專利名稱：修飾的可溶性t細(xì)胞受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及識(shí)別CD1-抗原復(fù)合物、細(xì)菌超抗原和肽-MHC/超抗原復(fù)合物的可溶性T細(xì)胞受體(TCR)。
背景技術(shù)：
天然TCRs如在例如WO 99/60120中所描述的，TCR介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)特異性主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-肽復(fù)合物的識(shí)別，并且這是免疫系統(tǒng)細(xì)胞免疫的功能基礎(chǔ)。
抗體和TCR是僅有的兩種以特異方式識(shí)別抗原的分子，因而TCR是針對(duì)MHC所呈遞的具體抗原肽的僅有的受體，其中所述外源肽經(jīng)常是細(xì)胞內(nèi)異常的唯一征兆。T細(xì)胞識(shí)別在T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞(APC)直接物理接觸時(shí)發(fā)生，并由抗原特異性TCR與pMHC復(fù)合物的連接所啟動(dòng)。
天然TCR是與參與介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD3復(fù)合物的恒定的蛋白質(zhì)相連的免疫球蛋白超家族的異源二聚體細(xì)胞表面蛋白。TCR存在αβ和γδ形式，它們結(jié)構(gòu)類似但具有顯著不同的解剖學(xué)分布以及或許不同的功能。MHC I類和II類配體也是免疫球蛋白超家族蛋白質(zhì)但專門適用于抗原呈遞，它們具有能在APC細(xì)胞表面呈遞各種短肽片段的高度多態(tài)性的肽結(jié)合位點(diǎn)。
已知另外兩類蛋白質(zhì)能夠作為TCR配體發(fā)揮作用。(1)CD1抗原是MHC I類相關(guān)分子，其基因位于與經(jīng)典MHC I類和II類抗原不同的染色體上。CD1分子能以類似于常規(guī)的I類和II類MHC-肽復(fù)合物的方式向T細(xì)胞呈遞肽和非肽(例如脂質(zhì)、糖脂)部分。參見例如Barclay等，(1997)，《白細(xì)胞抗原概述》(The Leucocyte AntigenFactsbook)和Bauer(1997)Eur J Immunol 27(6)1366-1373。(2)細(xì)菌超抗原是能結(jié)合II類MHC分子和部分TCR的可溶性毒素(Fraser(1989)Nature 339 221-223)。許多超抗原對(duì)一個(gè)或兩個(gè)Vβ片段具有特異性，而其他的表現(xiàn)出更隨意的結(jié)合能力。在任何情況下，超抗原能夠通過其以多克隆形式刺激部分T細(xì)胞的能力引起增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
天然異源二聚αβTCR的胞外部分由兩個(gè)多肽構(gòu)成，每個(gè)具有近膜的恒定結(jié)構(gòu)域和遠(yuǎn)膜的可變結(jié)構(gòu)域(見

圖1)。每個(gè)恒定和可變結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵?？勺兘Y(jié)構(gòu)域包含類似于抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高度多態(tài)性的環(huán)。TCR的CDR3與MHC所呈遞的肽相互作用，并且CDR1和CDR2與所述肽和所述MHC相互作用。TCR序列的多樣性經(jīng)連鎖的可變區(qū)(V)、多樣區(qū)(D)、連接區(qū)(J)和恒定區(qū)(C)基因的體細(xì)胞重排產(chǎn)生。功能性α鏈多肽由重排的V-J-C區(qū)域形成，而β鏈由V-D-J-C區(qū)域構(gòu)成。胞外恒定結(jié)構(gòu)域具有近膜區(qū)域和一個(gè)免疫球蛋白區(qū)。存在稱為TRAC的單一的α鏈恒定結(jié)構(gòu)域和稱為TRBC1和TRBC2(IMGT命名法)的兩種不同的β恒定結(jié)構(gòu)域。這些β恒定結(jié)構(gòu)域之間存在4個(gè)氨基酸改變，其中3個(gè)在用于產(chǎn)生本發(fā)明所述的單鏈TCR的結(jié)構(gòu)域范圍內(nèi)。這些改變都在TRBC1和TRBC2的外顯子1范圍內(nèi)N4K5→K4N5和F37→Y(IMGT編號(hào)，TRBC1→TRBC2差異)，兩個(gè)TCRβ鏈恒定區(qū)之間最后一個(gè)氨基酸改變?cè)赥RBC1和TRBC2的外顯子3中V1→E。每種TCR胞外結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度稍有變化。然而，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用諸如《T細(xì)胞受體概述》(The T Cell Receptor Facts Book)，Lefranc& Lefranc，Publ.Academic Press 2001等參考可以容易地確定結(jié)構(gòu)域邊界的位置。
可溶性TCR可溶性TCR不僅可以用于研究特異性TCR-pMHC相互作用的目的，而且可能用作用于檢測(cè)感染或用于檢測(cè)自身免疫病標(biāo)記的診斷工具?？扇苄訲CR也可以應(yīng)用于染色，例如對(duì)細(xì)胞染色以說明在MHC背景下所呈遞的具體抗原肽的存在。類似地，可溶性TCR可以用于向呈遞特殊抗原的細(xì)胞遞送例如細(xì)胞毒化合物或免疫刺激化合物等治療性物質(zhì)?？扇苄訲CR也可以用于抑制那些例如與自身免疫抗原肽反應(yīng)的T細(xì)胞。
在許多情況下，由于蛋白質(zhì)通過其跨膜區(qū)得以穩(wěn)定，有一個(gè)以上多肽亞單位構(gòu)成并具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可能難以可溶形式進(jìn)行生產(chǎn)。對(duì)于TCR就是如此，并反應(yīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中，文獻(xiàn)描述了截短形式的TCR，它們包含能被TCR特異性抗體識(shí)別(這表明所述抗體所識(shí)別的重組TCR的所述部分已經(jīng)正確折疊)的或單獨(dú)胞外結(jié)構(gòu)域或胞外和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，但它們不能以令人滿意的得率進(jìn)行生產(chǎn)、在低濃度下不穩(wěn)定并且/或不能識(shí)別MHC-肽復(fù)合物。在WO 99/60120中回顧了這些文獻(xiàn)。
許多文獻(xiàn)描述了包含連接相應(yīng)亞單位的天然二硫橋的TCR異源二聚體的生產(chǎn)(Garboczi等，(1996)，Nature 384(6605)134-41；Garboczi等，(1996)，J Immunol157(12)5403-10；Chang等，(1994)，PNAS USA 9111408-11412；Davodeau等，(1993)，J.Biol.Chem.268(21)15455-15460；Golden等，(1997)，J.Imm.Meth.206163-169；美國(guó)專利No.6080840)。然而，雖然這樣的TCR可以被TCR特異性抗體所識(shí)別，它們只在相對(duì)高濃度下識(shí)別其天然配體并且/或是不穩(wěn)定的。
WO 99/60120中描述了一種正確折疊從而能識(shí)別其天然配體、在一段時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定的、并能以合理的數(shù)量進(jìn)行生產(chǎn)的可溶性TCR。這一TCR包含通過諸如亮氨酸拉鏈等一對(duì)C末端二聚肽分別與TCRβ或δ鏈胞外結(jié)構(gòu)域二聚化的TCRα或γ鏈胞外結(jié)構(gòu)域。這一生產(chǎn)TCR的策略通常適用于所有TCR。
Reiter等在Immunity，1995，2281-287中詳細(xì)描述了一種包含二硫鍵穩(wěn)定的其中之一與假單胞菌外毒素(PE38)截短形式相連的TCRα和β可變結(jié)構(gòu)域的可溶分子的構(gòu)建。生產(chǎn)這一分子的已說明的理由之一是克服單鏈TCR固有的不穩(wěn)定性。TCR可變結(jié)構(gòu)域中新的二硫鍵的位置通過與先前已作介紹的抗體可變結(jié)構(gòu)域的同源性進(jìn)行確定(例如參見Brinkmann等，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907538-7542，和Reiter等，(1994)Biochemistry 335451-5459)。然而，由于在抗體和TCR恒定結(jié)構(gòu)域之間沒有這樣的同源性，這樣的技術(shù)不能用于確定TCR恒定結(jié)構(gòu)域之間新的鏈間二硫鍵的適當(dāng)位置。
