯胺酮(氯胺酮S，Parke-Davis GmbH，Karlsruhe，德國)劑量2mg/kg體重，和0.5mg阿托品，1ml注射溶液(Atropinsulfat Braun 0.5mg，B.Braun Melsungen AG，Melsungen，德國)。在右側耳朵插入靜脈和動脈管。以1mg/kg體重施用丙撲佛(Disoprivan 2％，AstraZeneca GmbH，Wedel，德國)用于麻醉。對所述動物進行氣管內(nèi)插管(I.D.7.0mm)，并且施用100％的氧氣，以便控制正常換氣(normoventilation)(Sulla 808V麻醉呼吸器，Drger，Luebeck，德國)。
施用丙撲佛、(S)-氯胺酮和七氟醚以便保持平衡的麻醉。在手術期間監(jiān)控呼吸循環(huán)內(nèi)的壓力和體積比例、吸入的氧氣分數(shù)(Oxydig，Drger，Luebeck，德國)、最終呼氣的碳水化合物濃度(Kapnodig，Drger，Luebeck，德國)、心電圖和入侵性動脈血壓。
手術前的抗生素預防在即將進行手術之前，每一只動物靜脈內(nèi)接收2.0g頭孢菌素V的劑量(Basocef 2.0g，Curasan AG，Kleinostheim，德國)。在手術之后通過兩次皮下給藥的長效產(chǎn)品(depot product)，Strepdipen-懸浮液(1.0ml，包括100 000IU芐星青霉素和100 000IU硫酸雙氫鏈霉素；劑量1.0ml/kg體重)再保持四天抗生素預防。所述皮下注射是在手術結束之后馬上進行并且在48小時之后再次進行的。
手術技術將業(yè)已插管的動物以左側位置放置。然后將頭轉向右側，并且通過夾在手術臺上來保持在水平位置。然后對顱骨進行徹底剔毛，用汽油對皮膚進行脫脂，然后消毒。固定具有暴露出要進行手術的部位開口的無菌片層，并且用無菌覆蓋物覆蓋整個動物。
在中間線左側形成1.5cm的皮膚切口，并且延長大約6cm。使用有兩極的鑷子凝固來自剝落的頭皮的出血。使用拉鉤，并且通過收縮和展開帽狀腱膜使顱骨的顳頂區(qū)暴露。然后使用手工操縱的鉆子鉆兩個孔(直徑0.8cm)，其間隔大約5cm。用鋸子(Mikrotom，Aesculap，Melsungen，德國)去除鉆孔之間的顱骨上的長橢圓形的骨盤。
通過使用骨蠟阻止來自顱骨的任何出血。用手術刀在硬膜上切開大約0.5cm長的切口。然后用硬膜剪刀沿所述骨頭的邊緣剪掉大約3×2cm的橢圓形硬膜片。特別注意以便不損傷蛛網(wǎng)膜。使用止血劑，TachoComb(Nycomed Austria GmbH，Linz，奧地利)阻止來自硬膜血管的任何出血。
然后切割橢圓形馬膠原薄片(尺寸為3.5×2.5cm)至一定大小，并且在無菌的0.9％的鹽水中浸泡5分鐘。為了封閉所述缺陷，將所述馬膠原薄片沿著硬膜的整個邊緣塞入，并且點上血纖蛋白膠，以便將其保持在一定位置。參見圖7。
然后用兩個小板(miniplate)(Bioplates，Codman，Norderstedt，德國)重新附著顱骨盤。用可以吸收的縫合線(Vicryl 2.0)封閉所述帽狀膜，并且用Ethilon 3.0縫合皮膚。
將TutoplastDura產(chǎn)品以類似方式應用在顱骨的右側。參見圖8。這兩個傷口最終都用噴射敷料(Hansaplast Sprühpflaster，BeiersdorfAG，Hamburg，德國)處理。
平均手術時間為120分鐘。從誘導麻醉到開始手術的平均時間段為大約60分鐘，且從縫合結束到麻醉結束的平均時間為5-10分鐘。
動物的手術后觀察在拔掉插管之后大約30分鐘將所述動物送回它們的圍欄。由外科醫(yī)生、獸醫(yī)和動物護理員定期檢查這些動物的炎癥或神經(jīng)學異常的病征。在手術之后八天將所述動物放入露天圍欄中。
