專利名稱：一種治療燒傷的噴霧劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物，特別是關(guān)于一種用于治療燒傷的噴霧劑。
背景技術(shù)：
燒傷臨床表現(xiàn)為疼痛，休克，肢體功能障礙，容貌毀損，愈后常留下瘢痕，嚴(yán)重者給患者身心造成的損害往往持續(xù)一生。近幾年隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展重度燒傷治愈率已經(jīng)有了很大提高。但是外用治療藥物品種較少，對深二度燒傷治療之后仍然遺留瘢痕。并且常用藥膏或散劑在皮膚上藥時(shí)要接觸創(chuàng)面，給病人造成很大痛苦，使用受到一定限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療燒傷的噴霧劑，它采用生化噴霧劑治療燒傷，具有無毒，副作用小，有效率高，瘢痕小的特點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)一種治療燒傷的藥物，其特征是它將α-溶血鏈球菌33號菌種搭載往返式太空飛行器，在太空的特殊條件下導(dǎo)致α-溶血鏈球菌33號菌種遺傳性質(zhì)發(fā)生變異，優(yōu)選出其中的正變異、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的菌種，經(jīng)培育發(fā)酵后生產(chǎn)成治療燒傷的生化藥劑，該菌種經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.1082。
所述的治療燒傷的生化藥劑是噴霧劑，1000ml中含太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽0.5g-10.0g。
所述的噴霧劑是以α-溶血鏈球菌33號菌種搭載、變異、優(yōu)選后的菌種，經(jīng)培育發(fā)酵生產(chǎn)的甘露聚糖肽，加入其它輔料和溶劑制成。
所述的輔料是防腐劑、或苯甲醇、或硫柳汞、或三氯叔丁醇、或?qū)αu基苯甲酸酯類。
所述的溶劑是水或甘油、或丙二醇、或聚乙二醇。
所述治療燒傷藥物的制備方法是；①優(yōu)選α-溶血性鏈球菌33菌種進(jìn)行太空搭載，經(jīng)過太空誘變精心選育的α-溶血性鏈球菌33號菌珠作為生產(chǎn)菌種制備；經(jīng)一級發(fā)酵和二級發(fā)酵，將發(fā)酵液提純，最終生產(chǎn)出太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽.②以甘露聚糖肽為原料加入輔料及適當(dāng)溶劑配制成噴霧劑。
所述的菌種制備；A.斜面種子培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化鈉0.2-0.6％，瓊脂1-5％，綿羊血5-10％；pH 7.2-7.4；斜面種子培養(yǎng)基滅菌溫度105-125℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.14Mpa；啟封菌種冷凍管，用無菌肉湯培養(yǎng)基稀釋，在無菌條件下接入血斜面，接種后置25-40℃恒溫培養(yǎng)24-30小時(shí)；B.肉湯種子培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化鈉0.2-0.6％；pH 7.0-7.4；肉湯種子培養(yǎng)基滅菌溫度105-125℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.14Mpa；將培養(yǎng)好的斜面菌種在無菌條件下按1-9％接種量接入肉湯種子培養(yǎng)基內(nèi)，25-40℃恒溫培養(yǎng)10-30小時(shí)。
所述的發(fā)酵過程；用發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化鈉0.2-0.6％；發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌溫度105-125℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.14Mpa；A.一級種子罐將優(yōu)良的肉湯菌種在無菌條件下按1-10％接種量接入一級種子罐，在25-40℃恒溫培養(yǎng)10-50小時(shí)；罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢瑁籅.二級發(fā)酵罐將一級發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20％接種量接入發(fā)酵罐，在25-40℃恒溫培養(yǎng)20-100小時(shí)，罐壓不超過0.02Mpa；滅活放罐，滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達(dá)到70-120℃，保溫20-60分鐘，冷卻靜置。
