專利名稱：高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物模型的制備方法，尤其涉及一種高表達(dá)HBsAg的且能較好模擬人類乙型病毒性肝炎的小鼠模型的制備方法。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的一種傳染性疾病。目前全世界有大約4億HBV慢性感染患者；在中國，HBsAg攜帶率達(dá)9.75％，慢性乙型肝炎病人約為3000萬，其中10％～20％可發(fā)展為肝硬化，1％～5％可演變?yōu)楦渭?xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。乙型肝炎是一種免疫性疾病，目前對其發(fā)病機制尚不完全清楚；雖然借助細(xì)胞模型和動物模型進(jìn)行了很多體外和體內(nèi)研究，但是由于這些模型在各方面的限制和缺陷，一直沒有取得突破性進(jìn)展。
HBV感染有高度的種屬和組織特異性，人和類人猿是HBV的天然宿主。其原因是病毒黏附以及病毒DNA轉(zhuǎn)錄及復(fù)制對細(xì)胞有嚴(yán)格的要求[參見Tang H，McLachlan A.Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptorsis a critical determinant of viral tropism.Proc Natl Acad Sci USA，2001，981841-1846.]。類人猿和黑猩猩作為HBV感染模型已得到公認(rèn)，但價格昂貴，并涉及倫理問題，難以推廣。
土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus，WHV)是肝炎病毒發(fā)現(xiàn)后第一種被詳細(xì)描述的哺乳動物和鳥類黃病毒，WHV慢性感染后會發(fā)展成嚴(yán)重的肝炎和HCC，其特征性的病理損壞與人類感染HBV后類似。給新生的土撥鼠接種WHV，可獲得慢性WHV感染土撥鼠模型[參見Gerin JL.Experimental WHV infection of woodchucksan animalmodel of hepadnavirus-induced liver cancer.Gastroenterol Jpn.1990 Sep；25 Suppl238-42.]。慢性WHV攜帶的土撥鼠平均壽命為29個月，最后幾乎全部都發(fā)展為肝腫瘤。慢性攜帶WHV的土撥鼠成為HBV感染后抗病毒治療臨床前評價的有價值的動物模型，提供了有用的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)結(jié)果。但是用土撥鼠作動物模型的局限是WHV與HBV有一定差異，使對乙型肝炎的發(fā)病機制和機體應(yīng)答的研究受到限制。
研究發(fā)現(xiàn)樹鼩(Tree shrews，Tupaia belangeri chinenesis)可以感染HBV，樹鼩感染后HBsAg血癥者47％，平均持續(xù)7周，HBV DNA陽性率51％，持續(xù)41周以上；肝細(xì)胞HBV DNA陽性率67％，并存在復(fù)制型HBV DNA[參見嚴(yán)瑞琪，蘇建家，黃定瑞，等.人乙型肝炎病毒在樹鼩的實驗感染及其與HCC發(fā)生的關(guān)系.中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1995，161-5.]。用感染HBV樹鼩的血清可連續(xù)傳代感染，這種感染傳給下一代的平均感染率為94.0％；用乙肝疫苗后可以使88.89％的樹鼩不受感染。通過接種不同量的HBV，發(fā)現(xiàn)樹鼩對HBV感染敏感，認(rèn)為樹鼩可作為一種可靠而有用的動物模型，可用于研究HBV感染及HBV與HCC的關(guān)系[參見Yan RQ，Su JJ，Huang DR，et al.Human hepatitis Bvirus and hepatocellular carcinoma.I.Experimental infection of tree shrewswith hepatitis B virus.J Cancer Res Clin Oncol，1996；122(5)283-288.]。但國外也有不同報道，將新生樹鼩和成年樹鼩腹腔接種HBV陽性患者的血清，都在血清中檢測到HBsAg，2～4周后血清中檢測到抗HBs，抗HBc及抗HBe，而HBsAg消失，類似急性肝炎的病程。說明在樹鼩感染HBV是一過性的，HBV的復(fù)制和表達(dá)水平不高。
鴨乙肝病毒(Duck hepatitis B virus，DHBV)與人HBV屬于一個家族，鴨感染DHBV后可作為人類慢性HBV感染的一種動物模型，用于治療性實驗研究[參見LofgrenB，Vickery K，Zhang YY，et al.2’3’-dideoxy-3’-fluoroguanosine inhibits duckhepatitis B virus in vivo.J Viral Hepat，1996；3(2)61-65.]。但DHBV的感染過程及其引發(fā)的免疫反應(yīng)與人類HBV感染有很大差別，相關(guān)研究結(jié)果僅供參考。
隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生，國內(nèi)外許多學(xué)者相繼建立了各種類型的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(transgenic mouse，Tg鼠)模型[參見Chisari FV，Pinkert CA，Milich DR，et al.Atransgenic mouse model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state.Science，1985；230(4730)1157-1160.2.Hu YP，Hu WJ，Zheng WC，et al.Establishment of transgenic mouse harboring hepatitis B virus(adr subtype)genomes.World J Gastroenterol，2001；7(1)111-114.]，受到各國學(xué)者的重視。將HBV目的基因顯微注射到小鼠的受精卵，產(chǎn)生穩(wěn)定整合HBV的小鼠。在目的基因的選取上，可以是HBV全長或超過其基因組的1.3倍HBV，也可以是HBV片段，如前s、s、c和x基因，用于研究各基因及其表達(dá)產(chǎn)物在HBV生活史中的作用。HBV Tg鼠不僅可以研究HBV感染過程和感染后的免疫病理改變[參見Walter E，Keist R，Niederost B，etal.Hepatitis B virus infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo.Hepatology，1996，241-5.]，還有助于發(fā)展新的抗病毒治療方法。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在慢性HBV攜帶者由于樹突狀細(xì)胞的功能缺陷和缺乏一些必要的細(xì)胞因子，不能有效提呈HBsAg，不能清除病毒，導(dǎo)致持續(xù)感染[參見Guidotti LG，Borrow P，Hobbs MV，et al.Viral cross talkintracellular inactivation of the hepatitis B virus duringan unrelated viral infection of the liver.Proc Natl Acad Sci USA，1996，934589-4594.]。但是在所有的HBV Tg鼠都不能檢測到細(xì)胞內(nèi)cccDNA，而cccDNA是前基因組及各種長度RNA的轉(zhuǎn)錄模板，在HBV的復(fù)制過程中起著非常重要的作用，而目前抗病毒治療主要是在反轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平抑制病毒DNA，而且HBV是整合在宿主染色體上的，沒有經(jīng)過和靶細(xì)胞受體結(jié)合穿透的過程，與自然感染不同，應(yīng)用也受到限制。HBV可在小鼠體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制并表達(dá)相關(guān)抗原，但由于Tg鼠處于對HBV的特異性耐受狀態(tài)，并沒有肝臟炎癥的發(fā)生[參見Farza H，Hadchouel M，Scotto J，et al.Replication andgene expression of hepatitis B virus in a transgenic mouse that contains thecomplete viral genome.J Virol，1988；62(11)；4144-4152.及Choo KB，Liew LN，Chong KY，et al.Transgenome transcription and replication in the liver andextrahepatic tissues of a human hepatitis B virus transgenic mouse.
Virology，1991；182(2)785-792.和Mancini M，Hadchouel M，Davis HL，et al.DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surfaceantigen chronic carrier state.Proc Natl Acad Sci USA，1996；93(22)12496-12501.]，這一缺陷限制了乙型肝炎及HBV相關(guān)HCC發(fā)病機制的深入研究。
為克服轉(zhuǎn)基因鼠的缺陷，研究者尋求一種模擬HBV自然感染的動物模型。將UPA轉(zhuǎn)基因小鼠和RAG-2基因剔除小鼠雜交，得到的后代被移植入人肝細(xì)胞。由于UPA是一種纖維蛋白酶原激活劑，它選擇性地在肝細(xì)胞表達(dá)，使肝細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水解，造成UPA小鼠體內(nèi)肝細(xì)胞持續(xù)損傷，產(chǎn)生肝再生刺激信號，有利于外源肝細(xì)胞的存活。而RAG-2基因剔除小鼠由于缺失重組活化基因RAG-2，T細(xì)胞和B細(xì)胞不能成熟，不具備完整的體液和細(xì)胞免疫功能，對外源肝細(xì)胞不排斥。二者雜交的后代兼有以上兩種特征，可以支持HBV感染和表達(dá)[參見Dandri M，Burda MR，Torok E，et al.Repopulation ofmouse liver with human hepatocytes and in vivo infection wth hepatitis B virus.Hepatology，2001，22981-988.]。實驗中采用脾內(nèi)注射人肝細(xì)胞懸液，在小鼠血清和肝臟中均檢測到HBV各種抗原和復(fù)制中間體。該模型可以用于HBV感染過程和治療的研究，以及肝癌的發(fā)生機制，但因采用的是免疫缺陷鼠，不能作為機體和病毒相互作用特別是免疫清除機制的研究。
Wu等[參見Wu CH，Ouyang EC，Walton C，Liver cell transplantation--novelanimal model for human hepatic viral infections.Croat Med J，2001；42(4)446-450.]給新生期的大鼠移植人的肝細(xì)胞，然后再接種HBV，誘導(dǎo)了對人肝細(xì)胞的耐受而但對HBV感染敏感。通過蛋白印跡及免疫組織化學(xué)染色在肝組織中檢測到能合成人白蛋白的人肝細(xì)胞，并且30％的細(xì)胞HBsAg及HBV DNA陽性，肝臟中存在共價閉環(huán)HBV DNA，這種嵌合了人肝細(xì)胞的耐受大鼠可作為HBV感染的動物模型。Galun等[參見Galun E，Nahor O，Eid A，et al.Human interleukin-6 facilitates hepatitis B virus infectionin vitro and in vivo.Virology，2000；270(2)299-309.]將正常小鼠進(jìn)行致死劑量的射線照射，給予SCID鼠的骨髓細(xì)胞，然后移植預(yù)先經(jīng)過HBV處理人的肝組織或肝細(xì)胞，這樣構(gòu)建的人-鼠嵌合模型血清中可測到HBV DNA。
