專利名稱：使用全葡聚糖顆粒和抗體治療癌癥的方法
相關(guān)申請本申請要求60/408,126號美國臨時申請的權(quán)益，60/408,126號美國臨時申請于2002年9月4日提交，該臨時申請的全文在此通過引證被并入本文。
政府支持本發(fā)明全部或部分地得到了美國國家健康協(xié)會/美國國家癌癥協(xié)會的RO1CA86412號撥款和美國國防部及美國陸軍BC010287號撥款的支持。美國政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
β-葡聚糖是一種復(fù)合糖，β-葡聚糖通常可從幾種物質(zhì)衍生出來，這些物質(zhì)包括酵母、細菌、真菌和谷物。這些來源可產(chǎn)生各種混合的β-葡聚糖、各種純的β-葡聚糖以及各種結(jié)構(gòu)的β-葡聚糖。β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)差異是由葡萄糖以不同方式而結(jié)合成具有不同化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)的化合物而造成的。舉例而言，由細菌和藻類物質(zhì)衍生出的β(1-3)葡聚糖是線性葡聚糖，因此這種葡聚糖可用作食品增稠劑。蘑菇多糖(由擔(dān)子菌綱科的香菇衍生出來)是一種高分子量β-葡聚糖，這種葡聚糖的(1，3)骨架上帶有β(1，6)支鏈。裂殖菌多糖(由提子菌綱科的裂褶菌衍生出來)也是類似的葡聚糖，但裂殖菌多糖的β(1，6)側(cè)鏈更短。大麥、燕麥或小麥所衍生出的β-葡聚糖在其骨架中帶有(1，3)和(1，4)混合的連接鍵，但沒有(1，6)β支鏈，而且這些葡聚糖的分子量通常比較高。葡聚糖的側(cè)鏈頻率被稱為置換程度或分支頻率，側(cè)鏈頻率決定著葡聚糖的二級結(jié)構(gòu)和溶解性。酵母衍生出的β-葡聚糖帶有通過β(1-3)鍵連接起來的葡萄糖骨架，骨架上的葡萄糖單元帶有較低程度的分子內(nèi)和分子外支鏈，這些支鏈通過β(1-6)鍵和骨架相連。從已經(jīng)公布的大量研究結(jié)果看，在純度和活性方面，面包酵母(釀酒酵母)被廣泛地公認為β(1-3)葡聚糖的優(yōu)選來源。
釀酒酵母的細胞壁主要由β-葡聚糖構(gòu)成，這一點決定著釀酒酵母細胞壁的形狀和機械強度。雖然酵母最常見的用途是用作食品級微生物，但酵母也是酵母多糖的來源，酵母多糖是一種不溶性的原提取物，它被用來刺激非特異性免疫反應(yīng)。酵母多糖是一種豐富的β(1-3)葡聚糖來源。酵母衍生出的β(1，3)葡聚糖在一定程度上是通過激活先天抗真菌免疫機制來抵御各種目標，從而刺激免疫系統(tǒng)。面包酵母衍生出的β(1-3)葡聚糖是一種基本上由β(1-3)鍵連接的葡萄糖分子組成的多糖，這種多糖骨架上每隔一段就帶有通過β(1-6)鍵連接起來的β(1-3)支鏈。這種多糖更正式地被稱為聚-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1-3)-β-D-吡喃葡萄糖。當(dāng)來源和分離方法不同時，葡聚糖的結(jié)構(gòu)和功能是不同的。
β-葡聚糖具有多種活性。β-葡聚糖提高非特異性免疫力和增強抗感染的能力與內(nèi)毒素相似。當(dāng)β-葡聚糖作為免疫輔助劑和造血刺激劑時，其活性可與諸如長芥苗和粉刺丙酸菌這些更復(fù)雜的生物反應(yīng)改性物的活性相比。酵母β-葡聚糖的功能活性與那些從真菌和植物分離出來的并且在結(jié)構(gòu)上類似碳水聚合物的功能活性也是可比的。諸如裂殖菌多糖、蘑菇多糖、云芝多糖、灰樹花多糖和茯苓多糖這些分子量高的(1-3)-β-D-葡聚糖表現(xiàn)出了相似的免疫調(diào)節(jié)活性。研究人員就顆粒型葡聚糖和可溶性葡聚糖的各種劑型在動物模型中進行了試驗，從而說明這些生物活性。單獨使用可溶性β-葡聚糖和單獨使用不溶性β-葡聚糖或?qū)ⅵ?葡作為病毒疫苗或細菌疫苗的輔劑都可以顯著提高使用者對多種細菌、真菌、原生動物以及病毒感染的抵抗力。β-葡聚糖在造血方面的功能包括可以增加外周血中白細胞的數(shù)量和骨髓以及脾細胞質(zhì)，增加粒性白細胞-巨噬細胞祖細胞的數(shù)量、脾多能性干細胞的數(shù)量、紅色祖細胞數(shù)量以及血清中性粒白細胞-單核細胞集落劑刺激因子的水平。
β-葡聚糖作用的分子機理涉及免疫細胞膜上特異性β-葡聚糖受體結(jié)合位點，比如涉及中性粒細胞和巨噬細胞這些免疫細胞細胞膜上的β-葡聚糖特異性受體結(jié)合位點。甘露多糖、半乳聚糖、α(1-4)鍵葡萄糖聚合物以及β(1-4)鍵葡萄糖聚合物對該受體沒有親和力。最近的研究數(shù)據(jù)表明，C3補體蛋白的受體CR3是β-葡聚糖的主要受體。與β-葡聚糖受體相結(jié)合的配體可以激活補體，觸發(fā)吞噬作用、溶酶體酶的釋放、前列腺素的生成、促凝血素的生成以及白細胞三烯的生成。以前技術(shù)所述的大多數(shù)β-葡聚糖制劑可刺激細胞因子的產(chǎn)生，比如白細胞間素-1和腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，這些細胞因子具有抗腫瘤活性。
正如日本醫(yī)藥文獻中所述的，有關(guān)β-葡聚糖潛在的抗癌活性研究已經(jīng)進行了約30年。舉例而言，自上世經(jīng)70年代未開始，研究人員在動物體內(nèi)和臨床上對蘑菇多糖進行了廣泛的研究，其中動物實驗的用藥時間為10天，用藥量為1毫克/公斤；臨床試驗是針對早期及復(fù)發(fā)性惡性淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、乳癌、肺癌和胃癌進行的。最近的報道對這項工作進行了回顧，其主要內(nèi)容是有關(guān)從蘑菇中分離出來的β-葡聚糖(見Borchers AT.等人在《蘑菇與免疫》上發(fā)表的文章，221(4)，281(1999))。這項研究工作表明，從蘑菇中分離出的多糖的抗癌活性在很大程度上是由T細胞和巨噬細胞介導(dǎo)的，而T細胞和巨噬細胞由β-葡聚糖所激活。從原酵母和谷物制品中分離出的β-葡聚糖也表現(xiàn)出了抗癌活性。這些研究工作所使用的是原β(1，3)葡聚糖制品，其中原β(1，3)葡聚糖制品是β(1，3)葡聚糖與其他諸如β-葡聚糖、甘露聚糖、殼多糖/脫乙酰殼多糖、β(1，4)葡聚糖、核酸、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)這些多糖物質(zhì)的混合物。β(1，3)葡聚糖在這些制品中所占的重量比通常小于50％。不同種類的葡聚糖在誘導(dǎo)各種細胞反應(yīng)的能力以及在抗具體癌癥的活性上是不同的，尤其在細胞因子表達和細胞因子產(chǎn)生方面存在著差異。人們認為，β-葡聚糖的抗癌機理涉及到巨噬細胞的刺激以及此后炎癥介質(zhì)的釋放，比如白細胞間素-1、腫瘤環(huán)死因子以及前列腺素E2的釋放(見Sveinbjrnsson等人在《生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊》上發(fā)表的文章，223(3)，643(1996))。
與癌癥生長相關(guān)的細微變化會導(dǎo)致表面蛋白的表達不同，這可以刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng)做出微弱的反應(yīng)。表面抗原表達所出現(xiàn)的這些變化還提供了治療的靶目標，其中的治療使用選擇性單克隆抗體或抗癌疫苗。已開發(fā)出的單克隆抗體以在結(jié)腸癌、淋巴溜、乳腺癌以及急性白血病中表達的各種蛋白為靶目標。腫瘤對單克隆抗體的臨床反應(yīng)的免疫基礎(chǔ)包括直接細胞毒性和誘導(dǎo)免疫，其中抗體依賴型細胞介導(dǎo)細胞毒性和補體介導(dǎo)細胞毒性可直接殺滅腫瘤細胞。然而，人們已經(jīng)注意到，天然抗體或單克隆抗體介導(dǎo)的補體活性的增強對腫瘤的生長幾乎沒有影響，其原因在于腫瘤對于補體介導(dǎo)的細胞毒性具有固有的耐受性，這一事實經(jīng)常會使單克隆抗體或腫瘤抗原疫苗喪失療效。
人們越來越認識到，免疫系統(tǒng)有效地破壞腫瘤需要多種效應(yīng)機理的協(xié)同作用，單一一種疫苗、細胞因子或生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物不可能在眾多患者中取得成功。舉例而言，疫苗可誘導(dǎo)免疫細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng)和/或體液抗體反應(yīng)，但這兩種反應(yīng)都存在缺陷?？贵w通常是無效的，因為諸如DAF、MCP以及CD59這樣的正常宿主細胞蛋白會抑制補體介導(dǎo)的細胞毒性，而且iC3b對腫瘤的調(diào)理作用并非只是吸收巨噬細胞或天然殺傷細胞?？贵w依賴性細胞介導(dǎo)的免疫力被認為是無效的，因為腫瘤上免疫球蛋白G濃度太低以及抗體FC片段介導(dǎo)的細胞毒性受到天然殺傷細胞對I型MHC腫瘤細胞識別作用的抑制。所以做為轉(zhuǎn)移過程的一部分，由于腫瘤通常會失去抗原表達所需的主要組織相容性復(fù)雜分子，所以使用細胞毒性T淋巴細胞的細胞介導(dǎo)免疫性也存在缺陷。因此，需要一種組合抗癌療法，這種組合抗癌療法將克服這些缺陷。
發(fā)明概述本申請對抗腫瘤療法進行了說明，在該腫瘤療法中，不溶性β-葡聚糖和激活補體的腫瘤特異性抗體聯(lián)合使用，從而達到抗腫瘤的效果。不溶性β(1，3)葡聚糖(在本文中也被稱為全葡聚糖顆粒)通過與C3補體蛋白的受體CR3相結(jié)合來加強免疫系統(tǒng)殺滅腫瘤的活性。在優(yōu)選實施方案中，該方法形成協(xié)同效應(yīng)。這種協(xié)同效應(yīng)在一定程度上來自于抗體能夠有選擇性地以腫瘤細胞作為靶細胞。β-葡聚糖通過C3的沉積來放大正常情況下較弱的體液反應(yīng)或無效的體液反應(yīng)，C3的沉積是由瞄準腫瘤細胞的抗體所引發(fā)的，帶有β-葡聚糖啟動過的CR3的先天免疫細胞可識別腫瘤細胞。