鑒于可溶性TCR的重要性，對(duì)于生產(chǎn)這樣的分子的其他方法會(huì)存在需求。尤其希望提供識(shí)別CD1-抗原復(fù)合物、細(xì)菌超抗原和肽-MHC/超抗原復(fù)合物的其他的可溶性TCR。本發(fā)明所述的TCR提供了能再多種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的穩(wěn)定的、可溶的多肽。出于經(jīng)濟(jì)原因尤其優(yōu)選細(xì)菌表達(dá)。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種可溶的T細(xì)胞受體(sTCR)，它包括(i)除了其跨膜結(jié)構(gòu)域的完整或部分TCRα鏈，以及(ii)除了其跨膜結(jié)構(gòu)域的完整或部分TCRβ鏈，其中(i)和(ii)各自包含一個(gè)功能性可變結(jié)構(gòu)域和至少一部分TCR鏈的恒定結(jié)構(gòu)域，并且通過天然TCR中不存在的恒定結(jié)構(gòu)域殘基之間的二硫鍵連接，其特征在于所述sTCR識(shí)別CD1-抗原復(fù)合物、細(xì)菌超抗原或肽-MHC/超抗原復(fù)合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種識(shí)別CD1-抗原復(fù)合物、細(xì)菌超抗原或肽-MHC/超抗原復(fù)合物的可溶αβ形式的T細(xì)胞受體(sTCR)，其中共價(jià)二硫鍵將α鏈恒定結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白區(qū)的一個(gè)殘基與β鏈恒定結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白區(qū)的一個(gè)殘基連接。
本發(fā)明所述sTCR具有不包含可能具有免疫原性或可能導(dǎo)致所述sTCR快速從體內(nèi)清除的異源多肽的優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明所述TCR具有與其來源的天然TCR高度類似的三維結(jié)構(gòu)，并且由于其結(jié)構(gòu)相似性，它們大概不具有免疫原性。
本發(fā)明所述的TCR是可溶的。在本申請(qǐng)的上下文中，溶解度被定義為TCR以1毫克/毫升的濃度在磷酸鹽緩沖液(PBS)(KCl 2.7mM，KH2PO41.5mM，NaCl 137mM和Na2PO48mM，pH7.1-7.5.Life Technologies，Gibco BRL)中作為單分散的異源二聚體得以純化并且90％以上所述TCR在25℃孵育1小時(shí)后保持單分散的異源二聚體形式的能力。為了評(píng)價(jià)TCR的溶解度，將其首先如實(shí)施例2中所述進(jìn)行純化。純化后，100微克TCR使用例如PBS平衡的Pharmacia Superdex 75 HR柱通過分析型尺寸排阻色譜進(jìn)行分析。另外100微克TCR 25℃孵育1小時(shí)隨后如前所述通過尺寸排阻色譜進(jìn)行分析。隨后通過積分分析尺寸排阻圖并比較對(duì)應(yīng)于單一分散的異源二聚體的峰面積。相應(yīng)的峰可以通過與已知分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫位置比較得以確定。所述單一分散的異源二聚可溶性TCR分子量約50kDa。如上所述，本發(fā)明所述TCR是可溶的。然而，如下更詳細(xì)所述，所述TCR可以與化學(xué)部分偶聯(lián)從而所得復(fù)合物是不可溶的，或它們可以存在于不溶的固體支持物的表面。
這里所使用的TCR氨基酸的編號(hào)遵循《T細(xì)胞受體概述》(T Cell ReceptorFactsbook)，2001，LeFranc & LeFranc，Academic Press中所述的IMGT系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，α鏈恒定結(jié)構(gòu)域具有以下表述TRAC*01，其中“TR”表示T細(xì)胞受體基因；“A”表示α鏈基因；C表示恒定區(qū)；以及“*01”表示等位基因1。β鏈恒定結(jié)構(gòu)域具有以下表述TRBC1*01。在這種情況下，存在兩種可能的恒定區(qū)基因“C1”和“C2”。每個(gè)等位基因編碼的翻譯的結(jié)構(gòu)域可以包括幾個(gè)外顯子的遺傳編碼；因此它們也是特異的。氨基酸按照其所在具體結(jié)構(gòu)域的外顯子進(jìn)行編號(hào)。
天然TCR的胞外部分包括兩條多肽(αβ或γδ)，其中每條具有近膜的恒定結(jié)構(gòu)域和遠(yuǎn)膜的可變結(jié)構(gòu)域(見圖1)。每個(gè)恒定和可變結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。可變結(jié)構(gòu)域包含類似于抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高度多態(tài)性環(huán)。TCR的CDR3與MHC所呈遞肽相互作用，并且CDR1和2與所述肽和MHC相互作用。TCR的多態(tài)性通過連鎖的可變區(qū)(V)、多態(tài)區(qū)(D)、連接區(qū)(J)和恒定基因的體細(xì)胞重排產(chǎn)生。功能性的α鏈多肽由重排的V-J-C區(qū)形成，而β鏈包括V-D-J-C區(qū)。胞外恒定結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)近膜區(qū)和一個(gè)免疫球蛋白區(qū)。所述近膜區(qū)包括跨膜結(jié)構(gòu)域和近膜半胱氨酸殘基之間的氨基酸。所述恒定的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括從近膜半胱氨酸延伸到連接區(qū)起始處的其余恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基，并具有存在免疫球蛋白類折疊的特點(diǎn)。存在稱為Cα1或TRAC*01的單一α鏈恒定結(jié)構(gòu)域和稱為Cβ1或TRBC1*01和Cβ2或TRBC2*01的兩種不同β恒定結(jié)構(gòu)域。這些不同的β恒定結(jié)構(gòu)域之間的差異體現(xiàn)在外顯子1的氨基酸殘基4、5和37。這樣，TRBC1*01在其外顯子1中含4N、5K和37，以及TRBC2*01在其外顯子1中含4K、5N和37Y。每種TCR胞外結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度稍有不同。
本發(fā)明中，在位于各自鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(或其部分)中的殘基之間引入了二硫鍵。TCR各自的鏈包含結(jié)合時(shí)足以能與其相應(yīng)TCR配體(CD1-抗原復(fù)合物、超抗原或超抗原/pMHC復(fù)合物)相互作用的部分。這樣的相互作用可以使用BIAcore 3000TM或BIAcore 2000TM儀器進(jìn)行測(cè)量。WO99/6120提供了對(duì)分析TCR與MHC-肽復(fù)合物所需方法的詳細(xì)描述并且這些方法同樣適用于TCR/CD1和TCR/超抗原的研究。為了使這些方法適用于TCR/CD1相互作用的研究，需要可溶形式的CD1，Bauer(1997)Eur JImmunol 27(6)1366-1373中對(duì)其生產(chǎn)進(jìn)行了描述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述sTCR各自的鏈也包含其鏈內(nèi)二硫鍵。本發(fā)明所述TCR可以包含所述各自完整的TCR鏈胞外恒定Ig區(qū)，以及優(yōu)選地所述各自鏈的完整的胞外結(jié)構(gòu)域，也就是說包含近膜區(qū)。在天然TCR中存在一個(gè)連接各自鏈的保守近膜區(qū)的二硫鍵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，不存在這一二硫鍵。這可以通過將適當(dāng)?shù)陌腚装彼釟埢?分別是TRAC*01基因外顯子2的氨基酸4以及TRBC1*01和TRBC2*01基因的氨基酸2)突變?yōu)槠渌被?、或截短各自鏈以排除所述半胱氨酸殘基得以?shí)現(xiàn)。如本發(fā)明所述的一種優(yōu)選的可溶性TCR包含C末端截短的天然α和βTCR鏈，從而使得形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基得以排除，即在所述半胱氨酸端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)殘基處截短。然而需要指出的是本發(fā)明所述TCR中可以存在鏈間二硫鍵，并且在某些實(shí)施方案中，僅有一條TCR鏈具有形成天然鏈間二硫鍵的天然半胱氨酸殘基。這一半胱氨酸可以用于TCR與化學(xué)部分的連接。
然而，TCR各自的鏈可以較短。由于恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與與肽/MHC配體的接觸，C末端截短位置可以充分改變而不會(huì)引起功能的丟失。
另外，可以存在比這里所優(yōu)選的更大的恒定結(jié)構(gòu)域片段，即恒定結(jié)構(gòu)域不需要在緊鄰形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸前截?cái)唷＠?，可以包含除跨膜結(jié)構(gòu)域的完整的恒定結(jié)構(gòu)域(即胞外和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。在這種情況下可以優(yōu)選將形成細(xì)胞TCR中鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基突變成不參與二硫鍵形成的其他氨基酸，或刪除一個(gè)或多個(gè)這些殘基。
