專利名稱：一種新型?？?0型病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物病毒領(lǐng)域，涉及病毒新毒株，具體涉及一種?？?0型(Echo30)病毒的新毒株及其用途。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，近年來(lái)有明確病原的無(wú)菌性腦膜炎基本上是由腸道病毒引起的，其中Echo30是主要病原之一。Echo30導(dǎo)致的腦膜炎爆發(fā)，我國(guó)從90年代初起有部分地區(qū)陸續(xù)報(bào)道，但規(guī)模都不大，歐美各國(guó)則從80年代以來(lái)就有多起爆發(fā)報(bào)道。目前Echo30病毒的分離主要依靠細(xì)胞培養(yǎng)，型別鑒定除了傳統(tǒng)的中和試驗(yàn)，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的以RT-PCR為基本手段的各種分子生物學(xué)技術(shù)也相繼成為病毒的快速鑒定方法。其中受到較多肯定的是病毒VP1全部或部分序列的測(cè)定。2003年1-7月，我國(guó)江蘇省鹽城市區(qū)及其所屬的8個(gè)縣發(fā)生了較大規(guī)模的無(wú)菌性腦膜炎爆發(fā)流行。共1757人發(fā)病，主要是14歲以下的兒童，男性多于女性，性別比約為2∶1。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱，頭痛，嘔吐，顱內(nèi)壓增高，頸項(xiàng)強(qiáng)直，個(gè)別患者有咳嗽，腹瀉等消化道癥狀少見(jiàn)；結(jié)合腦脊液生化檢查及細(xì)菌培養(yǎng)陰性的結(jié)果，臨床診斷為病原待查的無(wú)菌性腦膜炎。由于爆發(fā)病原不明，不能及時(shí)采取有效的控制措施，導(dǎo)致了較大規(guī)模的疾病流行爆發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型?？?0型(Echo30)病毒毒株，本發(fā)明毒株能制備Echo30診斷試劑，用于疾病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，控制流行規(guī)模，為完善Echo30及腸道病毒監(jiān)測(cè)系統(tǒng)提供生物信息。
本發(fā)明的另一目的是采用新型Echo30病毒毒株，為腸道病毒疫苗的制備提供信息。
本發(fā)明采用住院患者的腦脊液和糞便標(biāo)本進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，利用RT-PCR初步鑒定為腸道病毒，然后通過(guò)腸道病毒組合血清及各種可得的單價(jià)抗血清進(jìn)行毒株的中和試驗(yàn)，將毒株定型為Echo30型腸道病毒。同時(shí)，用RT-PCR技術(shù)將病毒衣殼蛋白VP1的基因進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，進(jìn)入GenBank搜尋比對(duì)進(jìn)行毒株的基因分型，證實(shí)所分離的病毒為Echo30的變異毒株。命名為Echo30-FDJS03，保藏號(hào)CGMCCNo.1199，保藏日期2004年7月28日。
本發(fā)明通過(guò)下述方法與步驟進(jìn)行，1)病原體分離培養(yǎng)按常規(guī)方法，腦脊液標(biāo)本直接接種于單層MRC-5細(xì)胞，糞便處理參照WHO推薦的方法(World Health Organization.Specimen receipt and processing.InPolio Laboratory Manual-underrevision.GenevaWHO，2001.69-74)，用完全PBS將糞便標(biāo)本制成20％的懸液，經(jīng)氯仿處理，1500g4℃離心20min，取上清接種于MRC-5細(xì)胞，在5％CO237℃條件下培養(yǎng)，每天對(duì)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)進(jìn)行觀察，經(jīng)培養(yǎng)7d后，病變細(xì)胞培養(yǎng)液3000rmp離心20min后取上清，分離病毒顆粒進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察。
2)中和試驗(yàn)在96孔板上進(jìn)行微量中和試驗(yàn)。按照常規(guī)方法，將50μl100TCID50的病毒與等量的腸道病毒各組(型)血清混合，37℃作用2h，然后取50μl混合物接種于單層MRC-5細(xì)胞，同步設(shè)陰性細(xì)胞對(duì)照和陽(yáng)性病毒對(duì)照，5％CO237℃培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)7天。
3)RT-PCR及VP1序列測(cè)定用Trizol法提取病毒RNA；以randomhexamer為引物，MMLV(Promega)37℃作用1h將RNA反轉(zhuǎn)錄為c-DNA；VP1的PCR循環(huán)條件為94℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃30s，72℃7min。VP1擴(kuò)增產(chǎn)物提純后在ABI3730型DNA序列自動(dòng)分析儀上測(cè)序。
結(jié)果顯示，(1)正常MRC-5細(xì)胞為人胚肺二倍體細(xì)胞，呈纖維狀生長(zhǎng)；細(xì)胞感染陽(yáng)性分離標(biāo)本后出現(xiàn)腸道病毒典型的淚滴形細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞收縮變圓，甚至破碎，漂浮于培養(yǎng)液中。
(2)電鏡負(fù)染色觀察病毒形態(tài)，感染細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)物低速離心后取上清進(jìn)行電鏡負(fù)染色觀察，顯示直徑在20-30nm的球形病毒顆粒。符合Echo病毒的已知形態(tài)。
