專利名稱：一種裂解病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種裂解病毒的方法，更具體地說(shuō)，涉及一種用超臨界流體萃取技術(shù)裂解具有脂膜或類脂膜病毒的方法。
背景技術(shù)：
具有脂膜或類脂膜的病毒存在以下共性①脂膜和類脂膜對(duì)病毒具有保護(hù)性，脂膜和類脂膜被破壞后將導(dǎo)致病毒喪失活性和感染性；②脂膜和類脂膜上均嵌有病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白對(duì)維持病毒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及病毒感染生物機(jī)體使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體具有重要的生物學(xué)意義；③使用可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的病毒蛋白，可以制備用于預(yù)防該病毒引起感染的裂解疫苗或亞單位疫苗。
目前，具有脂膜或類脂膜病毒的裂解主要采用廣泛用于醫(yī)藥衛(wèi)生工業(yè)的裂解劑，這些裂解劑有表面活性劑、去污劑以及有機(jī)溶劑，例如吐溫-80、Triton系列、脫氧膽酸鈉、乙醚等。使用這些裂解劑破壞病毒的脂膜或類脂膜后，使其上的蛋白或包裹的蛋白處于溶解狀態(tài)，經(jīng)過(guò)純化，用于其功能的研究和應(yīng)用。以流感疫苗為例，在裂解疫苗的制備過(guò)程中，加入裂解劑將經(jīng)過(guò)純化的病毒裂解，使血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)兩種抗原處于溶解狀態(tài)后再純化，然后還要經(jīng)過(guò)去除裂解劑的工序，以及對(duì)去除的效果進(jìn)行驗(yàn)證后，才能制成安全的疫苗。
這些表面活性劑、去污劑以及有機(jī)溶劑的使用給操作者帶來(lái)人體危害，尤其在裂解疫苗工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，裂解劑的大量使用對(duì)環(huán)境造成極大污染。另外，去除殘留裂解劑的工序使工藝過(guò)程變得繁雜，如果這些溶劑(和試劑)有殘存，就會(huì)對(duì)后續(xù)的研究工作產(chǎn)生影響，尤其對(duì)于制成供人體直接使用的裂解疫苗或亞單位疫苗，即使裂解劑有微量的殘存也將對(duì)使用者產(chǎn)生潛在的危害。
另外，由于使用裂解劑裂解病毒的過(guò)程是一個(gè)漸變的過(guò)程，裂解劑隨機(jī)地破壞病毒脂膜或類脂膜的部分區(qū)域，使脂膜或類脂膜發(fā)生破裂，形成帶有缺口的半裂解病毒(見(jiàn)圖2中標(biāo)號(hào)2)，只有部分血凝素從病毒表面脫落，因此裂解過(guò)程終止后，通過(guò)電鏡仍然會(huì)觀察到完整病毒顆粒的存在(見(jiàn)圖2中標(biāo)號(hào)1)，所以其裂解并不是完全充分和均勻的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中大量使用具有一定毒性的化學(xué)裂解劑，造成對(duì)環(huán)境的污染和人體的危害，以及裂解效果不佳致使有效物質(zhì)不能完全獲取的問(wèn)題，提供了應(yīng)用超臨界流體萃取技術(shù)裂解病毒的方法。
本方法是利用某些處于超臨界狀態(tài)下的流體裂解具有脂膜或類脂膜的病毒。具體的做法是將病毒置于帶有通氣管路的密封良好的容器中，通入處于超臨界狀態(tài)下的流體，保持一定時(shí)間后，再將該流體導(dǎo)出，完成裂解。
本發(fā)明使用的超臨界流體一般是在常溫常壓條件下為氣體的流體，在本發(fā)明中，用于裂解病毒時(shí)，使該流體的溫度和壓力都處于高于其臨界溫度和臨界壓力的超臨界狀態(tài)下。這種處于超臨界狀態(tài)下的流體具有液體的溶解度、氣體的流動(dòng)性和介于兩者之間的粘性，在臨界點(diǎn)附近，壓力微小的變化就會(huì)導(dǎo)致體積很大的變化，所產(chǎn)生的能量很大，能夠使病毒的脂膜或類脂膜被均一地完全破壞，血凝素從病毒表面完全脫落而使病毒完全裂解。