由于其在TCR的配體結(jié)合能力成熟中沒有任何作用，并且在有些情況下可能妨礙功能性可溶性TCR的形成，如果可溶性TCR在例如大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)，可以去除信號(hào)肽。在多數(shù)情況下，從成熟TCR鏈中去除信號(hào)肽的切割位點(diǎn)是預(yù)測(cè)的而不是實(shí)驗(yàn)確定的。改造表達(dá)的TCR使其在N末端少或多一些氨基酸(例如10個(gè)以內(nèi))可能對(duì)可溶性TCR的功能(即識(shí)別CD1的能力)沒有顯著影響?？梢蕴砑釉嫉鞍仔蛄兄胁淮嬖诘哪承┨砑印＠?，如果其不影響TCR的抗原結(jié)合位點(diǎn)的正確結(jié)構(gòu)和折疊，可以添加有助于TCR純化的短的標(biāo)簽序列。
對(duì)于在大腸桿菌中表達(dá)，可以在預(yù)測(cè)的成熟蛋白序列的N末端起始點(diǎn)設(shè)計(jì)一個(gè)甲硫氨酸殘基以啟動(dòng)翻譯過程。
TCR鏈可變結(jié)構(gòu)域中許多殘基對(duì)于抗原特異性和功能性來說不是必需的。因此，在這一結(jié)構(gòu)域中可以引入多個(gè)突變而不影響抗原特異性和功能性。TCR鏈恒定結(jié)構(gòu)域中許多殘基對(duì)于抗原特異性和功能性來說不是必需的。因此，在這一結(jié)構(gòu)域中可以引入多個(gè)突變而不影響抗原特異性。
TCRβ鏈包含一個(gè)在細(xì)胞或天然TCR中不成對(duì)的半胱氨酸殘基。優(yōu)選去除這一半胱氨酸殘基或突變成其他殘基以避免錯(cuò)誤的鏈間或鏈內(nèi)配對(duì)。這一半胱氨酸殘基置換成例如絲氨酸或丙氨酸等其他殘基對(duì)于體外重折疊效率能夠具有顯著的促進(jìn)作用。
二硫鍵可以通過將各自鏈上的非半胱氨酸殘基突變成半胱氨酸并且引起突變殘基之間形成化學(xué)鍵的方式形成。優(yōu)選天然TCR中其各自的β碳原子相距約6(0.6nm)(優(yōu)選介于3.5(0.35nm)到5.9(0.59nm)區(qū)間)的殘基，這樣可以在替代天然殘基而引入的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。優(yōu)選所述二硫鍵位于恒定免疫球蛋白區(qū)的殘基之間，雖然可以位于近膜區(qū)的殘基之間?？梢砸氚腚装彼嵋孕纬啥蜴I的優(yōu)選位點(diǎn)是TCRα鏈TRAC*01的外顯子1中和TCRβ鏈的TRBC1*01或TRBC2*01中的以下殘基
本發(fā)明所述的一種sTCR源自A6 Tax TCR(Garboczi等，Nature，1996，384(6605)134-141)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述sTCR包括含外顯子2的N端、TRAC*01的殘基4(按照Garboczi等所使用的編號(hào)α鏈的氨基酸殘基1-182)的完整TCRα鏈和含外顯子2的N端、TRBC1*01和TRCB2*01的殘基2(按照Garboczi等所使用的編號(hào)β鏈的氨基酸殘基1-210)的完整TCRβ鏈。為了形成二硫鍵，TRAC*01中外顯子1的絲氨酸48(按照Garboczi等所使用的編號(hào)，α鏈的絲氨酸158)以及TRBC1*01和TRBC2*01中外顯子1的絲氨酸57(按照Garboczi等所使用的編號(hào)，β鏈的絲氨酸172)可以各自突變成半胱氨酸。這些氨基酸分別位于α和βTCR鏈恒定結(jié)構(gòu)域的β鉸鏈D中。
需要注意的是，在圖3a和3b中，殘基1(按照Garboczi等所使用的編號(hào))分別是K和N。N末端甲硫氨酸殘基在天然A6 Tax TCR中不存在，并且如上所述在相應(yīng)的鏈在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的情況下有時(shí)存在。
目前人TCR中可以突變成半胱氨酸殘基以形成新的鏈間二硫鍵的殘基已被鑒定，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠以相同方式對(duì)任何TCR進(jìn)行突變以產(chǎn)生具有新的鏈間二硫鍵的的該TCR的可溶形式。在人TCR中，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員只需要在相應(yīng)TCR鏈中尋找以下基序以鑒別需要突變的殘基(陰影中的殘基是突變成半胱氨酸的殘基)。
α鏈Thr 48DSDVYITDK VLDMRSMDFK(TRAC*01基因外顯子1的氨基酸39-58)(SEQ ID 1)α鏈Thr 45QSKDSDVYI DKTVLDMRSM(TRAC*01基因外顯子1的氨基酸36-55)(SEQ ID 2)α鏈Tyr 10DIQNPDPAV QLRDSKSSDK(TRAC*01基因外顯子1的氨基酸1-20)(SEQ ID 3)α鏈Ser 15DPAVYQLRD KSSDKSVCLF(TRAC*01基因外顯子1的氨基酸6-25)(SEQ ID 4)β鏈Ser 57NGKEVHSGV TDPQPLKEQP(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外顯子1的氨基酸48-67)(SEQ ID 5)β鏈Ser 77ALNDSRYAL SRLRVSATFW(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外顯子1的氨基酸68-87)(SEQ ID 6)β鏈Ser 17PPEVAVFEP EAEISHTOKA(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外顯子1的氨基酸8-27)(SEQ ID 7)β鏈Asp 59KEVHSGVST PQPLKEQPAL(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外顯子1的氨基酸50-69)(SEQ ID 8)β鏈Glu 15VFPPEVAVF PSEAEISHTQ(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外顯子1的氨基酸6-25)(SEQ ID 9)在其他物種中，TCR鏈可能不包含與以上基序100％相同的區(qū)域。然而，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠使用上述基序鑒別TCRα或β鏈的等價(jià)部分并從而確定突變成半胱氨酸的殘基。在這方面可以使用序列比對(duì)技術(shù)。例如，歐洲生物信息學(xué)研究所網(wǎng)站(http//www.ebi.ac.uk/index.html)所提供的ClustalW可以用于比較上述基序和具體TCR鏈序列以對(duì)用于突變的TCR序列的相應(yīng)部分加以定位。
本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括人的二硫鍵相連的αβTCR，以及其他哺乳動(dòng)物二硫鍵相連的αβTCR，這包括但不限于小鼠、大鼠、豬、山羊和綿羊。如上所述，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠確定與可以導(dǎo)入半胱氨酸殘基以形成鏈間二硫鍵的上述人的位點(diǎn)等同的位點(diǎn)。例如，下面展示了小鼠Cα和Cβ可溶結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，以及表示與上述能突變成半胱氨酸以形成TCR鏈間二硫鍵的人的殘基等同的基序(其中相應(yīng)殘基用陰影表示)小鼠Cα可溶結(jié)構(gòu)域PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVP(SEQ ID 10)小鼠Cβ可溶結(jié)構(gòu)域EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGREVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRAD(SEQ ID 11)人α鏈Thr 48的小鼠等價(jià)序列ESGTFITDK VLDMKAMDSK(SEQ ID 12)人α鏈Thr 45的小鼠等價(jià)序列KTMESGTFI DKTVLDMKAM(SEQ ID 13)人α鏈Tyr 10的小鼠等價(jià)序列YIQNPEPAV QLKDPRSQDS(SEQ ID 14)人α鏈Ser 15的小鼠等價(jià)序列AVYQLKDPR QDSTLCLFTD(SEQ ID 15)人β鏈Ser 57的小鼠等價(jià)序列NGREVHSGV TDPQAYKESN(SEO ID 16)人β鏈Ser 77的小鼠等價(jià)序列KESNYSYCL SRLRVSATFW(SEQ ID 17)人β鏈Ser 17的小鼠等價(jià)序列PPKVSLFEP KAEIANKQKA(SEQ ID 18)人β鏈Asp 59的小鼠等價(jià)序列REVHSGVST PQAYKESNYS(SEQ ID 19)人β鏈Glu 15的小鼠等價(jià)序列VTPPKVSLF PSKAEIANKQ(SEQ ID 20)在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TCR的(i)和(ii)各自包括與第二TCR的恒定結(jié)構(gòu)域的全部或部分融合的第一TCR的功能性可變結(jié)構(gòu)域，第一和第二TCR來自相同的物種并且鏈間二硫鍵位于所述天然TCR中不存在的相應(yīng)完整或部分恒定結(jié)構(gòu)域中的殘基之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二TCR是人源的。換言之，所述二硫鍵相連的恒定結(jié)構(gòu)域作為在這之上可以融合可變結(jié)構(gòu)域的框架。所獲得的TCR應(yīng)是從中獲得第一TCR的天然TCR充分相同的。這樣的系統(tǒng)使得在穩(wěn)定的恒定結(jié)構(gòu)域框架上方便地表達(dá)任何功能性可變結(jié)構(gòu)域成為可能。