動物安死術在手術之后2、4、8、16和24周的預定的存活時間殺死動物以便取樣。
在宰殺之前，通過肌內(nèi)注射1mg/kg體重的鹽酸甲苯噻嗪2％對所述動物實行鎮(zhèn)靜?？酆眯碾妶D(ECG)監(jiān)測儀，并且將靜脈或動脈管放入右側耳朵。然后通過靜脈內(nèi)注射T-61(Hoechst Roussel Vet，Somerville，New Jersey)宰殺深度鎮(zhèn)靜的動物；1ml的注射溶液包括0.2g乙甲丁酰胺、0.05g碘環(huán)己銨和0.005g鹽酸丁卡因；劑量為0.3ml/kg體重)。通過ECG和動脈血壓的測量監(jiān)控所述過程。
取樣剔掉所述動物頭上的毛，并且按手術方法所述進行定位。在兩個手術疤痕周圍的皮膚上形成直徑為大約9cm的圓形切口。收縮帽狀腱膜，以便暴露出顱骨蓋的大切片，并且在右側前面區(qū)域鉆孔。用鋸子取出大約為8cm的圓形顱骨盤。整個移植部位由骨、硬膜和大腦實質組成，通過用解剖刀沿骨邊緣切割進入該部位。然后小心地將硬膜和腦組織與覆蓋的骨分離，并且在福爾馬林中固定，以便進行組織學研究。所述移植物樣品的直徑大約為7cm。
組織學方法對所述移植物樣品進行肉眼檢查，并且劃分成額切片(frontalslice)。同時準備兩個手術部位。從每一個樣品中取出厚度為大約2-3μm的五個切片。
利用標準染色方法評估變化，包括用蘇木精-曙紅評估細胞成分，用Elastica van Gieson評估間充質結構，用Trichrome評估間充質結構，并且評估膠原纖維新生，并且用鐵染料確定出血的程度結果手術內(nèi)和手術后過程除了兩只動物之外所有動物的麻醉、手術和手術后隨訪期都是平靜無事的。一只動物在誘導麻醉期間死亡，這是由于難治性心律失常。另一只動物在手術之后14天突然且出乎意料地死亡，在此之前一直是平安無事的手術后過程。對腦進行的顯微檢查示出了廣泛的皮質壞死，具有出現(xiàn)疤痕的跡象。因此，導致死亡的最可能的原因是由于未知的病因而導致的長期大腦局部缺血。
很少出現(xiàn)手術內(nèi)出血，這種出血是輕度的，并且在大部分場合下來自硬膜的小血管。使用具有雙極的鑷子或止血劑迅速控制出血。
在手術后隨訪過程中，沒有一只動物表現(xiàn)出神經(jīng)學異常。同樣，沒有動物表現(xiàn)出炎癥、腦脊液泄漏或受到損傷的傷口愈合的病征。
肉眼檢查在從手術部位取出樣品期間對以下參數(shù)進行檢查和定量-顱骨和硬膜之間粘連的形成；-腦脊液泄漏和炎癥變化；-硬膜移植物的可見的變化；和-腦膜皮層粘連和皮層反應。
顯微鏡檢查按照以下方法對組織學切片進行系統(tǒng)性評估-對移植部位的炎癥反應進行描述和定量(硬膜外、硬膜下、位于硬膜和移植物之間的過渡區(qū))；-移植物結締組織的組織的程度；-異物反應的程度；
-蛛網(wǎng)膜下隙的改變(炎癥過程；纖維化對開放的蛛網(wǎng)膜下隙)；和-皮層的改變(炎癥，壞死)。
肉眼檢查和組織學研究結果下面所描述的組織學研究結果在細胞組成方面相同，而在強度方面不同，所述研究是用來自相同動物的不同的額切片以及在相同組的所有動物進行的。
移植物整合的肉眼檢查評估在2周時間段之后取出顱骨，在血纖蛋白膠殘余物和覆蓋的骨之間發(fā)現(xiàn)了雙側的最小的粘連。這種粘連是容易松開的。在任一個硬膜移植部位都沒有出現(xiàn)炎癥或腦脊液滲出的跡象。在兩種移植物上都分散有斑點狀獨立的血凝塊，其直徑為幾個毫米。
在左半球上，所述馬膠原薄片仍然同樣是局限的，并且看上去比最初的磨砂玻璃外觀變得透明度更差一些。在將所述硬膜小心地從皮層上取下時，所述膠原產(chǎn)品保持與所述硬膜邊緣附著。存在少數(shù)幾個非常輕微的粘連，這些粘連很容易松開而又不損傷皮層。
