專(zhuān)利名稱(chēng)：血管發(fā)生相關(guān)分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管發(fā)生領(lǐng)域，更具體地涉及新的諸如蛋白質(zhì)和肽的分子，由此可開(kāi)發(fā)新的抗血管發(fā)生物質(zhì)。本發(fā)明還涉及開(kāi)發(fā)這類(lèi)物質(zhì)的方法。
背景幾乎所有的哺乳動(dòng)物機(jī)體組織均含有極細(xì)血管的細(xì)小網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)血管均比人發(fā)更細(xì)。通常，由于覆蓋血管的內(nèi)皮細(xì)胞分化緩慢，這些血管的數(shù)目和大小實(shí)際上長(zhǎng)達(dá)數(shù)年也不增加。例外的情況是例如，在創(chuàng)傷愈合以及月經(jīng)期間，該情況中血管生長(zhǎng)迅速。但是，這僅發(fā)生在有限的期間，此后細(xì)胞分裂停止。
從已有細(xì)胞中產(chǎn)生新血管被稱(chēng)為血管發(fā)生。已知血管發(fā)生與癌癥及腫瘤形成以及其它疾病相關(guān)，諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎甚至一些炎性疾病。因此，全球范圍內(nèi)已進(jìn)行了相當(dāng)大量的研究以找出預(yù)防和抑制血管發(fā)生過(guò)程的方法。如果可能，則可控制腫瘤生長(zhǎng)，可開(kāi)發(fā)出針對(duì)上述疾病的有用的治療方法。
已有大量證據(jù)顯示，多種腫瘤依賴(lài)于血管的從頭形成以擴(kuò)增至大于數(shù)立方毫米的物質(zhì)。血管發(fā)生由腫瘤細(xì)胞分泌的多種因子引發(fā)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，腫瘤通過(guò)不受約束的蛋白質(zhì)分解活性產(chǎn)生顯示抗血管生成活性的肽片段。一個(gè)例子是制管張素分子，其是纖溶酶原的片段。
纖溶酶原是血漿中的一種物質(zhì)，其激活時(shí)形成纖溶酶或纖維蛋白溶酶，該酶參與血液凝集。纖溶酶原自身缺乏任何可檢測(cè)到的抗血管生成活性。已發(fā)現(xiàn)此內(nèi)源性蛋白質(zhì)的一部分，更具體地，其前四個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域能阻止內(nèi)皮細(xì)胞分裂(Judah Folkman等，哈佛醫(yī)學(xué)院(Harvard Medical School)，Boston)。此纖溶酶原部分已被命名為制管張素，本領(lǐng)域中大量研究集中于此分子。現(xiàn)有技術(shù)顯示，制管張素尤其在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞，且體內(nèi)阻斷血管發(fā)生。用制管張素皮下注射的系統(tǒng)性治療在SCID小鼠中誘導(dǎo)大范圍腫瘤的體內(nèi)休眠(O’Reilly等，自然雜志醫(yī)藥分冊(cè)(Nature Med.)，2卷，689頁(yè)，1996)。即使在數(shù)月的治療后也未在這些動(dòng)物中檢測(cè)到任何可檢測(cè)的毒性。制管張素顯示兩種水平的特異性體外其特異性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡(Claesson-Welsh等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci；USA)，卷95，5579頁(yè)，1998)，并且僅在體內(nèi)血管發(fā)生中影響內(nèi)皮細(xì)胞的活性。目前尚未顯示在已有血管中對(duì)細(xì)胞有副作用。
制管張素的確顯示出一些有利的性質(zhì)，尤其是它是一種內(nèi)源性物質(zhì)。但是，與其用于可能的醫(yī)藥用途相關(guān)的不利之處不能忽視。一個(gè)是其半壽期非常短，其可能以小時(shí)計(jì)，由此需要頻繁給藥。由此顯示其效率相當(dāng)?shù)停@一事實(shí)要求其大劑量施用。這兩個(gè)不利之處本身強(qiáng)烈激發(fā)了針對(duì)尋找替代性的、更小和/或更有效的分子作為藥物的研究。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)提供一種稱(chēng)為“ABP-1”的人類(lèi)蛋白質(zhì)解決了與上述制管張素相關(guān)的問(wèn)題，所述蛋白質(zhì)由其結(jié)合纖溶酶原片段(優(yōu)選其前四個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域(K1-K4))的能力定義，所述片段的特征為抗血管發(fā)生生物學(xué)活性。
ABP-1包含與SEQ ID NO.2所示基本上類(lèi)似的氨基酸序列。本發(fā)明也涵蓋ABP-1的變體和片段。
本發(fā)明還涵蓋了其它種屬尤其是其它哺乳動(dòng)物中的ABP-1同系物。
又一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼ABP-1的序列或編碼與ABP-1基本上類(lèi)似的多肽，包括其變體、片段和同系物。
本發(fā)明又一方面提供了核酸探針，其序列衍生自SEQ ID NO.1；這些探針可用作研究工具以及用于診斷方法中，例如檢測(cè)和測(cè)量組織和細(xì)胞中ABP-1生物合成。
相應(yīng)的，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供用于在組織和細(xì)胞中檢測(cè)ABP-1或其變體和片段存在與否及數(shù)量的診斷方法。
本發(fā)明也包括了用于鑒定能夠與ABP-1或其變體及片段相互作用的化合物之篩選方法。篩選方法可為任何本領(lǐng)域周知的形式。
本發(fā)明的又一方面提供了用所述篩選方法鑒定的且能夠調(diào)節(jié)ABP-1或其變體和片段的生物學(xué)活性之化合物。
本發(fā)明的又一方面提供了含有用上述篩選方法鑒定的化合物作為活性成分的藥物組合物。
本發(fā)明的又一方面提供了針對(duì)ABP-1或其變體和片段中存在的表位之抗體，以及產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
本發(fā)明的又一方面提供了含有ABP-1或其變體和片段的核苷酸序列之載體。
本發(fā)明的又一方面提供了含有上述載體的細(xì)胞。
定義本發(fā)明中，以下述定義使用如下術(shù)語(yǔ)。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“血管發(fā)生”涉及新血管在組織或器官中的產(chǎn)生。如上述，在正常生理?xiàng)l件下，人和動(dòng)物僅在非常特別限定的情況下經(jīng)歷血管發(fā)生。例如，在創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育和黃體及胎盤(pán)形成中可觀察到血管發(fā)生。
術(shù)語(yǔ)“內(nèi)皮”涉及作為漿液腔、淋巴管和血管襯里的扁平上皮細(xì)胞薄層。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)皮抑制活性”涉及抑制內(nèi)皮毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)的能力。
術(shù)語(yǔ)“一種血管發(fā)生相關(guān)蛋白質(zhì)”涉及一種能夠在血管發(fā)生中相互作用的蛋白質(zhì)，諸如受體結(jié)合抗血管發(fā)生物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“基本上類(lèi)似”當(dāng)用于指SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4時(shí)，意思是一種與SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQID NO.4具有高度序列同源性的氨基酸序列。高度同源性是指至少大約80％氨基酸同源性，優(yōu)選至少大約90％氨基酸同源性，更優(yōu)選至少大約95％氨基酸同源性，最優(yōu)選至少大約98％氨基酸同源性。
術(shù)語(yǔ)“與…特異性雜交”是指當(dāng)序列存在于一種DNA或RNA的復(fù)雜混合物(如，總細(xì)胞DNA或RNA)中，在嚴(yán)格條件下一個(gè)分子僅僅與特定核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈或雜交。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指探針會(huì)與其靶序列雜交但不會(huì)與其它序列雜交的條件。嚴(yán)格條件取決于序列，在不同環(huán)境條件中各不相同。較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。一般而言，選擇比在一定離子強(qiáng)度和pH下的特定序列之熱融化溫度(Tm)低大約5℃的嚴(yán)格條件。Tm是(在一定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)50％與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交達(dá)到平衡的溫度。(一般靶序列的存在過(guò)量，在Tm下，平衡時(shí)50％的探針被占據(jù))。通常，嚴(yán)格條件是指在鹽濃度小于約1.0M鈉離子，一般約0.01至1.0M鈉離子(或其它鹽)，pH7.0至8.3，對(duì)于較短探針(如，10-50核苷酸)溫度低于約30℃，對(duì)于較長(zhǎng)探針溫度至少約60℃的那些條件。嚴(yán)格條件也可通過(guò)去穩(wěn)定劑(如甲酰胺)的添加實(shí)現(xiàn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示體外125I-標(biāo)記的制管張素和纖溶酶原與牛微毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。橫坐標(biāo)的單位分別表示未標(biāo)記的制管張素及纖溶酶原的摩爾過(guò)量倍數(shù)。
圖2顯示分離制管張素結(jié)合蛋白質(zhì)的方法。
圖3顯示在選擇條件下陽(yáng)性酵母菌落的生長(zhǎng)。
圖4比較了重組“Big-3”分別與制管張素和纖溶酶原的結(jié)合。
圖5是“Big-3”的圖譜。
圖6顯示編碼本發(fā)明制管張素受體的基因之開(kāi)放閱讀框(框架2)。其它可能的框架不產(chǎn)生任何推定的蛋白質(zhì)。
圖7顯示胚胎及成年mRNA以及內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)模式。
圖8顯示在不同組織中ABP-1基因的相對(duì)定量。更詳細(xì)的內(nèi)容見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分。
圖9闡明(A)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中GFP標(biāo)記的ABP-1受體之細(xì)胞定位，和(B)在與制管張素溫育后GFP標(biāo)記的ABP-1重新排列(reorganization)。圖9C顯示制管張素與ABP-1的結(jié)合。更詳細(xì)的內(nèi)容見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分。圖9D是在人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVE)中的ABP-1免疫染色與針對(duì)帶有羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽的肌動(dòng)蛋白的染色。ABP-1位于病灶粘附處和膜波緣處(箭頭)。
圖10闡明加入制管張素后ABP-1相關(guān)激酶活性的下調(diào)。