Takahashi等[參見Takahashi H，F(xiàn)ujimoto J，Hanada S，et al.Acute hepatitisin rats expressing human hepatitis B virus transgenes.Proc Natl Acad Sci USA，1995；92(5)1470-1474.]通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方式建立了一種大鼠的動物模型，將HBV重組體(pHBV-HTD，adwR9亞型)陽離子脂質(zhì)體包裹植入大鼠的肝臟，轉(zhuǎn)染后3～7天，大多數(shù)大鼠可檢測到HBV病毒顆粒及HBe抗原，2～3周后，血清中轉(zhuǎn)氨酶水平升高、匯管區(qū)肝細(xì)胞死亡及淋巴細(xì)胞浸潤，此時血清中檢測不到HBV病毒顆粒，其組織及血清學(xué)變化類似于人類急性乙型肝炎，這種動物模型可用于研究HBV感染后的致病機制。將富含HBV的人血清經(jīng)門靜脈和尾靜脈注入大鼠體內(nèi)(Wistar大鼠，雄性，7只)，1～2月后，肝組織活檢，分別用原位雜交和免疫組化的方法檢測到肝細(xì)胞中HBV DNA、HBsAg呈陽性，HBV DNA、HBsAg位于肝細(xì)胞的胞漿，大多數(shù)陽性細(xì)胞分布于中央靜脈、散在分布于肝小葉中，但未觀察到肝細(xì)胞病變及炎癥的發(fā)生，也未檢測到病毒和抗原血癥，通過這種方法建立了攜帶人HBV的大鼠實驗動物模型[參見Wang Y，Chen H，Wang F，etal.Rat as an animal model carrying human hepatitis B virus in hepatocytes.ChinMed J(Engl)，1996；109(9)674-679.]。
Klein等[參見Klein C，Bock Ct C，Wedemeyer H，et al.Inhibition of hepatitisB virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA.Gastroenterology，2003；125(1)9-18.]通過尾靜脈給NMRI小鼠注射HBV重組體的裸DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV在肝臟特異性表達(dá)，10％的肝細(xì)胞表現(xiàn)為HBc和HBsAg陽性，血清中可檢測到HBeAg、HBsAg和病毒DNA，并能誘導(dǎo)HBV特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
綜上所述，目前應(yīng)用的胚胎期轉(zhuǎn)HBV基因動物都對HBV的主要基因產(chǎn)物處于免疫耐受狀態(tài)，不能引起明顯的肝臟炎癥；而DHBV、WHV與HBV的生物特性相差較大，研究結(jié)果不能直接應(yīng)用于HBV感染的研究。小鼠飼養(yǎng)方便、繁殖周期短，是理想的實驗動物。小鼠對HBV不易感，但HBV可在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)復(fù)制。因此建立一種既能夠嚴(yán)格模擬人類乙型病毒性肝炎又能便于推廣應(yīng)用的小鼠動物模型勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在問題，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中HBV感染動物模型的不足，提供一種包括1.1倍HBV基因的重組載體。
本發(fā)明的第二個目的是利用包括1.1倍HBV基因的重組載體，提供一種采用尾靜脈高壓注射技術(shù)制備高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的方法，利用本發(fā)明的方法建立的小鼠感染HBV的急性、慢性病毒性肝炎模型將有助于對HBV引發(fā)肝炎的發(fā)病機制、機體免疫反應(yīng)、藥物治療等方面的研究。
本發(fā)明的高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，由以下步驟組成(1)載體構(gòu)建載體pcDNA3經(jīng)EcoR V線性化后用牛小腸堿性磷酸酶使其去磷酸化，重組克隆載體p3.6II經(jīng)Pvu II酶切后獲得1.1倍的HBV基因片段，以T4 DNA連接酶連接1.1倍HBV DNA片段和線性化的pcDNA3；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選、酶切、測序鑒定重組質(zhì)粒；(2)將含有1.1倍HBV DNA的重組載體利用尾靜脈高壓注射的方法導(dǎo)入動物體內(nèi)，建立高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型；(3)模型鑒定。
其中，上述的1.1倍的HBV基因組(HBV-DNA)，含3,520個核苷酸，HBV-DNA分為負(fù)鏈即長鏈、正鏈即短鏈，其負(fù)鏈有4個開放讀碼框架(Open Reading Frame，ORF)①S基因區(qū)，由S基因，前S2(pre-S2)基因、前S1(pre-S1)基因組成，分別編碼HBsAg，pre-S、pre-S1及多聚人血清白蛋白受體(PHSA-R)；②C基因區(qū)，由前C基因和C基因組成，分別編碼HBeAg及HBcAg；③P基因區(qū)，編碼HBV-DNAp，并具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性；④X基因區(qū)，編碼HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用；所用1.1倍的HBV DNA包括了全長的4個ORF。