用肉眼看上去右半球中的TutoplastDura沒有改變。在取出所述產(chǎn)品時，在移植物-硬膜接觸區(qū)中，TutoplastDura在一定位置上發(fā)生分離。在將硬膜從皮層上取下時，有很少的蛛網(wǎng)膜下粘連，不過，很容易用鑷子將這些粘連松開。
手術之后四周，在疊蓋骨和下面的硬膜的邊緣之間存在少數(shù)的粘連；這些粘連是由于血纖蛋白膠的殘余物造成的。所述骨能夠在沒有拖拉的情況下很容易地從硬膜上松開，從而不會導致對硬膜或移植物的損傷。在位于左半球上的所述馬膠原薄片部位，硬膜和移植物之間的分界區(qū)不再明確。所述移植物與以前相比變得不太透明，并且呈現(xiàn)淺紅色。所述移植物朝向腦的表面的面貌是均勻的、光滑的和可以移動的。不再存在硬膜下粘連?？梢钥吹缴贁?shù)幾個血凝塊殘余物。
用肉眼看上去TutoplastDura同樣沒有改變。檢查移植物和硬膜之間的接觸區(qū)發(fā)現(xiàn)了不充分的、容易松開的結合。
手術之后八周，位于左半球上的硬膜和馬膠原薄片移植物之間的過渡區(qū)不再存在。在腦膜兩側的結構連續(xù)性是明顯的。放置所述馬膠原薄片的區(qū)域僅僅出現(xiàn)在略微變薄的膜上，并且呈現(xiàn)淺紅色外觀。參見圖9和10。此時位于右半球中的TutoplastDura移植物的兩側都被薄的結締組織膜覆蓋。參見圖11。在重疊的硬膜下面，移植物的邊緣仍然清晰可見。對TutoplastDura輕微的拖拉就足以使它與預先形成的硬膜分離。
在16周之后，新硬膜形成在所述馬膠原薄片部位進一步發(fā)展，并且所述硬膜和新硬膜幾乎不可區(qū)分。
位于右半球上的TutoplastDura移植物的結締組織封裝變得更清晰。
在24周時間段之后，兩個移植部位的切片與前一組的切片在肉眼檢查上沒有差別。
移植物整合的顯微鏡評估正如所預料的，在手術之后兩周，所述馬膠原薄片移植物部位出現(xiàn)了廣泛的炎癥改變區(qū)域。整個蛛網(wǎng)膜下隙是通過粘連閉合的，這種粘連是由于來自淋巴細胞、分割的粒細胞和巨噬細胞的大量滲出物造成的。在所述移植物上，具有非常廣泛的炎癥滲出物的某些區(qū)域同樣是明顯的。除了淋巴細胞和單核細胞成分之外，還有小的骨碎片具有多核巨大細胞與相應的異物的反應。
所述馬膠原薄片移植物本身表現(xiàn)出均勻結構的疏松和炎癥細胞的入侵，是心形的或廣泛的。參見圖12。在少數(shù)場合下，存在(與手術相關的)大腦皮層的淺表區(qū)的缺血性壞死。
TutoplastDura樣品同樣表現(xiàn)出廣泛的炎癥反應，特別是在蛛網(wǎng)膜下隙。移植物本身不會被炎癥細胞滲透，但是，在兩端炎癥淋巴細胞和單核細胞和異物反應是可以確認的。
在四周時間段之后，所述馬膠原薄片移植部位的炎性改變發(fā)生了明顯衰退，但是，仍然存在草坪樣淋巴細胞和單核細胞滲出物。參見圖13和14。多核異物巨大細胞更為常見，特別是在靠近骨碎片處。在最初的馬膠原薄片移植物中可以看到多個成纖維細胞。在HE(蘇木精-曙紅-染色)切片上，移植物的一般的均勻結構是檢測不到的。用EVG(Elasticavon Gieson)和trichrome染色的樣品在以前的移植部位表現(xiàn)出廣泛的膠原纖維新生。實際的硬膜順利地讓路于松散結構的組織，這種組織由表現(xiàn)出炎性滲透的新形成的膠原纖維組成。不再存在以前觀察到的柔腦膜的炎性粘連。同樣存在蛛網(wǎng)膜下隙，從而產(chǎn)生裂口。軟腦膜繼續(xù)表現(xiàn)出淋巴細胞-單核細胞在一定位置滲透的小的結節(jié)。
在TutoplastDura部位沒有結締組織的組織的跡象。在植入的組織的上面和下面存在炎性滲出，并且在預先成型的硬膜的過渡區(qū)存在炎性滲透。蛛網(wǎng)膜下隙是可檢測的和明顯的。參見圖15。