圖11是SDS-PAGE的放射自顯影，顯示ABP-1介導(dǎo)制管張素誘導(dǎo)的病灶粘附激酶活性。更詳細(xì)的內(nèi)容見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種分離的人血管發(fā)生相關(guān)蛋白質(zhì)，其能結(jié)合纖溶酶原的片段，優(yōu)選為N-末端片段，如kringle結(jié)構(gòu)域1-4和/或kringle 5。由此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)起著纖溶酶原片段的受體作用，特別是制管張素和/或纖溶酶原kringle 5結(jié)構(gòu)域的受體的作用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過(guò)生物或化學(xué)方法合成(如，重組基因表達(dá)和肽合成)。重組技術(shù)包括基因克隆或通過(guò)體外方法擴(kuò)增，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)或自持續(xù)的序列復(fù)制系統(tǒng)(SSR)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知多種克隆和體外擴(kuò)增方法。這些技術(shù)的例子有，如Berger和Kimmel，分子克隆技術(shù)指南(Guideto Molecular Cloning Techniques)，酶學(xué)方法(Methods inEnzymology)，152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)中所述。本發(fā)明包括含有基本上與SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4中所示的那些類(lèi)似的氨基酸序列之蛋白質(zhì)。SEQ ID NO.2蛋白質(zhì)序列與所有可得數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較，顯示與Caenorhabditis elegans的假擬(hypotetical)蛋白質(zhì)有23.7％同源性，所述蛋白質(zhì)由位于該生物染色體III上中央簇中的推定開(kāi)放閱讀框編碼(見(jiàn)R.Wilson等，自然(Nature)，卷368，3月，1994，32-38所述)。未推定此假擬蛋白質(zhì)任何功能。
根據(jù)上述定義，應(yīng)當(dāng)理解所有編碼能夠結(jié)合纖溶酶原片段并具有與SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4至少約80％序列同源性，優(yōu)選約90％序列同源性，更優(yōu)選約95％序列同源性，最優(yōu)選約98％序列同源性之氨基酸序列的多肽，均被構(gòu)思包含在本發(fā)明中。這些變體可例如來(lái)自相同來(lái)源生物不同組織中不同地表達(dá)或不同地剪接。變體形成的特征可以是例如氨基酸插入、刪除或替換。優(yōu)選的ABP-1變體形式示于SEQ ID NO.3(見(jiàn)下)。
一種本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是下面進(jìn)一步詳述的被稱(chēng)為Big-3的ABP-1片段，其包括ABP-1的制管張素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO.4)。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有至少約5個(gè)優(yōu)選至少約10個(gè)連續(xù)SEQ ID NO.2的氨基酸殘基或其任何變體或片段之肽。但是，肽的最有利的大小取決于其使用目的，本發(fā)明并不局限于上述氨基酸殘基數(shù)。
也包括在本發(fā)明中的是在其它種屬，特別是其它哺乳動(dòng)物中的ABP-1和Big-3同系物。術(shù)語(yǔ)“同系物”是指與本發(fā)明的蛋白質(zhì)發(fā)揮基本上相同的生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，無(wú)論相應(yīng)的氨基酸序列之間是否存在同源性。
另一方面，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)和肽的序列，包括如上述的變體、片段和同系物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸分子具有SEQ ID NO.1的序列。此序列存在5’(從核苷酸1-核苷酸796)以及3’(從核苷酸2825-核苷酸6463)非翻譯區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸分子具有從SEQ ID NO.1核苷酸797至核苷酸2824的序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸分子編碼稱(chēng)為Big-3的ABP-1片段(示于SEQ ID NO.4)，其包括從SEQ ID NO.1的位置2180至位置2608的核苷酸序列。所有編碼本發(fā)明多肽且以遺傳密碼簡(jiǎn)并性方式與SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其片段不同的核苷酸序列均認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。序列分析揭示，SEQ ID NO.1中1199-1201密碼子存在可能的多態(tài)性，其中可存在Asn、Ser或Asp的密碼子；發(fā)現(xiàn)相應(yīng)于SEQ ID NO.1的核苷酸位置1238-1246的區(qū)域編碼三肽Glu-Leu-Ala或三肽Thr-Trp-Pro。這些ABP-1的氨基酸序列的變體示于SEQ ID NO.3，其構(gòu)成了本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選蛋白質(zhì)。也包括在本發(fā)明的是編碼ABP-1或其片段的同系物之核苷酸分子。
本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下能與任何上述本發(fā)明的核酸分子特異性雜交的核酸。
當(dāng)本發(fā)明的核酸用作探針時(shí)，常常期望用可檢測(cè)的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記該序列。這類(lèi)標(biāo)記可包括任何可被分光光度計(jì)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法檢測(cè)的組分。標(biāo)記可通過(guò)任一本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法摻入。檢測(cè)這類(lèi)標(biāo)記的方法也為本領(lǐng)域周知并公開(kāi)于文獻(xiàn)中。探針用于診斷性應(yīng)用，如檢測(cè)和測(cè)量組織和細(xì)胞中ABP-1的生物合成。
另一方面，本發(fā)明提供了篩選方法或檢驗(yàn)方法，所述方法用來(lái)篩選顯示與制管張素和/或kringle 5相同性質(zhì)的分子。在一般的篩選方法中，通過(guò)高通量的基于細(xì)胞的篩選鑒定能夠激活制管張素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的化合物。這類(lèi)篩選依賴(lài)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入制管張素應(yīng)答性細(xì)胞系之制管張素應(yīng)答性元件驅(qū)動(dòng)的報(bào)告分子基因。應(yīng)答性元件與報(bào)告分子基因如螢光素酶連接，化合物一旦與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合，即激活細(xì)胞內(nèi)途徑，由此引起可檢測(cè)到的報(bào)告分子基因活性的增加。
通過(guò)此處所述的篩選方法鑒定的化合物在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這類(lèi)化合物優(yōu)選為低分子量的肽類(lèi)或非肽類(lèi)分子。得益于其小分子量，與制管張素相比，其更具有作為藥物用途的實(shí)用性。這些分子和其用途的進(jìn)一步詳述如下。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽可利用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)肽合成技術(shù)合成。對(duì)于固相合成，見(jiàn)如Barany和Merrifield，固相肽合成(Solid-Phase PeptideSynthesis)，3-284頁(yè)中“肽分析、合成生物學(xué)(The PeptidesAnalysis，Synthesis Biology)”，卷2“肽合成的特殊方法(SpecialMethods in Peptide Synthesis)，A部”。
優(yōu)選地，利用重組DNA技術(shù)合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)類(lèi)、肽類(lèi)和多肽類(lèi)，該技術(shù)通常包括制備編碼蛋白質(zhì)或肽的DNA序列，將該DNA序列在特定啟動(dòng)子的控制下置于一種表達(dá)盒中，在宿主中表達(dá)蛋白質(zhì)或肽，分離表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽，如需要，復(fù)性該產(chǎn)物。一旦表達(dá)，可根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法純化重組肽類(lèi)或蛋白質(zhì)類(lèi)。因此，本發(fā)明另一方面是一種載體，如病毒或質(zhì)粒，其包含本發(fā)明的核酸。此外，本發(fā)明還涵蓋用所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞，其表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽，以及表達(dá)在下面詳細(xì)定義的本發(fā)明抗體的重組細(xì)胞。編碼根據(jù)本發(fā)明的肽類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)的載體可用于表達(dá)這類(lèi)分子，以為制備抗體提供免疫原。本發(fā)明的載體也可用于體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以表達(dá)本發(fā)明的肽類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)。表達(dá)任一本發(fā)明核酸(如由SEQ ID NO.1定義的基因)之細(xì)胞可用于多種用途，且均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這類(lèi)細(xì)胞可為真核或原核的。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽可用作抗原用來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體。因此，本發(fā)明也包括特異性結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的肽之抗體。這類(lèi)抗體可用于免疫分析檢定，如用于肽類(lèi)或多肽類(lèi)的分離。根據(jù)本發(fā)明的肽類(lèi)還可用于諸如擴(kuò)增特異性分析、免疫鑒定等分析檢定中。
根據(jù)本發(fā)明的抗體可為單克隆或多克隆的，包括獨(dú)立的、等位片段、菌株或種屬變體、或其片段，均可為其天然存在(全長(zhǎng))形式和重組形式。此外，誘導(dǎo)產(chǎn)生的針對(duì)本發(fā)明的肽或多肽之抗體可為天然構(gòu)型或非天然構(gòu)型。也可產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知許多制備抗體的方法。制備單克隆抗體的技術(shù)，見(jiàn)例如，Stiites等(編)，基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)(Basic and Clinical Immunology)(第4版)，Lange Medical Publications，Los Altos，CA，及其中所引用的文獻(xiàn)。對(duì)于涉及在噬菌體或類(lèi)似載體中篩選重組抗體文庫(kù)的技術(shù)，見(jiàn)例如Huse等，(1989)科學(xué)，2461275-1281。
根據(jù)本發(fā)明的分子可用于藥物制劑，尤其是用于治療和/或預(yù)防血管發(fā)生相關(guān)疾病。因此，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽、多肽、蛋白質(zhì)或抗體用作藥物，以及所述分子用于制備針對(duì)血管發(fā)生相關(guān)疾病或病癥的藥物的用途。本發(fā)明還涉及一種含有根據(jù)本發(fā)明的分子以及藥學(xué)可接受的載體的藥物制劑。用作根據(jù)本發(fā)明的藥物的分子可為上述肽類(lèi)、多肽類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)或抗體類(lèi)的任一種，以及在利用上述分子和所述方法的篩選方法中鑒定的任何新物質(zhì)。