其中，上述的載體pcDNA3用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，長約5.4kb，帶有CMV早期啟動增強子、多克隆位點及新霉素抗性基因；其多克隆位點上存在EcoR I、HindIII、XholI、EcoR V酶切位點，而CMV啟動子則可在多種細(xì)胞內(nèi)獲得有效表達(dá)。pcDNA3載體中存在免疫激活序列，即兩個氨芐抗性基因中的5’-AACGTT-3’序列。免疫激活序列是以CpG為基元的6堿基DNA序列，其中5’端為兩個嘌呤、3’端為兩個嘧啶時效應(yīng)最強。免疫激活序列可刺激B細(xì)胞活化和抗體的產(chǎn)生，并可刺激淋巴細(xì)胞分泌IL-12、IFN-γ和IL-6，其中IL-12和IFN-γ可以促進(jìn)依賴于TH1的細(xì)胞免疫應(yīng)答；而IL-6則可以進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞活化和抗體的分泌，但以促進(jìn)細(xì)胞免疫為主。
上述包括1.1拷貝HBV DNA的重組真核表達(dá)載體由重組克隆載體p3.6II經(jīng)Pvu II酶切后獲得1.1倍的HBV基因片段，再經(jīng)T4連接酶連接到經(jīng)酶切后的pcDNA3的EcoR V位點上。這樣構(gòu)建的重組載體既可以高效復(fù)制、表達(dá)HBV基因，又可激活機體免疫系統(tǒng)，能夠誘發(fā)肝臟炎癥。本室已經(jīng)將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系BEL7402，結(jié)果證實可以高效的進(jìn)行HBV基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，表達(dá)高水平的HBsAg、HBeAg，并可檢測到病毒顆粒。因此，將這一載體用于小鼠體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染建立肝炎模型，可以很好的模擬人類HBV感染所致肝炎的發(fā)生過程與機體免疫反應(yīng)等。
一種含有1.1倍HBV DNA轉(zhuǎn)染的小鼠模型，它是將含有1.1倍HBV DNA的重組載體利用尾靜脈高壓注射的方法導(dǎo)入動物體內(nèi)。所述動物為小鼠。尾靜脈高壓注射法是本發(fā)明所用的關(guān)鍵技術(shù)。
尾靜脈高壓注射[參見F Liu，YK Song and D Liu.Hydrodynamics-basedtransfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.Gene Therapy(1999)6，1258-1266.]作為一種新的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法，克服了原有的肌肉注射、門靜脈注射裸DNA的缺點。目的基因主要在肝細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)，一次注射后基因表達(dá)持續(xù)時間達(dá)到一周，與門靜脈注射相比不需手術(shù)，操作相對簡便。由于轉(zhuǎn)染的基因主要在肝細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)，對于HBV的研究尤其適用。利用這種方法制備乙肝小鼠模型，能夠模擬人類乙肝的發(fā)病過程及免疫應(yīng)答情況，為乙肝發(fā)病機制的研究、藥物篩選與防治方案的選擇提供良好的實驗平臺。
常規(guī)的尾靜脈高壓注射方法先將小鼠置于高溫環(huán)境，使尾靜脈擴張；注射前用異氟烷麻醉，觀察小鼠眼部反射消失；立即在5～8秒內(nèi)將1.5～2.5ml液體(8～10％體重)經(jīng)尾靜脈勻速注射入小鼠體內(nèi)，然后將小鼠置于25～28℃。質(zhì)粒DNA用量為10～100μg，溶液可以是0.9％NS，PBS或Ringer液(147mM NaCl，4mM KCl，1.13mM CaCl2)；尾靜脈注射使用26～27.5號針頭。
本發(fā)明根據(jù)所用質(zhì)粒和動物的實際情況對上述步驟作了改進(jìn)所述的尾靜脈高壓注射方法是先將小鼠置于紅外燈下照射，并用75％的乙醇擦拭，使尾靜脈擴張(更易于進(jìn)行尾靜脈高壓注射)；注射前用乙醚麻醉，觀察小鼠眼部反射消失；5秒內(nèi)將1.4～2.0ml質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1液體經(jīng)尾靜脈勻速注射入小鼠體內(nèi)，然后將小鼠置于25～28℃待用。
所述的質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1用量為20～50μg/ml，溶液使用0.9％NaCl溶液；尾靜脈注射使用了兒科臨床常用的0.55mm頭皮針頭，配合1～5ml注射器。
一次尾靜脈高壓注射后24h之內(nèi)即可獲得急性乙肝模型。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出在首次注射7天后再次進(jìn)行尾靜脈高壓注射，并可多次重復(fù)，可以獲得慢性乙型肝炎模型。
本發(fā)明的特點是利用包括1.1倍HBV DNA的真核表達(dá)載體建立小鼠肝炎模型。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)制作過程簡單易行，能廣泛推廣應(yīng)用；(2)制作過程時間短，對實驗動物的損傷小，動物死亡率低；(3)獲得的模型能高水平的表達(dá)HBsAg，亦能較高水平的表達(dá)HBeAg。能夠較好的模擬人類HBV的感染過程，從而為研究HBV感染的動物實驗提供動物模型制作方法。