(3)首先用KMB組合抗血清(包括CoxA9，CoxB1～6，Echo1～7，9，11～15，17，19～21，24，25，27，32共28個(gè)血清型)進(jìn)行中和試驗(yàn)，沒(méi)有任何一組血清能完全中和分離毒株的致細(xì)胞病變效應(yīng)；接著用未包括在KMB組合抗血清中的各型單價(jià)抗血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果表明只有Echo30型單價(jià)抗血清在試驗(yàn)劑量下能完全中和病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)。表明分離毒株為Echo30型腸道病毒。
(4)分離株病毒在經(jīng)腸道病毒通用引物引導(dǎo)的RT-PCR成功擴(kuò)增出440bp目標(biāo)條帶。分別位于VP3和2A區(qū)的一對(duì)引物擴(kuò)增出包括完整VP1基因(876nt)在內(nèi)的目的片段，純化測(cè)序。通過(guò)GenBank的blastn和blastp程序進(jìn)行相近基因的檢索比對(duì)，證實(shí)分離株病毒為與Echo30原型株Bastianni的VP1序列有82％同源性的Echo30變異株。
(5)本發(fā)明的完整VP1序列已提交GenBank，獲得的accession no.為AY665609。
本發(fā)明方法中采用的細(xì)胞系為本領(lǐng)域公知的MRC-5細(xì)胞。
本發(fā)明方法中采用的腸道病毒組合血清和各種單價(jià)抗血清由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，RT-PCR所需腸道病毒通用引物及擴(kuò)增VP1的引物為國(guó)際認(rèn)可引物序列(Oberste MS，Maher K，Kennett ML，et al.Molecular epidemiology and genetic diversityof echovirus type 30(E30)genotypes correlate with temporaldynamics of E30 isolation.J Clin Microbiol，1999，373928-3933)，由上海生工和博亞兩家生物技術(shù)有限公司合成，VP1擴(kuò)增產(chǎn)物由博亞提純并測(cè)序。
本發(fā)明Echo30-FDJS03毒株是國(guó)內(nèi)首次得到Echo30分離株的核酸序列信息，并將其提交至GenBank。本發(fā)明不僅對(duì)我國(guó)腸道病毒毒種保存是一種補(bǔ)充，同時(shí)提供了我國(guó)Echo30病毒極有價(jià)值的生物信息，對(duì)該病原引起的疾病診斷、感染監(jiān)測(cè)體系的完善和所致疾病流行的控制等都有重要作用。
本發(fā)明Echo30-FDJS03毒株還可用于制備Echo30病毒感染的快速診斷試劑和疫苗研究。


圖1為培養(yǎng)液替換為維持液后72小時(shí)正常的MRC-5細(xì)胞。
圖2為感染105TCID50病毒后72小時(shí)的MRC-5細(xì)胞。
圖3電鏡負(fù)染色可見(jiàn)20-30nm的球形病毒顆粒。
圖4440bp腸道病毒通用引物引導(dǎo)下的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳照片。
圖5部分VP1測(cè)序結(jié)果(截圖)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采集我國(guó)江蘇省鹽城市區(qū)及其所屬的8個(gè)縣爆發(fā)于2003年1月部分腦膜炎住院患者的腦脊液和糞便標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)分離到能產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變并能連續(xù)穩(wěn)定傳代增殖的病毒22株，定型為Echo30。
1)病原體分離培養(yǎng)按常規(guī)方法，腦脊液標(biāo)本直接接種于單層MRC-5細(xì)胞，糞便處理參照WHO推薦的方法，用完全PBS將糞便標(biāo)本制成20％的懸液，經(jīng)氯仿處理，1500g4℃離心20min，取上清接種于MRC-5細(xì)胞，在5％CO237℃條件下培養(yǎng)，每天對(duì)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)進(jìn)行觀察，經(jīng)培養(yǎng)7d后，病變細(xì)胞培養(yǎng)液3000rmp離心20min后取上清，分離病毒顆粒進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察。
2)中和試驗(yàn)在96孔板上進(jìn)行微量中和試驗(yàn)。按照常規(guī)方法，將50μl100TCID50的病毒與等量的腸道病毒各組(型)血清混合，37℃作用2h，然后取50μl混合物接種于單層MRC-5細(xì)胞，同步設(shè)陰性細(xì)胞對(duì)照和陽(yáng)性病毒對(duì)照，5％CO237℃培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)7天。
3)RT-PCR及VP1序列測(cè)定用Trizol法提取病毒RNA；以randomhexamer為引物，MMLV(Promega)37℃作用1h將RNA反轉(zhuǎn)錄為c-DNA；VP1的PCR循環(huán)條件為94℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃30s，72℃7min。VP1擴(kuò)增產(chǎn)物提純后在ABI3730型DNA序列自動(dòng)分析儀上測(cè)序。