本申請公開，全葡聚糖顆粒增強腫瘤抗原單克隆抗體療法和抗腫瘤疫苗所刺激的抗腫瘤免疫活性。細胞表面單克隆抗體和腫瘤疫苗刺激復(fù)雜的抗腫瘤免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)包括非特異性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)。非特異性免疫反應(yīng)涉及先天免疫細胞因子(比如補體系統(tǒng))和細胞(樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和天然殺傷細胞)。以腫瘤抗原為靶目標的單克隆抗體和腫瘤疫苗刺激產(chǎn)生的抗體與腫瘤細胞的表面相結(jié)合，并以腫瘤細胞為靶目標，從而滿足補體直接作用和補體介導(dǎo)細胞毒性的需要。
抗體介導(dǎo)的殺滅腫瘤細胞機理的核心部分涉及到C3補體蛋白對抗體-腫瘤抗原絡(luò)合物的識別以及C3-抗體腫瘤抗原絡(luò)合物的形成。該絡(luò)合物被先天免疫細胞通過CR3所識別。帶有CR3受體的先天免疫細胞通過CR3和C3-抗體腫瘤細胞抗原絡(luò)合物之間的特異性反應(yīng)與腫瘤細胞相結(jié)合，但先天免疫細胞不將腫瘤細胞認作是異質(zhì)物，也不會隨后引發(fā)殺滅腫瘤的活性。當(dāng)CR3與該絡(luò)合物相結(jié)合時，先天免疫細胞受到刺激，從而發(fā)揮其殺滅腫瘤的活性。在本發(fā)明中，這些先天免疫細胞還受到全葡聚糖顆粒的刺激。當(dāng)β(1，3)-葡聚糖在單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和天然殺傷細胞的表面與CR3相結(jié)合后，這些細胞便處于激活狀態(tài)。β(1，3)-葡聚糖與CR3間的相互作用對這些細胞的激活作用增強了這些細胞以C3-抗體-腫瘤細胞抗原絡(luò)合物為靶目標的殺滅腫瘤活性，從而通過協(xié)同效應(yīng)加強了殺滅腫瘤的能力。
本發(fā)明的一個新方面是全葡聚糖顆粒與細胞表面單克隆抗體和/或腫瘤疫苗的共同作用下所產(chǎn)生的協(xié)同抗腫瘤活性，以全葡聚糖顆粒形式存在的β(1，3)葡聚糖的優(yōu)勢在于可以容易地從任何β(1，3)葡聚糖來源制備出高純度的這種葡聚糖。此外，人們還發(fā)現(xiàn)口服全葡聚糖顆粒對目標位點也具有生物活性。將全葡聚糖顆粒用作抗腫瘤藥劑有多個重要的方面。第一，使用高純?nèi)暇厶穷w粒可使葡聚糖的活性更高、副作用更少。第二，一旦全葡聚糖顆粒降解便可以與凝集素的CR3結(jié)合區(qū)相結(jié)合，從而激活先天免疫細胞的殺滅腫瘤活性。通過使用補體沉積所產(chǎn)生的定向激活作用，β葡聚糖通過直接細胞毒性作用以及細胞因子介導(dǎo)的局部補充免疫細胞而提高免疫系統(tǒng)清除腫瘤的能力。
本文還對抑制或殺滅腫瘤細胞的方法進行了說明，這些方法包括對需要治療的個體使用有效治療劑量的全葡聚糖顆粒以及以腫瘤細胞的抗原為靶目標的抗體。這些抗體是可以激活補體的抗體。在某些實施方案中，這些抗體是I亞型免疫球蛋白G或III亞型亞型免疫球蛋白G。通過使用適當(dāng)?shù)囊呙缫部稍诨颊唧w內(nèi)誘導(dǎo)出這些抗體，也可以通過直接使用單克隆抗體或多克隆抗體而提供抗體，比如通過靜脈注射單克隆抗體的方式而直接提供抗體。另外，抗體也可以是個體內(nèi)自然存在的抗體。在某些實施方案中，全葡聚糖顆粒和抗體形成協(xié)同效應(yīng)。不溶性β(1，3)葡聚糖可通過口服、注射或本領(lǐng)域所知的其他方式進行給藥。
在某些實施方案中，抑制或殺滅腫瘤細胞的方法包括對需要治療的個體使用有效治療劑量的全葡聚糖顆粒以及至少一種激活補體的抗腫瘤抗體，其中葡聚糖和抗體的聯(lián)合使用可抑制或殺滅腫瘤細胞?？贵w通過直接使用單克隆抗體或多克隆抗體而得到，或者由癌癥疫苗產(chǎn)生。在具體的實施方案中，抗體選自于曲妥單抗、美羅華、西妥昔單抗以及這些抗體的組合物。全葡聚糖顆粒可通過口服或注射方式進行給藥。在某些實施方案中，全葡聚糖顆?？捎山湍?、真菌(比如蘑菇)或諸如大麥這樣的谷物產(chǎn)生。
在其他實施方案中，全葡聚糖顆粒和抗體形成協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)。
本文還對使用激活補體的抗體制造治療贅生細胞藥物的方法進行了說明，全葡聚糖顆粒和抗體的協(xié)同作用會減緩贅生細胞的生長。
在另一實施方案中，治療贅生細胞的方法包括對贅生細胞使用有效治療劑量的全葡聚糖顆粒以及激活補體的抗體，這種激活補體的抗體對贅生細胞具有特異性。在某些實施方案中，全葡聚糖顆粒和抗體的協(xié)同作用會保護贅生細胞的宿主，并通過減緩贅生細胞的生長速度和/或抑制贅生細胞的生長和/或延長贅生細胞宿主的存活時間而發(fā)揮作用。
在其他實施方案中，抑制或殺滅贅生細胞的方法包括對需要治療的個體使用有效治療劑量的全葡聚糖顆粒以及至少一種激活補體的抗腫瘤抗體，全葡聚糖顆粒和抗體的協(xié)同作用會抑制或殺滅腫瘤細胞，這種激活補體的抗體包裹住腫瘤細胞，并通過iC3b在腫瘤細胞上的沉積來激活補體。全葡聚糖顆粒被巨噬細胞所吸收，并被降解；降解后的片段與骨髓中的中性粒細胞相結(jié)合，并在趨化性作用下向抗體包裹的腫瘤細胞運動并與之相結(jié)合，其中被抗體包裹的腫瘤細胞上的補體通過沉積在腫瘤細胞上的iC3b所激活。
本文還對抑制或殺滅腫瘤細胞的方法進行了說明，該方法包括對需要治療的個體使用有效治療劑量的不溶性全葡聚糖顆粒，全葡聚糖顆粒被巨噬細胞所吸收，并被降解；降解后的片段與骨髓中的中性粒細胞相結(jié)合，并在趨化性作用下向抗體包裹的腫瘤細胞運動并與之相結(jié)合，其中被抗體包裹的腫瘤細胞上的補體由自然存在的激活補體的抗體通過沉積在腫瘤細胞上的iC3b所激活，其中葡聚糖與iC3b的結(jié)合可以抑制或殺滅腫瘤細胞。
圖示簡介通過下面對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行更詳細說明，可以清楚地了解前面所述的本發(fā)明目標、特點和優(yōu)勢以及本發(fā)明其他的目標、特點和優(yōu)勢，本文所附的圖形對這些優(yōu)選實施方案進行了圖解說明。


圖1表明的是C3調(diào)理的酵母在激活CR3時同時需要iC3b和β-葡聚糖與凝集素位點相結(jié)合。
圖2表明的是缺乏細菌的β-葡聚糖并不通過CR3觸發(fā)吞噬作用或脫粒作用。
圖3表明的是降解為可溶性葡聚糖的全葡聚糖顆粒與CR3相結(jié)合并啟動受體，從而觸發(fā)細菌的脫粒和解體或iC3b的腫瘤靶細胞的脫粒和解體。
圖4表明的是啟動鼠源性中性粒細胞CR3的β-葡聚糖可使iC3b調(diào)理的乳腺腫瘤細胞在此后觸發(fā)細胞毒性。
圖5A-5D表明的是乳房腫瘤患者的腫瘤細胞針對免疫球蛋白M、免疫球蛋白G或C3所做的雙色流式細胞檢測分析。圖5A是抗老鼠-免疫球蛋白G-PE/M1G-異硫氰酸熒光素的圖形。圖5B是抗MUC1-PE/抗免疫球蛋白M-異硫氰酸熒光素的圖形。圖5C是抗MUC1-PE/抗免疫球蛋白M-異硫氰酸熒光素的圖形。圖5D是抗MUC1/抗C3-異硫氰酸熒光素的圖形。
圖6表明的是新切除的原發(fā)乳腺腫瘤細胞的懸浮液中含有足夠的C3，同種基因的天然殺傷細胞對腫瘤細胞的識別需要足夠的C3，其中的天然殺傷細胞帶有β-葡聚糖啟動的CR3。
圖7表明的是β-葡聚糖對Balb/c小鼠Ptas64乳腺癌的治療結(jié)果。
圖8表明的是β-葡聚糖在治療缺乏血清C3或白細胞CR3的小鼠時失效的情況。
圖9表明的是使用β-葡聚糖可增強抗腫瘤單克隆抗體療法對EL-4肝淋巴瘤的療效。
圖10表明的是在治療裸小鼠體內(nèi)人類LAN-1成神經(jīng)細胞瘤時，抗體和口服大麥β-葡聚糖所取得的協(xié)同療效。
圖11表明的是在靜脈注射單克隆抗體加口服不溶性酵母β-葡聚糖顆粒的情況下Balb/c小鼠乳腺癌的治療結(jié)果。
圖12表明的是單克隆抗體加口服全葡聚糖顆粒療法的殺滅腫瘤活性需要通過白細胞三烯受體B4吸收白細胞。
圖13表明的是β-葡聚糖刺激天然殺傷細胞分泌腫瘤壞死因子α和CR3依賴性刺激天然殺傷細胞分泌腫瘤壞死因子α。
圖14A-圖14B表明的是口服酵母全β-葡聚糖顆?？杉訌娔[瘤的消退，其中圖14A表明的是腫瘤直徑與植入腫瘤細胞之后天數(shù)之間的關(guān)系；圖14B表明的是在靜脈注射酵母β-葡聚糖情況下存活率與植入腫瘤細胞之后天數(shù)之間的關(guān)系。
圖15A-15D表明的是口服可溶性大麥β-葡聚糖或顆粒型酵母β-葡聚糖所導(dǎo)致的腫瘤消退需要白細胞CR3。其中圖15A表明的是腫瘤直徑(毫米)與野生型小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖15B表明的是存活率與野生型小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖15C表明的是腫瘤直徑(毫米)與缺乏CR3的小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖15D表明的是存活率與缺乏CR3的小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系。
圖16A-16D表明的是口服可溶性大麥β-葡聚糖或顆粒型酵母β-葡聚糖所導(dǎo)致的長期無腫瘤存活需要白細胞CR3。其中圖16A表明的是腫瘤直徑(毫米)與野生型小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖16B表明的是存活率與野生型小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖16C表明的是腫瘤直徑(毫米)與缺乏CR3的小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖16D表明的是存活率與缺乏CR3的小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系。