在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以利用此模型作為乙肝治療藥物的篩選平臺，以及用于乙肝防治的基礎(chǔ)研究與臨床前實驗，進(jìn)一步研究HBV感染過程中機體免疫系統(tǒng)的變化，探討乙型肝炎及其相關(guān)疾病(如HCC)發(fā)生的分子機制等。


圖1重組載體pcDNA3/1.1HBV的構(gòu)建策略圖2重組載體pcDNA3/1.1HBV的酶切鑒定電泳圖(1)p3.6II、pcDNA3的酶切鑒定自左至右依次為1.DL-2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.pcDNA3以EcoR V酶切，得到線性DNA；3.DL-15000分子量標(biāo)準(zhǔn)；4.p3.6II以Pvu II酶切，得到兩個片段，分別為3907bp、2822bp；5.p3.6II以BamH I酶切，線性DNA長度為6729bp；6.p3.6II(2)pcDNA3/1.1HBV的連接鑒定自左至右依次為1.pcDNA3/1.1HBV以BamH I酶切，得到6099bp、3254bp的兩個片段；2.pcDNA3/1.1HBV以EcoR I酶切，線性DNA長度為9353bp；3.pcDNA3以EcoR I酶切；4.DL-15000分子量標(biāo)準(zhǔn)圖3重組載體pcDNA3/1.1HBV的測序4重組載體pcDNA3/1.1HBV大量提取與純化的電泳圖自左至右依次為1.DL-15000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.純化得到的質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV；3~6.質(zhì)粒提取與純化過程中留取的樣品圖5血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖6血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定結(jié)果圖7ELISA檢測HBV抗原(HBsAg、HBeAg)圖8實時定量PCR檢測HBV DNA含量圖9肝臟組織切片HE染色觀察病理變化可見肝組織彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤，部分有中性粒細(xì)胞浸潤；肝細(xì)胞呈氣球樣變，部分細(xì)胞有壞死表現(xiàn)。
具體實施例方式
制備本發(fā)明的包含1.1倍HBV DNA的重組真核表達(dá)載體及轉(zhuǎn)染該載體的小鼠模型的方法大體包括如下步驟
1.包括1.1拷貝HBV DNA的重組真核表達(dá)載體由重組克隆載體p3.6II經(jīng)Pvu II酶切后獲得1.1倍的HBV基因片段，再經(jīng)T4連接酶連接到經(jīng)酶切后的pcDNA3的EcoR V位點上。重組質(zhì)粒構(gòu)建策略見附圖1。
2.用德國QIAGEN公司質(zhì)粒大量提取純化試劑盒獲得純化的重組質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV。
3.重組質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV經(jīng)尾靜脈高壓注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，建立急性、慢性肝炎模型。
4.模型的鑒定。
采用多方面的指標(biāo)，力求反映人類乙肝檢查的各項指標(biāo)。包括(1)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等肝臟功能指標(biāo)的測定直接反映肝臟炎癥的程度。
(2)ELISA檢測HBV抗原(HBsAg，HBeAg)反映HBV各抗原的表達(dá)水平。
(3)實時定量PCR檢測HBV DNA含量反映HBV DNA的復(fù)制水平。
(4)RT-PCR檢測HBV基因轉(zhuǎn)錄水平。
(5)肝臟HE染色觀察病理變化目前臨床診斷肝炎的金標(biāo)準(zhǔn)，直觀的反映肝臟病變情況。
(6)肝臟免疫組化檢測HBV抗原、抗體表達(dá)。
下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)該理解的是，所述的實施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。
實施例1重組質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV的構(gòu)建1.材料含1.1倍乙型肝炎病毒全基因的質(zhì)粒p3.6II由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所的汪垣教授惠贈。質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA回收試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品。BioPhotometer定量儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，凝膠自動成像系統(tǒng)為美國AmershamPharmacia Biotech公司產(chǎn)品，ZF-BI型紫外分光光度計由上海長明電子儀器廠制造，HZS-H型恒溫水浴振蕩器為哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品，數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(HH·W21·600S)由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造，LKB2103型電泳儀為德國LKB公司產(chǎn)品。
2.方法(1)以Pvu II酶切質(zhì)粒p3.6II，獲得1.1倍HBV DNA片段在Ep管中依次加入雙蒸水6μl、酶切緩沖液2μl、質(zhì)粒p3.6II 10μl、Pvu II 2μl，總體積20μl。離心，37℃水浴3~4小時。加10×loading buffer 2μl終止反應(yīng)。