所述的提取過程；a、發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1∶15-1∶20或酌情而定；b、發(fā)酵液的濃縮液加入80-99％乙醇，體積量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定；充分?jǐn)嚢桁o置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH1.0-5.0，得到溶解液并將溶解液靜置。
c、再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液。準(zhǔn)確量取上清液體積，按上清液體積計(jì)算出所需乙醇量，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分?jǐn)嚢瑁o置后離心去除上清液得到沉淀物；d、沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH，離心。上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至含量檢測合格為止，得到的沉淀物為太空誘變菌種所生產(chǎn)的甘露聚糖肽粗品；真空干燥3-8小時(shí)即得太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽產(chǎn)品。
本發(fā)明的特點(diǎn)是它采用α-溶血性鏈球菌33號經(jīng)太空誘變后新的菌種經(jīng)發(fā)酵、提純及精制等高科技手段制備成的甘露聚糖肽噴霧劑治療燒傷，它具有激活淋巴細(xì)胞，促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞分化增殖，激活巨噬細(xì)胞，使白細(xì)胞生成增加，促進(jìn)補(bǔ)體生成，促進(jìn)白細(xì)胞介素-1的生成，經(jīng)過收集大量用藥患者病歷資料深入研究歸納總結(jié)證實(shí)存在促進(jìn)皮膚粘膜再生修復(fù)作用，燒傷的感染因素可由甘露聚糖肽的增強(qiáng)免疫作用消除。甘露聚糖肽治療燒傷粘膜病變的主要機(jī)理是促進(jìn)皮膚粘膜再生修復(fù)，通過促進(jìn)創(chuàng)傷部位巨噬細(xì)胞分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF使燒傷創(chuàng)面修復(fù)。它具有促進(jìn)皮膚粘膜再生修復(fù)作用。
新藥理作用試驗(yàn)分析驗(yàn)證燒傷的感染因素可由甘露聚糖肽的增強(qiáng)激活巨噬細(xì)胞作用解釋。采用白色念珠菌氘葡萄糖摻入實(shí)驗(yàn)，1、按甘露聚糖肽0.5ml/kg口服給藥大白兔一周。2、收集兔肺泡灌洗液。3、玻器粘附分離巨噬細(xì)胞。將被甘露聚糖肽激活的巨噬細(xì)胞在體外與白色念珠菌共同培養(yǎng)24小時(shí)。4、用水將巨噬細(xì)胞裂解，使氘標(biāo)記的葡萄糖僅摻入菌絲體中。5.計(jì)數(shù)菌絲體內(nèi)氘的摻入量判斷巨噬細(xì)胞對白色念珠菌生長的抑制率為97％。
甘露聚糖肽治療燒傷的另一個(gè)機(jī)理是促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)?；罨木奘杉?xì)胞分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF使燒傷創(chuàng)面修復(fù)。
甘露聚糖肽治療燒傷瘢痕減少的新機(jī)理是組分中甘露聚糖肽成分以競爭抑制方式阻礙TGF-β-LAP復(fù)合物與6-磷酸-甘露糖/胰島素樣生長因子II受體結(jié)合，從而抑制隱活TGF-β的活化。兔眼角膜紫外線燒傷模型觀察用藥組傷后40日傷口膠原以網(wǎng)狀方式沉積，瘢痕程度明顯減緩。平均愈合時(shí)間比非用藥組提前7天。
治療結(jié)果本組30例，治愈29例，治愈率96.6％，好轉(zhuǎn)1例，好轉(zhuǎn)率3.4％，總有效率100％。有好轉(zhuǎn)1例中由于經(jīng)費(fèi)問題放棄治療，用該法治愈2度最大面積44％，最小面積0.5％，平均面積22％，其中淺2度創(chuàng)面14例，平均治愈天數(shù)14天，合并有3度創(chuàng)面3例，平均治愈天數(shù)23天，在治療過程中未發(fā)現(xiàn)有任何不良反應(yīng)、肝腎功能及小便檢查，治療前后無明顯差異。經(jīng)臨床應(yīng)用觀察，該藥無毒和不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用效果好，創(chuàng)面愈合快，因此，我們認(rèn)為神舟三號甘露聚糖肽噴霧劑治療燒傷創(chuàng)面療效顯著，深2度燒傷不留疤痕。為燒傷創(chuàng)面外用藥提供一種新的治療方法。