在手術之后八周，在所述馬膠原薄片組中，在新硬膜中的炎癥過程進一步衰退。只有小的淋巴細胞和單核細胞滲透叢仍然存在。所述蛛網(wǎng)膜下隙是清晰的，并且同樣只存在小的炎癥活性病灶。用EVG和trichrome染色的切片在高度膠原的內(nèi)源硬膜和新形成的新硬膜的膠原纖維之間表現(xiàn)出明顯的連續(xù)性。這種新的膜看上去厚度不同，并且部分地表現(xiàn)出結構疏松。參見圖16。
在TutoplastDura部位，也已很好地消除了炎癥活性。在一定位置不存在與相鄰的硬膜的整合，而在其他位置，存在與相鄰的硬膜的炎性滲透和粘連的跡象。
在16周之后，在所述馬膠原薄片組中，仍然可以看到淋巴細胞和單核細胞結節(jié)狀炎性滲透物的叢。高度膠原的實際硬膜和新硬膜之間的連續(xù)性沒有改變，其中相對于在8周的發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)重大的結構改變。存在不同厚度的膠原纖維，其中在一定位置存在某些結構疏松。
TutoplastDura部位同樣顯示了與周圍硬膜的炎性變化和粘連；這些發(fā)現(xiàn)的強度不同。
在24周之后，在所述馬膠原薄片組中，除了細胞炎癥反應的進一步衰退之外，與16周的移植物整合階段相比，不存在相關的組織學差異。參見圖17。
組織學結果在下面的表1中提供了在移植部位和硬膜下和硬膜外隙的炎癥反應、結締組織的組織和異物反應程度的定量。
表1-移植物、硬膜下和硬膜外隙的檢查
炎癥(炎癥反應)-- 沒有可見的炎癥反應的跡象u僅僅局限的炎性滲透+輕度炎癥反應++ 顯著炎癥反應+++ 嚴重的炎性滲透移植物的組織-- 結締組織的組織缺乏或輕微+移植物內(nèi)隔離的成纖維細胞u局限的組織的組織(40％-70％)u/K 組織的組織＞70％K新硬膜和硬膜的可見的連續(xù)性，移植物的完全組織(100％)異物與多核巨大細胞的反應-- 沒有異物反應u僅有局限的異物反應+中度異物反應++ 顯著的異物反應+++ 廣泛的異物反應在下面的表2中提供了兩個移植部位的蛛網(wǎng)膜下隙的組織學檢查結果。
表2-蛛網(wǎng)膜下隙(SAS)的檢查
炎癥-- 無炎癥反應+中度炎癥反應++ 顯著炎癥反應嚴重炎癥反應SAS(蛛網(wǎng)膜下隙)閉合-- 分散的炎癥細胞+由細胞滲透閉合的SASu在SAS中隔離的炎性滲透pF/F SAS的部分纖維化/纖維化SAS開放-- SAS主要是清晰的，具有隔離的細胞組+蛛網(wǎng)膜下隙清晰討論手術方法的評估和兩種移植物的處理所述馬膠原薄片以不存在問題的手術內(nèi)的處理為特征。在生理鹽水中再次水合5分鐘，產(chǎn)生了大約2mm厚的非常堅硬的薄膜，它不會喪失其形狀，不會粘聚，并且非常容易切割成型。很容易用鑷子和平頭鉤子將這種材料放入硬膜缺陷中。由于它的活動性，在固定在一定位置之前還很容易糾正所述馬膠原薄片在腦表面上的位置。沒有必要縫合所述薄膜，因為使用血纖蛋白膠能夠將所述移植物快速而且容易地附著在所述硬膜邊界上。以前的研究同樣也已證實，血纖蛋白膠是用于硬膜閉合的可靠的封閉劑。
用最小的拖拉就能將實驗性施用的固定縫合線從所述馬膠原薄片上拉開，從而表明了血纖蛋白膠是這種移植物的更好的選擇。
在隨后取出所述產(chǎn)品時，在某些場合下存在過于隨意的施用血纖蛋白膠業(yè)已導致了與一定位置的覆蓋骨粘連的跡象。這些粘連必須用解剖器小心地松開，以便避免拉動腦膜和皮層。這一問題可以通過使用或點上少量的血纖蛋白膠而避免。在取出所述產(chǎn)品時，很明顯，血纖蛋白膠自身的施用產(chǎn)生了牢固的硬膜閉合，并且避免了腦脊液滲出。這種現(xiàn)象在手術后2周就開始出現(xiàn)，此時，沒有動物發(fā)展皮下CSF泄漏或腦脊液瘺管。