(2)pcDNA3經(jīng)EcoR V線性化后用牛小腸堿性磷酸酶使其去磷酸化。
(3)以T4 DNA連接酶連接1.1倍HBV DNA片段和線性化的pcDNA31.1倍HBV DNA片段和線性化的pcDNA3各5μl，10×T4 buffer 2μl，10mmol/L ATP2μl，T4 DNA連接酶2μl，雙蒸水4μl，共20μl，混勻。短暫離心，12℃過夜。
(4)氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，抗性篩選。
(5)酶切、測序鑒定重組質(zhì)粒。
3.結(jié)果經(jīng)抗性篩選、酶切、測序鑒定獲得大小、目的基因插入方向均正確的重組質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV。電泳結(jié)果見附圖2，測序結(jié)果見附圖3。
實施例2重組質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV的擴增、提取與純化1.材料(1)質(zhì)粒攜帶1.1拷貝HBV全基因組的重組質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV由本實驗室構(gòu)建并保存。重組質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV保存于大腸桿菌DH5α中。
(2)試劑質(zhì)粒大量提取試劑盒為德國QIAGEN公司產(chǎn)品。試劑盒包含QIAGEN-tip500 10個，Buffer P1 1×110ml，Buffer P2 1×110ml，Buffer P3 1×110ml，Buffer QBT 1×110ml，Buffer QC 3×240ml，Buffer QF 1×170ml，RNase A*1×11mg。
(3)儀器凝膠自動成像系統(tǒng)為美國Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品，ZF-BI型紫外分光光度計由上海長明電子儀器廠制造，HZS-H型恒溫水浴振蕩器為哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品，數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(HH·W21·600S)由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造，LKB2103型電泳儀為德國LKB公司產(chǎn)品，微型臺式離心機(TGL-16G)為上海醫(yī)用分析儀器廠制造，J2-21M/E低溫高速離心機BECKMAN公司產(chǎn)品，Heraeus低溫高速離心機(5804R)、BioPhotometer核酸分析儀(RS 232C)及真空干燥器(5301)均為Eppendorf公司產(chǎn)品。
2.方法按照試劑盒提供說明書的操作步驟進(jìn)行。具體如下(1)開始前將試劑盒提供的整管RNase A加入Buffer P1，使RNase A終濃度為100μg/ml.
(2)將保存的菌種接種到含有氨芐青霉素的LB(稱為LA)固體培養(yǎng)基，挑取單菌落，接種到2～5ml LA液體培養(yǎng)基，37℃水浴振蕩(300rpm)培養(yǎng)8小時。
(3)將上述菌液1ml轉(zhuǎn)種到500～1000ml LA液體培養(yǎng)基，37℃水浴振蕩(300rpm)培養(yǎng)12～16小時，使細(xì)菌數(shù)量達(dá)到3～4×109/ml，約等于3g/L培養(yǎng)基。
(4)收集到的菌液離心6000rpm，15min，4℃。離心完畢，將離心管倒置，使上清流干。
(5)10ml Buffer P1重懸沉淀。
(6)加入10ml Buffer P2，顛倒混勻4～6次，室溫放置～5min。
(7)加入10ml冰預(yù)冷的Buffer P3輕輕顛倒混勻4～6次，冰上放置15～20min。
(8)12,000rpm離心，30min，4℃。迅速轉(zhuǎn)移上清至新的離心管。
(9)將上清再次離心，12,000rpm，15min，4℃。迅速轉(zhuǎn)移上清至新的離心管。(保存120μl樣品作電泳)(10)用10ml Buffer QBT平衡QIAGEN-tip 500，依靠重力使之流過柱子。
(11)將第9步得到的上清加入QIAGEN-tip，使之利用重力流過柱子。(保存120μl樣品作電泳)(12)30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip 2次。(保存240μl樣品作電泳)(13)15ml Buffer QF洗脫DNA，用50ml離心管收集洗脫液。(保存240μl樣品作電泳)(14)室溫下加入10.5ml(0.7倍體積)的異丙醇，混勻，離心9500rpm，30min，4℃。小心去掉上清。
(15)室溫下70％乙醇5ml洗沉淀，離心9500rpm，10min。小心去掉上清。
(16)沉淀置于空氣中干燥5～10min，用合適的溶液溶解(例如生理鹽水，pH7.4；PBS，pH8.0或者10mM Tris·Cl，pH8.5)。
(17)紫外分光光度計測定DNA濃度。
(18)1％瓊脂糖凝膠電泳上述收集的樣品分別用1倍體積的異丙醇沉淀，70％的乙醇洗沉淀，10μl TE buffer(pH8.0)重溶。取2μl上樣電泳。
3.結(jié)果(1)DNA濃度測定1000μg/ml，500μl。OD260/280＝1.75(2)2％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果參見附圖4。
實施例3尾靜脈高壓注射建立小鼠肝炎模型1.材料(1)動物SPF級BALB/c小鼠，4～6周齡，雄性，體重18～22g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)條件按照SPF級動物標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。
