專利名稱：人組織蛋白酶g的dna適體的制作方法
背景技術(shù)：
組織蛋白酶G是通常發(fā)現(xiàn)于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞嗜天青顆粒的絲氨酸蛋白酶。與彈性蛋白酶和蛋白酶3一起屬于胰凝乳蛋白酶家族，并且水解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)如彈性蛋白、膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白，導(dǎo)致動物廣泛的肺組織損傷。
組織蛋白酶G還在血液凝固中起作用，事實(shí)上它參與了白血球啟動的血凝固的另一個(gè)途徑，并且通過激活凝血因子X和V而水解并潛在調(diào)節(jié)凝血酶受體以及體外(in vitro)激活血小板。它還能夠?qū)⒀芫o張素I轉(zhuǎn)變成血管緊張素II，其中在分子其它處只發(fā)生較少水解。
已經(jīng)表明組織蛋白酶G能夠殺死細(xì)菌和真菌，但是該特性與其活性無關(guān)，事實(shí)上其水解后產(chǎn)生的肽具有直接抗菌特性。它還能使壞死組織惡化并且因此與幾種炎性疾病如肺氣腫、支氣管炎、囊性纖維化和銀屑病相關(guān)。
組織蛋白酶G的酶活性通過兩類蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)所謂的“典型”抑制劑和絲氨酸蛋白酶抑制劑。前者是相對較小的蛋白質(zhì)(29-190個(gè)氨基酸)并且是緊密結(jié)合的可逆抑制劑；其中有Mucus蛋白酶抑制劑(MPI)、水蛭蛋白酶抑制劑c和抑蛋白酶肽。絲氨酸蛋白酶抑制劑是較大的蛋白質(zhì)(400-450個(gè)殘基)，由于在組織蛋白酶G的催化部位和絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)域之間形成不可水解的?；I，所以絲氨酸蛋白酶抑制劑與它們的關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)形成不可逆的復(fù)合物。在絲氨酸蛋白酶抑制劑中，1-抗胰凝乳蛋白酶是最重要的因?yàn)樗鼈兡軌蚪Y(jié)合和抑制其它胰凝乳蛋白酶所以該家族抑制劑不是選擇性的。而且，它們的體內(nèi)(in vivo)穩(wěn)定性和分布受其肽的性質(zhì)的影響。
從包含1，2，5-噻二唑烷-3-酮1，1-二氧化物(1，2，5-thiadiazolidin-3-one1，1dioxide)或者1，3-二氮雜環(huán)丁烷-2，4二酮的肽模擬物支架發(fā)現(xiàn)了幾種合成抑制劑，并且它們中的一些(特別是具有芳族側(cè)鏈的那些)表現(xiàn)出對組織蛋白酶G的相當(dāng)特異的活性。然而，它們與酶形成了不可逆的?；衔?。
最近，發(fā)現(xiàn)全長的和水解的染色體DNA都能體外和體內(nèi)結(jié)合和抑制組織蛋白酶G。一個(gè)30bp的DNA片段在生理?xiàng)l件下與組織蛋白酶G緊密結(jié)合，并且對人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的親和性與對蛋白酶3的親和性相比降低一個(gè)等級，這與彈性蛋白酶的陽離子特性降低相一致。
具體而言，EP-775745公開了具有大約40個(gè)核苷酸(并且在任何情況下均低于55個(gè)核苷酸)的鏈長度并且包含G對重復(fù)單位的抑制組織蛋白酶G的寡核苷酸適體，它對于治療和預(yù)防炎癥發(fā)生和前凝血?jiǎng)┎涣紶顩r是有用的。
發(fā)明描述本研究主要致力于組織蛋白酶G的非肽抑制劑的鑒定，其中所述的抑制劑具有高水平的選擇性并且因此能夠更有效地用于治療和預(yù)防上述疾病并且也可用于治療和預(yù)防遺傳病、退化性疾病、DNA損傷、瘤形成和/或皮膚病。
像抗體一樣，DNA分子也能依靠它們的序列呈現(xiàn)出多種三維結(jié)構(gòu)。它們中的一些與靶標(biāo)的結(jié)合有關(guān)。在本研究中，我們采用叫作SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)的方法選擇和鑒定了稱作適體并表現(xiàn)出對組織蛋白酶G高親和性的ssDNA或RNA分子。
適體技術(shù)結(jié)合了在寡核苷酸隨機(jī)庫中產(chǎn)生巨大結(jié)構(gòu)多樣性的能力和擴(kuò)增所選擇序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的能力。該技術(shù)涉及篩選寡核苷酸的大的隨機(jī)序列庫，并且基于它們能夠呈現(xiàn)出大量的四級結(jié)構(gòu)的事實(shí)，在這些大量的四級結(jié)構(gòu)當(dāng)中一些四級結(jié)構(gòu)會擁有針對靶分子的目的結(jié)合或催化活性。