因此，本發(fā)明分子的最優(yōu)選的用途是用在篩選新物質(zhì)的分析檢定中?？设b定這樣的化合物，其顯示與制管張素和/或kringle 5類(lèi)似的抗血管發(fā)生作用，但是該化合物更小，更有效且優(yōu)選在人或動(dòng)物體內(nèi)有較長(zhǎng)的半壽期。較長(zhǎng)的半壽期可由于被蛋白酶降解的趨勢(shì)較低。當(dāng)設(shè)計(jì)有機(jī)化合物時(shí)，本發(fā)明的分子用作一種“先導(dǎo)”化合物。設(shè)計(jì)與已知藥物活性化合物的模擬物是基于這類(lèi)“先導(dǎo)”化合物的藥物開(kāi)發(fā)中周知的方法。一般使用模擬物設(shè)計(jì)、合成及測(cè)試來(lái)避免在大量分子中隨機(jī)篩選目標(biāo)性質(zhì)。
因此，這類(lèi)新分子優(yōu)選地用作可以以大大低于制管張素的劑量施用的藥物，且其可以以較低的頻率施用，如每14天施用一次，其將與大約短10倍的制管張素半壽期相比較。在一特定實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明的篩選方法鑒定的新分子為低分子量有機(jī)分子，其中可由此制備用于口服攝入的藥物制劑，諸如片劑。
然而，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑可制備成用于任一給藥途徑，例如，口服、靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、鼻、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)。載體或其它配料的性質(zhì)可取決于給藥的特定途徑(用于本發(fā)明的技術(shù)和方法的例子尤其參見(jiàn)雷明頓藥物科學(xué)，第16版，Osol，A(編)，1980)。
這些低分子量化合物的劑量取決于待治療的疾病或病癥的狀況，以及其它臨床因素，諸如體重和人或動(dòng)物的狀況，以及化合物的給藥途徑。對(duì)于人或動(dòng)物的治療，可在約0.5mg化合物/Kg體重至500mg化合物/Kg體重之間施用。
本發(fā)明的化合物和方法有利地用于所有種類(lèi)的與血管發(fā)生相關(guān)的疾病和/或病癥，諸如腫瘤疾病、糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和甚至一些炎癥疾病如干癬，慢性腸道炎癥、哮喘等。還提示這些分子可用于處理、治療或防止肥胖。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子可用于基因治療。基因治療方法的綜述見(jiàn)，例如Anderson，科學(xué)，(1992)256808-813。
本發(fā)明的又一有利用途是開(kāi)發(fā)在機(jī)體中調(diào)節(jié)本發(fā)明的制管張素和/或kringle 5受體的信號(hào)傳導(dǎo)之方法，因此，本發(fā)明還涉及治療患有血管發(fā)生相關(guān)疾病或病癥的人或動(dòng)物患者的方法，以及防止這些疾病的方法。
實(shí)驗(yàn)下面，將參照附圖更詳細(xì)地公開(kāi)本發(fā)明。
所有本發(fā)明中公開(kāi)的和上述的內(nèi)容中文獻(xiàn)均引入本申請(qǐng)。
制管張素結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的證據(jù)通過(guò)制管張素與血管發(fā)生因子VEGF和bFGF之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析，本發(fā)明人證實(shí)制管張素不影響這些分子的配體-受體相互作用。在未標(biāo)記的制管張素存在或不存在時(shí)可檢測(cè)到相同的結(jié)合水平。因此，可排除制管張素通過(guò)封閉血管發(fā)生因子與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用來(lái)起作用。
制管張素和其前體纖溶酶原的直接結(jié)合已通過(guò)結(jié)合檢定分析加以研究，該方法利用碘化蛋白質(zhì)，并分析其與牛微毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，見(jiàn)圖1。
具體地，人制管張素(kringle結(jié)構(gòu)域1-4)或纖溶酶原可根據(jù)制造商的方法(Pierce Inc.)通過(guò)Iodogen方法用碘125標(biāo)記。然后在G50Sepharose柱(Pharmacia Inc.)上純化標(biāo)記的蛋白質(zhì)。據(jù)估計(jì)比活性為90 000cpm/ng蛋白質(zhì)。為了結(jié)合檢定分析，將牛毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞在12孔板中生長(zhǎng)至鋪滿。用含有1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌細(xì)胞。然后將細(xì)胞與10ng/ml放射性標(biāo)記的制管張素或纖溶酶原一起溫育。結(jié)合與濃度增加的未標(biāo)記配體競(jìng)爭(zhēng)。將細(xì)胞在冰上溫育2小時(shí)。然后用PBS+1mg/ml BSA洗滌五次。用PBS中1％Triton X100裂解細(xì)胞，在γ計(jì)數(shù)器中測(cè)定放射性。利用RBINDING程序(van ZoelenE，分析生物化學(xué)雜志(J.Anal.Biochem.)1992年2月1；200(2)393-9)估計(jì)解離常數(shù)和受體數(shù)目。
利用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定制管張素結(jié)合分子甚至在還原后制管張素仍保留活性，提示其三維折疊對(duì)于結(jié)合和活性并不重要。這有利于這樣的篩選方法，其中盡管蛋白質(zhì)的再折疊可能不甚正確，仍可大量篩選克隆。
利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選可結(jié)合纖溶酶原kringle1-4結(jié)構(gòu)域的分子。下面結(jié)合圖2進(jìn)一步描述。篩選了大約2×106個(gè)來(lái)自人足月胎盤(pán)的雙雜交cDNA文庫(kù)(Stratagene)。在下列方法中鑒定了陽(yáng)性克隆(1)在選擇性條件下(His-，Leu-和Trp-)篩選產(chǎn)生了酵母菌株CG1945中的37個(gè)陽(yáng)性克隆。
(2)與ONPG(SIGMA)在30℃溫育2小時(shí)后，37個(gè)克隆中有7個(gè)顯示高β-半乳糖苷酶活性。
(3)純化含有高β-gal活性的7個(gè)克隆之DNA，再轉(zhuǎn)染入酵母菌株Y190。在新酵母菌株中7個(gè)克隆有3個(gè)保留了活性。這些克隆的序列測(cè)定分析顯示，它們來(lái)自相同基因。
(4)在50mM 3-氨基三唑存在下生長(zhǎng)(圖3)，在Big 3克隆中鑒定β-gal活性(見(jiàn)下表)，并與陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

Big-3(制管張素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的序列從胎盤(pán)酵母雙雜交文庫(kù)(Stratagene，Inc.)中分離big-3克隆，我們用GAL4 AD測(cè)序引物直接測(cè)定pGAD活化結(jié)構(gòu)域載體的cDNA插入序列的序列。利用來(lái)自適配接頭的EcoRI位點(diǎn)將cDNA插入序列再次克隆入pUC18載體，利用通用和反向引物重復(fù)測(cè)序。在ALF自動(dòng)化測(cè)序儀中分析序列(Pharmacia)。Big-3的序列示于SEQ ID NO.4。
Big3及Big3-GST融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化Big3已經(jīng)以與來(lái)自Schistosoma japonicum的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)形式在大腸桿菌中表達(dá)。
載體構(gòu)建利用pUC18-Big3質(zhì)粒作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得Big3片段(429bp)。引物序列為BamHI-NH25’TAC GGA TCC GAA TCG AAC AAA ACT GCA GCT G3’(SEQ ID NO.5)XhoI-COOH 5’ATA CTC GAG TCA TGG AGC TGG AGT TGG AGCCA 3’(SEQ ID NO.6)使用的循環(huán)方案為94℃ 3’，60℃ 1’，72℃ 1’1個(gè)循環(huán)94℃ 30”，60℃ 1’，72℃ 2’30個(gè)循環(huán)94℃ 30”，60℃ 1’，72℃ 5’1個(gè)循環(huán)Taq聚合酶天然Pfu DNA聚合酶(Stratagene)。
用BamHI和XhoI消化PCR片段，純化并連接入已經(jīng)用相同限制性酶消化的PGEX-6P-2質(zhì)粒(Pharmacia Biotech)。連接混合物用于轉(zhuǎn)化XL1-Blue細(xì)胞(Stratagene)。通過(guò)限制性酶切分析和自動(dòng)化測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒。
表達(dá)及純化用一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的稱(chēng)為pGEX-Big3的克隆轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞(Clontech)，用0.1mM IPTG室溫下誘導(dǎo)6小時(shí)。
于4000轉(zhuǎn)/分離心發(fā)酵培養(yǎng)液15分鐘，將細(xì)胞沉淀重懸于10％w/v裂解緩沖液(50mM TRIS-HCl pH 8.0，100mM NaCl，20mM DTT，1mM EDTA，蛋白酶抑制劑混合物)中，超聲裂解。于4℃下15000g離心總裂解物20分鐘。將澄清上清液上樣于經(jīng)裂解緩沖液預(yù)平衡過(guò)的谷胱甘肽-Sepharose柱(每20ml裂解物用1ml)。樹(shù)脂用10倍柱體積(CV)的裂解緩沖液洗滌，用3倍CV的洗脫緩沖液(100mM TRIS-HCl pH8.0 20mM還原的谷胱甘肽)洗脫融合蛋白質(zhì)。
通過(guò)將谷胱甘肽-Sepharose結(jié)合的融合蛋白質(zhì)與20ul/ml樹(shù)脂的PreScission蛋白酶PS溶液(其中含有50mM TRIS.HCl pH7.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，1mM PMSF)溫育，切割GST-Big3蛋白質(zhì)。
洗脫的蛋白質(zhì)在rp-HPLC(10-90％梯度的乙腈水溶液加0.1％TFA)表現(xiàn)為單一峰，顯示通過(guò)質(zhì)量分析(電噴射)所預(yù)期的分子大小和正確的NH2序列。在SDS-PAGE中于表觀MW為80kD處顯示有污染，經(jīng)證實(shí)為陪伴分子DnaK，其可通過(guò)HiTrapQ柱的離子交換層析除去。
從1升發(fā)酵液中獲得的產(chǎn)率為約10mg GST-Big3融合蛋白質(zhì)和約3mg的切割的Big3。
體外重組GST-標(biāo)記的Big3與制管張素的結(jié)合用于結(jié)合的方法描述如下。
一個(gè)pGEX-Big3轉(zhuǎn)化子的菌落接種入10ml添加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，于37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
將過(guò)夜培養(yǎng)物以1∶10稀釋入100ml新鮮培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，將IPTG加入至終濃度為0.5mM，繼續(xù)溫育3-7小時(shí)。
然后于5000g將培養(yǎng)物離心10分鐘，細(xì)胞沉淀重懸于3-5ml冰冷的PBS中，超聲裂解細(xì)胞。加入Triton X100至終濃度0.5-1％，將1.5ml上清液等份于14000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。
向上清液中加入0.1-0.3ml的50％谷胱甘肽瓊脂糖珠漿液，于4℃混合3-5小時(shí)。離心收集珠，用冰冷的PBS洗滌5次，用組成為50mMTris pH7.5，150mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM DTT和1mM PMSF的結(jié)合溶液(B.S.)洗滌2次。
結(jié)合檢定分析將0.7ml B.S.，0.1％牛血清，500ng制管張素與30-50μl的50％固定化Big3-谷胱甘肽瓊脂糖珠漿液在4℃下混合。