(2)試劑經(jīng)QIAGEN質(zhì)粒大量提取試劑盒純化的pcDNA3-HBV1.1，調(diào)整濃度為20～50μg/ml；生理鹽水(0.9％NaCl溶液)。
(3)儀器1ml及5ml注射器；0.55mm針頭。
2.方法(1)尾靜脈高壓注射先將小鼠置于高溫環(huán)境，使尾靜脈擴張；注射前用乙醚麻醉，觀察小鼠反射情況；5秒內(nèi)將1.4～2.0ml液體經(jīng)尾靜脈勻速注射入小鼠體內(nèi)，小鼠置于25～28℃。
(2)經(jīng)內(nèi)眥靜脈竇取血于第1、4、7、10天將小鼠用乙醚麻醉，1ml注射器由內(nèi)眥靜脈竇取血0.2～0.5ml，離心分離血清，用于各項指標(biāo)的檢測。
(3)處死小鼠于第1、4、7、10天將小鼠摘眼球取血、頸椎脫臼處死。取肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟及胸腺，-80℃保存。
3.結(jié)果成功的經(jīng)尾靜脈高壓注射重組質(zhì)粒pcDNA3/1.1HBV，小鼠沒有因操作死亡；經(jīng)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乙肝表面抗原、e抗原測定，實時定量PCR檢測HBV DNA以及肝臟病理證實小鼠肝炎模型建立成功。
實施例4血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定1.材料小鼠血清；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(ALT/GPT，賴氏法)由濰坊3V生物工程有限公司生產(chǎn)(試劑1、2、3及標(biāo)準(zhǔn)液)。
2.方法(1)配制0.4mol/L NaOH溶液取10mol/L NaOH 40ml，用蒸餾水稀釋至1000ml即為0.4mol/L NaOH溶液；(2)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線


混勻，室溫放置10分鐘，在505nm波長處，以0號管調(diào)零，1cm比色杯比色，記錄各管吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(3)測定

混勻，室溫放置10分鐘，在505nm波長處，以蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度，以(AU-AB)之差查標(biāo)準(zhǔn)曲線得ALT活力單位。
3.結(jié)果用本專利發(fā)明的方法建立的小鼠肝炎模型其血清ALT明顯升高。標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)本測定動態(tài)結(jié)果見附圖5及附圖6。
實施例5ELISA檢測HBV抗原HBsAg、HBeAg1.材料小鼠血清，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)酶免試劑盒2.方法(1)配制工作用洗滌液濃縮洗滌液20ml/瓶，用蒸餾水1∶20稀釋后使用；
(2)加樣設(shè)空白對照1孔，陰、陽性對照各2孔，分別加陰、陽性對照各50μl和50μl待測樣本于相應(yīng)孔內(nèi)；(3)加酶除空白對照孔外，每孔加1滴(50μl)酶標(biāo)記物，輕輕振蕩，用透明膠條將板孔封好；(4)溫育37℃水浴30分鐘；(5)洗滌扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置20秒，扣去洗滌液，重復(fù)4次后在吸水紙上拍干；(6)顯色每孔加入底物液A、B各1滴，輕輕振蕩封板后，置37℃水浴15分鐘；(7)結(jié)果判定每孔加終止液1滴，用酶標(biāo)儀檢測(波長450nm)各孔OD值(空白孔調(diào)零)。
3.結(jié)果檢測到了高水平的HBsAg表達(dá)，較高水平的HBeAg表達(dá)。HBV抗原表達(dá)的動態(tài)變化見附圖7。
實施例6實時定量PCR檢測HBV DNA含量1.材料小鼠血清標(biāo)本，乙型肝炎病毒(HBV)熒光定量PCR檢測試劑盒由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；熒光檢測使用美國伯樂公司生產(chǎn)的BIO-RAD iCycler。
2.方法(1)試劑準(zhǔn)備按每個反應(yīng)取HBV PCR反應(yīng)液22μl，酶1μl計算加于一總的無菌離心管中，振蕩混勻；用微量加樣器在每一PCR反應(yīng)管內(nèi)加入23μl上述混勻的反應(yīng)液，存于4℃。
(2)標(biāo)本裂解(直接裂解法)取20μl裂解緩沖液加入0.5ml離心管后，再分別加入20μl血清標(biāo)本、陰性對照、臨界對照、陽性對照，混勻。沸水浴10分鐘，14000rpm離心10分鐘，取上清2μl做PCR反應(yīng)。
(3)PCR反應(yīng)在上述準(zhǔn)備的PCR反應(yīng)管中加入標(biāo)本DNA 2μl，在PCR熱循環(huán)儀iCycler上設(shè)定如下程序


55℃時收集熒光信號。
(4)反應(yīng)完畢，存儲結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
(5)每次試驗均做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將曲線相關(guān)系數(shù)控制在0.99以上。
3.結(jié)果用本方法建立的小鼠乙肝模型HBV DNA陽性，復(fù)制拷貝數(shù)達(dá)到3.5×105。詳見附圖8。
權(quán)利要求