雖然抑制作用不是選擇過程所需要的，但是在許多情況下這些配體直接抑制靶蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。在這些情況下，配體的抑制性功能推測可能是由于它們的結(jié)合部位與蛋白質(zhì)的功能區(qū)重疊所致。
我們研究的結(jié)果導(dǎo)致闡明了一個(gè)具有相當(dāng)高水平選擇性的抑制組織蛋白酶G的新類適體。
本發(fā)明的新的抑制組織蛋白酶G的適體是單鏈或雙鏈線形DNA或多核苷酸序列，其特征為具有至少60個(gè)(優(yōu)選70個(gè))核苷酸的鏈長度并且基本上沒有分子間和/或分子內(nèi)堿基配對。
根據(jù)本發(fā)明的最佳實(shí)施方案，DNA序列具有70-120個(gè)核苷酸、優(yōu)選70-110個(gè)核苷酸、甚至更加優(yōu)選80-100個(gè)核苷酸的鏈長度。雖然本發(fā)明的序列可以是單鏈或者雙鏈的，但單鏈序列是優(yōu)選的。本發(fā)明的序列還可以優(yōu)選地表征為具有大約25-50％、優(yōu)選35-45％的鳥嘌呤摩爾含量和/或具有大約1.0-2.0、優(yōu)選1.2-1.8的AG/TC摩爾比(為了本發(fā)明的目的，AG意思是指序列中A和G核苷酸的總數(shù)，而TC意思是指序列中T和C核苷酸的總數(shù))。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是●(GT)n或(AC)n寡聚物(oligopolymer)，其中n為35-60，優(yōu)選40-50；●(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n單一多聚物(omopolymer)，其中n為70-120，優(yōu)選80-100。
在本發(fā)明的條件內(nèi)，措辭“基本上沒有分子間和/或分子內(nèi)堿基配對”意思是指在嚴(yán)格和非嚴(yán)格條件下DNA或多核苷酸序列的分子間和/或分子內(nèi)堿基配對沒有達(dá)到高于20％、優(yōu)選高于10％、甚至更加優(yōu)選高于5％的程度。此種結(jié)果是它們的結(jié)構(gòu)的直接結(jié)果，因?yàn)槿缦率聦?shí)實(shí)際上阻止了任何種類的雜交●具有1.0-2.0的AG/TC摩爾比；或●為(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n大于30；或●為(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n單一多聚物，其中n大于60。
根據(jù)下面的討論很明顯本發(fā)明的適體確實(shí)選擇性地并有效地抑制組織蛋白酶G，并且因此它們可以用于制造治療和預(yù)防炎癥發(fā)生、前凝血?jiǎng)┎涣紶顩r、遺傳病、退化性疾病、DNA損傷、瘤形成和/或皮膚病的藥物，因此這代表了是本發(fā)明的目標(biāo)。本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是包含本發(fā)明抑制組織蛋白酶G的適體和通常的賦形劑和/或佐劑的藥物組合物。本發(fā)明的其它目標(biāo)是選自序列表中所報(bào)道(即選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO18)的抑制組織蛋白酶G的適體。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)部分材料組織蛋白酶G購自Europa Bioproducts或Calbiochem。所有的寡核苷酸從Eurogentec Bel SA(比利時(shí))得到并在使用前用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化。一些已經(jīng)通過PAGE純化的寡核苷酸從Gibco BRLCustom Primers得到。Taq聚合酶購自Pharmacia Amersham Biotech，而dNTP鈉鹽購自Boehringer Mannheim。T4多核苷酸激酶、連接酶和限制酶購自Gibco Life Technologies。使用Qiagen試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒小量制備純化并且使用T7序列(Pharmacia Amersham Biotech)和[γ-33P]dATP(NenLife Sciences)進(jìn)行測序。