上述A6 Tax sTCR的恒定結(jié)構(gòu)域，或甚至是任何具有上述新的鏈間二硫鍵的突變?chǔ)力耇CR的恒定結(jié)構(gòu)域可以用作在這之上可以融合異源可變結(jié)構(gòu)域的的框架。所述融合蛋白優(yōu)選地盡可能多地保持所述異源可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。因此，優(yōu)選所述異源可變結(jié)構(gòu)域與恒定結(jié)構(gòu)域在所引入的半胱氨酸殘基和恒定結(jié)構(gòu)域N端之間的任何位置進(jìn)行連接。對(duì)于A6 Tax TCR，在α和β鏈上所引入的半胱氨酸殘基優(yōu)選地分別位于TRAC*01外顯子1的蘇氨酸48(按照Garboczi等所使用的編號(hào)，α鏈的蘇氨酸158)以及TRBC1*01和TRBC2*01外顯子1的絲氨酸57(按照Garboczi等所使用的編號(hào)，β鏈的絲氨酸172)。因此，優(yōu)選異源α和β鏈可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)分別位于殘基48(按照Garboczi等所使用的編號(hào)159)或58(按照Garboczi等所使用的編號(hào)173)和α或β恒定結(jié)構(gòu)域N端之間。
異源α和β鏈恒定結(jié)構(gòu)域中對(duì)應(yīng)于A6 Tax TCR中結(jié)合位點(diǎn)的殘基可以通過序列同源進(jìn)行鑒別。所述融合蛋白優(yōu)選地構(gòu)建成在所述結(jié)合位點(diǎn)N端包含全部所述異源序列。
如以下更詳細(xì)的敘述，本發(fā)明所述sTCR在其C或N端可以與一化學(xué)部分衍生或與之融合。由于位于結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)側(cè)，優(yōu)選C末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，一條或兩條TCR鏈在其C和/或N末端都具有一個(gè)這樣的化學(xué)部分可以與之融合的半胱氨酸殘基。
可以以足夠純的形式或作為經(jīng)純化或分離的制劑形式提供本發(fā)明所述的可溶性TCR(優(yōu)選人的)。例如，可以以與其他蛋白質(zhì)充分分離的形式提供。
可以在多價(jià)復(fù)合物中提供多種本發(fā)明所述的可溶性TCR。因此，本發(fā)明在一個(gè)方面提供了一種多價(jià)T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合物，它包括多種如這里所述的可溶性T細(xì)胞受體。優(yōu)選地，多種可溶性TCR中的每一種是相同的。
另一方面，本發(fā)明的提供了一種用于檢測(cè)選自CD1-抗原、細(xì)菌超抗原和MHC-肽/超抗原復(fù)合物的TCR配體的方法，所述方法包括(i)提供如這里所述的可溶性T細(xì)胞受體或多價(jià)T細(xì)胞受體復(fù)合物；(ii)使所述可溶性T細(xì)胞受體或多價(jià)T細(xì)胞受體復(fù)合物與TCR配體接觸；以及(iii)檢測(cè)可溶性T細(xì)胞受體或多價(jià)T細(xì)胞受體復(fù)合物與TCR配體的結(jié)合。
在本發(fā)明所述的多價(jià)復(fù)合物中，TCR可以是多聚體的形式，并/或可以是存在于例如脂質(zhì)體等脂質(zhì)雙層之上或與之結(jié)合。
如本發(fā)明所述的多價(jià)TCR復(fù)合物的最簡(jiǎn)單的形式包括相互之間優(yōu)選地經(jīng)接頭分子相連(例如共價(jià)或其他方式相連)的2、3、4或更多T細(xì)胞受體分子的多聚體。合適的接頭分子包括但不限于諸如親和素、鏈親和素、中性鏈親和素(neutravidin)和extravidin等每個(gè)具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)結(jié)合分子。這樣，生物素化的TCR分子可以形成具有多個(gè)TCR結(jié)合位點(diǎn)的T細(xì)胞受體多聚體。多聚體中TCR分子的數(shù)量將取決于相對(duì)于用以產(chǎn)生多聚體的接頭分子數(shù)量的TCR數(shù)量，并且也取決于任何其他生物素化分子的存在與否。優(yōu)選的多聚體是二聚、三聚或四聚TCR復(fù)合物。
遠(yuǎn)大于TCR四聚體的結(jié)構(gòu)可以用于表達(dá)CD1-抗原復(fù)合物的示蹤或靶向。優(yōu)選的結(jié)構(gòu)介于10納米到10微米直徑范圍內(nèi)。每種結(jié)構(gòu)可以以充分間距排列多個(gè)TCR分子以使所述結(jié)構(gòu)上2個(gè)或更多TCR分子能同時(shí)結(jié)合細(xì)胞上2個(gè)或更多CD1-抗原復(fù)合物并因此提高多聚體結(jié)合部分對(duì)所述細(xì)胞的親合力。
用于本發(fā)明的合適的結(jié)構(gòu)包括諸如脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)和優(yōu)選諸如小珠等顆粒的固體結(jié)構(gòu)(例如乳膠珠)?？梢杂肨細(xì)胞受體分子在外包被的其他結(jié)構(gòu)也可適用。優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)是用T細(xì)胞受體多聚體而不是單一的T細(xì)胞受體分子包被的。
在使用脂質(zhì)體的情況下，T細(xì)胞受體分子或其多聚體可以附著或以其他方式與膜相連。這樣的技術(shù)對(duì)于精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。
本發(fā)明所述多價(jià)TCR復(fù)合物中可以包含諸如毒素或治療性部位的標(biāo)記或其他部分。例如，所述標(biāo)記或其他部分可以包含在混合分子多聚體中。這樣的多聚體分子的實(shí)例是含3個(gè)TCR分子和1個(gè)過氧化物酶分子的四聚體。這可以通過將TCR和酶按照3∶1的摩爾比混合以形成四聚化合物，并將所需復(fù)合物與任何不含正確分子比率的復(fù)合物分離得以實(shí)現(xiàn)。如果空間阻礙不影響或不顯著影響所述分子的所需功能，這些混合分子可能包含分子的任何組合。由于空間阻礙大概不會(huì)發(fā)生，鏈親和素分子上結(jié)合位點(diǎn)的分布適于混合分子。
其他生物素化TCR的方法也是可能的。例如，可以使用化學(xué)生物素化。雖然生物素標(biāo)簽序列中某些氨基酸是必需的，可以使用其他的生物素化標(biāo)簽(Schatz，(1993).Biotechnology N Y 11(10)1138-43)。用于生物素化的混合物也可以改變。酶需要Mg-ATP和低離子強(qiáng)度，雖然這兩個(gè)條件可以改變，例如，可能使用較高的離子強(qiáng)度和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間?？赡苁褂貌煌谟H和素或鏈親和素的其他分子以形成TCR的多聚體?？梢赃m用以多價(jià)形式結(jié)合生物素的任何分子。另外，可以設(shè)計(jì)完全不同的連接(諸如聚組氨酸標(biāo)簽與螯合的鎳離子(Quiagen產(chǎn)品指南，1999，第3章《蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、檢測(cè)與試驗(yàn)》(Protein Expression，Purification，Detection andAssay)第35-37頁))。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽位于蛋白質(zhì)的C末端從而將在與對(duì)應(yīng)的TCR配體相互作用中的空間阻礙最小化。
兩條TCR鏈或其中之一可以用例如適于診斷目的標(biāo)記物等可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記。這樣，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)選自CD1-抗原、細(xì)菌超抗原、和MHC-肽/超抗原復(fù)合物的TCR配體的方法，該方法包括TCR配體與如本發(fā)明所述的對(duì)所述TCR配體特異的TCR或多聚TCR復(fù)合物接觸；以及檢測(cè)TCR或多聚TCR復(fù)合物與TCR配體的結(jié)合。在使用生物素化異源二聚體形成的四聚TCR中，熒光鏈親和素(商業(yè)現(xiàn)貨)可以用于提供可檢測(cè)的標(biāo)記物。熒光標(biāo)記的四聚體適于在FACS分析中使用，例如用以檢測(cè)攜帶對(duì)所述TCR特異的肽的抗原呈遞細(xì)胞。
可以對(duì)本發(fā)明所述可溶性TCR進(jìn)行檢測(cè)的另一種方式是通過使用TCR特異性抗體，尤其是單克隆抗體。存在多種商業(yè)提供的諸如αFl和βFl等分別識(shí)別α和β鏈恒定區(qū)的抗TCR抗體。
本發(fā)明所述TCR(或其多價(jià)復(fù)合物)可以另外或此外與例如在細(xì)胞殺傷中使用的毒素部分或諸如白介素或細(xì)胞因子等免疫刺激劑等治療性物質(zhì)相連(例如共價(jià)或以其他方式相連)。本發(fā)明所述多價(jià)TCR復(fù)合物與非多聚T細(xì)胞受體異源二聚體相比對(duì)于TCR配體可以具有增強(qiáng)的結(jié)合能力。因此，本發(fā)明所述多價(jià)TCR復(fù)合物尤其可以用于對(duì)呈遞具體抗原的細(xì)胞的體內(nèi)或體外示蹤或靶向，并且也可以用作生產(chǎn)其他具有這樣用途的多價(jià)TCR復(fù)合物的中間體。因此所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物可以以體內(nèi)使用的藥學(xué)上可接受的配方提供。