新療效驗(yàn)證劉東虎，男，23歲。西安亨通光華制藥廠汽車司機(jī)。2003年6月3日下午全身被汽油燒傷，頭面部起泡，額部頭發(fā)，眉毛，胡須燒焦，雙手燒燙起泡，雙側(cè)下肢皮膚燒燙燥烈，脫皮，滲液，劇痛難忍，心慌，大汗淋漓。診斷汽油燒傷(深I(lǐng)I度)面積34.9％。治療抗菌消炎止痛，靜脈補(bǔ)液，外用神舟三號甘露聚糖肽噴霧劑，共住院19天，痊愈出院。繼續(xù)使用燒傷液，14天后復(fù)診全身無疤痕。
(見附件附件材料1陜西省科學(xué)技術(shù)廳陜西省科學(xué)技術(shù)成果鑒定證書材料附件材料2太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽生產(chǎn)菌株經(jīng)“神舟三號”飛船搭載公證書。
附件材料3太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽生產(chǎn)菌株經(jīng)“神舟三號”飛船搭載返回地面篩選報(bào)告附件材料4中國科學(xué)院微生物所關(guān)于“神舟三號”飛船搭載太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽生產(chǎn)菌株與地面對照菌的形態(tài)生理生化鑒定報(bào)告書附件材料5中國科學(xué)院微生物所關(guān)于“神舟三號”飛船搭載太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽生產(chǎn)菌株與地面對照菌的SDS-PAGE及RFLP/PFGE分析鑒定報(bào)告書附件材料6陜西省藥品檢驗(yàn)所“神舟三號”太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽口服液檢測報(bào)告附件材料7科技查新報(bào)告復(fù)印件附件材料8中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏菌種保藏受理通知書復(fù)印件)
具體實(shí)施方案菌種選育在α-溶血鏈球菌生長規(guī)律的基礎(chǔ)上，選定較合適生長時(shí)期的菌種，采用平皿生長的菌落、浸入其它物質(zhì)中的菌懸液、帶菌的砂土等方法，于2002年3月25日搭載“神舟三號”宇宙飛船。在太空軌道(近地點(diǎn)高度200公里、遠(yuǎn)地點(diǎn)高度350公里)進(jìn)行了6天零18小時(shí)的在軌飛行。太空的特殊條件主要體現(xiàn)為微重力、高真空、高輻射、交變磁場等特殊環(huán)境。在外層空間飛行的菌種被置于一個(gè)與地球上的生態(tài)環(huán)境完全不同的環(huán)境中，主要包括來自磁場俘獲的電子、質(zhì)子及低能重粒子；來自銀河系的宇宙射線如質(zhì)子、粒子及更重的高能重粒子；來自太陽磁暴的質(zhì)子及重粒子等。這些粒子作用于微生物細(xì)胞核中的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致雙鏈斷裂。微重力、高真空環(huán)境可使DNA的堿基序列發(fā)生重組，即基因組的重組和變異。變異后產(chǎn)生的新菌株，其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達(dá)、中試生產(chǎn)指標(biāo)等均會發(fā)生不同程度的變化。在宇宙飛船返回地面后，經(jīng)過進(jìn)一步篩選，僅優(yōu)選出其中0.2％的正變異且遺傳特性穩(wěn)定的菌株，經(jīng)培育制成生產(chǎn)菌種。這種經(jīng)航天搭載誘變后選育出的菌種已經(jīng)在在2003年12月29日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.1082。
實(shí)驗(yàn)及中試生產(chǎn)結(jié)果表明，經(jīng)空間誘變后的新型太空菌種在遺傳特性上穩(wěn)定，有較強(qiáng)的生產(chǎn)適應(yīng)性，由其發(fā)酵產(chǎn)生的甘露聚糖肽含量提高，多肽含量比國家標(biāo)準(zhǔn)(80％)提高3至5倍，西安市藥品檢驗(yàn)所送樣測定達(dá)到271.6％，發(fā)酵含量比對照組產(chǎn)物含量平均高出三倍以上，發(fā)酵周期大大縮短。
制備方法太空誘變菌種生產(chǎn)甘露聚糖肽的制備過程本發(fā)明所述的太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽是由以下方法制備太空菌種制備---一級發(fā)酵---二級發(fā)酵----發(fā)酵液提純，最終生產(chǎn)出甘露聚糖肽。
①太空菌種制備以經(jīng)過空間誘變育種精心選育的α-溶血鏈球菌作為生產(chǎn)菌種。
A.斜面種子培養(yǎng)基牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化鈉0.5％，瓊脂3％，綿羊血8％；pH 7.4。