ssDNA文庫合成的隨機(jī)庫是96個(gè)堿基長度的，并且分子的中間部分是隨機(jī)區(qū)，隨機(jī)區(qū)的兩側(cè)是用于擴(kuò)增、克隆和測序的兩個(gè)恒定區(qū)；其序列為5’CGTACGGAATTCGCTAGC(N)60GGATCCGAGCTCCACGTG-3’。下劃線的序列分別指EcoRI和BamHI的限制位點(diǎn)。
通過使用引物II-up(其序列為5’-CGTACGGAATTCGCTAGC-3’)和引物III-Down(5’Biot-CACGTCGAGCTCGGATCC-3’，其中在5’端進(jìn)行生物素化以便能夠被鏈霉親和素柱結(jié)合以得到ssDNA)的PCR對庫進(jìn)行擴(kuò)增。
選擇方法將開始的隨機(jī)庫用32p進(jìn)行放射性標(biāo)記、在高溫下變性并在接近生理?xiàng)l件的孵育緩沖液(IB緩沖液30mM Tris HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM KCl和5mM MgCl2)中與組織蛋白酶G孵育。
孵育在冰上進(jìn)行90分鐘，然后將樣品裝載到填有用IB緩沖液溶脹和平衡的瓊脂糖SP(Amersham Pharmacia Biotech)的親和層析微型柱上。將ssDNA/蛋白質(zhì)溶液與樹脂在4℃孵育30分鐘。用緩沖液IB洗掉未結(jié)合的寡核苷酸分子，將保留下的更具有選擇性的寡核苷酸分子用高離子強(qiáng)度洗脫緩沖液(EB緩沖液0.8M NaCl，50mM Tris pH7.8)從柱上洗脫下來。
為了增加嚴(yán)格性可以在選擇過程中改變洗滌體積和DNA濃度，其中在第一個(gè)循環(huán)中DNA濃度是蛋白質(zhì)的兩倍，但濃度逐漸減低。
測定各個(gè)級分并將Selex循環(huán)的產(chǎn)量表示為總放射性的百分?jǐn)?shù)。收集洗滌流過液和EB洗脫的前2個(gè)級分并擴(kuò)增。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用0.3-0.5u/50μl濃度的Taq聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，緩沖液為生產(chǎn)者所指定的。在每次不同的選擇后調(diào)整循環(huán)數(shù)。
在插入用于克隆的質(zhì)粒載體之前，將DNA進(jìn)行反應(yīng)以得到平端在推薦的緩沖液中將一份正常PCR反應(yīng)與2.5u/μl Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)在72℃孵育30分鐘。
ssDNA的產(chǎn)生為了從dsDNA得到ssDNA我們使用了堿變性方法。使用生物素化的Down-II引物擴(kuò)增DNA并結(jié)合到填有鏈霉親和素瓊脂糖(Pierce)的色譜柱上。在孵育30分鐘后，使用NaCl 50mM，Tris/HCl 100mM，EDTA 10mM的緩沖液(SBB-鏈霉親和素結(jié)合緩沖液)將未結(jié)合的dsDNA洗掉，而保留部分是變性的并且用0.15N NaOH洗下來。然后沉淀并收集用于選擇循環(huán)。
克隆和測序使用2.5單位的EcoRI處理擴(kuò)增的dsDNA和載體pUC19(Amersham-Pharmacia Biotech)并且使用產(chǎn)生平端的SmaI處理載體。
沉淀后，將3pmol dsDNA和0.6pmol pUC19在推薦的緩沖液中使用T4連接酶進(jìn)行反應(yīng)。
然后通過使用E.coli pulser(Biorad)的電穿孔方法將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)細(xì)胞(SURE株，Stratagene)并鋪于含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的固體培養(yǎng)基(用于藍(lán)白斑篩選)上。分別挑取50個(gè)不同的白色克隆，并在液體LB培養(yǎng)基中生長并收獲。通過堿裂解純化質(zhì)粒并通過瓊脂糖凝膠電泳測定每次純化的質(zhì)粒的質(zhì)量。
使用Sanger方法測定了適體的序列，其中用[γ-33P]dATP進(jìn)行標(biāo)記并使用2個(gè)不同引物EleA4575’-ACG-CCA-AGC-TTG-CAT-3’(正義)和EleS5’-GGG-TTT-TCC-CAG-TCA-CGA-3’(反義)。
Kd和Ki的測定如在選擇方法中所實(shí)施，通過親和層析測定了寡核苷酸的親和性。將每一寡核苷酸的不同等分試樣與15μg的組織蛋白酶G在冰上預(yù)先孵育。然后將溶液裝載于用于選擇的微型層析柱上并使用15倍體積的IB緩沖液洗滌。在孵育1小時(shí)后，用6倍體積的EB緩沖液洗滌。收集相等體積的級分并測定。