圖17A-17D表明的是口服可溶性大麥β-葡聚糖或顆粒型酵母β-葡聚糖所導(dǎo)致的腫瘤消退需要血清C3。其中圖17A表明的是腫瘤直徑(毫米)與野生型小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖17B表明的是存活率與野生型小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖17C表明的是腫瘤直徑(毫米)與缺乏CR3的小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖17D表明的是存活率與缺乏CR3的小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系。
圖18A-18D表明的是口服可溶性大麥β-葡聚糖或顆粒型酵母β-葡聚糖所導(dǎo)致的長期無腫瘤存活需要血清C3。其中圖18A-18B表明的是存活率與野生型小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系；其中圖18C-18D表明的是存活率與缺乏CR3的小鼠治療天數(shù)之間的關(guān)系。
圖19表明的是有空白邊緣的粒性白細胞庫吸收可溶性β葡聚糖需要膜表面CR3。
優(yōu)選實施方案的詳細說明本申請對抗腫瘤療法進行了說明，在該療法中，β-葡聚糖與瞄準腫瘤抗原的抗體結(jié)合使用，從而對贅生細胞產(chǎn)生抗腫瘤效果。以下將對這些葡聚糖的制備以及這些葡聚糖與抗體聯(lián)合治療贅生細胞的方法進行說明。
正如本文所述的，口服不溶性β-葡聚糖可誘導(dǎo)殺滅腫瘤的活性。這類葡聚糖能夠啟動循環(huán)中性粒細胞中的CR3(iC3b受體，CD11b/CD18)，從而通過單克隆抗體殺滅經(jīng)iC3b調(diào)理過的腫瘤。正如本文所述的，口服大麥β(1-3)(1-4)葡聚糖和全葡聚糖顆?？娠@著加強抗腫瘤單克隆抗體所介導(dǎo)的腫瘤退化和腫瘤宿主的存活情況。在CR3-(CD11b-1-)小鼠或缺乏C3的小鼠體內(nèi)沒有出現(xiàn)口服葡聚糖介導(dǎo)的腫瘤退化，這進一步表明白細胞中的CR3對與腫瘤細胞相結(jié)合的iC3b進行識別的必要性。研究人員使用全葡聚糖顆粒-熒光素對口服全葡聚糖顆粒的體內(nèi)結(jié)果進行了研究。胃腸巨噬細胞將口服吸收的全葡聚糖顆粒-熒光素運送到淋巴組織，在口服全葡聚糖顆粒-熒光素3天后全葡聚糖顆粒-熒光素出現(xiàn)在脾巨噬細胞中，5天后出現(xiàn)在骨髓巨噬細胞中。由于野生型小鼠和CD11b-/-小鼠的骨髓巨噬細胞中含有全葡聚糖顆粒-熒光素，巨噬細胞吸收全葡聚糖顆粒-熒光素并不需要CR3。骨髓巨噬細胞消化全葡聚糖顆粒-熒光素并分泌出可溶性β-葡聚糖-熒光素，骨髓中性粒細胞通過CR3來吸收β-葡聚糖-熒光素。只有從口服全葡聚糖顆粒小鼠體中引出的中性粒細胞有能力殺滅iC3b調(diào)理過的腫瘤細胞。巨噬細胞將口服β-葡聚糖運送到骨髓中，β-葡聚糖在骨髓中啟動中性粒細胞的CR3，從而導(dǎo)致殺滅腫瘤的活性。
全葡聚糖顆粒是經(jīng)過提純的酵母細胞壁制品。通過除去酵母細胞的甘露多糖蛋白外層并保持β-葡聚糖體內(nèi)形態(tài)的條件下使β-葡聚糖暴露出來就可制備出全葡聚糖顆粒。在某些實施方案中，全葡聚糖顆粒的大小在1微米或1微米以上。
另外一種形式的β-葡聚糖是被稱為全葡聚糖顆粒的不溶性顆粒。全葡聚糖顆粒是酵母細胞壁的剩余物，通過將生長中的酵母與其生長介質(zhì)分離開并用堿性物質(zhì)處理這些完整的細胞壁從而去除不想要的蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)就可制備出全葡聚糖顆粒。在某些實施方案中，剩下來的是外層甘露多糖蛋白已被去除的球形β-葡聚糖顆粒。從含有葡聚糖的真菌細胞壁中也可以獲得全葡聚糖顆粒，但優(yōu)選的全葡聚糖顆粒來源是啤酒酵母。在某些實施方案中，制品中葡聚糖的含量大于50％。在某些實施方案中，制品中其余的部分由脂質(zhì)和/或糖原組成。這些不溶性顆?？稍鰪娝拗鲗Χ喾N感染的抵抗力，促進抗體的生成(輔肋活性)、促進白細胞的運動并加快傷口的愈合。制備全葡聚糖顆粒的方法是本領(lǐng)域共知的，4,810,646、4,492,540、5,037,972、5,082,936、5,250,436和5,506,124號美國專利對制備全葡聚糖顆粒的方法進行了說明，這些專利的內(nèi)容在此通過引證被并入本文。
在本文中，微粒型葡聚糖顆粒被定義為全葡聚糖顆粒的一部分，將酵母細胞壁β(1-3；1-6)葡聚糖精細研磨到1微米左右或1微米以下便得到了微粒型葡聚糖顆粒。
人們已經(jīng)制備出了各種形式的顆粒型葡聚糖。一種具體的葡聚糖就是微粒型葡聚糖顆粒。將酵母細胞壁β(1-3；1-6)葡聚糖精細研磨到1微米左右或1微米以下便得到了微粒型葡聚糖顆粒。正如5,702,719號美國專利所述的，這種形式的β-葡聚糖被用作營養(yǎng)補品和皮膚修復(fù)劑。適用于本文所述方法的其他葡聚糖包括WGPTMβ-葡聚糖和βRightTM，這兩種產(chǎn)品由明尼蘇達州的生物聚合物工程公司制造。微粒型β-葡聚糖顆粒也具有增強使用者免疫系統(tǒng)的功能。見5,223,491號和5,576,015號美國專利，這兩篇專利的內(nèi)容在此通過引證被并入本文。
在某些實施方案中，本文所述方法中所用的全葡聚糖顆粒是口服生物活性成分。正如本文所使用的，“生物活性”是指全葡聚糖顆粒能夠達到功效目標。換句話說就是，全葡聚糖顆粒含有足夠的β(1，3；1，6)葡聚糖，這些葡聚糖被派伊爾淋巴集節(jié)所吸收。葡聚糖被派伊爾淋巴集節(jié)所吸收，并被巨噬細胞吞噬和降解，然后傳送到骨髓中，降解的片段在骨髓中被釋放出來。這些降解后的片段與骨髓中的中性粒細胞相結(jié)合，并通過趨化性而遷移到抗體覆蓋的腫瘤細胞上并與腫瘤細胞相結(jié)合，其中補體已經(jīng)通過iC3b在腫瘤細胞上的沉積所激活。舉例而言，全葡聚糖顆粒能夠到達腫瘤細胞，并同抗體一同作用于腫瘤細胞。在全葡聚糖的作用位點，葡聚糖通過與CR3受體的結(jié)合而刺激細胞，這反過來又啟動或促進CR3發(fā)揮功能。通過胃腸巨噬細胞將全葡聚糖顆粒輸送到骨髓中可以介導(dǎo)口服全葡聚糖的生物藥效率，胃腸巨噬細胞使全葡聚糖發(fā)生降解。降解后的顆粒然后在骨髓中發(fā)揮作用，當(dāng)中性粒細胞遷移到腫瘤細胞上并與腫瘤細胞上的iC3b相結(jié)合時，這些降解的顆粒通過激活CR3而刺激中性粒細胞。
制備全葡聚糖顆粒簡單而言，生產(chǎn)全葡聚糖顆粒的過程涉及不溶于堿性物質(zhì)的全葡聚糖顆粒的萃取和提純，其中的全葡聚糖顆粒由酵母細胞壁或真菌細胞壁制得。這一過程產(chǎn)生一種產(chǎn)品，這一產(chǎn)品保持著體內(nèi)葡聚糖所具有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特性，這一產(chǎn)品被稱為全葡聚糖或全葡聚糖顆粒。
全葡聚糖制劑的結(jié)構(gòu)-功能特性直接取決于葡聚糖的來源，同進還取決于最終產(chǎn)品的純度。全葡聚糖的來源可以是酵母或其他真菌或任何其他含有葡聚糖的來源，其中的葡聚糖具有本文所述的特性，在某些實施方案中，酵母細胞是優(yōu)選的葡聚糖來源。本過程所用的酵母菌株可以是任何的酵母菌株，例如包括啤酒酵母菌株，delbruecrii菌株、rosei菌株、微橢圓菌株、卡爾酵母菌株、二孢酵母菌株、發(fā)酵芽胞菌株、rouxii菌株等。
一般而言，上述過程可用來將其他突變的酵母菌株與作為起始材料的其他原始菌株分離開來。此外，可采用誘變劑來誘導(dǎo)突變，舉例而言，可使用化學(xué)誘變劑、輻射或其他脫氧核糖核酸和重組體控制手段來誘導(dǎo)突變。同樣還可以使用其他的選擇或篩分技術(shù)來制備全葡聚糖顆粒。
酵母細胞可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)加以制造。舉例而言，典型的生長介質(zhì)包括葡萄糖、蛋白胨以及酵母提取物。通過使用將生物物質(zhì)與液體介質(zhì)相分離的常規(guī)技術(shù)可以將酵母細胞與生長介質(zhì)分離開，并對酵母細胞進行收集。這些方法通常使用諸如過濾或離心分離這樣的固-液分離工藝。在本工藝過程中，優(yōu)選的情況是在酵母細胞對數(shù)生長期的中后期對酵母細胞進行收集，從而使酵母細胞中的糖原和殼多糖含量達到最低程度。糖原、殼多糖和蛋白質(zhì)是不良污染物，這些不良污染物會對全葡聚糖顆粒的生物學(xué)特性和流體力學(xué)特性造成不利影響。
制備全葡聚糖顆粒包括使用適當(dāng)濃度的堿性水溶液對酵母進行處理，從而將一部分酵母溶解掉，并由此生成不溶于堿性氫氧化物的全葡聚糖顆粒，這些全葡聚糖顆粒主要含有β(1-6)鍵和β(1-3)鍵。在制備全葡聚糖顆粒過程中所使用的堿性物質(zhì)通常為堿金屬氫氧化物，比如氫氧化鈉或氫氧化鉀等。制備全葡聚糖所用的原料是從生長介質(zhì)中分離出來的酵母。在酵母原料濃度較低的情況下，將氫氧化物溶液的消耗量和濃度控制在理想的范圍內(nèi)是十分困難的。酵母應(yīng)該帶有完整的未出現(xiàn)破裂的細胞壁，因為本發(fā)明中全葡聚糖顆粒的性質(zhì)是否理想取決于細胞壁是否完整。
酵母在氫氧化物水溶液中進行處理，酵母細胞的細胞內(nèi)組分和甘露糖蛋白溶解于氫氧化物水溶液中，剩余的不溶性細胞壁物質(zhì)基本上不含蛋白質(zhì)，并含有基本上未發(fā)生改變的三維β(1-6)鍵和β(1-3)鍵矩陣的葡聚糖。在優(yōu)選的操作條件下，細胞壁中的甘露聚糖成分在這一處理步驟中溶解于氫氧化物水溶液中。細胞內(nèi)的組分發(fā)生水解并進入到溶解相中。對酵母進行處理的條件至少要使細胞的主要組分和細胞壁的三維結(jié)構(gòu)不被破壞。在特定環(huán)境下，基本上所有的細胞壁葡聚糖未發(fā)生改變。