對(duì)于適用于本發(fā)明的超臨界流體沒(méi)有特別限制，只要該流體的臨界溫度不使病毒變性、活性物質(zhì)不被破壞即可；臨界壓力只要是容器能夠耐受的壓力即可。例如，這樣的流體可以是二氧化碳(CO2)、氮(N2)、一氧化二氮(N2O)、氧(O2)等。其中，臨界點(diǎn)時(shí)溫度為31.1℃，臨界壓力為7.32Mpa的二氧化碳和臨界點(diǎn)時(shí)溫度為-147.1℃，臨界壓力為3.35Mpa的氮其臨界條件容易達(dá)到，且本身化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定并且容易獲得，所以優(yōu)選使用這兩種氣體。另外，由于二氧化碳的臨界溫度最接近一般病毒裂解的最佳溫度，而且來(lái)源豐富、價(jià)格便宜、無(wú)爆炸性、無(wú)污染而特別適宜于裂解病毒。
同時(shí)，處于超臨界狀態(tài)下的流體對(duì)病毒表面的脂膜和類脂膜還具有萃取的作用，通過(guò)該作用能夠破壞病毒表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)，造成病毒表面的某些位置產(chǎn)生結(jié)構(gòu)缺陷，從而使膜上物質(zhì)和內(nèi)容物脫離病毒，有助于實(shí)現(xiàn)良好的裂解效果。
作為具有脂膜或類脂膜的病毒可以列舉出正粘病毒科病毒(Orthomyxoviridae)、彈狀病毒科病毒(Rhabdoviridaes)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)的漢坦病毒屬(Hantavirus)、風(fēng)疹病毒(rubella virus)、副粘病毒科病毒、披膜病毒科的甲病毒屬、乙型腦炎病毒(又稱日本腦炎病毒)、登革病毒、丙型肝炎病毒等。其中，正粘病毒科病毒例如有流行性感冒病毒甲1型、甲3型和乙型等各亞型；彈狀病毒科病毒例如有狂犬病病毒屬的狂犬病病毒等；布尼亞病毒科(Bunyaviridae)的漢坦病毒屬例如有腎綜合征出血熱病毒等和它們的不同血清型；副粘病毒科病毒例如有人類呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒等。
本發(fā)明采用的超臨界流體萃取技術(shù)為物理方法，完全能夠替代現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)試劑裂解病毒，并且采用本發(fā)明的方法，由于脂膜或類脂膜被均一地完全破壞，血凝素和神經(jīng)氨酸酶從病毒表面完全脫落，從而提高了病毒的裂解效果。
另外，由于裂解過(guò)程中避免使用了化學(xué)試劑，所用的超臨界流體在完成裂解后易于從體系中除去，并可以循環(huán)使用，因此大大減少了對(duì)環(huán)境造成的不良影響。
再有，在利用裂解后的病毒的有效成分制成疫苗時(shí)，采用本發(fā)明的方法由于超臨界流體無(wú)殘留，得到的疫苗純度很高，不會(huì)對(duì)使用者產(chǎn)生潛在危害，因此疫苗的安全性大大提高。


圖1為全病毒的透視電鏡照片；圖2為利用化學(xué)試劑裂解病毒顆粒后觀察到的透視電鏡照片；圖3為按實(shí)施例1的方法裂解甲1型流感病毒后觀察到的透視電鏡照片；圖4為按實(shí)施例2的方法裂解甲3型流感病毒后觀察到的透視電鏡照片；圖5為按實(shí)施例3的方法裂解乙型流感病毒后觀察到的透視電鏡照片；
圖6為按實(shí)施例4的方法裂解乙型流感病毒后觀察到的透視電鏡照片；圖7為按實(shí)施例1～4的方法裂解的病毒和使用化學(xué)裂解劑裂解相應(yīng)病毒的蛋白電泳照片。
具體實(shí)施例方式
流行性感冒病毒屬于正粘病毒科，其外殼為類脂膜，膜上有可以產(chǎn)生中和抗體的血凝素蛋白和對(duì)預(yù)防流行性感冒病毒具有一定意義的神經(jīng)氨酸酶，在具有脂膜或類脂膜病毒中具有一定的代表性，所以選取不同亞型的流感病毒，即甲1、甲3及乙型流感病毒，采用超臨界萃取技術(shù)進(jìn)行裂解，進(jìn)而具體說(shuō)明本發(fā)明。