表面等離振子共振(SPR)實(shí)驗(yàn)將來自人嗜中性粒細(xì)胞的組織蛋白酶G溶解于HBS EP緩沖液，pH7.40(Biacore)，并按照Biacore推薦的方法使用Biacore胺偶聯(lián)試劑盒將其固定于CM 5研究級傳感器芯片流動室表面?？瞻讓φ樟鲃邮沂峭ㄟ^使用不含組織蛋白酶G而含有所有上述試劑的試劑制備的。固定于流動室表面的組織蛋白酶G的量是5178.91±129.63RU。
將適體[Poly GT(鏈長度20、30、40、60、80和100)和Poly AC(鏈長度20、40和80]溶解于30mM Tris-HCl緩沖液，pH7.50，150mM NaCl，5mM KCl和5mM MgCl2中，并且注射到組織蛋白酶G表面或空白對照表面。進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)。第一組，所有的適體濃度為500nM；第二組，所有的適體濃度為6595μg/L；第三組，根據(jù)待測試的適體濃度范圍為15.6-8000nM。所有上述實(shí)驗(yàn)均使用運(yùn)行緩沖液Biacore HBS EP Buffer，pH7.40并于25℃下進(jìn)行。通過兩次注射2M NaCl使組織蛋白酶G表面再生。將每一樣品的傳感圖減去對照的傳感圖并且評價(jià)了結(jié)合反應(yīng)。將在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)合反應(yīng)以濃度(nM)的對數(shù)作圖得到濃度-效應(yīng)曲線，以便找出能夠結(jié)合來自人嗜中性粒細(xì)胞的組織蛋白酶G的相對有效的適體。
結(jié)果部分適體的選擇和鑒定我們從DNA庫開始選擇了組織蛋白酶G的適體，其中DNA庫具有60個(gè)核苷酸的隨機(jī)區(qū)和兩側(cè)的具有用于PCR反應(yīng)的保守序列和用于隨后克隆步驟的限制位點(diǎn)的區(qū)域(見上)。
我們選擇親和層析作為選擇方法，將蛋白質(zhì)結(jié)合到樹脂上。因?yàn)樵谏項(xiàng)l件下帶有正電荷的組織蛋白酶G(理論等電點(diǎn)為11)能夠緊密地結(jié)合到離子交換樹脂上，而DNA分子與樹脂的非特異結(jié)合大大降低了，所以該方法是最容易的方法。實(shí)際上，只有識別蛋白質(zhì)的DNA分子保留在柱子上，而未結(jié)合的物質(zhì)將被洗掉。我們試著通過在結(jié)合溶液中包含5mM的氯化鉀和氯化鎂以提高緩沖液的離子強(qiáng)度并穩(wěn)定寡核苷酸的折疊來獲得標(biāo)記ssDNA和蛋白質(zhì)間更有選擇性地結(jié)合過程。
然后使用高離子強(qiáng)度緩沖液(緩沖液EB)將選擇的分子連同結(jié)合的蛋白質(zhì)一起從柱子上有效去除并測定放射性。收集前兩個(gè)級分和洗滌流過液，PCR擴(kuò)增并還原成單鏈分子便于在下一循環(huán)中使用(細(xì)節(jié)見方法部分)。
我們進(jìn)行了9個(gè)循環(huán)的選擇在第四個(gè)循環(huán)后觀察到產(chǎn)量明顯增加，但是在三輪后沒有觀察到庫親和性的進(jìn)一步增加時(shí)于是終止SELEX，實(shí)現(xiàn)了42％的終產(chǎn)量(表1)。通過改變洗滌次數(shù)和體積增加了選擇的嚴(yán)格性。在第5和7個(gè)循環(huán)后進(jìn)行保護(hù)柱的操作以避免適體非特異結(jié)合樹脂將來自先前循環(huán)的庫裝載到?jīng)]有蛋白質(zhì)的柱子上，從柱中洗脫的第一個(gè)級分用于擴(kuò)增并用于下一個(gè)循環(huán)。


圖1SELEX循環(huán)方案圖
序列分析如在實(shí)驗(yàn)部分所描述將選擇的分子克隆入大腸桿菌細(xì)胞并測序。在50個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn)了19個(gè)不同的序列。使用了兩個(gè)序列比對程序即Clustal W和FastA-align查找重復(fù)的共有序列，但是由于分子的多樣性相當(dāng)高以致于甚至在所測序分子的子集中也沒有得到好的比對。進(jìn)一步的分析表明GT基序明顯地在14個(gè)序列中出現(xiàn)重復(fù)。仔細(xì)觀察后發(fā)現(xiàn)它們不易于形成適當(dāng)程度的分子間和分子內(nèi)堿基配對也不能形成像G四方結(jié)構(gòu)(G quartet)一樣的更加復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)?？雌饋恚x擇方法產(chǎn)生了能夠緊密結(jié)合帶正電荷蛋白質(zhì)的松散的、線性的和靈活的分子，它們的結(jié)合是由于電荷-電荷之間的相互作用。為了證實(shí)該假設(shè)，我們將所選擇適體之一即60mer CG51與不具有配對序列的其他寡核苷酸如oligo GT或AC結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。在最后一個(gè)循環(huán)的選擇中得到的寡核苷酸序列報(bào)道如下；它們每一個(gè)記做不同的編號(其中CG51和CG43是相同的)。