本發(fā)明也提供了一種用于向靶細(xì)胞遞送治療性物質(zhì)的方法，該方法包括潛在的靶細(xì)胞與如本發(fā)明所述的TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物在允許所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物與靶細(xì)胞結(jié)合的條件下相接觸，其中所述TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物是對(duì)所述TCR復(fù)合物特異的并具有與之相連的治療性物質(zhì)。
所述可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物尤其可以用于向呈遞特定抗原的細(xì)胞的區(qū)域遞送治療劑。這可以用于多種情況，尤其是針對(duì)癌癥。治療劑可以這樣遞送使得它局部地而不是僅對(duì)其所結(jié)合的細(xì)胞發(fā)揮其功能。這樣，一種具體策略設(shè)計(jì)了與腫瘤抗原特異的T細(xì)胞受體或多價(jià)TCR復(fù)合物相連的抗腫瘤分子。
許多治療劑可以用于這一目的，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化療物質(zhì)(例如順鉑)。為確保毒性作用在所需區(qū)域發(fā)揮，毒素可以位于與鏈親和素相連的脂質(zhì)體中使得所述化合物緩慢釋放。這會(huì)防止體內(nèi)運(yùn)輸過程中的破壞作用并確保所述毒素在TCR與相應(yīng)抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合后具有最大作用。
其他適當(dāng)?shù)闹委焺┌āば》肿蛹?xì)胞毒物質(zhì)，即分子量小于700Da的具有殺傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力的化合物。這樣的化合物也可以包含具有細(xì)胞毒作用的有毒金屬。此外，需要理解，這些小分子細(xì)胞毒物質(zhì)也包括前藥，即在生理?xiàng)l件下降解或轉(zhuǎn)化以釋放細(xì)胞毒物質(zhì)的化合物。這樣的物質(zhì)的例子包括順鉑、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、多西他賽、依托泊甙、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、美法侖、米托蒽醌、sorfimer sodiumphotofrin II、替莫唑胺(temozolmide)、托泊替康、trimetreate、葡糖醛酸、auristatin E、長(zhǎng)春新堿和阿酶素；·肽細(xì)胞毒素，即具有殺傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力的蛋白質(zhì)或其片段。實(shí)例包括蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌細(xì)菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；·放射性核素，即隨著一種或多種α或β粒子或γ射線的同時(shí)發(fā)射而衰退的元素的不穩(wěn)定同位素。實(shí)例包括碘131、錸186、銦111、釔90、鉍210和213、錒225和砹213；·前藥，如抗體引導(dǎo)的前藥酶等；·免疫刺激劑，即刺激免疫反應(yīng)的化學(xué)成分。實(shí)例包括諸如IL-2的細(xì)胞因子，諸如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長(zhǎng)刺激蛋白等等趨化因子，諸如抗CD3抗體或其片段等抗體或其片段，補(bǔ)體激活因子、異種基因蛋白結(jié)構(gòu)域、同種基因蛋白結(jié)構(gòu)域、病毒/細(xì)菌蛋白結(jié)構(gòu)域以及病毒/細(xì)菌肽。
本發(fā)明所述的可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物可以與能將前藥轉(zhuǎn)化成藥物的酶相連。這使得前藥僅在其需要的位置轉(zhuǎn)化成藥物(即由sTCR靶向)。
通過使藥物由于可溶性TCR的特異性而局部化可以提高對(duì)多種疾病的治療。
例如HIV、SIV、EBV、CMV等有藥物存在的病毒疾病會(huì)受益于在受感染細(xì)胞周圍釋放或活化的藥物。對(duì)于癌癥來說，局限于腫瘤或轉(zhuǎn)移灶周圍會(huì)提高毒素或免疫刺激劑的作用。在自身免疫疾病中，免疫抑制藥物可以緩慢釋放，這在較長(zhǎng)的時(shí)間跨度上具有更局部的作用而對(duì)個(gè)體的整體免疫能力的影響降至最低。在防止移植排斥中，免疫抑制藥物的作用可以以相同方式加以優(yōu)化。對(duì)于疫苗遞送，疫苗抗原可以局限在抗原呈遞細(xì)胞的周圍，從而增強(qiáng)抗原的功效。所述方法也可以用于造影的目的。
本發(fā)明所述可溶性TCR可以通過與特異TCR配體結(jié)合并從而抑制T細(xì)胞活化而用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化。這一方法可以用于例如I型糖尿病等涉及T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和/或組織損傷的自身免疫疾病。為此需要有對(duì)相應(yīng)pMHC所呈遞的特異肽表位的知識(shí)。
也設(shè)計(jì)了本發(fā)明所述可溶性TCR和/或多價(jià)TCR復(fù)合物在制備用于治療癌癥或自身免疫疾病的組合物中的應(yīng)用。
也提供了一種治療癌癥或自身免疫病的方法，該方法包括對(duì)有此需要的患者使用有效量的如本發(fā)明所述的可溶性TCR和/或多價(jià)TCR復(fù)合物。
如在抗癌癥和自身免疫治療中所常見的，本發(fā)明的sTCR可以與其他用于癌癥和自身免疫病的治療的物質(zhì)以及在相似患者組中所發(fā)現(xiàn)的其他相關(guān)條件組合使用。
如本發(fā)明所述的藥劑通常應(yīng)作為無菌的、通常應(yīng)包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物的一部分進(jìn)行提供。這一藥物組合物可以是任何適當(dāng)形式的(取決于所需的對(duì)患者的給藥方法)。它可以以單位劑量的形式提供，通常應(yīng)在密封容器中提供并可以作為試劑盒的一部分提供。這樣的試劑盒通常應(yīng)(雖然不是必須的)包括使用說明書。它可以包括多種所述的單位劑量形式。
所述藥物組合物可以適用于通過任何適當(dāng)途徑的給藥，例如通過口腔(包括口腔和舌下)、直腸、鼻、局部(包括口腔、舌下或透皮)、陰道或注射(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))途徑。這樣的組合物可以通過藥劑學(xué)領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法進(jìn)行制備，例如通過在無菌條件下將活性成分與載體或賦形劑混合。
適用于口腔給藥的藥物組合物可以以諸如膠囊或藥片的分散單位；以粉末或顆粒；以溶液、糖漿或懸浮液(水性或非水性液體中的；或如可食用泡沫；或如乳劑)等形式提供。對(duì)于藥片或硬膠囊來說適當(dāng)?shù)馁x形劑包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其鹽。適用于軟膠囊的賦形劑包括例如植物油、蠟、脂肪、半固體或液體的多元醇等等。對(duì)于溶液和糖漿的制備，可以使用的賦形劑包括例如水、多元醇和糖。懸浮液的制備中油(例如植物油)可以用于提供水包油或油包水懸浮液。適用于透皮給藥的藥物組合物可以以計(jì)劃與受體上皮長(zhǎng)時(shí)間保持緊密接觸的分散的膏藥形式提供。例如，活性成分可以如Pharmaceutical Research，3(6)318(1986)中通常所述的經(jīng)離子滲透從膏藥進(jìn)行遞送。適用于局部給藥的藥物組合物可以配制成藥膏、乳膏、懸浮液、洗液、粉末、溶液、糊劑、膠體、噴劑、氣霧劑或油。對(duì)于眼睛或例如口腔和皮膚等其他外部組織的感染，所述組合物優(yōu)選使用局部用的藥膏或乳膏。在配制成藥膏的情況下，活性成分可以與含蠟或水混藥膏基質(zhì)使用。另外，活性成分可以與水包油乳膏基質(zhì)或油包水基質(zhì)配制成乳膏。適用于眼睛局部給藥的藥物組合物包括眼滴液，其中活性成分溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)妮d體(特別是水性溶劑)中。適用于口腔局部給藥的藥物組合物包括錠劑和漱口液。