1.一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，由以下步驟組成(1)載體構(gòu)建載體pcDNA3經(jīng)EcoR V線性化后用牛小腸堿性磷酸酶使其去磷酸化，重組克隆載體p3.6II經(jīng)Pvu II酶切后獲得1.1倍的HBV基因片段，以T4 DNA連接酶連接1.1倍HBV DNA片段和線性化的pcDNA3；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選、酶切、測序鑒定重組質(zhì)粒；(2)將含有1.1倍HBV DNA的重組載體利用尾靜脈高壓注射的方法導(dǎo)入動物體內(nèi)，建立高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型；(3)模型鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，其特征是，所述的1.1倍的HBV基因組(HBV-DNA)，含3,520個核苷酸，HBV-DNA分為負(fù)鏈即長鏈、正鏈即短鏈，其負(fù)鏈有4個開放讀碼框架(Open Reading Frame，ORF)①S基因區(qū)，由S基因，前S2(pre-S2)基因、前S1(pre-S1)基因組成，分別編碼HBsAg，pre-S、pre-S1及多聚人血清白蛋白受體(PHSA-R)；②C基因區(qū)，由前C基因和C基因組成，分別編碼HBeAg及HBcAg；③P基因區(qū)，編碼HBV-DNAp，并具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性；④X基因區(qū)，編碼HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用；所用1.1倍的HBV DNA包括了全長的4個ORF。
3.如權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，其特征是，所述的載體pcDNA3用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，長約5.4kb，帶有CMV早期啟動增強子、多克隆位點及新霉素抗性基因；其多克隆位點上存在EcoR I、HindIII、Xhol I、EcoR V酶切位點，CMV啟動子可在多種細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。
4.如權(quán)利要求3所述的一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，其特征是，所述的載體pcDNA3中存在免疫激活序列，即兩個氨芐抗性基因中的5′-AACGTT-3′序列，所述免疫激活序列是以CpG為基元的6堿基DNA序列，其中5’端為兩個嘌呤、3’端為兩個嘧啶時效應(yīng)最強。
5.如權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，其特征是，所述的尾靜脈高壓注射方法是將小鼠置于紅外燈下照射，并用75％的乙醇擦拭，使尾靜脈擴張；注射前用乙醚麻醉小鼠，觀察小鼠眼部反射消失；5秒內(nèi)將1.4～2.0ml質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1液體經(jīng)尾靜脈勻速注射入小鼠體內(nèi)，然后將小鼠置于25～28℃待用。
6.如權(quán)利要求5所述的一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，其特征是，所述的質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1用量為20～50μg/ml，溶液使用0.9％ NaCl溶液；尾靜脈注射使用兒科臨床常用的0.55mm頭皮針頭，配合1～5ml注射器。
7.如權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，其特征是，所述的模型鑒定采用如下指標(biāo)(1)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測定——肝臟功能指標(biāo)；(2)HBV抗原HBsAg或HBeAg的ELISA檢測；(3)HBV DNA含量的實時定量PCR檢測；(4)HBV基因轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR檢測；(5)肝臟病理變化——HE染色觀察；(6)HBV抗原、抗體表達(dá)——肝臟免疫組化檢測。
8.如權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，載體構(gòu)建尚包括單拷貝、多拷貝及HBV DNA片段為目的基因的重組真核表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型的制備方法，由以下步驟組成(1)載體構(gòu)建載體pcDNA3經(jīng)EcoR V線性化后用牛小腸堿性磷酸酶使其去磷酸化，重組克隆載體p3.6II經(jīng)Pvu II酶切后獲得1.1倍的HBV基因片段，以T4 DNA連接酶連接1.1倍HBV DNA片段和線性化的pcDNA3；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選、酶切、測序鑒定重組質(zhì)粒；(2)將含有1.1倍HBV DNA的重組載體利用尾靜脈高壓注射的方法導(dǎo)入動物體內(nèi)，建立高表達(dá)HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型；(3)模型鑒定。本發(fā)明的方法制作過程簡單易行，能廣泛推廣應(yīng)用；制作過程時間短，對實驗動物的損傷小，動物死亡率低；獲得的模型能高水平的表達(dá)HBsAg，亦能較高水平的表達(dá)HBeAg。模型可作為乙肝治療藥物的篩選平臺，用于HBV感染的基礎(chǔ)研究和臨床相關(guān)研究。
文檔編號A61K49/00GK1679967SQ200410075550
公開日2005年10月12日 申請日期2004年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月21日
發(fā)明者孫汶生, 劉玉剛, 張秋, 高立芬, 石永玉, 劉素俠, 朱法良, 郭春 申請人:山東大學(xué)