上面的序列對應(yīng)如下的序列表CG1＝SEQ ID NO1，CG3＝SEQ IDNO2，CG11＝SEQ ID NO3，CG16＝SEQ ID NO4，CG20＝SEQ ID NO5，CG25＝SEQ ID NO6，CG28＝SEQ ID NO7，CG32＝SEQ ID NO8，CG39＝SEQ ID NO9，CG43(和CG51)＝SEQ ID NO10，CG48＝SEQ IDNO11，CG49＝SEQ ID NO12，CG2＝SEQ ID NO13，CG31＝SEQ IDNO14，CG23＝SEQ ID NO15，CG34＝SEQ ID NO16，CG45＝SEQ IDNO17，CG40＝SEQ ID NO18。
所選擇分子和相關(guān)序列對組織蛋白酶G的親和性CG1GGGTGGCCCCCTAGTCGCGCACTGGAAGCGGTAGTGTCGTGAGATTCGTATCTGGGGTATCG3CAACGAGTCAGGGCGTGATTGGTGAAGATGTGTGGTTTGGCCAGAAAGGGCGATGGTGGACG11AGAGCTGAGACGGACATGCTGCCCATGGAGACTGTTCGAGAGGGTGAGCGGGAGTGGGCG16ACCCCTAGGTCAGCACGTAGTGTAGGGCGATGTGTTCATGGCGGGAATGTGAGTTGTGGGCG20GGGCGGCTCGCGTTGTGGAACATTCGTGGTGCCAATGCGTACCAGGGATTGCCTCCTGTCG25GGGCGATTGGCGAATGCAAGGGTAAGGTTGGGCGATTGATGTGCACGTAGC GCAGAGCATCG28GGAACGTGGTAGGTGTGTCTGCTGTGTGTGGCTCGGGCAGGTTGTCAGGGTGTTT
CG32GGGCATAGGGCGTCGTAGCCTGAAGGTGTGATTCGTGCGTTAGATGGGGGGCAGTCTGCCG39CGGTGGAGAGGTCGCAATGACACGGTTGACGATAGGCCCCTTGCTAACATCGGTTGGTGCG43CAACGTGTGATATGTGGGTATACGCTTGGGTGTTACGCTGAGCACAGAGGGTATTCGTGTCG48AGSGGGCAGCAGCACACCACACATGTACGTGGGGGATTGCATTGTGTACTTAGACGGTATCG49GGCCTGGGTGATGTACTATGTATGCGTCGTGGTGGCTGGTAAAGGGGGTCTGCTATGGGTCG51CAACGTGTGATATGTGGGTATACGCTTGGGTGTTACGCTGAGCACAGAGGGTATTCGTGTCG2CCACGGACGCTGTGAGCGGCCAACGGATGGGAATCACGATCTGGCCCGAACCACATACCGCG31TCACACTAGGGCACTTGCTAAGTAGCTATGTAACTCGATCATACTTATTAGGCTTGCG23AATCGATGGACACTTCAACGCAACTTGACATGGCGGTACGTGGACTCTTGTGGCGACAGTTCG34AACCCGTGTGATAAGGATATGGTGACTTCGTGGCACAGCGTCGACGGACTGCCCATTCCACG45GGCGGGCGGTATGGGCTGCAGGATATGCAGGGGCGCAGAGGACAGTCTGGCCATGTACTACG40GGCAGGGACGTTCCCAGGAATGCGGCACAGGCAGACAGCTCCCGACGAGTACCAGGGTG通過與選擇方法類似的親和層析法評價(jià)了寡核苷酸與組織蛋白酶G的結(jié)合。首先，將適體CG51與同樣長度的AC和GT寡核苷酸比較，如所提到，這些AC和GT寡核苷酸不能明顯折疊成通過沃森-克里克堿基配對或G四方結(jié)構(gòu)形成所表征的任何結(jié)構(gòu)。將CG51的互補(bǔ)序列(叫作cmpCG51)作為對照。此外，為了證明寡核苷酸長度是否是結(jié)合蛋白質(zhì)的重要因素，測定了長于或短于60個(gè)核苷酸的AC和GT寡核苷酸的親和性。
如通過SELEX的高產(chǎn)量所預(yù)測，CG51表現(xiàn)出對組織蛋白酶G高的親和性(Kd為0.9nM)。除此之外，其Kd與相同長度的AC和GT寡核苷酸(Kd分別為0.8nM和1nM)和cmpCG51(Kd為0.6nM)的Kd是可比的(圖1)。這些資料表明，關(guān)于通過松散和靈活分子緊密結(jié)合的假設(shè)是正確的。