樹(shù)脂用冰冷的B.S.洗滌5-7次，然后用于利用抗人纖溶酶原抗體(Dako Inc.)進(jìn)行的Western印跡分析。
圖4顯示，純化的重組Big3如何體外結(jié)合制管張素。有趣的是，也可檢測(cè)到纖溶酶原的結(jié)合，但是僅僅在用DTT處理的二硫鍵還原之后。
全長(zhǎng)序列的克隆圖5顯示，克隆ABP-1全長(zhǎng)序列的方案。通過(guò)用Big-3探針(去除了重復(fù)序列)篩查胎盤(pán)cDNA噬菌體文庫(kù)，以及利用來(lái)自人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的mRNA進(jìn)行5’RACE PCR(Gibco)，克隆了完整基因。cDNA克隆的全長(zhǎng)序列示于SEQ ID NO.1，而編碼的蛋白質(zhì)示于SEQ IDNO.2。實(shí)驗(yàn)方法的細(xì)節(jié)如下述。
利用Big-3的HinfI片段作為探針篩查了胎盤(pán)λ噬菌體文庫(kù)(Stratagene，Inc)的10×106克隆。根據(jù)現(xiàn)有的方法進(jìn)行DNA分離和Southern印跡實(shí)驗(yàn)(Sambrook等，1989)。我們分離到5個(gè)帶有與Big-3重疊的序列之克隆(7-1，7-2，8-2，9-3，9-5)。7-2克隆的5’序列用來(lái)設(shè)計(jì)用于5’RACE PCR的基因特異性引物(GSP)(Gibco Lifetechnologies，Inc.)從人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞分離的mRNA用于鑒定5’序列。
用于第一次RACE PCR的引物引物GSP1-(5′-3′)GCTGACAGTTGCCCTGACGCTGCT(SEQ ID NO.10)GSP2-(5′-3′)CGGAGACGGTGCTCTAGCTGCTCA(SEQ ID NO.11)
GSP3-(5′-3′)TCCTTCCAACTCTTGCCTCAAGTTCCG(SEQ ID NO.12)RACE方法已被用于擴(kuò)增和克隆GSP2和GSP3以及ABP-1mRNA5′端之間的未知序列。此序列隨后用于設(shè)計(jì)下一次RACE PCR的新引物引物GSP1-(5′-3′)GGTGGCAGCGGACAGGCAGGATAC(SEQ ID NO.13)GSP2 GAGGCGGAGAGAACTAAGAGAAGA(SEQ ID NO.14)GSP3 GAGCGGAGATGGAGGAGTAATTCA(SEQ ID NO.15)分離了帶有重疊序列的克隆A2-2，A2-1和A1-C。其中A2-1用作探針用于胎盤(pán)噬菌體文庫(kù)的第二次篩選。通過(guò)此次篩選我們分離了另外兩個(gè)克隆(7-10和6-5)。如圖6所示，6個(gè)可能的框架中僅有的產(chǎn)生完整開(kāi)放閱讀框的一個(gè)是框架2，產(chǎn)生675個(gè)氨基酸殘基的推定蛋白質(zhì)。
mRNA表達(dá)模式探查了市售(Clontech，Inc.)多種人成年及胚胎組織(#7760-1和#7756-1)mRNA印跡(2mg mRNA/孔)中的ABP-1。根據(jù)制造商的方法用ExpressHyb雜交溶液(Clontech，Inc.)雜交印跡。用7-25’PstI片段探查印跡。圖7顯示試驗(yàn)結(jié)果，大小為9.5和7.5kb。
也在人臍帶、牛主動(dòng)脈和牛微毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到ABP-1。在永生化內(nèi)皮細(xì)胞系EaHy926和人胚胎成纖維細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到或未檢測(cè)到表達(dá)。這些細(xì)胞系不應(yīng)答制管張素，也不顯示任何FITC標(biāo)記的制管張素的結(jié)合。
實(shí)時(shí)RT-PCR5’核酶分析鑒定(TaqMan分析檢定)使用了非延伸寡核苷酸雜交探針(TaqMan探針)。TaqMan探針構(gòu)成一種具有5’報(bào)告分子染料和3’淬滅染料的寡核苷酸。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告分子染料與淬滅染料鄰近，導(dǎo)致報(bào)告分子熒光的抑制，主要是由于Foster型能量轉(zhuǎn)移。在PCR過(guò)程中，正向和反向引物與靶DNA的特定序列雜交。TaqMan探針與PCR產(chǎn)物內(nèi)的靶序列雜交。Taq聚合酶用其5’-3’核酶活性切割TaqMan探針。一經(jīng)切割，報(bào)告分子染料與淬滅染料分離，導(dǎo)致報(bào)告分子的熒光增加。
實(shí)時(shí)RT-PCR分析RNA制備利用Ultraspec RNA分離系統(tǒng)(Biotex)從如下列出的組織和細(xì)胞中分離并純化總RNA。

cDNA合成利用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑(PE Applied Biosystems)以隨機(jī)六聚體作為RT引物進(jìn)行RT反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄步驟的反應(yīng)體積為100μl，樣品總RNA量為1μg。
利用如下循環(huán)參數(shù)進(jìn)行RT25℃ 10’48℃ 45’95℃ 5’PCR反應(yīng)引物濃度優(yōu)化后，利用TaqMan通用PCR Master Mix(PEApplied Biosystems)和下面的寡核苷酸對(duì)10ng DNA進(jìn)行PCR。
ABP-1正向引物5’GTTTGACCTGCAATCCAGACAA 3’(SEQID NO.7)，終濃度300nMABP-1反向引物5’CCCAGGATCTGAATGGGAGTT 3’(SEQID NO.8)，終濃度900nmABP-1 TaqMan探針5’(FAM染料)-CAGATGGGCCTGTGTTCCACTCCAA-(TAMRAdye)3’(SEQ ID NO.9)，終探針濃度200nM循環(huán)方案為50℃2’；95℃ 10’1個(gè)循環(huán)95℃15”；60℃ 1’40個(gè)循環(huán)基因表達(dá)的相對(duì)定量比較方法使用數(shù)學(xué)公式無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到相對(duì)定量結(jié)果。
示于圖8的結(jié)果表明，與顯示靶的最低表達(dá)水平之樣品的校準(zhǔn)物相比，樣品X中表達(dá)的靶序列相對(duì)于校準(zhǔn)物的倍數(shù)。在本試驗(yàn)中，EaHY926樣品被選為校準(zhǔn)物。
針對(duì)Big-3的抗體為免疫接種新西蘭白兔，將100微克Big-3-GST融合蛋白質(zhì)溶于1ml磷酸緩沖鹽液(PBS)中，與1ml弗氏完全佐劑(Gibco)混勻。于第0天皮下注射所得乳液，于第15和第28天重復(fù)上述處理。于第35天從兔中取血，4℃下凝結(jié)，將得到的血清于-20℃貯存。
為了特定抗體的純化，如下制備樹(shù)脂固定化配體將Big-3多肽以總體積2ml中5mg/ml的濃度稀釋入0.1M碳酸氫鈉，0.5M NaCl，pH8.3。將其室溫下與2ml溴化氰活化的Sepaharose CL-4B樹(shù)脂(SigmaChemical Co.St Louis，MO)反應(yīng)兩小時(shí)。反應(yīng)后，樹(shù)脂用10倍體積的100mM Tris，500mM NaCl，pH7.5洗滌3次。將免疫血清與親和樹(shù)脂4℃下溫育兩小時(shí)，其后將樹(shù)脂在5ml玻璃層析柱(Bio-Rad，Richmond CA)用25體積的100mM Tris，500mM NaCl，pH7.5洗滌。以1ml等份用100mM甘氨酸/HCl，pH2.8洗脫特定抗體?？贵w洗脫后在280nM(OD280)處檢測(cè)光密度，收集OD280大于1的級(jí)分，于4℃對(duì)1升PBS透析36小時(shí)(Slide-A-lyzer cassettes，Pierce)，更換緩沖液三次。
制管張素經(jīng)ABP-1蛋白質(zhì)的結(jié)合與信號(hào)傳遞圖9A和圖9B顯示了FITC標(biāo)記的制管張素與ABP-1轉(zhuǎn)染的HeLa結(jié)合，和與用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的EaHy926細(xì)胞的結(jié)合。具體地，圖9A顯示，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，融合于綠色熒光蛋白(GFP)的ABP-1的細(xì)胞定位?？稍趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜上檢測(cè)到該蛋白質(zhì)。DABP-1在基因的5’端含有500bp的缺失，其破壞了先前描述的ABP-1的定位。
圖9B顯示用ABP-1GFP轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。0℃下與2.5mg制管張素溫育60分鐘隨后于37℃下溫育15分鐘，誘導(dǎo)ABP-1-GFP的內(nèi)化。
圖9C顯示制管張素與ABP-1的結(jié)合。我們已證實(shí)，熒光素異硫氰酸胍(FITC)標(biāo)記的制管張素特異性結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞(數(shù)據(jù)未給出)。我們用ABP-1表達(dá)構(gòu)建體或?qū)φ蛰d體(p RC/CMV，Vitrogen，Inc.)轉(zhuǎn)染了HeLa細(xì)胞。我們?cè)?℃于DMEM+10％胎牛血清中溫育活HeLa細(xì)胞FITC-標(biāo)記的制管張素(10ug/ml)60分鐘。然后在37℃下溫育細(xì)胞15分鐘，以聚集結(jié)合的制管張素。用熒光顯微鏡分析結(jié)合情況。在ABP-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)到制管張素的結(jié)合，在載體對(duì)照的情況中未檢測(cè)到結(jié)合。
圖9D顯示在人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVE)中的ABP-1免疫染色以及用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽針對(duì)F肌動(dòng)蛋白的染色。
免疫染色方法在4％甲醛中固定HUVE細(xì)胞，用PBS洗滌并于5％馬血清中預(yù)封閉。除去封閉溶液，并用針對(duì)制管張素結(jié)合結(jié)構(gòu)域Big-3的兔多克隆抗體(稀釋于5％馬血清)替換。用熒光素標(biāo)記的第二抗體(Dako，Inc.)顯示陽(yáng)性染色。同時(shí)用第二抗體(在用1％triton X100通透化1分鐘)染色羅丹明偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽。針對(duì)綠色熒光蛋白的兔多克隆抗體用作陰性對(duì)照。此外，在人成纖維細(xì)胞中未檢測(cè)到任何陽(yáng)性染色。
如圖9D中可見(jiàn)，ABP-1定位于病灶粘附和膜波緣(箭頭)。
體外激酶數(shù)據(jù)將Huve細(xì)胞于5cm培養(yǎng)皿中鋪板至亞鋪滿。于其后的不同時(shí)間以2.5mg/ml加入制管張素。所有培養(yǎng)皿包括對(duì)照均同時(shí)收獲。在冰冷的PBS中洗滌細(xì)胞，在1ml裂解緩沖液中溫育。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入eppendorf管中，4℃下于14000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。上清液移入另一個(gè)eppendorf管中，加入2μgABP-1兔多克隆抗體。4℃溫育樣品60分鐘，隨后加入50μl的蛋白A Sepharose(Pharmacia，Inc.)漿液，在攪拌溫育器中再溫育60分鐘。短暫離心收集免疫沉淀，用裂解緩沖液洗滌兩次，于洗滌緩沖液中洗滌一次，于激酶緩沖液中洗滌一次。經(jīng)虹吸吸去殘余緩沖液。每管中加入25μl激酶緩沖液以及1μCiγATP(Amersham，Inc.)。樣品于室溫下溫育20分鐘。加入2xSDS PAGE樣品緩沖液終止反應(yīng)。在變性條件下煮沸樣品，隨后用SDS PAGE分析。
圖10顯示的數(shù)據(jù)表明，加入制管張素在30分鐘內(nèi)下調(diào)ABP-1相關(guān)激酶活性。這是制管張素影響由ABP-1介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑的直接證據(jù)。
ABP-1介導(dǎo)制管張素誘導(dǎo)的病灶粘附激酶活性圖11的數(shù)據(jù)顯示，加入2.5μg/ml制管張素在加入后1小時(shí)內(nèi)上調(diào)FAK活性。