斜面種子培養(yǎng)基滅菌溫度121℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.12Mpa。
啟封菌種冷凍管，用無菌肉湯培養(yǎng)基稀釋，在無菌條件下接入血斜面，接種后置38℃恒溫培養(yǎng)30小時(shí)。
B.肉湯種子培養(yǎng)基牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化鈉0.5％；pH 7.4。
肉湯種子培養(yǎng)基滅菌溫度121℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.12Mpa。
將培養(yǎng)好的斜面菌種在無菌條件下按9％接種量，接入肉湯種子培養(yǎng)基內(nèi)，38℃恒溫培養(yǎng)30小時(shí)。
②發(fā)酵過程發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏0.4％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％，氯化鈉0.5％。
發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌溫度121℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.12Mpa。
A.一級發(fā)酵罐將優(yōu)良的肉湯菌種在無菌條件下按10％接種量，接入一級種子罐，在29℃恒溫培養(yǎng)30小時(shí)，罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢琛?br> B.二級發(fā)酵罐將一級發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按20％接種量，接入發(fā)酵罐，在29℃恒溫培養(yǎng)70小時(shí)，罐壓不0.02Mpa，滅活放罐。滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達(dá)到100℃，保溫60分鐘，冷卻靜置。
③提取過程a、發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1∶15-1∶20或酌情而定。
b、發(fā)酵液的濃縮液加入80-99％乙醇，體積量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定。充分?jǐn)嚢桁o置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH5.0，得到溶解液并將溶解液靜置。
c、再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液，準(zhǔn)確量取清液體積，按上清液體積計(jì)算出所需乙醇量，調(diào)pH值，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分?jǐn)嚢?，靜置后離心去除上清液得到沉淀物。
d、沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH，離心，上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至中間檢測合格為止，得到的沉淀物為太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小時(shí)，即得到太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽產(chǎn)品。
上述方法得到的產(chǎn)品的檢驗(yàn)[性狀]本品為白色或微黃色無定形粉末；無臭、無味。
本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。
比旋度取本品，精密稱定，加水溶解并稀釋成每1ml中約含10mg的溶液，依法測定(中國藥典2000年版二部附錄vIE)，比旋度為+70℃至+80℃。
1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5-100)1ml，搖勻，沿管壁緩緩加硫酸0.5ml，數(shù)分鐘后，界面呈紫紅色。
2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取約10ul點(diǎn)于濾紙上，晾干，用無水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后.加0.2mol/L醋酸鈉溶液1.5ml與乙醇100ml，混勻即得。置暗處保存，可使用數(shù)月)中浸泡5分鐘，取出，用70％乙醇溶液沖洗，置還原液(取碘化鉀5g，硫代硫酸鈉5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L鹽酸液2.5ml，隨加隨攪拌，臨用時(shí)配)中浸泡5分鐘，取出，用70％乙醇溶液沖洗，置品紅業(yè)硫酸試液中浸泡約30分鐘，取出，用焦亞硫酸鈉溶液(取焦亞硫酸鈉0.4g，加鹽酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，沖洗，晾干，在濾紙片點(diǎn)樣處應(yīng)呈紫紅色。