比60mer長的分子如(AC)60和(GT)40(它們分別為120mer和80mer)表現(xiàn)出Kd為1.2nM的親和性。另一方面，較短的分子(GT)20和(GT)10的Kd分別為1.5nM和2nM，這表明所選擇寡核苷酸的長度對于有效結(jié)合是重要的。
為了證明寡核苷酸的結(jié)構(gòu)對于組織蛋白酶的結(jié)合是否是重要的，將所選擇的針對凝血酶的適體THR作為對照。已知該適體形成穩(wěn)定的G四方結(jié)構(gòu)。在這種情況下，Kd值低(4nM)，表明該類型的結(jié)構(gòu)不可能表現(xiàn)出有效的識別基序。
有趣地是，雙鏈CG51表現(xiàn)出比單鏈更低的親和性，即使單鏈具有大量帶電荷的基團(tuán)也是如此。的確，雙鏈寡核苷酸體積更大且更不靈活，因此不能最佳結(jié)合蛋白質(zhì)。
表面等離振子共振(SPR)實(shí)驗(yàn)從第一組實(shí)驗(yàn)(每一適體為500nM)得到的資料提供了第一種證據(jù)，即以GT適體為例，超過60的鏈長度的增加導(dǎo)致結(jié)合的增加，但是這種增加比30-60范圍內(nèi)的增加較緩。在20-30的范圍內(nèi)時(shí)結(jié)合較差。以AC適體為例，它們的結(jié)合比GT適體的結(jié)合更不顯著。SPR反應(yīng)與分析物(在本例中為適體)的表面質(zhì)量濃度相關(guān)，因此其取決于與表面(在本例中由組織蛋白酶G制成)結(jié)合部位數(shù)量有關(guān)的分析物的分子量。為了排除一下疑問，即適體的明顯結(jié)合不是取決于適體的質(zhì)量而恰恰是取決于適體結(jié)構(gòu)特征，開展了第二組實(shí)驗(yàn)，其中質(zhì)量濃度是相同的(每個(gè)適體濃度為6595μg/L)。結(jié)果同第一組實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果(為了簡短起見沒有顯示數(shù)據(jù))。在圖2中總結(jié)了GT和AC適體的濃度對數(shù)-效應(yīng)的曲線。在該圖中報(bào)道了每個(gè)適體在所提到的得到線性回歸的濃度范圍內(nèi)的反應(yīng)。GT 100是最有效的適體并被賦予效能為1(相對標(biāo)準(zhǔn))。GT 80的相對效能大約為0.32，GT 60的相對效能大約為0.144，AC 80的相對效能大約為0.017，GT 40的相對效能大約為0.016，AC 40的相對效能大約為0.0047且GT 30的相對效能大約為0.0020。由于GT 20和AC 20結(jié)合較差，所以無法估計(jì)數(shù)值?？梢源致缘貙⑦m體分成三個(gè)家族(圖2)。第一家族GT 100，GT 80和GT 60；第二家族AC 80，GT 40，AC 40和GT30；第三家族AC 20和GT 20。
在圖3中總結(jié)了PolyT適體的濃度對數(shù)-效應(yīng)曲線。正如所認(rèn)識到的，分別具有序列(T)100和(T)80的適體PolyT100和PolyT80比PolyT60更有效。討論僅在四個(gè)循環(huán)的選擇之后，可以看到結(jié)合到蛋白質(zhì)的分子的百分?jǐn)?shù)極大增加，并且在第9個(gè)循環(huán)得到了42％的產(chǎn)量，不可能進(jìn)一步地對庫進(jìn)行富集。然而對所選擇適體的序列分析沒有發(fā)現(xiàn)它們具有共有基序的證據(jù)。仔細(xì)觀察后發(fā)現(xiàn)這些分子大多數(shù)缺乏GT/C，因此不可能進(jìn)行配對并折疊成G四方結(jié)構(gòu)。可能帶負(fù)電荷和靈活的單鏈DNA分子能夠最好地結(jié)合這種帶正電荷的蛋白質(zhì)。甚至在SELEX緩沖液中存在相當(dāng)數(shù)量的氯化鈉和氯化鎂的情況下，靶分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用仍然主要通過電荷相互作用控制著。
為了證實(shí)該奇特的“一致的”基因原理的假設(shè)，將所選擇適體之一CG51的親和性與幾種AC和GT寡核苷酸的親和性比較。我們確認(rèn)CG51對組織蛋白酶G具有相當(dāng)高的親和性，其Kd在納摩爾范圍內(nèi)，這表明選擇過程有效選擇出了有效的結(jié)合子(binder)庫。(AC)30、(GT)30和與CG51具有相同長度(和總體結(jié)構(gòu)特性的)的cmpCG51的解離常數(shù)是可比的，而較短的分子表現(xiàn)出較低的親和性。雙鏈CG51表現(xiàn)出對組織蛋白酶G較低的親和性該意義十分巨大，因?yàn)樗C明平均長度為30bp的染色體DNA不能夠結(jié)合該蛋白質(zhì)。