將EaHy926細(xì)胞于5cm培養(yǎng)皿中鋪板至亞鋪滿。于其后的不同時(shí)間以2.5μg/ml加入制管張素。所有培養(yǎng)皿包括對(duì)照均同時(shí)收獲。在冰冷的PBS中洗滌細(xì)胞，在1ml裂解緩沖液中溫育。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入eppendorf管中，4℃下于14000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。上清液移入另一個(gè)eppendorf管中，加入1μgFAK單克隆抗體(Transduction Lab.Inc.)。4℃溫育樣品60分鐘，隨后加入兔抗小鼠IgG+50μl的蛋白ASepharose(Pharmacia，Inc.)漿液，在攪拌溫育器中再溫育60分鐘。短暫離心收集免疫沉淀，用裂解緩沖液洗滌兩次，于洗滌緩沖液中洗滌一次，于激酶緩沖液中洗滌一次。經(jīng)虹吸吸去殘余緩沖液。每管中加入25μl激酶緩沖液以及1μCiγATP(Amersham，Inc.)。樣品于室溫下溫育20分鐘。加入2xSDS PAGE樣品緩沖液終止反應(yīng)。在變性條件下煮沸樣品，隨后用SDS PAGE分析。
如圖11中可見(jiàn)，制管張素的加入在1小時(shí)內(nèi)上調(diào)FAK活性。應(yīng)當(dāng)注意，如逆轉(zhuǎn)錄PCR分析證實(shí)，EaHy926細(xì)胞不表達(dá)ABP-1。
序列表<110>Pharmacia & Upjohn<120>血管發(fā)生相關(guān)分子<130>pctpha1856<140>
<141>
<150>SE9804372-2<151>1998-12-17<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6463<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(797)..(2824)<400>1ccaggagctg ccttggcagt cacgcccctt ccttccgagg agctttctgg ctgcctaaac 60tggtagaccc cctgaattac tcctccatct ccgctctctt tcgcctcctc ttctcttagt 120tctctccgcc tccccctcaa ctaccaccac ctccagtcag tctcgcctcc ggctatccgc 180tgctccaccc tctggcccgg tatcctgcct gtccgctgcc accaaggaga gcccggacgg 240agcagcgagg aggggagcag ccgggagttg gggcttcccc cctgcccatc cctggccgct 300ggcccgggac cgaagccact tgagcgagca gagagtcgtc accttgtctt ctttgccttc 360agggagctgc taagaaggac aaataagata gcagagtgaa agagcttttg tctccttaga 420aggaaggctg agaaactaaa ggccagcgca ggacatctca ttgccattgt cagccaggaa 480
ctcgcagcct cacagcccta cttcttctct gacctctggg gggtccttgc ccttgctaca 540atctccacca tccactagat tgtctcctgc ccgacacccc ttggtcccaa accagggaga 600ccattcagct cacctgccta ggccgcagca gcatttcctt cctaatcagg ctcaccaggg 660ggatcattac cgtctctccc aacctggcct gagtcagcag cagcagcaac agcagcagca 720gcaccatcat caccatcacc accaacaaca gcagcagcag cagccacagc agcagccagg 780agaagcctat tcagct atg cct cgg gct cag cca tcc tct gct tct tat cag 832Met Pro Arg Ala Gln Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gln1 5 10cca gtg cca gca gac cct ttt gcc att gtt tcc aga gcc cag cag atg 880Pro Val Pro Ala Asp Pro Phe Ala Ile Val Ser Arg Ala Gln Gln Met15 20 25gtt gag atc ctc tca gac gag aac cgg aac ttg agg caa gag ttg gaa 928Val Glu Ile Leu Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Arg Gln Glu Leu Glu30 35 40gga tgc tat gag aag gtg gca aga ctg cag aag gtg gag aca gaa atc 976Gly Cys Tyr Glu Lys Val Ala Arg Leu Gln Lys Val Glu Thr Glu Ile45 50 55 60cag cgc gtc tcg gag gca tat gag aac ctc gtg aag tca tcc tcc aaa 1024Gln Arg Val Ser Glu Ala Tyr Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser Lys65 70 75aga gag gcc cta gag aaa gcc atg aga aac aag cta gag ggc gag att 1072Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile80 85 90cgg agg atg cat gat ttc aac agg gat ctg aga gag cgt cta gag act 1120Arg Arg Met His Asp Phe Asn Arg Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu Thr95 100 105gcc aac aag cag ctt gca gag aag gaa tat gag ggg tca gag gac acc 1168Ala Asn Lys Gln Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp Thr110 115 120aga aaa acc atc tcg cag ctc ttt gca aaa aat aaa gaa agc cag cgt 1216Arg Lys Thr Ile Ser Gln Leu Phe Ala Lys Asn Lys Glu Ser Gln Arg
125 130 135 140gag aag gag aag ctg gaa gcg gag ctg gcc act gcc cgt tct acc aat 1264Glu Lys Glu Lys Leu Glu Ala Glu Leu Ala Thr Ala Arg Ser Thr Asn145 150 155gag gac caa aga cga cac atc gaa atc cga gat cag gcc ctg agt aat 1312Glu Asp Gln Arg Arg His Ile Glu Ile Arg Asp Gln Ala Leu Ser Asn160 165 170gcc cag gcc aag gtg gta aag ctg gaa gaa gag ctg aaa aag aag caa 1360Ala Gln Ala Lys Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Gln175 180 185gtg tac gtt gac aag gtg gag aag atg cag cag gcc ctt gta cag ctc 1408Val Tyr Val Asp Lys Val Glu Lys Met Gln Gln Ala Leu Val Gln Leu190 195 200cag gca gca tgt gaa aaa cgt gag cag cta gag cac cgt ctc cgg aca 1456Gln Ala Ala Cys Glu Lys Arg Glu Gln Leu Glu His Arg Leu Arg Thr205 210 215 220cga ctg gag agg gaa ctg gaa tcc ctg aga atc cag cag cgt cag ggc 1504Arg Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ser Leu Arg Ile Gln Gln Arg Gln Gly225 230 235aac tgt cag ccc acc aac gtt tca gaa tac aat gct gcc gca ctg atg 1552Asn Cys Gln Pro Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu Met240 245 250gag ctc ctt cgg gag aaa gag gag agg att ctg gct ctg gaa gct gat 1600Glu Leu Leu Arg Glu Lys Glu Glu Arg Ile Leu Ala Leu Glu Ala Asp255 260 265atg aca aag tgg gag cag aaa tat ttg gag gag aat gtg atg aga cat 1648Met Thr Lys Trp Glu Gln Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met Arg His270 275 280ttt gct ctg gat gct gct gca act gtg gct gct cag agg gac aca aca 1696Phe Ala Leu Asp Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gln Arg Asp Thr Thr285 290 295 300gtc atc agt cac tct cct aac acc agc tat gac aca gct cta gaa gct 1744Val Ile Ser His Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Ala305 310 315
cgc atc cag aaa gag gag gaa gaa atc ttg atg gcc aat aag cgt tgc 1792Arg Ile Gln Lys Glu Glu Glu Glu Ile Leu Met Ala Asn Lys Arg Cys320 325 330ctt gac atg gag ggc agg att aag acc ctc cat gcc cag att att gag 1840Leu Asp Met Glu Gly Arg Ile Lys Thr Leu His Ala Gln Ile Ile Glu335 340 345aag gat gcc atg atc aaa gta ctc cag cag cgt tcc cgg aag gag ccg 1888Lys Asp Ala Met Ile Lys Val Leu Gln Gln Arg Ser Arg Lys Glu Pro350 355 360agc aag aca gag cag ctg tcg tgc atg cgg cca gcg aag tct ctg atg 1936Ser Lys Thr Glu Gln Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu Met365 370 375 380tcc att tcc aat gct gga tca ggc ttg ctc tcc cac tca tcc acc ctg 1984Ser Ile Ser Asn Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr Leu385 390 395act ggc tcc ccc atc atg gaa gaa aag cga gac gac aag agc tgg aag 2032Thr Gly Ser Pro Ile Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp Lys400 405 410ggg agc cta ggc att ctc ctg ggt gga gac tac cgt gct gaa tat gtc 2080Gly Ser Leu Gly Ile Leu Leu Gly Gly Asp Tyr Arg Ala Glu Tyr Val415 420 425cct tcc aca ccc tcg cct gtg cca ccc tcg act ccc ctg ctc tcg gct 2128Pro Ser Thr Pro Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ala430 435 440cac tcc aag aca ggc agc cga gac tgc agt acc caa act gaa cgt ggg 2176His Ser Lys Thr Gly Ser Arg Asp Cys Ser Thr Gln Thr Glu Arg Gly445 450 455 460acg gaa tcg aac aaa act gca gct gtt gct ccc atc tct gtt cct gct 2224Thr Glu Ser Asn Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro Ile Ser Val Pro Ala465 470 475cca gtt gct gct gcc gcc act gct gcc gcc atc act gcc act gct gcc 2272Pro Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ala Ala480 485 490