3、取供試品和對照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每1ml中含1mg的溶液作為供試品溶液和對照品溶液，按甘露聚糖肽免疫原性測定法試驗(yàn)，供試品和對照品管應(yīng)均無溶血發(fā)生。
1、酸度取本品，加水制成每1ml中含I0mg的溶液，依法測定(中國藥典2000年版二部附錄VIH)，pH值應(yīng)為3.0-5.0。
2、吸收度取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VIA)，在260nm的波長處，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波長處，其吸收度不得大于0.20。
3、總氮量取本品，照氮測定法(中國藥典2000年版二部附錄VIID第二法)測定.按干燥品計(jì)算，含總氮量應(yīng)為0.8-2.0％。
4、免疫原性取供試品和對照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分別用磷酸鹽緩沖液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀釋液作為供試品溶液和對照品溶液，依法檢查(附甘露聚糖肽免疫原性測定法)，供試品不溶血管的最低濃度應(yīng)不得高于對照品相應(yīng)濃度的一倍以上。
5、干燥失重 取本品，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過5.0％(中國藥典2000年版二部附錄VIIIL)。
6、重金屬 取本品，在1.0g，依法檢查(中國藥典2000年版VIIIH)含重金屬不得過百萬分之二十。
7、異常毒性 取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法檢查(中國藥典2000年版附錄XIC)。按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定(供注射用)。
1.對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的D-甘露糖對照品0.1g置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。搖勻；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，搖勻。每1ml中含甘露糖50ug。
2.供試品溶液備取本品適量，精密稱定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，搖勻，沖入硫酸4.5ml，搖勻，放置于室溫，以0管為空白。照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IVA)在490nm的波長處測定吸收度。以甘露糖ug數(shù)對相應(yīng)的吸收度，計(jì)算回歸方程。
4.測定法精密量取供試品溶液1.0ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下自“再加3％苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，測定吸收度，由回歸方程計(jì)算甘露糖的含量。
甘露聚糖肽免疫原性測定法(補(bǔ)體結(jié)合法)；1、試液A.酸鹽緩沖液(pH7.2)取氯化鈉8.5g、磷酸氫二鈉0.565g及磷酸二氫鉀0.135g，加水至1000ml使其溶解，加10％硫酸鎂溶液1ml，搖勻。
B.1％羊紅細(xì)胞懸液羊血紅細(xì)胞的制備由綿羊頸靜脈無菌采血于盛有等量阿氏液(取葡萄糖20.5g、枸椽酸鈉8.0g、氯化鈉4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000mI使溶解，100℃滅菌30分鐘)的無菌容器中，4℃保存。
1％羊血紅細(xì)胞懸液的制備取上述羊血紅細(xì)胞適量，用氯化鈉注射液洗滌三次，每次離心5分鐘(2000轉(zhuǎn)/分)，取壓積羊血紅細(xì)胞，用氯化鈉注射液制成1％羊血紅細(xì)胞懸液。取懸液，用氯化鈉注射液稀釋20倍制成供試品溶液，另取等量懸液加水稀釋20倍作為空白溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IVA)，在541nm的波長處測定，其吸收度應(yīng)為0.65-0.70，如超出限度應(yīng)調(diào)節(jié)1％羊紅細(xì)胞懸液的濃度。