在經(jīng)過幾分鐘的短時間的再水合之后，TutoplastDura產(chǎn)品同樣很容易處理，不過它是更堅硬的，并且在口徑方面表現(xiàn)出大的波動。
血纖蛋白膠產(chǎn)生適度的粘連，以便將TutoplastDura保持在最初的位置上，但是在重新打開手術部位時，原始硬膜和移植物之間的連接是疏松的。在手術之后24周依然是這種情況，這是由于TutoplastDura本身沒有與自體的硬膜融合的結果。因此，使這種移植物與單個縫合線附著的實踐似乎好于使用血纖蛋白膠，因為觀察表明，在其他場合下不會出現(xiàn)適當?shù)恼?。在TutoplastDura和皮層之間的過渡區(qū)很少出現(xiàn)粘連，這些粘連使用解剖器很容易分開。
用于將所述馬膠原薄片插入硬膜和皮層之間的技術似乎在某些手術場合下是不適合的。具體地講，用這種方法在涉及大腦實質的大的缺陷，例如，腫瘤腔的手術中似乎不能適當?shù)毓潭ā?br> 在肉眼檢查水平上，所有動物都表現(xiàn)出硬膜缺陷的可靠的閉合，其中沒有移植物排斥反應。在少數(shù)場合下發(fā)展了移植物和皮層結構之間的小的粘連，這可能是由于在手術期間對蛛網(wǎng)膜的微小的損傷造成的。過度濫用血纖蛋白膠，導致某些動物在小的區(qū)域具有容易松開的與疊蓋的骨的粘連。
從組織學角度看，在植入之后14天出現(xiàn)了淋巴細胞、巨噬細胞和成纖維細胞對所述馬膠原薄片的密集的滲透。隨后在移植物中形成了毛細管。在手術后僅4周，在蛛網(wǎng)膜下和硬膜下/硬膜外隙的伴隨的炎性改變就充分衰退。由于膠原纖維新生而在所述馬膠原薄片移植物和周圍的硬膜之間出現(xiàn)的連續(xù)的過渡此時同樣是可見的。
通過所述馬膠原薄片誘導的這種新硬膜在手術之后24周不如原始硬膜厚，這可能是由于所述硬膜薄片從開始僅提供了某種厚度。不過這種差異可能隨著更多膠原纖維的產(chǎn)生在隨后被抵消。
在手術之后兩周，TutoplastDura在薄層結締組織中表現(xiàn)出所述產(chǎn)品的肉眼可見的封裝，所述薄層隨著時間的推移變厚。另外，所有動物都表現(xiàn)出適當?shù)挠材ら]合，沒有CSF瘺管，并且在移植物和皮層或骨之間出現(xiàn)少許粘連。
盡管在移植物周圍的結構中存在類似的炎癥反應，但沒有手術后進行組織的跡象，并且少有移植物的細胞滲透和復蘇的跡象。
除了預期的局部包含的淋巴細胞和單核細胞炎癥反應之外，沒有動物發(fā)展神經(jīng)學異常或傷口感染。
實施例2-馬膠原薄片的膨脹能力涉及所述馬膠原薄片的膨脹能力的研究是按以下方法進行的1)首先將所述馬膠原薄片切割成1cm2的方形片。
2)在常規(guī)掃描顯微鏡下檢查這些切割片的樣品，以便確定所述材料的總體形態(tài)學一致性和厚度，作為膨脹過程的參考。
3)然后將這些切割片放入塑料培養(yǎng)皿中。
4)然后通過以下方式檢查流體吸收能力和膨脹能力用生理鹽水溶液連續(xù)滴定，用Eppendorf微量移液管施用，其中使用逐漸加大量的流體，從10μl/cm2開始直到最高150μl/cm2(參見表3)。
表3
結果在如上表所示的1、2和3小時之后測定被滲透到所述馬膠原薄片中的流體量。
一片大小為1cm2的馬膠原薄片材料能完全吸收10μl量的鹽水流體，而又并不會有厚度的明顯可見的膨脹。
20μl量的鹽水流體能夠用1cm2的馬膠原薄片完全吸收，并且導致該材料厚度的略微增加。
在整個系列中只觀察到了馬膠原薄片厚度的最小的增加。據(jù)估計，厚度的最大增加僅為初始體積的大約2倍，即使在3小時之后。
在第一小時之后沒有發(fā)現(xiàn)厚度或流體吸收的顯著增加。
實施例3-水合的馬膠原薄片的長度的增加1.0cm2大小的七個干燥馬膠原薄片放在等滲氯化鈉中水合1小時。由于干燥馬膠原薄片水合而導致的平均長度增加為大約3.4％。