病毒的預(yù)處理分別取甲1、甲3及乙型流感病毒接種于9-11日齡的清潔級(jí)(SPF)雞胚，48小時(shí)(乙型為72小時(shí))后冷胚，收集尿囊液，向其中加入甲醛，使甲醛的終濃度達(dá)到0.03～0.05g/100ml(W/V)，放置10天，或者向其中加入β-丙內(nèi)酯，使β-丙內(nèi)酯的終濃度為1∶4000-1∶2000(V/V)，放置24小時(shí)使病毒滅活，再放置7天使β-丙內(nèi)酯水解，上述放置條件為2～8℃。滅活后使用超濾的方法進(jìn)行濃縮，使用分子篩凝膠過(guò)濾的方法進(jìn)行純化，將純化后的滅活病毒濃縮，濃縮后病毒的血凝效價(jià)為1∶10000到1∶100000以上，選取適量病毒濃縮液進(jìn)行以下裂解試驗(yàn)。
以二氧化碳作流體為例，其裂解病毒的具體過(guò)程為1.將上述純化濃縮的病毒裝入潔凈的超臨界萃取儀的萃取釜內(nèi)，將萃取釜密閉。
2.通入CO2，將萃取釜內(nèi)CO2的溫度調(diào)節(jié)為31.1～75℃、壓力為7.32～110Mpa的狀態(tài)，維持此狀態(tài)2～30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
3.裂解完成后，關(guān)閉進(jìn)氣閥門，從萃取釜導(dǎo)出裂解的病毒，收集排出的液體，即獲得裂解的流感病毒。
上述超臨界萃取釜內(nèi)溫度調(diào)節(jié)原則是當(dāng)萃取釜內(nèi)的壓力在臨界壓力以上時(shí)，溫度的提高有利于病毒表面的脂膜和類脂膜在流體中溶解度的提高，有利于均勻快速的裂解。但由于病毒對(duì)熱的不穩(wěn)定性，當(dāng)溫度超過(guò)75℃時(shí)，病毒就會(huì)被破壞，會(huì)影響其抗原性，因此萃取釜內(nèi)的溫度應(yīng)控制在75℃以內(nèi)。
當(dāng)超臨界流體為CO2時(shí)，適用的溫度范圍為31.1～75℃，適宜的壓力范圍為7.32～110Mpa，溫度范圍較佳為32～38℃，壓力范圍較佳為7.5～50Mpa。當(dāng)超臨界流體為N2時(shí)，適用的溫度范圍為-147.1～75℃，適宜的壓力范圍為3.35～110Mpa。當(dāng)超臨界流體為N2O時(shí)，適用的溫度范圍為36.5～75℃，適宜的壓力范圍為7.2～110Mpa。
對(duì)裂解的時(shí)間沒(méi)有特殊的限制，以達(dá)到裂解為目的，通常為2～30分鐘。延長(zhǎng)裂解時(shí)間，并不會(huì)進(jìn)一步增加裂解效果，因此實(shí)際操作中可盡量減少裂解的時(shí)間，以便提高生產(chǎn)效率，較佳裂解時(shí)間為2～10分鐘。
裂解后取樣，通過(guò)電鏡觀察病毒形態(tài)以驗(yàn)證裂解效果。
實(shí)施例1甲1型流行性感冒病毒(A/New Caledonia/20/99(H1N1))的裂解取來(lái)源于世界衛(wèi)生組織(WHO)的甲1型流行性感冒病毒(A/NewCaledonia/20/99(H1N1))接種于9-11日齡的清潔級(jí)(SPF)雞胚，按上述的病毒預(yù)處理方法，進(jìn)行預(yù)處理，制備成血凝效價(jià)為1∶51200的病毒液。取200ml該病毒液將其置于潔凈的超臨界萃取儀(南通華安超臨界萃取設(shè)備有限公司，超臨界CO2萃取儀)的萃取釜內(nèi)，通入二氧化碳，控制溫度為32℃，壓力為25MPa，保持該狀態(tài)2分鐘后，將壓力降至常壓，完成裂解。裂解后取樣通過(guò)電鏡觀察病毒形態(tài)以驗(yàn)證裂解效果。(結(jié)果見(jiàn)圖3)從圖3可見(jiàn)，超臨界流體裂解后的溶液中無(wú)完整的病毒顆粒存在，由于脂膜或類脂膜被均一完全地破壞，血凝素從病毒表面完全脫落，從而形成均勻的彌散狀態(tài)。完成了裂解操作的病毒液通過(guò)超速離心進(jìn)行純化，純化也可以采用柱層析的方法進(jìn)行。將純化后的樣品進(jìn)行稀釋，使稀釋后血凝素含量為32μg/ml，進(jìn)行效力實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果是接種小白鼠后產(chǎn)生50％中和抗體的效價(jià)為1∶640，達(dá)到疫苗要求的標(biāo)準(zhǔn)。該稀釋液分別接種小白鼠和豚鼠，接種后觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無(wú)任何異常表現(xiàn)。證明疫苗無(wú)異常毒性，并經(jīng)過(guò)敏原性實(shí)驗(yàn)證明該方法制備的疫苗中不存在過(guò)敏原。