acc atc acc acc acc atg gta gct gct gct cca gtt gct gtt gct gct 2320Thr Ile Thr Thr Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala495 500 505gct gct gct cca gct gct gct gct gcc ccg tct cca gcc act gcc gct 2368Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala510 515 520gct act gct gct gct gtt tct cca gct gct gct ggt cag att cca gct 2416Ala Thr Ala Ala Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ile Pro Ala525 530 535 540gct gcc tct gtt gcc tca gct gct gcc gtt gct cct tct gct gct gct 2464Ala Ala Ser Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala545 550 555gct gct gct gtt cag gtt gct cca gct gct ccg gct cca gtt cca gct 2512Ala Ala Ala Val Gln Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala560 565 570ccg gct ctg gtt ccg gtt cca gct cca gca gcg gct cag gct tct gct 2560Pro Ala Leu Val Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ser Ala575 580 585cct gct cag act cag gca cca act tca gct ccg gct gtg gct cca act 2608Pro Ala Gln Thr Gln Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr590 595 600cca gct cca act cca act cca gct gtg gct cag gct gag gtt cct gca 2656Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala Glu Val Pro Ala605 610 615 620agt cca gct acc ggt cct gga cca cat cgt ttg tct ata cca agt ttg 2704Ser Pro Ala Thr Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser Ile Pro Ser Leu625 630 635acc tgc aat cca gac aaa aca gat ggg cct gtg ttc cac tcc aat act 2752Thr Cys Asn Pro Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn Thr640 645 650ctg gaa aga aaa act ccc att cag atc ctg gga caa gag cct gat gca 2800Leu Glu Arg Lys Thr Pro Ile Gln Ile Leu Gly Gln Glu Pro Asp Ala655 660 665gag atg gtg gaa tat ctc atc taa acggccaaat caagagctgc agattatcag 2854
Glu Met Val Glu Tyr Leu Ile670 675caaaaatgct tttaatcatt ttcccccttt tattggttct tgttttgagg gtgaggacaa 2914gggttgtggg gaggggatgt tttttaacag gactttttat tggaacaatg tactacttga 2974gtaataccat gtgaacacca gtctattttg gtatgcttag ggagtacctc taaagacaga 3034ttaatcagaa tgtgctctaa agcttattgt ttgaatttat acgaatactg ggactgttaa 3094caggtggcta tacatcgacg ttttcaatgt gcttaaattt gtttaaattt tccatattct 3154agatcatttt ttattgaaga gcacagtatg tgtggaagac agtgtataac acgtagtttg 3214gaagtgggaa gctagagaga attgagtgtg tgctgttttg tatagttact atcctgtgca 3274gcagctggag aaagcactca cctcaggctt acaaaaggga atagtttcag gagctatgta 3334agctggaaaa aaggtaggga gttttggggt gcagaagggt actggagcta attttttctt 3394ccagtttccc agctaccctg ccccagggaa ttgtgtttgt cttcatttca gtggtgcttt 3454ggaaatggat tcttttggtt ccctcctgga ggttcataca ttcatatata tgctctggag 3514taatttatgc atttggataa ttaatatatt gctttcagat gctgggagag tacattaact 3574gagtgatgcg caacttcctc tctcttaggg aattagacca tcagaggcct tgatggagag 3634ttgcatgggg tgctatatgc agacttccat ggtttgtgtg tagccatgaa cacagcttgc 3694ttgcatttag taagaccaat cagcttagtg tttatttctt ctacagcaca gattcactgg 3754ctgggtctcc agtctcaaat tgccaatcat ttgcaaagtg aggaaggatc tttgttgaca 3814ggttgaatgc tttgaatttc tggtgactac tttgaaataa cttgttttgt ttgtcaaatt 3874ctaagcatat gtcttaaaag gcatttttga ctatcacctc caagggaata gcttgagaaa 3934cccaaagtac tatgctgcag tcgggggaga ggtggattgc agcagtatcc tcaactacct 3994cttctcactg tcagtgacac catcttggaa tacctttggg aagcagcagg aaatgtgcat 4054gtgggtagag atcaaaggag gcaatggctc caagccttgc catagggctg cctccaagga 4114
cacagaagga tgccagttgc cacaggtccc tgccctgtgt cacctgtctg cccttcatta 4174aggtgagaaa tctgcagata gcatcattaa gatcagtttt aaggggtata gggagggtga 4234gggaagtggg gggtgttagg taagggttgg gggtagaggt tttgggatgt cttagttaga 4294aaccagatta atagaagagt aggcctgata tattacatca tgagccatag tggtgggaaa 4354gaactttagc aatatagccc tacctcctca ttttagtgat gaggaatctg agaactggag 4414aggttcagtg actttttgaa agtcatacaa cacagctaac cattatgcca atcaccatgc 4474ttattttggg aaactcttta tcttttttaa attccatttt atgaaaaggc atcttcatgg 4534tccagggaat atgtatcttg taaaatgtac ctggttggag tagcttgtcc agtcttgaca 4594aactactgaa tttctgtctt gcctctcctt cagtgccttt taaaaggttt tcccttttct 4654gatctgcatt tcaacataga gtcacataaa tgtccccctg agaaaccaat cccacttctt 4714tctaggagat tgggtatctt agataatctt ttggggttcc tctgtgagta taggaatggt 4774atccttccta attatcttcc aaaggaatta ttttgtgtgt gtgcctgtgt gtgtgtagag 4834acataaagga gggtgatgtg attttcagct agtcctttca cattttcaat aatgaggtaa 4894tcatgttaca tacacattag tcctcagtta taaagtgaat ctcagataga aattaaaagt 4954gcagttgtgt taagactctt tcatactacc ctttagtcat aaggagaaaa aaacactcaa 5014atagtagaag cagcaagtag caaacttcag gagagctact ttctatccaa ataatttaaa 5074aaacactttt cacctactcc tttcatggtt ataacacatt ggcagacttt ttgctggctc 5134tgggagccat gattttaatc acattctgca aggtgacaaa tgtcatacat tccacattgt 5194gtggtagcca tctctttaga ctcatgtgtt ttggggaaag gaagaagttc ttggctgagt 5254actattttga actttccaga accctctcac accagagaca gttcttctct gttcagtttc 5314caatccccga taatttgcta aaataacatt gtacatccaa gagagggaag aagagtatgt 5374cagtatatta tgcagaagat agatacagcc ttttcagaag atctccacta gtttttgttc 5434caaaaattca agtttatggg agaaatctca attagccacc ttttcacagt tgtgtggata 5494
taacatttgg gggatctttc tggactccta cctatctgtg cattttaccg gcacctcagg 5554aaaggagggt gaccaggttg tcttagcttg tactgcttgg tgatctctga ggaccttcta 5614attcagttgt accccagtgt tccatgtata gaaaaacttc attagaacaa actttacttg 5674atatgaaact cctattaaca gtcttttttt gaaataaaaa gtagcttgag ctttctttta 5734aaatcatgta tcttgattgt tgatttaatg aaggatttcc ttttaatgct gcttttgagc 5794ttcaaggtaa taggacagca ggaacctaaa atatctgcca tcatctgcca taggaaagat 5854acccagagac ccatcatgtt ctctttttgt tgttacactg ttgggtgggt ataacaattg 5914gaaaatgaac aaactgattg attgtgcaaa ctacttttta tgacaagcct aaaccctcat 5974aatgcggcag cttaaagtgt atacatatgc actaactttg atcaattata ttctcatatc 6034tgttagctac acagtctcct attatctcaa ttgcttatgt gcatatggaa tatgttactt 6094aaaacgtgtg cattcttact gaaaatgttt tcaaaggaag gtatcagctg tgggctaatt 6154gccaccaatt tcagcctgcc acgattcttg gaaatatgtc ttccaagtgc catccatcat 6214cagtaggaca agtgtcggga gtttgtttat ttttttccag tagcaacgat gggttacatg 6274gagccatgaa acctccttct ggcctccctt gtgattaatg gcatgtgttt gtaaaatgga 6334tagctggggt tggcagatgg ctagagaaga atcgcctttg gtttaaaatg tatgtggtcc 6394cctaatgatt gtgaccccat tctgtaatca actgagctag ttccaataaa gttaagcagg 6454tttaaatcc 6463<210>2<211>675<212>PRT<213>人<400>2Met Pro Arg Ala Gln Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gln Pro Val Pro Ala1 5 10 15