表4
實施例4-水合的馬膠原薄片重量的增加將大小為1.0cm2的七個干燥的馬膠原薄片放在等滲氯化鈉中水合1小時。水合的馬膠原薄片的重量大約為干燥狀態(tài)的五倍。
表5
實施例5-馬膠原薄片的抗張強度和彈性/柔韌性測量了若干硬膜產(chǎn)品和本發(fā)明的馬膠原薄片的抗張強度。將樣品安裝在管子的下端，并且將水柱連續(xù)增加到最大為300cm來提高抗張強度。圖18提供了試驗室的說明。
所述試驗室能夠通過鑒定產(chǎn)品由于超出該產(chǎn)品抗張強度的壓力而損壞的點，來測定所述硬膜代用品的強度。本發(fā)明的馬膠原薄片(膠原含量5.6mg/cm2)和膠原薄片(膠原含量4.0mg/cm2)與Duragen(IntegraNeuroSciences，Plainsboro，NJ)進行比較。
試驗結果表明，所述馬膠原薄片(膠原含量5.6mg/cm2)和膠原薄片(膠原含量4.0mg/cm2)能承受最高達300cm的水柱而不損壞。參見圖19和20。比較而言，在健康顱骨中產(chǎn)生的壓力不會超過大約15cm高的水柱；在病理學狀態(tài)下，所述壓力可以提高到最高大約50cm。
DuraGen測量了明顯更低的抗張強度，在200cm水柱的壓力下破裂。參見圖21。所述試驗室還能夠通過鑒定所述產(chǎn)品在壓力下伸展的程度來比較所述產(chǎn)品的彈性。因此，產(chǎn)品的彈性/柔韌性是通過測量產(chǎn)品在所述水柱重量下的凸出確定的。
將所述馬膠原薄片(膠原含量5.6mg/cm2)和膠原薄片(膠原含量4.0mg/cm2)的彈性/柔韌性與DuraGen、膠原測試薄片、Tutoplast闊筋膜(Tutogen Medical GmbH，Neunkirchen am Brand，德國)，和Ethisorb Dura Patch(Ethicon GmbH & Co.KG，Nordrstedt.德國)進行比較。參見圖22-25。
與其他產(chǎn)品相比，所述馬膠原薄片(膠原含量5.6mg/cm2)表現(xiàn)為較大的抗張強度和彈性/柔韌性偶聯(lián)的混合物。這使得它能夠承受作為硬膜代用品在它上面產(chǎn)生的壓力，同時保持柔韌性和彈性，從而使它適合腦和顱骨的輪廓。相反，Ethisorb和Tutoplast在水柱試驗中表現(xiàn)出高的抗張強度，但是具有低得多的彈性/柔韌性。
實施例6-不透液體的特性置換硬膜產(chǎn)品的不透液體的特性的測量是使用與實施例5所討論的相同的實驗設置測定的。
在本實驗中，相對水柱高度測量水滴的發(fā)展和喪失的水的體積。該實驗的結果如圖23-26所示。
在本實驗中，所述馬膠原薄片(膠原含量5.6mg/cm2)在超過300cm高的水柱下保持是不透液體的。所述膠原薄片(膠原含量4.0mg/cm2)在300cm高的水柱下表現(xiàn)出小水滴的喪失。由于具有多孔結構，DuraGen不是不透水的，而是甚至在低的水壓力下也表現(xiàn)出明顯的水的喪失。類似地，Tutoplast闊筋膜同樣不是不透水的，在低壓力下表現(xiàn)出水的喪失。
實施例7-穩(wěn)定性和抗撕強度只有在潮濕和干燥環(huán)境下足夠穩(wěn)定、有彈性和抗撕裂的材料適合用作特殊手術場合的植入物，如用于替代硬膜。因此，測定潮濕材料的抗撕強度/極限張力，提供了關于結構、穩(wěn)定性和保持在手術部位的可能性的有價值的信息。
用水合樣品測試膠原手術植入物的抗撕強度，以便模擬在身體中占優(yōu)勢的條件。將所述材料放入等滲鹽水溶液中5分鐘。
為了測量抗撕強度/極限張力，將膠原植入物條在Zwick Model 1120All-Purpose Testing Machine(Zwick GmbH & Co.KG，Ulm，德國)中夾住。在表6中提供了測試過的膠原植入物。