C.溶血素及致敏羊血紅細(xì)胞溶血素的制備取上述壓積羊血紅細(xì)胞，用氯化鈉注射液制成25％羊血紅細(xì)胞懸液.取家兔1只，靜脈注射上述羊血紅細(xì)胞懸液，每日一次，共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分離血清，56℃。30分鐘滅活，分裝，0℃以下保存。
溶血素單位的測定取溶血素適量，加磷酸鹽緩沖液分別制成1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶9000、1∶10000的稀釋液，各取0.1ml置試管中，加1％羊血細(xì)胞懸液0.1ml，搖勻，加稀釋度為1∶30的豚鼠血清(補(bǔ)體)0.2ml及磷酸鹽緩沖液0.2ml，搖勻，37℃保溫30分鐘，完全溶血管的最高稀釋度為1單位溶血素。
致敏羊血紅細(xì)胞的制備臨用前，將2％的羊血紅細(xì)胞懸液與2單位溶血索等體積混合，37℃保溫15分鐘即得。
補(bǔ)體取三只以上的豚鼠，心臟采血，離心分離血清，0℃以下保存。
補(bǔ)體單位的測定取補(bǔ)體適量，加磷酸鹽緩沖液，分別制成1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀釋液，各取0.2ml置試管中，加0.2ml磷酸鹽緩沖液，搖勻，37℃保溫30分鐘后，分別加致敏羊血紅細(xì)胞0.2ml，搖勻，37℃再保溫30分鐘.完全溶血管的最高稀釋度為1單位的補(bǔ)體。
抗體取甘露聚糖肽對照品適量，加氯化鈉注射液制成每1ml中含10mg的對照品溶液免疫家兔，隔日采用耳靜脈注射對照品溶液一次。第一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，離心分離血清，56℃下30分鐘滅活，分裝，0℃以下保存(臨用前，需56℃30分鐘再次滅活)。
抗體單位的測定取抗體適量，加磷酸鹽緩沖液分別制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。1∶64、1∶128的稀釋液，各取0.1ml置試管中，加甘露聚糖肽對照品溶液0.1ml及2單位補(bǔ)體0.2m]，搖勻，于4-8℃放置4小時(shí)以上，置37℃保溫30分鐘，不溶血管的最高稀釋度為1單位抗體。同時(shí)設(shè)抗原(不加抗體，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、抗體(不加抗原，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、補(bǔ)體(不加抗原，抗體，以0.2ml磷酸鹽緩沖液代替)對照管，以上三種對照管應(yīng)全溶血；另設(shè)的致敏羊血紅細(xì)胞(不加抗原、抗體和補(bǔ)體，以0.4ml磷酸鹽緩沖液代替)對照管應(yīng)不溶血。
2、免疫原性測定法取甘露驟糖肽對照品與供試品適量，照藥品項(xiàng)下的規(guī)定制成不同濃度的對照品溶液和供試品溶液，各取0.1ml置試管中，加入2單位抗體0.1ml及2單位補(bǔ)體0.2ml.搖勻，于4-8℃放置4小時(shí)以上，置37℃保溫30分鐘，加入致敏羊血紅細(xì)胞0.2ml，搖勻，37℃再保溫30分鐘。觀察各管的溶血情況，不溶血管的最低濃度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同時(shí)設(shè)抗原(不加抗體，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、抗體(不加抗原，以0.1ml磷酸鹽緩沖液代替)、補(bǔ)體(不加抗原、抗體、以0.2ml磷酸鹽緩沖液代替)對照管，以上三種對照管應(yīng)全溶血另設(shè)的致敏羊血紅細(xì)胞(不加抗原、抗體和補(bǔ)體，以0.4ml磷酸鹽緩沖液代替)對照管應(yīng)不溶血。
太空誘變菌種生產(chǎn)的治療燒傷噴霧劑的制備方法①將噴霧劑瓶用純化水清洗兩遍，加75％酒精浸泡消毒，棄去酒精，再用經(jīng)過過濾的純化水清洗兩遍，瀝干，備用。
②取甘露聚糖肽、防腐劑加入純化水中，溶解，加溶劑至全量，流通蒸汽滅菌30分鐘，過濾。
③將配好的藥液灌入噴霧劑瓶中，即得。
噴涂劑中甘露聚糖肽的劑量按照使用對象，可適當(dāng)提高或降低.除上述成分外，如果需要，本發(fā)明的制劑也可加入其它任選成分。如加入其他藥物成分制成復(fù)方制劑，或采用其他輔料制成噴涂劑。
實(shí)施例1甘露聚糖肽0.5g聚乙二醇400 50g苯甲醇10g純化水 制成 1000ml取甘露聚糖肽0.5g，苯甲醇10g，加純化水800ml使溶解，再加入聚乙二醇400 50g使混合均勻，過濾，自濾器上加水至全量，攪勻，流通蒸汽滅菌30分鐘，分裝至事先已清潔、滅菌的噴霧劑瓶中，即得。
實(shí)施例2甘露聚糖肽 1g丙二醇 100g三氯叔丁醇 5g純化水 制成1000ml取甘露聚糖肽1g，三氯叔丁醇5g，加純化水800ml使溶解，再加入丙二醇100g使混合均勻，過濾，自濾器上加水至全量，攪勻，流通蒸汽滅菌30分鐘，分裝至事先已清潔、滅菌的噴霧劑瓶中，即得。