在某些實施方案中，使用氫氧化物水溶液對酵母進行浸泡的過程是在氫氧化物溶液的初始當(dāng)量濃度約在0.1～10.0的情況下進行的。典型的氫氧化物溶液含有元素周期表中堿金屬族的氫氧在化物和堿土金屬的氫氧化物。由于比較容易得到，所以優(yōu)選的氫氧化物水溶液是氫氧化鈉水溶液和氫氧化鉀水溶液。浸泡過程約在20℃～121℃的條件下進行，浸泡的溫度越低浸泡的時間越長。當(dāng)使用氫氧化鈉水溶液時，浸泡的溫度約在80℃～100℃之間，溶液的初始當(dāng)量濃度約在0.75～1.5之間。所加入的氫氧化物是過量的，因此不必再添加氫氧化物。
在一般情況下，每升氫氧化物溶液所處理的干酵母數(shù)量約在10～500克之間。在某些實施方案中。使用氫氧化物水溶液浸泡酵母的過程是由一系列接觸步驟實現(xiàn)的。在這種情況下，諸如蛋白質(zhì)這些雜質(zhì)的殘余量要少于只使用一次浸泡的雜質(zhì)殘余量。在某些實施方案中，應(yīng)該基本上將所有的蛋白質(zhì)從細胞中除去。蛋白質(zhì)的脫除程度應(yīng)該使蛋白質(zhì)在不溶性細胞壁葡聚糖顆粒中的殘余量低于1％。在優(yōu)選條件下，還應(yīng)在pH值約在2.0～6.0之間的酸性溶液中進行萃取處理。典型的酸性溶液包括鹽酸、使用鹽酸和醋酸鹽緩沖物調(diào)制到所需PH值的氯化鈉溶液。其他常用的酸性溶液包括硫酸溶液和含有適當(dāng)緩沖劑的乙酸溶液。在優(yōu)選條件下，萃取過程在約20℃～100℃下進行。如果需要，經(jīng)過浸泡的葡聚糖顆粒可以再進行洗滌和萃取處理。從而減少蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的含量。在經(jīng)過處理后，可將產(chǎn)物的pH值調(diào)節(jié)到約6.0～7.8之間。
在完成了這一不會對細胞壁造成破壞的處理步驟后，萃取過程可以在更嚴格的pH值和溫度條件下進行，而以往的處理過程會對細胞壁造成損壞。本發(fā)明中的處理過程在采用這些嚴格的萃取條件時避免了產(chǎn)品的質(zhì)量出現(xiàn)下降，本發(fā)明中的萃取過程消除了十分耗時的多級萃取步驟。
在經(jīng)過上述氫氧化物溶液處理后，全葡聚糖最終產(chǎn)物的重量約為酵母原料重量的5～30％，在優(yōu)選情況下，最終產(chǎn)物的重約為原料重量的7～15％。
不溶于氫氧化物溶液的全葡聚糖顆粒將在發(fā)明概述中進行說明。如果需要，全葡聚糖顆粒還可進行進一步的處理和/或提純。舉例而言，葡聚糖可干燥成細小的粉未(即在干燥爐中進行干燥)，或者使用有機溶劑(比如乙醇、醚類物質(zhì)、丙酮、甲乙酮、氯仿)進行處理，從而除去微量雜質(zhì)或溶于有機溶劑的物質(zhì)；或者再用氫氧化物溶液進行處理，從而除去可能存在的其他蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)。
在某些實施方案中，本發(fā)明工藝過程所生產(chǎn)出的全葡聚糖顆粒由純葡聚糖構(gòu)成，其中的葡聚糖基本是β(1-6)和β(1-3)鍵葡聚糖。全葡聚糖顆粒含有極少的蛋白質(zhì)的糖原雜質(zhì)。在某些實施方案中，全葡聚糖顆粒的形狀為球形，直徑約在2～10微米之間，當(dāng)使用單糖分析或其他適當(dāng)?shù)姆治鰰r，全葡聚糖所含己糖的重量比約大于85％(在其他實施方案中己糖的重量比大于約60％)，蛋白質(zhì)的重量比約為1％，可檢測到的甘露聚糖的含量小于1％。使用以往技術(shù)所制得的葡聚糖所含殼多糖和糖原的數(shù)量大大高于本發(fā)明中的葡聚糖。
正如本文前面所述，第二步是采用化學(xué)處理手段對全葡聚糖顆粒進行改性，從而改變葡聚糖的特性。除了從本文所述的那些具體酵母菌株所衍生出的全葡聚糖顆粒外，由任何酵母菌株所衍生出的全葡聚糖顆粒均可以使用。正如前面所述的，可以使用的酵母種類很多。前面所述的處理條件同樣適用于從真菌中提取葡聚糖的過程。同樣，這些葡聚糖的特性也取決于它們的來源。
在第一步化學(xué)處理中，可使用酸類物質(zhì)對全葡聚糖顆粒進行處理，從而減少β(1-6)鍵的數(shù)量，并由此改變所述葡聚糖的流體力學(xué)性質(zhì)，其表現(xiàn)結(jié)果是改性后葡聚糖水溶液的粘度會增加。
還可以使用酸性物類在適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)對全葡聚糖顆粒進行處理，從而改變β(1-6)鍵。乙酸由于其酸度適中、使用簡便、毒性低、成本低及容易獲得而是一種理想的酸性材料，但其他種類的酸也可以使用。一般而言，這些酸的酸度要適中，其酸度應(yīng)足以限制β(1-3)鍵發(fā)生水解。對全葡聚糖顆粒進行改性處理是在一定條件下進行的，這些條件基本上只對含β(1-6)鍵的葡聚糖發(fā)生影響。在某些實施方案中，酸處理過程是使用基本上由乙酸組成的溶液或本文所述的稀釋液(常用的稀釋液可以是有機溶劑或有機酸溶液)進行的。處理過程的溫度約在20℃～100℃之間。在某些實施方案中，酸處理過程可將處理前全葡聚糖顆粒中重量約為3～20％左右的酸溶性物質(zhì)除去。在其他的實施方案中，所脫除的重量比約為3～4％。經(jīng)過酸處理后所形成的某些組分能夠表明全葡聚糖顆粒的流體力學(xué)性質(zhì)已發(fā)生變化，并且表明處理后的粘度有所增加。
在第二步化學(xué)處理中，使用酶或酸對全葡聚糖顆粒進行處理，從而改變β(1-3)鍵的數(shù)量。對于由某些酵母菌株衍生出的全葡聚糖顆粒而言，使用酶對其進行處理會使其粘度降低，但對于其他由酵母衍生出的全葡聚糖顆粒而言，酶處理過程會使這些全葡聚糖顆粒的粘度上升。但一般而言，酶處理過程會改變葡聚糖的化學(xué)性質(zhì)和流體力學(xué)性質(zhì)。酶處理過程是使用β(1-3)葡聚糖酶對全葡聚糖顆粒進行處理，例如使用昆布糖酶對全葡聚糖顆粒進行處理，從而改變β(1-3)鍵，并由此改變?nèi)暇厶撬蠎腋∫旱牧黧w力學(xué)性質(zhì)。
酶處理過程可在全葡聚糖的水溶液中進行，其中葡聚糖的濃度約在0.1～10.0克/升之間。任何可水解的葡聚糖酶都可以使用，比如可使用昆布糖酶，這種糖酶十分有效并且十分容易獲得。培養(yǎng)期可視全葡聚糖顆粒和全葡聚糖酶的濃度而變化。在諸如乙酸這樣具有中等酸度的環(huán)境下，β(1-3)鍵具有抗水解能力。當(dāng)使用強酸或濃酸進行處理時，比如使用鹽酸、硫酸或甲酸進行處理時，β(1-3)鍵會發(fā)生水解，從而減少β(1-3)鍵的數(shù)量。酸處理過程可在全葡聚糖的水溶液中進行，其中葡聚糖的濃度約在0.1～10.0克/升之間。酸處理的時間可視全葡聚糖顆粒的濃度和酸的濃度而變化。酸處理過程可在20℃～100℃左右的溫度下進行。在優(yōu)選條件下，酸處理過程后所形成的組分可表明流體力學(xué)性質(zhì)的變化。
通過控制培養(yǎng)時間可以控制所生成產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)和流體力學(xué)性質(zhì)。舉例而言，可以對產(chǎn)物的粘度進行精確的控制，從而使產(chǎn)物用于特定的用途，比如用于各種食品中。
最終產(chǎn)物的流體力學(xué)參數(shù)(K1)取決于處理時間的長短，該參數(shù)由以下公式計算K1＝-0.0021(時間)+0.26其中時間的單位為分鐘并且不到1小時。
參數(shù)K1直接與產(chǎn)物的相對粘度相關(guān)(成比例)。在產(chǎn)物的水合懸浮液中，如果以厘泊為單位進行計量時，相對粘度與實際粘度相等。
本發(fā)明提供制備葡聚糖水合漿液的工藝方法，該水合漿液具有所需的預(yù)定粘度。該漿液所含葡聚糖的濃度是所需預(yù)定粘度的函數(shù)，所需預(yù)定粘度由以下近似公式計算l/濃度＝K1×(l/log(相對粘度))+K2其中K1＝(形狀因子)×(流體力學(xué)體積)，K2＝(流體力學(xué)體積)/(最大充填率)。
形狀因子是經(jīng)驗值，該經(jīng)驗值表明了在水合環(huán)境中的葡聚糖矩陣的形狀。形狀因子是葡聚糖顆粒長、寬比的函數(shù)，形狀因子可通過顯微觀察的方式加以確定。流體力學(xué)體積是葡聚糖顆粒在懸浮液中所占的體積。流體力學(xué)體積是葡聚糖懸浮液的一項重要參數(shù)，該參數(shù)表明了葡聚糖矩陣的含水能力的高低。最大充填率可以被描述成在單位體積的懸浮液中能夠獲得的最大葡聚糖體積分率。
制備微粒型β-葡聚糖顆粒通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的傳統(tǒng)方法可從酵母細胞壁中分離出β(1，3)葡聚糖的原料。從酵母制備葡聚糖的常用方法包括堿萃取過程以及其后的酸萃取過程(見Hassid等人在《美國化學(xué)協(xié)會雜志》上發(fā)表的文章，63295-298，1941)。5,223,491號美國專利對分離高純β(1，3)葡聚糖萃取物的改進方法進行了說明，其中的β(1，3)葡聚糖不溶于水，該專利在此通過引證被并入本文。4,992,540號美國專利對另外一種制備微粒型β-葡聚糖的方法進行了說明，該專利的全文在此通過引證被并入本文。5,702,719號美國專利對制備微粒型β-葡聚糖的方法進行了說明，該專利的全文在此通過引證被并入本文。所制得的葡聚糖微粒的平均顆粒直徑約為1.0微米或1.0微米之下，或者平均顆粒直徑約為0.2微米或0.2微米之下。
通過機械方式可以降低β-葡聚糖顆粒的直徑，例如可采用搗碎機、微流化器或球磨機來減小β-葡聚糖顆粒的大小。舉例而言，可使用帶有鈍刀片的搗碎機來降低葡聚糖顆粒的大小，其中葡聚糖混合物在足夠長的時間內(nèi)被搗碎，從而在不導(dǎo)致混合物出現(xiàn)過熱的情況下將顆粒研磨到所需的大小，優(yōu)選的研磨時間為幾分鐘。另外一種研磨方式是使用10毫米不銹鋼球研磨機對葡聚糖顆粒進行研磨。當(dāng)希望制備0.2微米或更小的葡聚糖顆粒時，后一種研磨方式特別適用。