表6-膠原植入物
機器控制、數(shù)據(jù)獲取和測試，包括統(tǒng)計學估計是使用TestExpert軟件(Zwick GmbH & Co.KG，Ulm，德國)進行的。試驗海綿樣品A、B和C看來相當脆弱。將樣品A、B和C切割成寬度為1.4cm的4cm的條。按比例計算所有樣品的1.0cm寬度條的測試結果。測試條的極限張力值是以牛頓/cm-條為單位測量的。在表7和圖27中提供了測試結果。
表7-抗撕強度/極限張力
結論所述馬膠原薄片的獨特的生產(chǎn)方法，提高了它的抗撕強度/極限張力。
與膠原海綿相比，膠原薄片表現(xiàn)出明顯更高的抗撕強度/極限張力。
膠原薄片的抗撕強度隨著每平方厘米的膠原含量的提高而提高(例如，膠原含量為4.0mg/cm23.21N/cm-條；膠原含量為5.6mg/cm24.09N/cm-條)。
綜上所述，可以看出實現(xiàn)了本發(fā)明的若干目的。
由于在不背離本發(fā)明范圍的前提下可以對上述組合物和方法進行多種改變，所以希望在上述說明書中所包含的所有事項都被理解成說明性質的而不是限制性質的。
關于在整個說明書(包括下面的權利要求書)中所使用的詞語“包含(comprise)”或“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，申請人指出，除非在上下文中有其他需要，這些詞語是以基本的和清楚的理解使用的，即它們被解釋成包含性質的，而不是排他性質的，并且申請人希望上述每一個詞語在理解整個說明書中都以這種方式解釋。
權利要求
1.馬膠原薄片在生產(chǎn)用來通過使所述硬膜組織與所述薄片接觸而修復和再生哺乳動物中硬膜組織的藥物中的用途，其中，所述馬膠原薄片包括不是通過化學試劑或輻射交聯(lián)的馬膠原原纖維的非天然存在的生物基質，所述生物基質是大體上無孔的，并且基本上由非細胞成分組成，所述成分包括結締組織蛋白。
2.如權利要求1的用途，其中，所述馬膠原薄片包括多層膠原原纖維。
3.如權利要求1或2的用途，其中，所述馬膠原原纖維源于腱。
4.如權利要求3的用途，其中，所述腱是跟腱。
5.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片是可再吸收的。
6.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述硬膜組織因為先天性狀況、出生缺陷、疾病、損傷或手術過程而需要修復和再生。
7.如權利要求6的用途，其中，所述手術過程是腫瘤切除。
8.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述硬膜組織位于顱骨內(nèi)。
9.如上述權利要求1-7中任意一項的用途，其中，所述硬膜組織位于脊柱內(nèi)。
10.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在干燥形式下的厚度為0.01mm-3.0mm，例如0.02mm-2.0mm，0.03mm-1.5mm或0.05mm-1.0mm。
11.如上述權利要求1-9中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在它的干燥形式下的厚度為1.0mm或更薄。
12.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述接觸步驟包括利用血纖蛋白封閉劑、組織膠和/或外科縫合線，和/或利用壓力配合技術或利用馬膠原薄片和硬膜組織之間的天然粘連將所述馬膠原薄片附著在硬膜組織上。
13.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片大體是不透液體的。