我們證明長度至少為60，優(yōu)選70-80的線性和靈活的單鏈DNA與染色體對等物相比能夠更有效結(jié)合組織蛋白酶G，并且也比較短的DNA鏈更有效。
序列表<110>真蒂奧姆有限公司<120>人組織蛋白酶G的DNA適體<130>04MG31E<150>EP 03425428.4<151>2003-06-30<160>18<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>60<212>DNA<213>未鑒定<400>1gggtggcccc ctagtcgcgc actggaagcg gtagtgtcgt gagattcgta tctggggtat60<210>2<211>60<212>DNA<213>未鑒定<400>2caacgagtca gggcgtgatt ggtgaagatg tgtggtttgg ccagaaaggg cgatggtgga60<210>3<211>58<212>DNA<213>未鑒定<400>3agagctgaga cggacatgct gcccatggag actgttcgag agggtgagcg ggagtggg 58<210>4<211>60<212>DNA<213>未鑒定<400>4acccctaggt cagcacgtag tgtagggcga tgtgttcatg gcgggaatgt gagttgtggg60<210>5<211>59
<212>DNA<213>未鑒定<400>5gggcggctcg cgttgtggaa cattcgtggt gccaatgcgt accagggatt gcctcctgt 59<210>6<211>60<212>DNA<213>未鑒定<400>6gggcgattgg cgaatgcaag ggtaaggttg ggcgattgat gtgcacgtag cgcagagcat60<210>7<211>55<212>DNA<213>未鑒定<400>7ggaacgtggt aggtgtgtct gctgtgtgtg gctcgggcag gttgtcaggg tgttt 55<210>8<211>59<212>DNA<213>未鑒定<400>8gggcataggg cgtcgtagcc tgaaggtgtg attcgtgcgt tagatggggg gcagtctgc 59<210>9<211>59<212>DNA<213>未鑒定<400>9cggtggagag gtcgcaatga cacggttgac gataggcccc ttgctaacat cggttggtg 59<210>10<211>60<212>DNA<213>未鑒定<400>10caacgtgtga tatgtgggta tacgcttggg tgttacgctg agcacagagg gtattcgtgt60<210>11<211>60<212>DNA<213>未鑒定
<400>11agsgggcagc agcacaccac acatgtacgt gggggattgc attgtgtact tagacggtat60<210>12<211>60<212>DNA<213>未鑒定<400>12ggcctgggtg atgtactatg tatgcgtcgt ggtggctggt aaagggggtc tgctatgggt60<210>13<211>60<212>DNA<213>未鑒定<400>13ccacggacgc tgtgagcggc caacggatgg gaatcacgat ctggcccgaa ccacataccg60<210>14<211>56<212>DNA<213>未鑒定<400>14tcacactagg gcacttgcta agtagctatg taactcgatc atacttatta ggcttg56<210>15<211>61<212>DNA<213>未鑒定<400>15aatcgatgga cacttcaacg caacttgaca tggcggtacg tggactcttg tggcgacagt60t61<210>16<211>60<212>DNA<213>未鑒定<400>16aacccgtgtg ataaggatat ggtgacttcg tggcacagcg tcgacggact gcccattcca60<210>17<211>60<212>DNA<213>未鑒定
<400>17ggcgggcggt atgggctgca ggatatgcag gggcgcagag gacagtctgg ccatgtacta60<210>18<211>59<212>DNA<213>未鑒定<400>18ggcagggacg ttcccaggaa tgcggcacag gcagacagct cccgacgagt accagggtg 59