在進行研磨之前，葡聚糖混合物最好經(jīng)過一系列的篩分，其中每個篩網(wǎng)的目數(shù)都大于前一個篩網(wǎng)的目數(shù)，最后一個篩網(wǎng)的目數(shù)約為80。對葡聚糖混合物進行篩分的目的在于將更大更粗的葡聚糖顆粒與更小的顆粒分離開(80目篩網(wǎng)的孔徑約為0.007英寸或0.178毫米)。分離出的較大顆粒然后按前面所述的研磨方法再進行研磨，并使用最后一個篩網(wǎng)為80目的篩分機再次進行篩分。篩分過程和研磨過程可重復(fù)進行，直至最終得到的顆粒可穿過80目的篩網(wǎng)。篩分出的顆粒被混合到一起，并進行進一步的研磨，優(yōu)選的研磨時間至少為1小時，直至達到所需的顆粒大小，優(yōu)選的顆粒直徑約為1.0微米或更小，更理想的顆粒直徑約為0.2微米或更小。在研磨過程中對葡聚糖顆粒進行定期的采樣，并用顯微鏡上的測微計測定顆粒的大小。
激活補體的抗體能夠激活補體的抗體(包括自然存在的抗體和本領(lǐng)域已知方法所制備出的抗體)是作用于腫瘤或腫瘤抗原的抗體，這些抗體可以激活補體群落中的一個或多個補體成員。換句話說就是需要一種能夠充分激活補體并使iC3b沉積在腫瘤細胞上的抗體。在某些實施方案中，抗體是I亞型免疫球蛋白G或II亞型免疫球蛋白G。
本發(fā)明還對可溶性葡聚糖與抗體的使用進行了說明，其中可溶性葡聚糖基本上可由任何來源產(chǎn)生，抗體包括感染所引發(fā)的自然抗體、疫苗所引發(fā)的抗體以及直接使用的單克隆抗體；其中單克隆抗體是療法的一個組成部分，該療法包括使用β-葡聚糖。任何具有激活補體特性的抗體都可被本文所述的方法用來增強β-葡聚糖的殺滅腫瘤活性?？贵w也可以是個體體內(nèi)自然存在的抗體，這些自然存在的抗體可以充分地使激活補體，從而使iC3b沉積在腫瘤細胞上。用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可對鼠性抗體進行升級，使用其能夠抵抗與贅生(腫瘤)細胞相關(guān)的抗原。在這一方面，腫瘤細胞表達著數(shù)量較多的各種各樣的分子受體，這些分子能夠提高自身的增殖，其中許多分子是致癌基因的產(chǎn)物。因此，人們已制備出了許多單克隆抗體，這些單克隆抗體可以抵抗諸如移動蛋白、白細胞間素-2以及表皮生長因子這些蛋白的受體?？梢哉f，任何有選擇性地對抗原進行跟蹤并能激活補體的抗體在與β-葡聚糖共同使用時都能使自身的活性得到增強。這些抗體包括各種類型的抗體，比如免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E和免疫球蛋白M，還包括諸如Fab這樣的抗體片段。
正如本文所用的，“抗體”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子中具有免疫活性的部分，比如含有抗原結(jié)合位點的分子中具有免疫活性的部分，其中的抗原結(jié)合位點專門與腫瘤抗原相結(jié)合。專門與腫瘤相結(jié)合的分子是與腫瘤多肽或腫瘤片段相結(jié)合的分子，但基本上不與生物試樣中的其他分子相結(jié)合，其中生物試樣中含有天然多肽類物質(zhì)。免疫球蛋白分子中具有免疫活性的部分包括F(ab)和F(ab’)2片段，使用諸如胃蛋白酶這樣的酶對抗體進行處理可產(chǎn)生F(ab)和F(ab’)2片段。正如本文所使用的，“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指抗體分子群落，這些抗體分子只含有一種抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點能夠與腫瘤靶目標的某一特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)。因此，單克隆抗體組合物通常對本發(fā)明中的特定多肽類物質(zhì)具有單一的結(jié)合親和力，單克隆抗體組合物與特定的多肽類物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)。
按照本文前面所述，通過對適當(dāng)?shù)膫€體使用所需的免疫源進行免疫接種可以制備出多克隆抗體，比如使用本發(fā)明中的多肽類物質(zhì)或多肽類物質(zhì)的片段作為免疫源?？贵w在一段時期內(nèi)在免疫個體中的效價可采用標準技術(shù)進行測定，比如使用酶聯(lián)免疫吸附測定發(fā)對抗體的效價進行測定。如果需要，作用于多肽類物質(zhì)的抗體分子可以從哺乳動物體內(nèi)分離出來(比如從血液中分離出來)并采用已知的技術(shù)進行進一步的提純，比如使用蛋白A色譜儀進行提純，從而得到免疫球蛋白G。在實施免疫接種后的適當(dāng)時間，即抗體效價處于最高時，可從個體獲得產(chǎn)生抗體的細胞，并使用標準技術(shù)從這些細胞制備單克隆抗體，其中的標準技術(shù)包括雜交瘤技術(shù)、人類B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人在《當(dāng)代免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，472)、EB病毒-雜交瘤技術(shù)(Cole等人所著《單克隆抗體和癌癥療法》(1985)，77-96頁)或三源雜交瘤技術(shù)。(見Kohler和Milstein在《自然》上發(fā)表的文章，256495-497)。產(chǎn)生雜交瘤的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的技術(shù)(見Coligan等人編輯的《當(dāng)代免疫學(xué)規(guī)程》)。簡單而言，無限增殖細胞系(通常是骨髓瘤細胞)與上述接受過免疫接種的哺乳動物的淋巴細胞(通常是脾細胞)相融合，對得到的雜交瘤細胞中的上層培養(yǎng)物進行篩分，從而識別能夠產(chǎn)生與本發(fā)明中多肽類物質(zhì)相結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤。
為了制備能與本發(fā)明中多肽類物質(zhì)相結(jié)合的單克隆抗體，可以使用多種眾所周知的方法使淋巴細胞與無限增殖細胞系相融合(見《當(dāng)代免疫學(xué)規(guī)程》、Galfre等人在《自然》是發(fā)表的文章，1977，26655052、R.H.Kenneth所著的《單克隆抗體生物分析中的新課題》，Plenum出版公司，紐約(1980)、Lerner在《耶魯生物醫(yī)藥雜志》上發(fā)表的文章，54387-402)。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)將會理解，對這些方法可以進行各種各樣的修改，修改后的方法同樣可以使用。
除了制備可分泌單克隆抗體的雜交瘤這種途徑外，能與本發(fā)明中肽類物質(zhì)相結(jié)合的單克隆抗體可通過使用多肽類物質(zhì)對重組體組合免疫球蛋白文庫(比如抗體噬菌體展示文庫)進行篩選被識別和分離出來，通過這一篩選過程可將能與多肽類物質(zhì)相結(jié)合的免疫球蛋白庫成員分離出來。通過商業(yè)渠道可購得生成和篩選噬菌體展示文庫所用的器具(比如藥用重組體噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號27-9400-01；Stratagene SurfZAPTM噬菌體展示器具，目錄號240612)。此外，在以下文獻可以找到特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫所用的方法和試劑5,223,409號美國專利、WO92/18619號PCT出版物、WO91/17271號PCT出版物、WO92/20791號PCT出版物、WO92/15679號PCT出版物、WO93/01288號PCT出版物、WO92/01047號PCT出版物、WO92/09690號PCT出版物、WO92/02809號PCT出版物、Fuchs等人在《生物技術(shù)》上發(fā)表的文章，91370-1372、Hay等人所著的《人類抗體雜交瘤》，381-85、Huse等人在《科學(xué)》上發(fā)表的文章，2461275-1281、Griffiths等人在《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》上發(fā)表的文章，12725-734。
此外，重組體抗體，例如嵌合抗體和人源化單克隆抗體既含有人源部分也含有非人源部分，使用標準的重組體DNA技術(shù)可制造出重組體抗體，重組體抗體在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。使用本領(lǐng)域所知的重組體DNA技術(shù)可制備出嵌合抗體和人源化單克隆抗體。
本發(fā)明對全葡聚糖顆粒與抗體的使用進行了說明，這些抗體基本上可由任何抗體源產(chǎn)生，其中包括對感染做出響應(yīng)而自然產(chǎn)生的抗體、對疫苗做出響應(yīng)而產(chǎn)生的抗體以及直接使用的單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體和多克隆抗體是使用β-葡聚糖療法的一部分。大多數(shù)含有人類免疫球蛋白G1 Fc區(qū)域的人源化單克隆抗體可以激活補體，比如赫塞汀TM、美羅華TM和ErbituTM這些人源化單克隆抗體可激活補體(見Spiridon C.I.等人在《癌癥臨床研究》上發(fā)表的文章，81720-1730(2002)，見IdusogieE.E.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1644178-4184(2000)見Cragg M.S.等人在《血液》上發(fā)表的文章，1011045-1052(2003)，見Herbst R.S.和Hong W.K.在《生殖腫瘤學(xué)》上發(fā)表的文章，2918-30(2002))。在某些是實施方案中，全鋪聚糖顆粒和抗體產(chǎn)生協(xié)同功效。