14.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在所述接觸步驟之前水合例如5秒鐘至10分鐘，優(yōu)選在所述接觸步驟之前在生理鹽水中水合1-6分鐘。
15.如上述權利要求1-13中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在所述接觸步驟之前不進行水合。
16.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在完全水合時，重量達到其干重的最多15倍，優(yōu)選僅達到它的干重的最多10-最多5倍。
17.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在干燥時其重量為1mg/cm2-50mg/cm2，例如，2.5mg/cm2-10mg/cm2。
18.如上述權利要求1-16中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在完全水合時的表面積比它的干燥形式的表面積大-5％-20％，優(yōu)選大-5％-10％或-5％-5％，例如比它的干燥形式大大約4％。
19.如權利要求1的用途，其中，所述馬膠原薄片的厚度在完全水合時大約是它的干燥形式的厚度的大約2倍或3倍。
20.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在與腦膜細胞進行細胞組織之后不會附著在神經(jīng)組織或腦組織上。
21.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片在與腦膜細胞發(fā)生細胞組織之后不會附著在顱骨或脊柱組織上。
22.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述哺乳動物選自人、馬、羊、猴和實驗室動物。
23.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片還包括選自下列一組的賦形劑防腐劑、生長因子、有助于馬膠原薄片的柔韌性和彈性的添加劑，以及它們的組合。
24.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片不包含病毒或朊病毒。
25.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述膠原原纖維基本上由I型膠原組成。
26.如上述權利要求中任意一項的用途，其中腦膜細胞的細胞組織是在手術后大約六周完全組織的。
27.如上述權利要求中任意一項的用途，其中，所述馬膠原薄片的極限張力為0.5牛頓/cm-條-30牛頓/cm-條，例如，1牛頓/cm-條-6牛頓/cm-條。
全文摘要
一種在硬膜組織因為損傷、腫瘤、手術等而受到損害時利用大體上無孔的馬膠原薄片修復和再生哺乳動物的硬膜組織的方法。所述無孔的馬膠原薄片包括膠原原纖維，它提供了替代硬膜組合物，所述組合物是彈性的、不透液體的，并且具有高抗張強度。另外，所述無孔的馬膠原薄片是可再吸收的，并且提供了生物基質，其中，快速形成了新硬膜，它能在大約幾周時間內(nèi)變得無法與自體的硬膜區(qū)分。用于制備馬膠原薄片的方法，降低了疾病傳播的可能性。
文檔編號A61L27/24GK1832773SQ200480022430
公開日2006年9月13日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權日2003年6月5日
發(fā)明者J·奧達, A·澤佩爾尼亞, R·沙赫特勒, A·W·施滕伯格 申請人:巴克斯特國際有限公司, 巴克斯特健康護理股份有限公司