適用于直腸給藥的藥物組合物可以栓劑或灌腸劑的形式提供。其中載體是固體的適用于鼻腔給藥的藥物組合物包括顆粒大小介于例如20到500微米的粗粉末，它以吸入方式給藥，即從將靠近鼻子的粉末容器中經(jīng)鼻腔快速吸入。其中載體是液體的、作為鼻噴劑或鼻滴劑給藥的藥物組合物包括活性成分的水或油溶液。適用于通過吸入給藥的藥物組合物包括可以通過多種類型的測(cè)定劑量增壓氣霧器、噴霧器或吹藥器等產(chǎn)生的細(xì)小顆粒粉塵或薄霧。適用于陰道給藥的藥物組合物可以以陰道栓劑、棉條、乳膏、膠體、糊劑、泡沫或噴霧劑型等形式提供。適用于注射給藥的藥物組合物包括可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得劑型與目標(biāo)受體的血液充分等壓的溶質(zhì)的水性或非水性無菌注射溶液；以及可以包含懸浮劑和增稠劑的水性或非水性無菌懸浮液。可以用于注射用溶液的賦形劑包括例如水、乙醇、多元醇、甘油和植物油。所述組合物可以在單位劑量或多劑量容器中提供，例如密封的安瓿和小瓶，并可以在冷凍干燥(凍干)條件下保存，在使用前僅需添加例如注射用水等無菌液體載體。即時(shí)注射溶液和懸浮液可以由無菌粉末、顆粒和藥片進(jìn)行制備。
藥物組合物可以包含防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、加濕劑、乳化劑、柔化劑、著色劑、著味劑、鹽(本發(fā)明所述物質(zhì)本身可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式提供)、緩沖液、包被劑或抗氧化劑。除了本發(fā)明所述物質(zhì)以外，它們也可以包含具有治療活性的物質(zhì)。
本發(fā)明所述物質(zhì)的劑量可以在寬泛的區(qū)間變動(dòng)，這取決于所治療的疾病或功能紊亂、所治療個(gè)體的年齡和狀況等等，并且醫(yī)師應(yīng)最終決定所使用的適當(dāng)劑量。所述劑量可以適當(dāng)?shù)亟?jīng)常重復(fù)。如果產(chǎn)生副作用，按照通常的臨床實(shí)踐可以降低劑量的數(shù)量和/或頻率。
基因克隆技術(shù)可以用于提供本發(fā)明所述的sTCR(優(yōu)選地以充分純的形式)。這些技術(shù)公開在例如Sambrook等的《分子克隆》(Molecular Cloning)，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)中。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種核酸分子，它包含編碼本發(fā)明所述可溶性TCR一條鏈的序列，或與其互補(bǔ)的序列。這樣的核酸序列可以通過從T細(xì)胞克隆中分離TCR編碼核酸并進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐蛔?通過插入、刪除或置換)獲得。
核酸分子可以是分離的或重組的。它可以與載體結(jié)合并所述載體可以組合進(jìn)宿主細(xì)胞。這樣的載體和適當(dāng)宿主形成了本發(fā)明的另一個(gè)方面。
本發(fā)明也提供了一種用于獲得TCR鏈的方法，該方法包括將這樣的宿主細(xì)胞在引起TCR鏈表達(dá)的條件下孵育并隨后純化所述多肽。
本發(fā)明所述可溶性TCR可以通過在例如大腸桿菌等細(xì)菌中以包含體形式表達(dá)和隨后的體外重折疊獲得。
TCR鏈的重折疊可以在適當(dāng)?shù)闹卣郫B條件下在體外進(jìn)行。在具體實(shí)施方案中，具有正確構(gòu)象的TCR通過在包含例如尿素的增溶劑的重折疊緩沖液中重折疊溶解的TCR鏈得以實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，尿素可以以至少0.1M或至少1M或至少2.5M或約5M的濃度存在。另一種可以使用的增溶劑是濃度介于0.1M和8M之間、優(yōu)選至少1M或至少2.5M的胍。重折疊之前，優(yōu)選地使用還原劑以確保半胱氨酸殘基的完全還原。此外可以按需要使用諸如DDT和胍等變性劑。重折疊步驟之前可以使用不同的變性劑和還原劑(例如尿素、β-巰基乙醇)。重折疊過程中可以使用另外的氧化還原對(duì)，諸如胱胺/半胱胺氧化還原對(duì)、DTT或β-巰基乙醇/大氣氧、以及還原和氧化形式的半胱氨酸。
折疊效率也可以通過向重折疊混合物添加某些其他蛋白質(zhì)成分(例如分子伴侶蛋白)加以提高。蛋白質(zhì)通過流經(jīng)固定化小分子伴侶的柱已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了重折疊的提高(Altamirano等，(1999).Nature Biotechnology 17187-191；Altamirano等，(1997).Proc Natl Acad Sci USA 94(8)3576-8)。
另外，本發(fā)明所述可溶性TCR可以通過在諸如昆蟲細(xì)胞的真核細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)獲得。例如未決申請(qǐng)(WO 03/020763)公開了本發(fā)明所述相同的基本設(shè)計(jì)的肽-MHC結(jié)合的可溶性TCR在酵母和昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)，并且預(yù)測(cè)了在大量其他原核或真核系統(tǒng)中的表達(dá)。因此，存在多種已用于膜結(jié)合TCR生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。例如，一項(xiàng)研究(Rubinstein(2003)J.Immunol 170(3)1209-1217)說明了體外逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的用編碼非天然膜結(jié)合TCR對(duì)成熟T細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)導(dǎo)，這導(dǎo)致產(chǎn)生了能夠特異性殺傷表達(dá)被導(dǎo)入的TCR所識(shí)別的pMHC復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞的T細(xì)胞。進(jìn)一步的研究(Pogulis(1998)Hum Gene Ther 9(15)2285-2297)使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)以用TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓細(xì)胞隨后導(dǎo)入小鼠并證明了導(dǎo)入的TCR的表達(dá)。
也設(shè)想了使用與先前對(duì)于抗體生產(chǎn)所證明的類似方法，本發(fā)明所述TCR可以表達(dá)在包括但不限于小鼠、大鼠、奶牛、綿羊和山羊等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中。例如Sola(1998)J Virol 72(5)3762-3772描述了將編碼嵌合抗體(IgA)的DNA導(dǎo)入小鼠并證明了可以產(chǎn)生能將導(dǎo)入的IgA分泌進(jìn)乳汁的小鼠。
表達(dá)的TCR的純化可以通過許多適用于所述TCR所表達(dá)的具體環(huán)境的不同的方法得以實(shí)現(xiàn)。可以使用離子交換或其他諸如凝膠過濾層析或親和層析等蛋白質(zhì)純化方式。
本發(fā)明所述的可溶性TCR和多價(jià)TCR復(fù)合物也可以用于篩選諸如小化合物等具有抑制TCR與其配體結(jié)合能力的物質(zhì)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種篩選抑制T細(xì)胞受體與選自CD1-抗原復(fù)合物、細(xì)菌超抗原和MHC-肽/超抗原復(fù)合物的TCR配體結(jié)合的物質(zhì)的方法，該方法包括在存在待測(cè)物質(zhì)的情況下監(jiān)測(cè)本發(fā)明所述可溶性TCR與TCR配體的結(jié)合；以及挑選抑制這樣的結(jié)合的物質(zhì)。
用于這種篩選方法的合適的技術(shù)包括WO 01/22084中所述的基于表面等離子共振的方法。可以作為這一篩選方法基礎(chǔ)的其他熟知的技術(shù)是閃爍接近分析(SPA)和增強(qiáng)型發(fā)光接近檢測(cè)。
通過本發(fā)明所述的篩選方法所選出的物質(zhì)可以用作藥物或藥物開發(fā)計(jì)劃的基礎(chǔ)，它經(jīng)過修飾或其他方式改進(jìn)以具有使其更適于作為藥物給藥的特征。這樣的藥物可以用于治療包括多余的T細(xì)胞反應(yīng)成分的病癥。這樣的病癥包括癌癥(例如直腸癌、卵巢癌、腸癌、頭頸癌、睪丸癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌或黑色素瘤)、自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主病。
本發(fā)明每個(gè)方面的優(yōu)選特點(diǎn)對(duì)于每個(gè)其他方面已作必要的修正。這里所提及的在先技術(shù)文獻(xiàn)按照法律允許的最完整范圍結(jié)合在本申請(qǐng)中。
實(shí)施例在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這不是以任何方式對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
下面參照附圖進(jìn)行說明，其中圖1是具有如本發(fā)明所述引入的鏈間二硫鍵的可溶性TCR的示意圖。
圖2a和2b分別顯示了一種突變以引入一個(gè)半胱氨酸密碼子的可溶的CD1結(jié)合TCR的α和β鏈的核酸序列。陰影表示所引入的半胱氨酸密碼子。
圖3a顯示了包括用于形成新的鏈間二硫鍵的T48→C突變(下劃線)的CD1結(jié)合TCRα鏈胞外氨基酸序列；圖3b顯示了包括用于形成新的鏈間二硫鍵的S57→C(下劃線)的CD1結(jié)合TCRβ鏈胞外氨基酸序列。
圖4是二硫鍵相連的CD1d結(jié)合可溶性TCR與可溶性CD1d特異性結(jié)合的BIAcore反應(yīng)曲線。