為了表明本發(fā)明的概念，諸如全葡聚糖顆粒這樣的β-葡聚糖可以與HerceptinTM共同使用，從而達到協(xié)同療效；HerceptinTM是Genentech公司出售的一種單克隆抗體，該抗體用來治療乳房癌。HerceptinTM是一種能夠識別her2細胞表面抗原的單克隆抗體，在乳房癌細胞類型中有20％存在her2細胞表面抗原。臨床試驗表明，HerceptinTM可以挽救生命，但同β-葡聚糖共同使用可以顯著增強其療效。在治療過程中共同使用可溶性葡聚糖和HerceptinTM可以使對HerceptinTM療法有響應(yīng)的婦女人數(shù)顯著增加，并使這些婦女的乳房癌得到長期持續(xù)的緩解。目前，在接受HerceptinTM療法的婦女中只有15％表現(xiàn)出了長期持續(xù)的緩解。
全葡聚糖顆粒可增強其活性的另一種單克隆抗體是美羅華，該單克隆抗體被用來治療某一類型的非何杰氏淋巴瘤，這是一種免疫系統(tǒng)癌癥。美羅華可有效在治療患有輕度B細胞非何杰氏淋巴瘤的患者，這類患者對標準的治療方法沒有反應(yīng)。B細胞非何杰氏淋巴瘤的破壞目標是已經(jīng)發(fā)生變換的白細胞(B細胞)，從而導(dǎo)致癌癥的生長。美羅華是經(jīng)過基因改造的鼠源性抗體，該抗體既含有人源性組分又含有鼠源性組分，在對166名患有早期輕度或生長緩慢的非何杰氏淋巴瘤患者的臨床研究中，接受美羅華治療的患者中有48％患者的腫瘤至少減退了一半，另有6％患者的腫瘤完全消退了。β-葡聚糖被認為可以明顯增強這一療法的療效，β-葡聚糖可以促進抗體標記的腫瘤細胞的滅亡。
劑型及使用可溶性葡聚糖和激活補體的抗體可順序給藥、同時給藥或分次給藥。此外，給藥的次序可以互換，抗體可以是自然存在的抗體。
適用于本發(fā)明的口服劑型包括膠囊、凝膠劑、扁膠囊、片劑、泡騰粉劑、泡騰片劑、非泡騰粉劑、非泡騰片劑、粉劑或顆粒劑、水合溶液、水合懸浮液、非水合溶液、非水合懸浮液、水包油乳液或油包水乳液。本發(fā)明中的化合物還可以以大丸劑、藥糖劑或膏劑形式存在。
一般而言，這些劑型是通過活性成分與液相載體或細微的固相載體或同時與固、液相載體均勻混合后再進行必要的成形加工而制得的。藥物載體是根據(jù)所選的給藥途徑和標準制藥方法而選定的。每種載體在與制劑中其他成分相兼容的方面上必須是“可接受的”，而且載體絕對不能對個體造成傷害。載體可以是固相載體或液相載體，具體的載體類型一般根據(jù)所選用的給藥類型而定。具體適用的固相載體包括乳糖、蔗糖、凝膠、瓊脂和整裝粉劑。具體適用的液相載體包括水、藥理上可接受的脂肪和油類物質(zhì)、醇類物質(zhì)或其他有機溶劑、其中包括酯類物質(zhì)、乳液、糖漿或酏劑、懸浮液、溶液和/或懸浮液、由非泡騰顆粒再造的溶液和/或懸浮液以及由泡騰顆粒再造的泡騰制劑。這些液相載體可含有適用的溶劑、防腐劑、乳化劑、懸浮劑、稀釋劑、甜味劑、增稠劑和熔化劑。優(yōu)選的載體為食用油，比如玉米或蕓苔油。聚乙烯醇也是比較理想的載體。
口服給藥所用的劑型可含有無毒的、藥理上可接受的惰性載體，比如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露醇、山梨醇、環(huán)糊精、環(huán)糊精衍生物等。
膠囊和片劑易于制造并易于吞咽或咀嚼。片劑可含有適當(dāng)?shù)妮d體、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑、引流或熔化劑。片劑可通過壓制或模制而制成，可以選擇的是，片劑可與一種或多種輔劑制在一起。壓制的片劑可通過將自由流體形式(比如粉未、顆粒)的活性成分擠壓成形而制得?？梢赃x擇的是，自由流動形式的活性成分可以與粘合劑(比如凝膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(比如淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素)、表面活性劑或分散劑混合在一起。適用的粘合劑包括淀粉、凝膠、諸如葡萄糖或β-乳糖這樣的天然糖類物質(zhì)、玉米甜味劑、諸如阿拉伯膠、西黃芪樹膠或海藻酸鈉這樣的天然膠質(zhì)和合成膠質(zhì)、羧甲基纖維素、聚乙烯醇、蠟質(zhì)物質(zhì)等?？梢杂糜谄瑒┑臐櫥瑒┌ㄓ退徕c、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃胞膠等。模壓成形的片劑可通過在適當(dāng)?shù)臋C械中將惰性稀釋液濕潤的活性成分粉未壓模成形而制得。
可以選擇的是，片劑還可以加上包衣和標記，并可以制成緩慢釋放活性成分的劑型或受控釋放活性成分的劑型。此外，還可以在片劑上加上腸溶包衣，從而在胃部以外的消化道中釋放藥物成分。
藥理上可接受的具體載體和制備本發(fā)明中口服劑型所用的賦形劑在3,903,297號美國專利中有所說明，該專利于1975年9月2日被授予Robert，該專利在此通過引證被并入本文。下列文獻對制造本發(fā)明藥劑所用的技術(shù)和材料進行了說明《(7Modem Pharmaceutics》的第9、10章(Banker和Rhodes編輯，1979)、Lieberman等人所著的《藥劑形式片劑》(1981)以及Ansel所著的《藥劑形式導(dǎo)論》(第2版，1976)。
適合全身給藥的劑型包括水合劑型和非水合劑型，這些劑型與給藥對象的血液具有相同的張力，適合全身給藥的劑型還包括水合無菌懸浮液和非水合無菌懸浮液，這些懸浮液包括的懸浮系統(tǒng)可使懸浮液中的化合物以血液成分為目標或以一個或多個器官為目標。這些制劑可存放在單劑量或多劑量密封容器中，比如存放于安瓿瓶或玻璃瓶中。從無菌粉未、顆粒以及前面所述的片劑可以制備出現(xiàn)用的注射溶液和懸浮液。全身給藥劑型和靜脈注射劑還可以包括礦物質(zhì)和其他物質(zhì)，從而使這些劑型與注射類型或所選的釋藥系統(tǒng)相適應(yīng)。
本文所引述的所有文獻在些通過引證被并入本文?，F(xiàn)在將通過下面的實例對本發(fā)明進行說明，這些實例并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
實例CR3在全葡聚糖顆粒的抗腫瘤活性中發(fā)揮著非常重要的作用。通過對iC3b調(diào)理過的酵母的中性粒細胞吞噬作用機理進行研究，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CR3的作用在于介導(dǎo)對全葡聚糖顆粒的反應(yīng)。當(dāng)iC3b附著在某一表面上時，它可以被血清蛋白剪切下來，從而形成更小的iC3b片段。當(dāng)iC3b處于“失活”狀態(tài)時，iC3b不能形成攻擊膜的絡(luò)合物，但iC3b仍然附著在表面上，此時iC3b的作用是吸引中粒性細胞和巨噬細胞，這兩種細胞可以吞噬可破壞被標記(“調(diào)理過的”)細胞。在中性粒細胞和巨噬細胞的表面存在著補體受體(CR3)，該補體受體與iC3b相結(jié)合。圖1表明了酵母被免疫系統(tǒng)消滅的過程。
刺激CR3依賴性吞噬作用或脫粒作用需要CR3內(nèi)兩個不同的位點同時發(fā)生連接作用；一個位點專門與iC3b相連，另一個位點專門與酵母細胞壁的全葡聚糖顆粒相連。正如圖2所示的，由于酵母在細胞表面上缺乏能與CR3相結(jié)合的全葡聚糖顆粒，所以經(jīng)過iC3b調(diào)理過的酵母菌通過CR3與中性粒細胞相結(jié)合，但不會刺激吞噬作用或脫粒作用。然而，正如圖3所示的，所加入的全葡聚糖顆粒可以與CR3的凝集素位點相結(jié)合，從而激活帶有受體的免疫細胞，并由此觸發(fā)外源性物質(zhì)的脫粒作用或吞噬作用。甘露聚糖中富含可溶性的由酵母多聚衍生出的多糖，β-葡聚糖與CR3具有較高的親和力，β-葡聚糖誘導(dǎo)受體的啟動。
圖4表明的是在iC3b調(diào)理過的乳房癌細胞觸發(fā)細胞毒性過程中全葡聚糖顆粒對鼠源性中性粒細胞CR3的誘導(dǎo)作用。當(dāng)使用正常的中性粒細胞時，加入β-葡聚糖會產(chǎn)生針對iC3b調(diào)理過的乳房腫瘤細胞較高的細胞毒性。然而，當(dāng)加入CD11b(鼠源性CR3的等效物)的抗體時，受體與iC3b相結(jié)合的能力受到了干擾，所以這種細胞毒性便消失了。在圖4右側(cè)表明的是，即使當(dāng)使用β-葡聚糖進行刺激時，缺乏CD-11b小鼠的中性粒細胞也不能介導(dǎo)iC3b調(diào)理過小鼠的細胞毒性，這再次表明了該受體的重要性。正如所預(yù)料的，加入抗CD11b抗體對缺乏CD11b的中性粒細胞幾乎沒有影響。
圖5表明的是腫瘤細胞被免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和C3所包裹。這一點十分有意義，因為它表明適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對這些腫瘤細胞出現(xiàn)了微弱的反應(yīng)，并且當(dāng)這種現(xiàn)象可用來觸發(fā)細胞毒性反應(yīng)時，腫瘤的生長可得到抑制或消除。雙色流式細胞儀被用來區(qū)分乳房腫瘤細胞和正常的乳房表皮細胞，并表明大多數(shù)腫瘤細胞帶有免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和C3。研究人員對取自兩個患者的新鮮腫瘤的單細胞懸浮液進行了分析。圖5表明的是從一位患者身上取下的腫瘤所得到的結(jié)果。通過使用生物素化抗粘蛋白-維生素H單克隆抗體BrE-3進行染色來區(qū)分惡性細胞和正常的乳房表皮細胞。通過使用與異硫氰酸熒光素相連的抗體進行雙重染色來確定MUC1呈陽性的惡性細胞上存在免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和C3。正如可以看到的，大多數(shù)MUC1陽性細胞帶有免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和C3。只有很少部分MUC1日性細胞沒有發(fā)生C3調(diào)理作用。在MUC1陰性細胞上幾乎沒有出現(xiàn)C3或免疫球蛋白染色，這代表著正常乳房表皮細胞。