Asp Pro Phe Ala Ile Val Ser Arg Ala Gln Gln Met Val Glu Ile Leu20 25 30Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Arg Gln Glu Leu Glu Gly Cys Tyr Glu35 40 45Lys Val Ala Arg Leu Gln Lys Val Glu Thr Glu Ile Gln Arg Val Ser50 55 60Glu Ala Tyr Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala Leu65 70 75 80Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile Arg Arg Met His85 90 95Asp Phe Asn Arg Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu Thr Ala Asn Lys Gln100 105 110Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp Thr Arg Lys Thr Ile115 120 125Ser Gln Leu Phe Ala Lys Asn Lys Glu Ser Gln Arg Glu Lys Glu Lys130 135 140Leu Glu Ala Glu Leu Ala Thr Ala Arg Ser Thr Asn Glu Asp Gln Arg145 150 155 160Arg His Ile Glu Ile Arg Asp Gln Ala Leu Ser Asn Ala Gln Ala Lys165 170 175Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Gln Val Tyr Val Asp180 185 190Lys Val Glu Lys Met Gln Gln Ala Leu Val Gln Leu Gln Ala Ala Cys195 200 205Glu Lys Arg Glu Gln Leu Glu His Arg Leu Arg Thr Arg Leu Glu Arg210 215 220Glu Leu Glu Ser Leu Arg Ile Gln Gln Arg Gln Gly Asn Cys Gln Pro225 230 235 240Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu Met Glu Leu Leu Arg245 250 255
Glu Lys Glu Glu Arg Ile Leu Ala Leu Glu Ala Asp Met Thr Lys Trp260 265 270Glu Gln Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met Arg His Phe Ala Leu Asp275 280 285Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gln Arg Asp Thr Thr Val Ile Ser His290 295 300Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Ala Arg Ile Gln Lys305 310 315 320Glu Glu Glu Glu Ile Leu Met Ala Asn Lys Arg Cys Leu Asp Met Glu325 330 335Gly Arg Ile Lys Thr Leu His Ala Gln Ile Ile Glu Lys Asp Ala Met340 345 350Ile Lys Val Leu Gln Gln Arg Ser Arg Lys Glu Pro Ser Lys Thr Glu355 360 365Gln Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu Met Ser Ile Ser Asn370 375 380Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr Leu Thr Gly Ser Pro385 390 395 400Ile Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp Lys Gly Ser Leu Gly405 410 415Ile Leu Leu Gly Gly Asp Tyr Arg Ala Glu Tyr Val Pro Ser Thr Pro420 425 430Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ala His Ser Lys Thr435 440 445Gly Ser Arg Asp Cys Ser Thr Gln Thr Glu Arg Gly Thr Glu Ser Asn450 455 460Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro Ile Ser Val Pro Ala Pro Val Ala Ala465 470 475 480Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ala Ala Thr Ile Thr Thr485 490 495
Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro500 505 510Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala515 520 525Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ile Pro Ala Ala Ala Ser Val530 535 540Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val545 550 555 560Gln Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro Ala Leu Val565 570 575Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ser Ala Pro Ala Gln Thr580 585 590Gln Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Pro Ala Pro Thr595 600 605Pro Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala Glu Val Pro Ala Ser Pro Ala Thr610 615 620Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser Ile Pro Ser Leu Thr Cys Asn Pro625 630 635 640Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn Thr Leu Glu Arg Lys645 650 655Thr Pro Ile Gln Ile Leu Gly Gln Glu Pro Asp Ala Glu Met Val Glu660 665 670Tyr Leu Ile675<210>3<211>675<212>PRT<213>人<220>
<221>變體
<222>()..)<223>殘基135＝Asn，Ser或Asp<220>
<221>變體<222>()..(150)<223>殘基148-150＝Glu-Leu-Ala或Thr-Thr-Pro<400>3Met Pro Arg Ala Gln Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gln Pro Val Pro Ala1 5 10 15Asp Pro Phe Ala Ile Val Ser Arg Ala Gln Gln Met Val Glu Ile Leu20 25 30Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Arg Gln Glu Leu Glu Gly Cys Tyr Glu35 40 45Lys Val Ala Arg Leu Gln Lys Val Glu Thr Glu Ile Gln Arg Val Ser50 55 60Glu Ala Tyr Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala Leu65 70 75 80Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile Arg Arg Met His85 90 95Asp Phe Asn Arg Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu Thr Ala Asn Lys Gln100 105 110Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp Thr Arg Lys Thr Ile115 120 125Ser Gln Leu Phe Ala Lys Xaa Lys Glu Ser Gln Arg Glu Lys Glu Lys130 135 140Leu Glu Ala Xaa Xaa Xaa Thr Ala Arg Ser Thr Asn Glu Asp Gln Arg145 150 155 160Arg His Ile Glu Ile Arg Asp Gln Ala Leu Ser Asn Ala Gln Ala Lys165 170 175Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Gln Val Tyr Val Asp180 185 190
Lys Val Glu Lys Met Gln Gln Ala Leu Val Gln Leu Gln Ala Ala Cys195 200 205Glu Lys Arg Glu Gln Leu Glu His Arg Leu Arg Thr Arg Leu Glu Arg210 215 220Glu Leu Glu Ser Leu Arg Ile Gln Gln Arg Gln Gly Asn Cys Gln Pro225 230 235 240Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu Met Glu Leu Leu Arg245 250 255Glu Lys Glu Glu Arg Ile Leu Ala Leu Glu Ala Asp Met Thr Lys Trp260 265 270Glu Gln Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met Arg His Phe Ala Leu Asp275 280 285Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gln Arg Asp Thr Thr Val Ile Ser His290 295 300Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Ala Arg Ile Gln Lys305 310 315 320Glu Glu Glu Glu Ile Leu Met Ala Asn Lys Arg Cys Leu Asp Met Glu325 330 335Gly Arg Ile Lys Thr Leu His Ala Gln Ile Ile Glu Lys Asp Ala Met340 345 350Ile Lys Val Leu Gln Gln Arg Ser Arg Lys Glu Pro Ser Lys Thr Glu355 360 365Gln Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu Met Ser Ile Ser Asn370 375 380Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr Leu Thr Gly Ser Pro385 390 395 400Ile Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp Lys Gly Ser Leu Gly405 410 415Ile Leu Leu Gly Gly Asp Tyr Arg Ala Glu Tyr Val Pro Ser Thr Pro420 425 430
Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ala His Ser Lys Thr435 440 445Gly Ser Arg Asp Cys Ser Thr Gln Thr Glu Arg Gly Thr Glu Ser Asn450 455 460Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro Ile Ser Val Pro Ala Pro Val Ala Ala465 470 475 480Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ala Ala Thr Ile Thr Thr485 490 495Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro500 505 510Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala515 520 525Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ile Pro Ala Ala Ala Ser Val530 535 540Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val545 550 555 560Gln Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro Ala Leu Val565 570 575Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ser Ala Pro Ala Gln Thr580 585 590Gln Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Pro Ala Pro Thr595 600 605Pro Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala Glu Val Pro Ala Ser Pro Ala Thr610 615 620Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser Ile Pro Ser Leu Thr Cys Asn Pro625 630 635 640Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn Thr Leu Glu Arg Lys645 650 655Thr Pro Ile Gln Ile Leu Gly Gln Glu Pro Asp Ala Glu Met Val Glu660 665 670
Tyr Leu Ile675<210>4<211>143<212>PRT<213>人<400>4Glu Ser Asn Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro Ile Ser Val Pro Ala Pro1 5 10 15Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ala Ala Thr20 25 30Ile Thr Thr Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala35 40 45Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala50 55 60Thr Ala Ala Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ile Pro Ala Ala65 70 75 80Ala Ser Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala85 90 95Ala Ala Val Gln Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro100 105 110Ala Leu Val Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ser Ala Pro115 120 125Ala Gln Thr Gln Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr130 135 140<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸
PCR反應(yīng)引物<400>5tacggatccg aatcgaacaa aactgcagct g31<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸PCR反應(yīng)引物<400>6atactcgagt catggagctg gagttggagc ca 32<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸PCR反應(yīng)引物<400>7gtttgacctg caatccagac aa 22<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸PCR反應(yīng)引物<400>8cccaggatct gaatgggagt t 21
<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸PCR反應(yīng)引物<400>9cagatgggcc tgtgttccac tccaa 25<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸RACE PCR反應(yīng)引物<400>10gctgacagtt gccctgacgc tgct24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸RACE PCR反應(yīng)引物<400>11cggagacggt gctctagctg ctca24<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸RACE PCR反應(yīng)引物<400>12tccttccaac tcttgcctca agttccg 27<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸RACE PCR反應(yīng)引物<400>13ggtggcagcg gacaggcagg atac24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸RACE PCR反應(yīng)引物<400>14gaggcggaga gaactaagag aaga24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸RACE PCR反應(yīng)引物<400>15gagcggagat ggaggagtaa ttca2權(quán)利要求
1.一種分離的哺乳動(dòng)物制管張素結(jié)合蛋白質(zhì)-1(ABP-1)，其能結(jié)合纖溶酶原kringle結(jié)構(gòu)域1-4和/或5且包含一種與SEQ ID NO.2、3或4具有大于至少80％序列同源性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)為人蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列與SEQ ID NO.2、3或4具有至少90％序列同源性。
4.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列與SEQ ID NO.2、3或4具有至少95％序列同源性。
5.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列與SEQ ID NO.2、3或4具有至少98％序列同源性。
6.權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列，其中位置135的氨基酸殘基為Asn、Ser或Asp，位置148-150的三個(gè)氨基酸殘基為三肽Glu-Leu-Ala或三肽Thr-Trp-Pro。
8.權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列。
9.一種分離的核酸分子，包含一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或肽的序列。
10.編碼權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)之權(quán)利要求9的分離的核酸分子。
11.編碼權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)之權(quán)利要求9的分離的核酸分子。
12.編碼權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)之權(quán)利要求9的分離的核酸分子。
13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，其至少包含SEQID NO.1的核苷酸2177至核苷酸2608的序列。
14.權(quán)利要求9的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO.1的核苷酸797至核苷酸2824的序列。
15.權(quán)利要求14的分離的核酸分子，其由SEQ ID NO.1的序列組成。
16.一種包含權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)的核酸的載體。
17.權(quán)利要求16的載體，其為質(zhì)粒。
18.權(quán)利要求16的載體，其為病毒。
19.一種用權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞。
20.一種抗體或抗體片段，其可特異性結(jié)合權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或肽。
21.權(quán)利要求20的抗體，其為單克隆抗體或其片段。
22.用作藥物的權(quán)利要求20或21的抗體。
23.一種表達(dá)權(quán)利要求20或21的抗體的重組細(xì)胞。
24.一種用于鑒別能與權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)相互作用或顯示與其基本上相同的生物功能的化合物的篩選方法。
25.用作藥物的權(quán)利要求1-8、9-15或20-21中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)、分子、抗體或抗體片段。
26.權(quán)利要求1-8、9-15或20-21中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)、分子、抗體或抗體片段在制備針對(duì)血管發(fā)生相關(guān)疾病或病癥的藥物中的用途。
27.一種藥物制劑，其包含權(quán)利要求1-8、9-15或20-21中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)、分子、抗體或抗體片段，以及藥學(xué)可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了能起制管張素受體作用的蛋白質(zhì)的序列及其核酸序列。本發(fā)明還涉及其在篩選方法中的用途，其中得到了顯示與制管張素相同的、有利的抗血管發(fā)生性質(zhì)的新物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61P27/02GK1626552SQ20041005600
公開(kāi)日2005年6月15日 申請(qǐng)日期1999年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月15日
發(fā)明者L·赫爾姆格蘭, B·特羅亞諾夫斯基 申請(qǐng)人:生物發(fā)明國(guó)際股份公司