權(quán)利要求
1.抑制組織蛋白酶G的適體，其由具有至少60個(gè)核苷酸的鏈長度和經(jīng)受低于20％的程度的分子間和/或分子內(nèi)堿基配對的線性DNA或多核苷酸序列組成，其中所述序列表征為·具有1.0-2.0的AG/TC摩爾比；或·是(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n大于30；或·是(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n單一多聚物，其中n大于60。
2.按照權(quán)利要求1所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于具有60-120個(gè)核苷酸的鏈長度。
3.按照權(quán)利要求2所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于具有70-110個(gè)核苷酸的鏈長度。
4.按照權(quán)利要求3所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于具有80-100個(gè)核苷酸的鏈長度。
5.按照權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于事實(shí)上其為單鏈序列。
6.按照權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于具有1.2-1.8的AG/TC摩爾比。
7.按照權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于具有25-50％的鳥嘌呤摩爾含量。
8.按照權(quán)利要求7所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于具有35-45％的鳥嘌呤摩爾含量。
9.按照權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于其為(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n為30-60。
10.按照權(quán)利要求9所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于其為(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n為35-60、優(yōu)選40-50。
11.按照權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于其為(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n單一多聚物，其中n為60-120。
12.按照權(quán)利要求11所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于其為(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n單一多聚物，其中n為70-120、優(yōu)選80-100。
13.按照權(quán)利要求12所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于經(jīng)受低于10％的程度的分子間和/或分子內(nèi)堿基配對。
14.按照權(quán)利要求13所述的抑制組織蛋白酶G的適體，其特征在于經(jīng)受低于5％的程度的分子間和/或分子內(nèi)堿基配對。
15.按照權(quán)利要求1-14任意一項(xiàng)所述的抑制組織蛋白酶G的適體的用途，其用于制造治療和預(yù)防炎癥發(fā)生、前凝血?jiǎng)┎涣紶顩r、遺傳病、退化性疾病、DNA損傷、瘤形成和/或皮膚病的藥物。
16.藥物組合物，其中包含按照權(quán)利要求1-14任意一項(xiàng)所述的至少一種抑制組織蛋白酶G的適體和通常的賦形劑和/或佐劑。
全文摘要
本發(fā)明致力于組織蛋白酶G的非肽抑制劑的鑒定，其中所述的抑制劑具有高水平選擇性并且能夠有效地用于治療和預(yù)防炎癥發(fā)生和前凝血?jiǎng)┎涣紶顩r。本發(fā)明的抑制組織蛋白酶G的適體由具有至少60個(gè)核苷酸的鏈長度并且基本上沒有有效的堿基配對的線性DNA或多核苷酸序列組成。
文檔編號A61P29/00GK1816625SQ200480018755
公開日2006年8月9日 申請日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者M·帕倫博, B·加托, R·佩斯卡多爾, R·波爾塔, L·I·費(fèi)羅 申請人:真蒂奧姆有限公司