另一方面，全葡聚糖顆粒與CR3相結(jié)合，刺激中性細胞的脫粒作用并刺激巨噬細胞分泌幾種細胞因子，這些細胞因子會促進Th1型T細胞反應(yīng)并促進對腫瘤或微生物的長期免疫力。顆粒型β-葡聚糖還可在體外和體內(nèi)啟動CR3，從而產(chǎn)生細胞毒性。
天然殺傷細胞是先天免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，天然殺傷細胞通過Fas配體或通過形成MAC絡(luò)合物并插入誘導(dǎo)脫噬作用的酶來刺激脫噬作用，從而殺死腫瘤細胞。天然殺傷細胞通過瞄準由于腫瘤作用或病毒作用而失去MHC蛋白的細胞而恢復(fù)巨噬細胞的活性。對于天然細胞的CR3依賴型細胞毒性而言，還需要與目標細胞相結(jié)合的CR3。圖6表明的是對從12個患者身上新取下的腫瘤進行試驗的結(jié)果，通過這些試驗確定腫瘤細胞是否帶有足夠數(shù)量的C3，其中帶有可溶性酵母多糖啟動過的CR3的天然殺傷細胞在識別腫瘤細胞和產(chǎn)生細胞毒性時需要足夠數(shù)量的C3。使用鉻51對新鮮的有活性的腫瘤細胞懸浮液進行示蹤，并對該懸浮液受天然殺傷細胞細胞毒性的影響程度進行測試，其中的天然殺傷細胞是從正常的不相關(guān)的個體身體上取得的，并在37℃下經(jīng)過4小時的培養(yǎng)。在可溶性酵母多糖中加入β-葡聚糖可有力地加強天然殺傷細胞的活性。雖然在未被激活的天然殺傷細胞中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒性，但使用2.0微克/毫升的可溶性酵母多糖對天然殺傷細胞進行處理可使天然殺傷細胞的細胞毒性從32％上升到了54％。隨腫瘤細胞一同被取下的正常乳房表皮細胞的存在可能會阻止細胞毒性達到較高的水平，其中正常的乳房表皮細胞是C3陰性細胞。
圖7表明的是β-葡聚糖療法的療效，該圖表明了β-葡聚糖療法對Balb/c小鼠的Ptas64乳腺癌進行治療的結(jié)果。在該項實驗中SZPm(β-甘露多糖中富含的可溶性酵母多糖)被用作β-葡聚糖的來源。Ptas64乳腺癌被植入到Balb/c小鼠體內(nèi)。在6次實驗中，每次實驗室用兩組小鼠，每組由6只小鼠組成。在每次實驗中，每天通過腹膜內(nèi)注射或靜脈注射方式對兩組小鼠使用200微克的可溶性酵母多糖(SZPm)。由6只小鼠組成的對照組每天通過靜脈注射方式接受磷酸鹽緩沖鹽水。使用SZPm對30只小鼠進行三次實驗，然后再使用不含LPS的SZPm對另外90只小鼠進行三次同樣的實驗。在每次實驗后測定治療組小鼠的平均腫瘤重量，并與對照組小鼠的平均腫瘤重量進行比較。圖7中的每根棒圖代表的是每個治療組的平均值±標準偏差。正如可以看到的，對于腹膜內(nèi)注射β-葡聚糖和靜脈注射β-葡聚糖的情況而言，腫瘤重量分別急劇減少到了原重量的4％和10％。此外，在使用不含LPS的SZPm所進行的實驗中，由于LPS的原因沒有出現(xiàn)腫瘤消退現(xiàn)象，LPS是一種眾所周知的免疫促進劑。
圖8表明的是β-葡聚糖療法既需要腫瘤細胞上帶有C3同時也需要白細胞帶有CR3。使用植入MMT乳腺癌細胞并缺乏C3的129/J小鼠進行實驗可以證實β-葡聚糖療法需要C3。在該項實驗中，在12只正常(C3+/+)的129/J小鼠和12只缺乏C3的129/J小鼠體內(nèi)植入MMT乳腺癌細胞系，在小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了可察覺到的癌腫后對小鼠進行治療，每組小鼠由6只小鼠組成，一組小鼠通過每天靜脈注射磷酸鹽緩沖鹽水進行治療，另一組小鼠通過每天靜脈注射β-葡聚糖進行治療。使用同樣的方法對植入Ptas64乳腺腫瘤細胞的正常(CD+/+)小鼠和乏CD3(沒有CD//b，CD//b-/-)的Balb/c小鼠進行試驗。正如圖中所示的，β-葡聚糖療法可使正常129/J小鼠體內(nèi)的腫瘤減少79％，這與正常Blab/c小鼠的結(jié)果是相似的。對腫瘤進行的流式細跑測定表明，在80％以上的腫瘤細跑上沉積有大量的C3。相比之下，在缺乏C3的129/J小鼠中腫瘤沒有出現(xiàn)明顯的減小，腫瘤細胞上沒有C3。腫瘤細胞上存在的免疫球蛋白G的相對數(shù)量在正常小鼠和缺乏C3的小鼠間并無差別，通過染色測試可以證實這一點。
下一步是要證明β-葡聚糖可用來增強單克隆療法的療效。這些實驗的結(jié)果在圖9中表明，該圖表明了β-葡聚糖可以增強抗腫瘤的單克隆抗體對肝臟EL-4淋巴瘤的療效。之所以測試EL-4淋巴瘤對β-葡聚糖療法的響應(yīng)是因為這種腫瘤與其他腫瘤不同，該同系基因型宿主(C57BL/6)并不表達天然抗體，其他的天然抗體使用C3調(diào)理腫瘤細胞。在實驗中通過靜脈注射方式向小鼠體內(nèi)注入EL-4細胞，這是導(dǎo)致肝臟發(fā)生同質(zhì)蛻變的已知方法。在注入EL-4細胞10天后，每天通過靜脈注射方式對小鼠使用β-葡聚糖、抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂(EL-4細胞的主要腫瘤抗原)的3F8單克隆抗體或β-葡聚糖加3F8單克隆抗體。3F8單克隆抗體是免疫球蛋白G3，該抗體是強力的補體激活劑，該抗體還調(diào)節(jié)抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性。正如其他實驗已經(jīng)表明的，單獨使用3F8就可使EL-4肝臟腫瘤得到明顯的退化(減小73.5％)。正如所預(yù)料的，由于腫瘤細胞帶有很少iC3b或沒有iC3b，所以單獨使用β-葡聚糖幾乎沒有效果。然而，同單獨使用3F8相比，聯(lián)合使用β-葡聚糖和3F8可使肝臟腫瘤出現(xiàn)更顯著的消退。
圖10表明的是大麥產(chǎn)生的β-葡聚糖(大麥通常產(chǎn)生(1，3)，(1，4)-β-D-葡聚糖)也可以增強單克隆抗體的抗腫瘤活性。通過皮下異種嫁接方式在無胸腺Balb/c小鼠體內(nèi)植入成神經(jīng)細胞腫瘤細胞。每5只小鼠組成一組，在植入腫瘤細胞2周后當(dāng)腫瘤的直徑達到0.7～0.8厘米時開始進行治療。在使用β-葡聚糖進行治療的小組中，每天口服400微克的β-葡聚糖，治療期為21～29天。單克隆抗體(3F8)通過靜脈注射方式給藥，用藥量為每周2次，每次200微克。從治療的第一天開始測量腫瘤的大小。所測得的最大直徑被表達為第零天腫瘤直徑的百分數(shù)。正如可以看到的，無論是單獨使用β-葡聚糖還是單獨使用單克隆抗體都沒有取得較大的效果。然而，當(dāng)β-葡聚糖和單克隆抗體聯(lián)合使用時，腫瘤的生長得到了明顯的抑制。
表1.蔗糖和中性粒細胞被異硫氰酸熒光素示蹤多糖熒光染色的CR3特性
表1所表明的是各種來源的β-葡聚糖的蔗糖特異性，同時還表明了流式細胞測定儀對各種純β-葡聚糖-異硫氰酸熒光素制劑的測定結(jié)果。右旋糖酐-異硫氰酸熒光素和α-甘露多糖-異硫氰酸熒光素沒有出現(xiàn)特異性染色。即使每種多糖-異硫氰酸熒光素制劑所產(chǎn)生的中性粒細胞染色強度比SZP-異硫氰酸熒光素的染色強度低，每種多糖-異硫氰酸熒光素的熒光性也同樣受到過量未蹤同源β-葡聚糖、未示蹤的SZP或抗CR3的抑制。對達到最大染色程度所需的多糖濃度進行的比較表明，由于SZP或MPβ-葡聚糖(從分子探針得到的可溶性β-葡聚糖)中任何一個達到飽和狀態(tài)需要濃度為2微克/毫升的己糖，所以SZP和MPβ-葡聚糖具有最強的親和力。由于異硫氰酸熒光素與多糖的摩爾比有可能發(fā)生變化，并且不容易通過計算得到，所以單獨多糖-異硫氰酸熒光素所產(chǎn)生的熒光強度值無法進行比較。
對SZP-異硫氰酸熒光素染色程度抑制50％所需β-葡聚糖濃度進行比較可以得出CR3對SZP的親和力比β-葡聚糖對SZP的親和力高。中性粒細胞在4℃和不同濃度的β-葡聚糖(SZP、昆布多糖、MPβ-葡聚糖、大麥β-葡聚糖和蘑菇多糖)、α-甘露多糖或右旋糖酐條件下培養(yǎng)15分鐘，然后加入1.0毫克/毫升的SZP-異硫氰酸熒光素進行染色，然后再在4℃下培養(yǎng)15分鐘。然后對抑制百分數(shù)和多糖濃度進行比較。雖然將SZP-異硫氰酸熒光素染色程度抑制50％需要0.2微克/毫升的己糖，但未示蹤的β-葡聚糖要將SZP-異硫氰酸熒光素染色程度抑制50％需要5毫克/毫升的己糖(MPβ-葡聚糖或昆布多糖)到75微克/毫升的己糖(蘑菇多糖)。當(dāng)對相同的未示蹤多糖抑制昆布多糖β-葡聚糖-異硫氰酸熒光素染色進行測試時可以得到相似的結(jié)果。在兩個試驗中抑制活性的排位的是SZP＞昆布多糖＞MPβ-葡聚糖。然而，CMβ-葡聚糖(從酵母得到的羧甲基β-葡聚糖)、大麥β-葡聚糖和蘑菇多糖抑制昆布多糖-異硫氰酸熒光素染色的效率高于其抑制SZP-異硫氰酸熒光素染色的效率?？傊?，這些結(jié)果表明大麥β-葡聚糖對CR3的親和力相對低于可溶性酵母MPβ-葡聚糖或SZP對CR3的親和力。
正如表1所示的，大麥β-葡聚糖對CR3的親和力低于酵母β-葡聚糖對CR3的親和力。圖11表明了酵母β-葡聚糖和大麥β-葡聚糖在單獨使用時和與抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體聯(lián)合使用時這兩種β-葡聚糖抗腫瘤效果的比較結(jié)果，其中GD2神經(jīng)節(jié)苷脂是RMA-S淋巴瘤表達的腫瘤抗原?？扇苄云暇厶堑挠盟巹┝繛?0毫克/公斤，大麥β-葡聚糖的用藥劑量為60毫克/公斤。結(jié)果表明，單獨使用可溶性葡聚糖比單獨使用大麥β-葡聚糖更有效?？扇苄云暇厶堑膯挝恢亓啃拭黠@更高。當(dāng)與單克降抗體聯(lián)合使用時，可溶性葡聚糖還能更快地抑制腫瘤，可溶性葡聚糖比大麥β-葡聚糖早5天使腫瘤的直徑減小到2毫米。對使用抗GD2單克隆抗體和可溶性葡聚糖β-葡聚糖進行治療的小鼠進行目測觀察還可發(fā)現(xiàn)在接受B5非特異性單克隆抗體治療的對比小鼠間存在著較大的差別。雖然對比小鼠長出了大的致死性腫瘤，但使用可溶性葡聚糖和單克隆抗體治療的小鼠只有很小的腫瘤，或者未出現(xiàn)腫瘤，其中50％的小鼠可以長期存活。綜合來看，這些結(jié)果表明可溶性葡聚糖比大麥β-葡聚糖具有明顯的優(yōu)勢。