使用方法1、將藥液直接噴涂于創(chuàng)面(嚴(yán)重污染者和磷燒傷者除外)。新創(chuàng)面開始用藥時(shí)，每小時(shí)應(yīng)用藥四至五次，待創(chuàng)面不甚疼痛后?？梢恢炼r(shí)用藥一次。
2、創(chuàng)面破皮者用藥時(shí)用二層藥用紗布浸飽藥液覆蓋在創(chuàng)面上(即濕敷)，并經(jīng)常保持紗布濕潤。如分泌物不多，可每天換紗布一次(換紗布時(shí)如紗布與創(chuàng)面粘附時(shí)可用燒傷藥連續(xù)浸泡半小時(shí)左右)，如分泌物多，可每天換紗布二至三次，必須保持創(chuàng)面周圍皮膚清潔衛(wèi)生；3、磷燒傷者必須在暗室用無菌水反復(fù)沖洗至磷沖清干凈后方能用燒傷液4、污染重的及其它化學(xué)品灼傷(如強(qiáng)酸？強(qiáng)堿？酒精)先用無菌水將創(chuàng)面清洗干凈，然后直接涂藥，如遇破皮創(chuàng)面仍需按以上方法濕敷；5、如遇陳舊潰瘍創(chuàng)面可用三至四層紗布濕敷，每日換紗布二至三次，并要保持敷料上的濕度；6、淺二度水泡一般不要刺破放水，直接用藥在創(chuàng)面。深二度水泡可適時(shí)適量放水，然后用藥在創(chuàng)面上。淺二度創(chuàng)面水腫消退后，形成的軟膜自然脫落，此時(shí)仍要繼續(xù)用藥，加快皮膚恢復(fù)正常。深二度創(chuàng)面有壞死組織，由表向里液化，其分泌物粘附在濕敷的紗布上，繼續(xù)用藥時(shí)，勿擦傷創(chuàng)面組織，并保持敷料上液體飽和。
7、三度燒傷的濕敷方法與深二度相同，但濕敷紗布不低于四層。小面積三度創(chuàng)面可自行濕敷愈合，大面積三度創(chuàng)面仍需助外科手術(shù)恢復(fù)(5)新用途驗(yàn)證亨通光華公司衛(wèi)生所公司技術(shù)科研制的神舟三號甘露聚糖肽噴霧劑對30例各種原因燒傷創(chuàng)面進(jìn)行了臨床療效觀察，取得了滿意的效果，報(bào)告如下臨床資料本組30例，其中男21例，女9例，年齡2歲-83歲。受傷距入院時(shí)間1小時(shí)至5天，平均1天，燒傷原因熱水燙傷15例，火焰燒傷13例，熱排水管燙傷2例。燒傷面積1％-10％18例，11％-20％10例，21％-44％2例，以2度燒傷為主，其中淺2度燒傷22例，深2度燒傷8例，伴有3度燒傷3例，3度燒傷平均面積2％-5％。
治療方法本組病例經(jīng)清洗后小水泡保留三天后處理，大水泡低位引流或用注射器吸干水泡液，去除部分腐皮，取燒傷液與消毒紗布混勻單層敷于創(chuàng)面，再將該液噴于創(chuàng)面上，新鮮創(chuàng)面每2-3小時(shí)噴一次，每天換藥一次，3天后改每天噴藥5-6次，保持紗布濕潤，5天后改為每天3-4次，直到至創(chuàng)面愈合，大面積燒傷除局部用藥外，應(yīng)常規(guī)輸液及靜滴抗菌素，休克期應(yīng)注意保溫。
權(quán)利要求
1.一種治療燒傷的藥物，其特征是它將α-溶血鏈球菌33號菌種搭載往返式太空飛行器，在太空的特殊條件下導(dǎo)致α-溶血鏈球菌33號菌種遺傳性質(zhì)發(fā)生變異，優(yōu)選出其中的正變異、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的菌種，經(jīng)培育發(fā)酵后生產(chǎn)成治療燒傷的生化藥劑，該菌種經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.1082。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療燒傷的藥物，其特征是所述的治療燒傷的生化藥劑是噴霧劑，1000ml中含太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽0.5g-10.0g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療燒傷的藥物，其特征是所述的噴霧劑是以α-溶血鏈球菌33號菌種搭載、變異、優(yōu)選后的菌種，經(jīng)培育發(fā)酵生產(chǎn)的甘露聚糖肽，加入其它輔料和溶劑制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療燒傷的藥物，其特征是所述的輔料是防腐劑、或苯甲醇、或硫柳汞、或三氯叔丁醇、或?qū)αu基苯甲酸酯類。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療燒傷的藥物，其特征是所述的溶劑是水或甘油、或丙二醇、或聚乙二醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療燒傷的藥物，其特征是所述治療燒傷藥物的制備方法是；①優(yōu)選α-溶血性鏈球菌33菌種進(jìn)行太空搭載，經(jīng)過太空誘變精心選育的α-溶血性鏈球菌33號菌珠作為生產(chǎn)菌種制備；經(jīng)一級發(fā)酵和二級發(fā)酵，將發(fā)酵液提純，最終生產(chǎn)出太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽.②以甘露聚糖肽為原料加入輔料及適當(dāng)溶劑配制成噴霧劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種治療燒傷的藥物，其特征是所述的菌種制備；A.斜面種子培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化鈉0.2-0.6％，瓊脂1-5％，綿羊血5-10％；pH7.2-7.4；斜面種子培養(yǎng)基滅菌溫度105-125℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.14Mpa；啟封菌種冷凍管，用無菌肉湯培養(yǎng)基稀釋，在無菌條件下接入血斜面，接種后置25-40℃恒溫培養(yǎng)24-30小時(shí)；B.肉湯種子培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化鈉0.2-0.6％；pH7.0-7.4；肉湯種子培養(yǎng)基滅菌溫度105-125℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.14Mpa；將培養(yǎng)好的斜面菌種在無菌條件下按1-9％接種量接入肉湯種子培養(yǎng)基內(nèi)，25-40℃恒溫培養(yǎng)10-30小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種治療燒傷的藥物，其特征是所述的發(fā)酵過程；用發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.9％，氯化鈉0.2-0.6％；發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌溫度105-125℃，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.11-0.14Mpa；A.一級種子罐將優(yōu)良的肉湯菌種在無菌條件下按1-10％接種量接入一級種子罐，在25-40℃恒溫培養(yǎng)10-50小時(shí)；罐壓不超過0.02Mpa，通氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，連續(xù)充分?jǐn)嚢?；B.二級發(fā)酵罐將一級發(fā)酵培養(yǎng)液在無菌條件下按2-20％接種量接入發(fā)酵罐，在25-40℃恒溫培養(yǎng)20-100小時(shí)，罐壓不超過0.02Mpa；滅活放罐，滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達(dá)到70-120℃，保溫20-60分鐘，冷卻靜置。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種治療燒傷的藥物，其特征是所述的提取過程；a、發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，使?jié)饪s液體積與發(fā)酵液體積比控制在1∶15-1∶20或酌情而定；b、發(fā)酵液的濃縮液加入80-99％乙醇，體積量比控制在1∶1.5-1∶5.5或酌情而定；充分?jǐn)嚢桁o置后，離心去除上清液，沉淀用蒸餾水溶解，調(diào)pH1.0-5.0，得到溶解液并將溶解液靜置。c、再將溶解液離心去除雜質(zhì)得到上清液。準(zhǔn)確量取上清液體積，按上清液體積計(jì)算出所需乙醇量，將乙醇緩慢加入到上清液中，并充分?jǐn)嚢?，靜置后離心去除上清液得到沉淀物；d、沉淀物再用蒸餾水溶解，調(diào)pH，離心。上清液再加乙醇沉淀。這樣的工藝反復(fù)操作至含量檢測合格為止，得到的沉淀物為太空誘變菌種所生產(chǎn)的甘露聚糖肽粗品；真空干燥3-8小時(shí)即得太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療燒傷的藥物，其特征是它將α－溶血鏈球菌33號菌種搭載往返式太空飛行器，在太空的特殊條件下導(dǎo)致α－溶血鏈球菌33號菌種遺傳性質(zhì)發(fā)生變異，優(yōu)選出其中的正變異、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的菌種，經(jīng)培育發(fā)酵后生產(chǎn)成治療燒傷的生化藥劑，該菌種經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.1082。所述的治療燒傷的生化藥劑是噴霧劑，1000ml中含太空誘變菌種生產(chǎn)的甘露聚糖肽0.5g－10.0g。這種治療燒傷的噴霧劑，它采用生化噴霧劑治療燒傷，具有無毒，副作用小，有效率高，瘢痕小的特點(diǎn)。
文檔編號A61K38/16GK1634563SQ20031012225
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者趙恒 , 劉恒 申請人:趙恒