結(jié)果顯示，感染本發(fā)明病毒的MRC-5細(xì)胞出現(xiàn)腸道病毒典型的淚滴形細(xì)胞病變，細(xì)胞收縮變圓，甚至破碎，漂浮于培養(yǎng)液中；電鏡負(fù)染色觀察，顯示直徑在20-30nm的球形病毒顆粒，符合Echo病毒的已知形態(tài)；中和試驗(yàn)結(jié)果表明，只有Echo30型單價(jià)抗血清在試驗(yàn)劑量下能完全中和病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)，證實(shí)所分離毒株為Echo30型腸道病毒；通過(guò)GenBank的blastn和blastp程序進(jìn)行相近基因的檢索比對(duì)，證實(shí)所分離株病毒為與Echo30原型株Bastianni的VP1序列有82％同源性的Echo30變異株。
SEQUENCE LISTING<110>復(fù)旦大學(xué)<120>一種新型埃可30型病毒及其用途<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>876<212>RNA<213>Echovirus 30<220>
<221>vRNA<222>(1)..(876)<400>1aaugacccug aaagugcacu caacaaggcc guagguaggg uggccgacac uguagccagu60ggaccuguca acaccgagca aauuccugcc uugacagcag uggagacagg acacacauca 120caagugguac cgagugacac aaugcaaaca cggcacguga ucaacuacca caccagguca 180gagucaucaa uagaaaacuu cauggguaga gcggcgugcg uguacaucgc ucaauacgcu 240acagagaaag ucaaugauga guuagacagg uacacuaacu gggagauaac aaccagacaa 300guggcgcaac ugaggcgcaa gcuggaaaug uucacauaca ugagauucga ccuugagauc 360acauuuguua ucaccagcuc ucagcgcacu ucaaccacau acgcaucgga cuccccucca 420cuaacacacc aggugaugua cguaccaccg ggagguccaa ucccuaaaag uuaugaggau 480uucgcauggc agacauccac uaacccaagc guauucugga cggaggguaa ugcccccccc 540aggaugucga uaccauucau gagcguuggu aacgcauacu gcaacuucua ugauggaugg 600ucucacuuca gucagagcgg cgucuaugga uauaccaccu ugaacaacau gggucacuua 660uacuuuagac augugaacaa aucgacugcu uacccaguca auaguguugc ccgugucuac 720uuuaaaccca agcaugucaa ggccugggug ccccgcgcgc cacgcuugug cccguauuug 780uaugcaagga augucaacuu ugaugugcaa ggggugaccg agucucggga caaaauuacu 840cuugaccgau caacccauaa uccucuguca aacacu 87權(quán)利要求
1.一種新型?？?0型病毒Echo30-FDJS03，CGMCC No.1199，其具有序列1的結(jié)構(gòu)和下述特征，(1)感染細(xì)胞有淚滴形細(xì)胞病變，包括細(xì)胞收縮變圓，破碎，漂浮于培養(yǎng)液中；(2)電鏡負(fù)染色觀察，顯示球形病毒顆粒，符合Echo病毒的已知形態(tài)病毒形態(tài)；(3)血清中和試驗(yàn)?zāi)芡耆泻筒《镜闹录?xì)胞病變效應(yīng)；(4)與Echo30原型株Bastianni的VP1序列有82％同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型埃可30型病毒Echo30-FDJS03，其特征是所述病毒株直徑為20-30nm。
3.權(quán)利要求1所述的新型埃可30型病毒Echo30-FDJS03在制備腸道病毒診斷試劑中的用途。
4.權(quán)利要求1所述的新型?？?0型病毒Echo30-FDJS03在制備Echo30診斷試劑中的用途。
5.權(quán)利要求1所述的新型埃可30型病毒Echo30-FDJS03在制備無(wú)菌性腦膜炎診斷試劑中的用途。
6.權(quán)利要求1所述的新型埃可30型病毒Echo30-FDJS03在制備Echo30病毒感染疾病的疫苗中的用途。
7.權(quán)利要求1所述的新型?？?0型病毒Echo30-FDJS03在制備無(wú)菌性腦膜炎疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物病毒領(lǐng)域，具體涉及一種?？?(Echo30)病毒的新毒株及其用途。本發(fā)明通過(guò)患者的腦脊液和糞便標(biāo)本分離培養(yǎng)和腸道病毒中和試驗(yàn)，及采用RT－PCR技術(shù)對(duì)病毒衣殼蛋白VP1的基因擴(kuò)增測(cè)序后比對(duì)，證實(shí)所分離的病毒為Echo30的變異毒株，命名為Echo30－FDJS03，保藏號(hào)CGMCC No.1199。本發(fā)明毒株是國(guó)內(nèi)首次得到Echo30分離株的核酸序列信息，補(bǔ)充了我國(guó)腸道病毒毒種保存，同時(shí)提供了我國(guó)Echo30病毒極有價(jià)值的生物信息，對(duì)該病原引起的疾病診斷、感染監(jiān)測(cè)體系的完善和所致疾病流行的控制等有重要作用。本發(fā)明Echo30－FDJS03毒株還可用于制備Echo30病毒感染的快速診斷試劑和疫苗研究。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1651573SQ20041005343
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2004年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月4日
發(fā)明者姜慶五, 趙雅男, 姜仁杰, 陳贏忠, 沈進(jìn)進(jìn) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)