實(shí)施例1-引物設(shè)計(jì)以及CD1結(jié)合TCRα和β鏈的突變?yōu)榱藢RAC*01中外顯子1的CD1結(jié)合TCR蘇氨酸48突變成半胱氨酸，設(shè)計(jì)了以下引物(突變用小寫表示)5’-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT(SEQ ID 21)5’-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G(SEQ ID 22)為了將TRBC1*01和TRBC2*01中外顯子1的CD1結(jié)合TCR絲氨酸57突變成半胱氨酸，設(shè)計(jì)了以下引物(突變用小寫表示)5’-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC(SEQ ID 23)5’-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G(SEQ ID 24)PCR突變包含CD1結(jié)合TCR基因的表達(dá)質(zhì)粒獲自分離自CD1特異的CD1 T細(xì)胞克隆的cDNA。分別使用α鏈引物或β鏈引物按以下所述對(duì)TCRα或β鏈進(jìn)行突變。100納克質(zhì)粒與5微升10mM dNTP、25微升10×Pfu緩沖液(Stratagene)、10單位Pfu聚合酶(Stratagene)并用H2O將最終體積調(diào)節(jié)為240微升。48微升所述混合物用稀釋的引物補(bǔ)足，使50微升最終反應(yīng)體積的終濃度為0.2μM。最初的95℃30秒變性步驟后，反應(yīng)混合物在Hybaid PCR express PCR儀上進(jìn)行15輪變性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分鐘)。產(chǎn)物隨后用10單位的DpnI限制性酶(New England Biolabs)在37℃下消化5小時(shí)。10微升消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL1-Blue細(xì)菌并在37℃生長(zhǎng)18小時(shí)。挑取單菌落并在5毫升TYP+氨芐青霉素(16克/升細(xì)菌蛋白胨、16克/升酵母提取物、5克/升NaCl、2.5克/升K2HPO4、100毫克/升氨芐青霉素)生長(zhǎng)過夜。質(zhì)粒DNA按照生產(chǎn)商說明書在Qiagen mini-prep柱上純化并且通過在牛津大學(xué)生物化學(xué)系測(cè)序裝置上自動(dòng)測(cè)序確定其序列。α鏈的相應(yīng)的突變的核酸和氨基酸序列顯示在圖2a和3a中，β鏈的則顯示在圖2b和3b中。
實(shí)施例2-可溶性TCR的表達(dá)、重折疊和純化將分別含突變的α鏈和β鏈的表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21pLysS菌株，并在37℃下使氨芐青霉素抗性單菌落在TYP(100微克/毫升氨芐青霉素)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至OD600達(dá)到0.4，隨后用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)3小時(shí)后通過在BeckmanJ-6B中以4000rpm離心30分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀重懸在含50mM Tris-HCl、25％蔗糖(重量體積比)、1mM NaEDTA、0.1％(重量體積比)疊氮鈉、10mM DTT，pH8.0的緩沖液中。經(jīng)隔夜的冷凍-解凍步驟之后，在Milsonix XL2020超聲儀中使用標(biāo)準(zhǔn)的12毫米直徑探頭將重懸細(xì)胞以1分鐘短脈沖(burst)總共超聲約10分鐘。包含體沉淀通過在Beckman J2-21離心機(jī)上13000rpm離心30分鐘得以回收。隨后用去垢劑清洗3次以去除細(xì)胞碎片和膜組分。在Beckman J2-21中13000rpm離心15分鐘沉淀之前，每次包含體沉淀在Triton緩沖液(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(重量體積比)疊氮鈉、2mM DTT，pH8.0)中勻漿。最后將包含體分成30毫克試樣量并-70℃凍存。包含體蛋白質(zhì)得率通過用6M鹽酸胍溶解并用Bradford染料結(jié)合檢測(cè)(PerBio)測(cè)量進(jìn)行定量。
從凍存液解凍得到約120毫克(即4微摩爾)溶解的α鏈包含體以及30毫克(即1微摩爾)溶解的β鏈包含體，隨后混合樣品并將混合液稀釋到15毫升胍溶液(6M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mM EDTA)以確保鏈完全變性。隨后將含完全還原并變性的TCR鏈的胍溶液注入1升以下重折疊緩沖液中100mM Tris pH8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、5M尿素、0.2mM PMSF。該溶液靜置24小時(shí)。隨后將重折疊液透析兩次，首先用10升100mM尿素、隨后用10升100mM尿素、10mM Tris pH8.0。重折疊和透析步驟都在6-8℃進(jìn)行。
通過將透析的重折疊液加載于POROS 50HQ陰離子交換柱并使用Akta純化裝置(Pharmacia)用50個(gè)柱體積以上的0-500mM NaCl梯度吸脫結(jié)合的蛋白將sTCR與降解產(chǎn)物及雜質(zhì)分離。峰組分于4℃保存并在合并和濃縮之前用考馬斯染色SDS-PAGE分析。最后，sTCR使用HBS-EP緩沖液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mMEDTA、0.05％諾乃洗滌劑p40)預(yù)平衡的Superdex 200HR凝膠過濾柱進(jìn)行純化和特征描述。合并在相對(duì)分子量約50kDa處的洗脫峰并在通過BIAcore表面等離子共振分析進(jìn)行特征描述之前進(jìn)行濃縮。
實(shí)施例3-sTCR與CD1結(jié)合的BIAcore表面等離子共振分析使用表面等離子共振生物傳感器(BIAcore 3000TM)分析sTCR與其CD1配體的結(jié)合。如Bauer(1997)Eur J Immunol 27(6)1366-1373中所述，產(chǎn)生可溶性CD1復(fù)合物有助于這一分析，所述可溶性CD1復(fù)合物以半定向方式固定在鏈親和素包被的結(jié)合表面，這允許同時(shí)有效檢測(cè)可溶性T細(xì)胞受體與4個(gè)不同TCR配體(固定在各自的流動(dòng)池中)的結(jié)合。手工注射HLA復(fù)合物允許簡(jiǎn)單地操縱固定的TCR配體的精確水平。
如此固定的化合物能結(jié)合T細(xì)胞受體和共受體CD8αα，這兩者都可被注入可溶相中。甚至在低濃度(至少40微克/毫升)下獲得了TCR的特異結(jié)合，這說明TCR是相對(duì)穩(wěn)定的。如果在可溶相或固定相中使用sTCR，觀察到sTCR的CD1結(jié)合結(jié)合性質(zhì)在數(shù)量和質(zhì)量上是相似的。這是對(duì)可溶形式部分活性的重要對(duì)照并也說明生物素化的CD1復(fù)合物與非生物素化復(fù)合物具有同樣的生物學(xué)活性。
在BIAcore 3000TM表面等離子共振(SPR)生物感應(yīng)器上分析含新的鏈間鍵的CD1結(jié)合sTCR和可溶性CD1之間的相互作用。SPR測(cè)量用反應(yīng)單位(RU)表示的小流動(dòng)池內(nèi)感應(yīng)器表面附近折射系數(shù)的變化，這一原理能用于檢測(cè)受體配體相互作用以及分析其親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通過在單獨(dú)的流動(dòng)池中固定CD1復(fù)合物制備探針流動(dòng)池。隨后通過sTCR以恒定的流速流經(jīng)不同的流動(dòng)池表面進(jìn)行檢測(cè)，這樣測(cè)量了SPR反應(yīng)?？扇躶TCR以恒定流速注入并以不同濃度經(jīng)過可溶性CD1復(fù)合物用于定義背景共振。
獲得的CD1結(jié)合TCR和可溶性CD1之間相互作用的Kd值是6.0±0.3μM。
權(quán)利要求
1.一種可溶性T細(xì)胞受體(sTCR)，其包括(i)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，以及(ii)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈，其中，(i)和(ii)各自包含功能性可變結(jié)構(gòu)域和所述TCR鏈恒定結(jié)構(gòu)域的至少一部分，并且通過天然TCR中不存在的恒定結(jié)構(gòu)域殘基之間的二硫鍵相連接，其特征在于，所述sTCR識(shí)別CD1-抗原復(fù)合物、細(xì)菌超抗原或肽-MHC/超抗原復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的sTCR，其特征在于，(i)和(ii)之一或兩者包括所述TCR鏈的完整胞外恒定Ig結(jié)構(gòu)域。
3.如權(quán)利要求1或2所述的sTCR，其特征在于，(i)和(ii)之一或兩者包括所述TCR鏈的完整胞外結(jié)構(gòu)域。