實(shí)施例2甲3型流感病毒(A/Panama/2007/99(H3N2))將來(lái)源于世界衛(wèi)生組織(WHO)的甲3型流感病毒(A/Panama/2007/99(H3N2))按與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行預(yù)處理，制備成血凝效價(jià)為1∶51200的病毒液。取200ml該病毒液將其置于潔凈的超臨界萃取儀的萃取釜內(nèi)，通入二氧化碳，控制溫度為35℃，壓力為10MPa，保持該狀態(tài)4分鐘后，將壓力降至常壓，完成裂解。裂解后取樣通過(guò)電鏡觀察病毒形態(tài)以驗(yàn)證裂解效果。(結(jié)果見(jiàn)圖4)從圖4可見(jiàn)，超臨界流體裂解后的溶液中無(wú)完整的病毒顆粒存在，由于脂膜或類脂膜被均一完全地破壞，血凝素從病毒表面完全脫落，從而形成均勻的彌散狀態(tài)。完成了裂解操作的病毒液通過(guò)超速離心進(jìn)行純化，純化也可以采用柱層析的方法進(jìn)行。將純化后的樣品稀釋，稀釋后血凝素含量為31μg/ml，進(jìn)行效力實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果是接種小白鼠后產(chǎn)生50％中和抗體的效價(jià)為1∶480，達(dá)到疫苗要求的標(biāo)準(zhǔn)。該稀釋液分別接種小白鼠和豚鼠，接種后觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無(wú)任何異常表現(xiàn)。證明疫苗無(wú)異常毒性，并經(jīng)過(guò)敏原性實(shí)驗(yàn)證明該方法制備的疫苗中不存在過(guò)敏原。
實(shí)施例3乙型流感病毒(B/Johannesburg/5/99)將來(lái)源于世界衛(wèi)生組織(WHO)的乙型流感病毒(B/Johannesburg/5/99)按與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行預(yù)處理，制備成血凝效價(jià)為1∶51200的病毒液。取200ml該病毒液將其置于潔凈的超臨界萃取儀的萃取釜內(nèi)，通入二氧化碳，控制溫度為32℃，壓力為20MPa，保持該狀態(tài)10分鐘后，將壓力降至常壓，完成裂解。裂解后取樣通過(guò)電鏡觀察病毒形態(tài)以驗(yàn)證裂解效果。(結(jié)果見(jiàn)圖5)從圖5可見(jiàn)，超臨界流體裂解后的溶液中無(wú)完整的病毒顆粒存在，由于脂膜或類脂膜被均一完全地破壞，血凝素從病毒表面完全脫落，從而形成均勻的彌散狀態(tài)。完成了裂解操作的病毒液通過(guò)超速離心進(jìn)行純化，純化也可以采用柱層析的方法進(jìn)行。將純化后的樣品進(jìn)行稀釋，使稀釋后血凝素含量為34μg/ml，進(jìn)行效力實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果是接種小白鼠后產(chǎn)生50％中和抗體的效價(jià)為1∶640，達(dá)到疫苗要求的標(biāo)準(zhǔn)。該稀釋液分別接種小白鼠和豚鼠，接種后觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無(wú)任何異常表現(xiàn)。證明疫苗無(wú)異常毒性，并經(jīng)過(guò)敏原性實(shí)驗(yàn)證明該方法制備的疫苗中不存在過(guò)敏原。