4.一種可溶的αβ-形式的T細(xì)胞受體(sTCR)，其特征在于，一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接α鏈恒定結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白區(qū)域的一個(gè)殘基與β鏈恒定結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白區(qū)域的一個(gè)殘基。
5.如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR，其特征在于，鏈間二硫鍵在天然TCR中是不存在的。
6.如權(quán)利要求5所述的sTCR，其特征在于，天然α和βTCR鏈在C端截?cái)鄰亩懦诵纬商烊绘滈g二硫鍵的半胱氨酸殘基。
7.如權(quán)利要求5所述的sTCR，其特征在于，形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基被替換成其他殘基。
8.如權(quán)利要求7所述的sTCR，其特征在于，形成天然鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基被替換成絲氨酸或丙氨酸。
9.如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR，其特征在于，不存在存在于天然TCRβ鏈中的不成對(duì)的半胱氨酸殘基。
10.如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫鍵位于替代天然TCR結(jié)構(gòu)中其β碳原子相距小于0.6納米的殘基的半胱氨酸殘基之間。
11.如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫鍵位于替代TRAC*01外顯子1的Thr 48和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 57的半胱氨酸殘基之間。
12.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫鍵位于替代TRAC*01外顯子1的Thr 45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 77的半胱氨酸殘基之間。
13.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫鍵位于替代TRAC*01外顯子1的Tyr 10和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser 17的半胱氨酸殘基之間。
14.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫鍵位于替代TRAC*01外顯子1的Thr 45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Asp 59的半胱氨酸殘基之間。
15.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫鍵位于替代TRAC*01外顯子1的Ser 15和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu 15的半胱氨酸殘基之間。
16.如權(quán)利要求1、2和5-15中任一項(xiàng)所述的sTCR，其特征在于，(i)和(ii)各自包含與第二TCR全部或部分恒定結(jié)構(gòu)域融合的第一TCR的功能性可變結(jié)構(gòu)域，所述第一和第二TCR來自相同物種。
17.如權(quán)利要求16所述的sTCR，其特征在于，所述第二TCR的恒定結(jié)構(gòu)域在形成非天然鏈間二硫鍵的殘基的N端截?cái)唷?br> 18.如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR，其特征在于，所述鏈之一或兩者在其C或N端與一化學(xué)部分衍生或與之融合。
19.如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR，其特征在于，所述鏈之一或兩者在其C和/或N端具有化學(xué)部分可以與之融合的半胱氨酸殘基。
20.如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR，其特征在于，所述sTCR進(jìn)一步包括可檢測(cè)的標(biāo)記物。
21.如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR，其特征在于，所述sTCR與治療劑相連。
22.一種多價(jià)T細(xì)胞受體(TCR)復(fù)合物，所述復(fù)合物包含多個(gè)如上述任一權(quán)利要求所述的sTCR。
23.如權(quán)利要求22所述的復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物包含sTCR多聚體。
24.如權(quán)利要求23所述的復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物包含優(yōu)選經(jīng)接頭分子相互連接的2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多T細(xì)胞受體分子。
25.如權(quán)利要求22、23或24所述的復(fù)合物，其特征在于，所述sTCR或sTCR多聚體存在于脂質(zhì)雙層中或與顆粒相連。
26.一種用于檢測(cè)選自CD1-抗原復(fù)合物、細(xì)菌超抗原或肽-MHC/超抗原復(fù)合物的TCR配體的方法，其特征在于，所述方法包括(i)提供如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的可溶性TCR或如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的多價(jià)T細(xì)胞受體復(fù)合物；(ii)使所述可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物與TCR配體接觸；以及(iii)檢測(cè)可溶性TCR或多價(jià)TCR復(fù)合物與TCR配體的結(jié)合。
27.一種藥物制劑，所述藥物制劑包含如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的sTCR和/或如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的多價(jià)TCR復(fù)合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
28.一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述sTCR的(i)或(ii)的序列或其互補(bǔ)序列。
29.一種載體，所述載體包含如權(quán)利要求28所述的核酸分子。
30.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如權(quán)利要求29所述的載體。
31.一種用于獲得如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所定義的(i)或(ii)的方法，其特征在于，所述方法包括在造成所述肽表達(dá)的條件下孵育如權(quán)利要求30所述的宿主細(xì)胞，然后純化所述多肽。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括在適當(dāng)?shù)闹卣郫B條件下混合(i)和(ii)。
33.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的sTCR和/或如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的多價(jià)TCR復(fù)合物在制備用于治療癌癥或自身免疫病的組合物中的應(yīng)用。
34.一種治療癌癥或自身免疫病的方法，所述方法給予有此需要的患者有效量的如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的sTCR和/或如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的多價(jià)TCR復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可溶性T細(xì)胞受體(sTCR)，它包括(i)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRα鏈，以及(ii)除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRβ鏈。(i)和(ii)各自包含所述TCR鏈的功能性可變結(jié)構(gòu)域以及至少一部分恒定結(jié)構(gòu)域，并且通過天然TCR中不存在的位于恒定結(jié)構(gòu)域殘基之間的二硫鍵相連，其特征在于，所述sTCR識(shí)別CD1－抗原復(fù)合物、細(xì)菌超抗原或肽－MHC/超抗原復(fù)合物。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1745099SQ03826014
公開日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2003年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月22日
發(fā)明者B·雅各布森, M·格利克 申請(qǐng)人:阿維德克斯有限公司