實(shí)施例4乙型流感病毒(B/Shangdong/7/97)將來(lái)源于世界衛(wèi)生組織(WHO)的乙型流感病毒(B/Shangdong/7/97)按與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行預(yù)處理，制備成血凝效價(jià)為1∶51200的病毒液，取200ml該病毒液將其置于潔凈的超臨界萃取儀的萃取釜內(nèi)，通入二氧化碳，控制溫度為32℃，壓力為45MPa，保持該狀態(tài)20分鐘后，將壓力降至常壓，完成裂解。裂解后取樣通過(guò)電鏡觀察病毒形態(tài)以驗(yàn)證裂解效果。(結(jié)果見(jiàn)圖6)從圖6可見(jiàn)，超臨界流體裂解后的溶液中無(wú)完整的病毒顆粒存在，由于脂膜或類脂膜被均一完全地破壞，血凝素從病毒表面完全脫落，從而形成均勻的彌散狀態(tài)。完成了裂解操作的病毒液通過(guò)超速離心進(jìn)行純化，純化也可以采用柱層析的方法進(jìn)行。將純化后的樣品進(jìn)行稀釋，稀釋后血凝素含量為32μg/ml，進(jìn)行效力實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果是接種小白鼠后產(chǎn)生50％中和抗體的效價(jià)為1∶640，達(dá)到疫苗要求的標(biāo)準(zhǔn)。該稀釋液分別接種小白鼠和豚鼠，接種后觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無(wú)任何異常表現(xiàn)。證明疫苗無(wú)異常毒性，并經(jīng)過(guò)敏原性實(shí)驗(yàn)證明該方法制備的疫苗中不存在過(guò)敏原。
另外，為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明方法裂解病毒的效果，將實(shí)施例1～4裂解的病毒和使用化學(xué)裂解劑裂解的相應(yīng)的病毒一起做了蛋白電泳實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)圖7。圖中標(biāo)號(hào)1、2、3、4依次為實(shí)施例1～4分別裂解甲1、甲3、乙型病毒的兩個(gè)毒株后，再經(jīng)純化的樣品；5、6、7、8依次為用化學(xué)裂解劑裂解甲1、甲3、乙型病毒的兩個(gè)毒株后，再經(jīng)純化的樣品；9為標(biāo)記物的蛋白分子量，從標(biāo)號(hào)9原點(diǎn)處開(kāi)始，分子量依次為116KD、66.2KD、45KD、35KD、25KD、18.4KD和14.4KD。從圖7可看出，分子量為61KD的神經(jīng)氨酸酶和分子量為50KD的血凝素呈現(xiàn)清晰的兩條條帶，化學(xué)裂解劑裂解的樣品5～8與超臨界裂解的樣品1～4相比，多了小分子量的蛋白，同時(shí)還存在由于未完全裂解而殘存于類脂膜上的大分子量的蛋白。因此，采用本發(fā)明的方法裂解病毒，可以獲得蛋白成分更均一、純度更高、含量更高的血凝素和神經(jīng)氨酸酶。
權(quán)利要求
1.一種裂解病毒的方法，其特征在于，應(yīng)用超臨界流體萃取技術(shù)裂解具有脂膜或類脂膜的病毒。
2.權(quán)利要求1所述的裂解病毒的方法，其特征在于所述病毒為正粘病毒科病毒。
3.權(quán)利要求2所述的裂解病毒的方法，其特征在于所述正粘病毒科病毒為流行性感冒病毒。
4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述裂解病毒的方法，其特征在于超臨界流體為CO2，裂解溫度為31.1～75℃，裂解壓力為7.32～110Mpa。
5.權(quán)利要求4任一項(xiàng)所述裂解病毒的方法，其特征在于超臨界流體為CO2，裂解溫度為32～38℃，裂解壓力為7.5～50Mpa。
全文摘要
本發(fā)明提供一種裂解病毒的方法，更具體地說(shuō)，提供一種用超臨界流體萃取技術(shù)裂解具有脂膜或類脂膜病毒的方法。該方法是將病毒置于密封良好的容器中，通入處于超臨界狀態(tài)下的流體，保持一定時(shí)間后，即完成裂解。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，易放大，裂解效果好，無(wú)污染，產(chǎn)品無(wú)殘毒。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1546657SQ20031012135
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者于曉光 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春百龍生物技術(shù)有限公司