本發(fā)明對顆粒型β-葡聚糖與抗體的使用進行了說明，其中可溶性葡聚糖基本上可由任何來源產(chǎn)生，抗體包括感染所引發(fā)的自然抗體、疫苗所引發(fā)的抗體以及直接使用的單克隆抗體；其中單克隆抗體是療法的一個組成部分，該療法包括使用β-葡聚糖。
在某些實施方案中，需要一種能夠充分激活補體從而使iC3b沉積在腫瘤細胞上的抗體。在大多數(shù)情況下，對抗體介導(dǎo)補體直接殺滅腫瘤細胞的能力進行評估。除美羅華外，大多數(shù)治療性抗體激活補體，但補體沒有能力殺滅腫瘤細胞。這一點與葡聚糖療法無關(guān)。并不需要補體來殺滅腫瘤細胞，所需要的是表面上結(jié)合有iC3b的補體，這些補體以腫瘤細胞為靶細胞。iC3b沉積在腫瘤細胞上所需要的激活補體大大少于補體殺滅腫瘤細胞所需要的激活補體。因此，腫瘤細胞上補體抑制劑的存在會充分阻止補體激活，從而阻止補體直接殺滅腫瘤細胞，但激活的補體足以用iC3b來標記腫瘤細胞。
圖12表明的是在口服全鋪聚糖顆粒和單克隆抗體聯(lián)合療法中殺滅腫瘤細胞的活性與白細胞三烯B4受體吸收白細胞之間的關(guān)系。圖12表明，除天然殺傷細胞外，抗腫瘤反應(yīng)中還涉及單核細胞和中性粒細胞。白細胞三烯B4是一種化學(xué)引誘物，它主要由中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生。白細胞三烯B4涉及到多個過程，其中包括促進白細胞向血液外的遷移、激活中性粒細胞、引發(fā)炎性疼痛、提高宿主對感染的抵抗力、增加白細胞間素的生成和轉(zhuǎn)錄。由于白細胞三烯B4的存在對于β-葡聚糖的抗腫瘤活性十分重要，所以很明顯，除天然殺傷細胞外，巨噬細胞和中性粒細胞也參與了免疫反應(yīng)。
天然殺傷細胞在調(diào)節(jié)宿主抵抗力方面的作用包括直接殺滅腫瘤細胞和分泌諸如腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ這樣的細胞因子，這些細胞因子可以潛在地調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及補充殺滅腫瘤的巨噬細胞。雖然通過激活CR3可以調(diào)節(jié)天然殺傷細胞對腫瘤的直接殺滅毒性，但其他的研究表明激活CR3也可觸發(fā)細胞因子的分泌。為證實這一點，研究人員進行了相關(guān)實驗，圖13表明了實驗結(jié)果。圖13表明了β-葡聚糖對天然殺傷細胞分泌腫瘤細胞壞死因子-α的CR3依賴性刺激。人類天然殺傷細胞或者使用顆粒狀酵母β-葡聚糖或使用可溶性CR3結(jié)合多糖在37℃下培養(yǎng)18小時。然后使用聯(lián)免疫吸附測定法對培養(yǎng)上清液進行了分析。顆粒狀酵母β-葡聚糖(2微克/毫升)和灰樹花多糖(由多葉奇果菌產(chǎn)生的500Kda可溶性β-葡聚糖，2微克/毫升)能夠與表面CR3分子上的凝集素位點相結(jié)合和形成交聯(lián)，從而激活細胞分泌腫瘤壞死因子-α和白細胞間素-6(未在圖中表明)。相比之下，小的(20KDa)可溶性酵母β-葡聚糖(MPβ-葡聚糖，2.0微克/毫升)和SZP(含有β-低甘露聚糖和/或β-葡聚糖的可溶性酵母多糖制劑，2.0微克/毫升)只與單個的CR3分子相結(jié)合，在缺乏靶細胞的情況下不會促進細胞的因子的釋放。與天然殺傷細胞CR3依賴型細胞毒性一樣，小β-葡聚糖與CR3的結(jié)合可導(dǎo)致受體的啟動，受體的啟動是此后釋放細胞因子所需的條件，與iC3b調(diào)理過的靶細胞(使用iC3b-“+EC3b”調(diào)理過的羊體紅細胞)形成配位連接可觸發(fā)細胞因子的釋放。EC3bi靶細胞在缺乏多糖啟動作用的情況下不會觸發(fā)天然殺傷細胞釋放細胞因子。在多糖啟動CR3之后，與iC3b靶細胞形成配位連接可誘導(dǎo)天然殺傷細胞分泌腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ干擾素-α和白細胞間素-6。加入濃度為5毫克/毫升的抗CD11b單克隆抗體可阻止天然殺傷細胞分泌這四種細胞因子。抗CR3可阻止β-葡聚糖與CR3的結(jié)合，并可阻止經(jīng)過啟動的CR3與EC3bi靶細胞上的iC3b結(jié)合。
圖13表明了這些結(jié)果，天然細胞分泌細胞因子與CR3被激活而產(chǎn)生細胞毒性是同步發(fā)生的。顆粒型β-葡聚糖可強力觸發(fā)CR3依賴型中性細胞過氧化物的爆發(fā)，顆粒型β-葡聚糖同樣會觸發(fā)天然殺傷細胞釋放出CR3依賴型細胞因子。細胞因子的分泌不是與CR3的初始啟動過程同時發(fā)生的，CR3的初始啟動過程是與小型可溶性β-葡聚糖與CR3結(jié)合的過程同時進行的，在經(jīng)過β-葡聚糖啟動的CR3與iC3b調(diào)理過的靶細胞形成交聯(lián)接連所觸發(fā)的CR3激活步驟后，天然殺傷細胞才分泌細胞因子。使用EC3bi在介質(zhì)中單獨培養(yǎng)天然殺傷細胞并不會刺激天然殺傷細胞溶解EC3bi，也不會觸發(fā)天然殺傷細胞分泌細胞因子。然而，在使用可溶性(或顆粒型)β-葡聚糖啟動天然殺傷細胞的CR3后加入EC3bi，使用聯(lián)免疫吸附測定法可檢測到分泌出的腫瘤壞死因子-α、干擾素-α、干擾素-γ和白細胞間素-6。分泌這些細胞因子依賴于CR3，因為當(dāng)同時加入靶目標EC3bi和CD121b單克隆抗體時，細胞因子的分泌會遭到抑制。
這一數(shù)據(jù)進一步說明了β-葡聚糖在癌癥免疫療法中的成功應(yīng)用。除了當(dāng)經(jīng)過β-葡聚糖啟動過的天然殺傷細胞進入到iC3b調(diào)理過的腫瘤細胞中時可觸發(fā)細胞毒性外，這種由iC3b調(diào)理過的腫瘤細胞所刺激產(chǎn)生的局部細胞毒性還伴隨細胞因子的分泌，但細胞因子的分泌是局部的，并不是全身性的。
實例2材料和方法抗體和其他試劑Hiroshi Fugi博士(紐約州水牛城Roswell Park癌癥研究院分子免疫學(xué)分部)慷慨地提供了產(chǎn)生雜交瘤的抗小鼠乳房腫瘤病毒11C1免疫球蛋白G2a(見Raychaudhuri S.等人在《免疫學(xué)》雜志上發(fā)表的文章，1371743-1749(1986))。Nai-Kong V.Cheung博士(紐約Sloan-Dettering癌癥中心)慷慨提供了3F8免疫球蛋白G3抗GD神經(jīng)節(jié)苷脂單克隆抗體(見Saito M.、Yu R.K和Cheung N-K.V.在《生物化學(xué)生物物理研究通訊》上發(fā)表的文章)，該單克隆抗體經(jīng)過提純處理并存在于無菌的檸檬酸鹽緩沖鹽水中。Ralph A.Reisfeld博士(加州Scripps臨床研究院)慷慨提供了高純14.G2a免疫球蛋白G2a抗GD2單克隆抗體(見Hank J.A.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，505234-5239，1990，見Uttenreuthetr-Fischer M.和M.Huang等人在《癌癥免疫療法》上發(fā)表的文章，4129-36，1995)以及雜交瘤。Ian F.C.McKenzie(澳大利亞Austin研究院)提供了產(chǎn)生免疫球蛋白G2b抗人類MUC1單克隆抗體的BCP8雜交瘤(見Xing P.X.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，522310-2317(1992))。Emil Umanue博士(華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院)提供了產(chǎn)生鼠源性抗鼠類粒性白細胞單克隆抗體RB6-8C5(LY-6G-抗GR-1)(見Hestdal K.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，14722-28，(1991))。分泌鼠源性免疫球蛋白G2a單克隆抗體的B5雜交瘤從美國標準菌庫中獲得。其中鼠源性免疫球蛋白G2a單克隆抗體對人類的高分子量黑色瘤抗原具有特異性。分離出的免疫球蛋白G在小鼠腫瘤療法中被用作“非特異性”單克隆抗體對照物。每種雜交瘤在1～2％的FCS和BD雜交瘤介質(zhì)中生長，然后在生物反應(yīng)器中生長，從而生成富含單克隆抗體的培養(yǎng)后介質(zhì)，隨后按硫酸銨沉淀、單-Q快速蛋白液相色譜法和單-S快速蛋白液相色譜法這一順序?qū)慰寺】贵w進行提純。提純后的單克隆抗體通過超濾過程進行消毒，并使用Triton X-114(見Aida Y.和Pabst M.J.等人在《免疫方法》上發(fā)表的文章，132191-195(1990))進行萃取而去除可察覺到的LPS。
羊源性抗鼠體抗體免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和異硫氰酸熒光素示蹤的C3從ICN Biomedicals/Cappell購買，這些物質(zhì)被用于使用流式細胞測定儀對免疫球蛋白和經(jīng)過C3調(diào)理過的腫瘤細胞懸浮液的分析?？故篌wCD45-PerCP-Cy5.5、抗鼠體CD80-異硫氰酸熒光素、抗Gr-1-PE、抗鼠體CD11-異硫氰酸熒光素以及正確示蹤的同類型對照物從BD Biosciences Phamingen購買。鼠源性抗鼠體F4/80-異硫氰酸熒光素及其同類型對照物從Calrag實驗室獲得。
治療所用的β-葡聚糖全葡聚糖顆粒制劑是從明尼蘇達州的生物聚合物工程公司獲得的。大麥葡聚糖可從任何的商業(yè)渠道獲得，比如從Sigma化學(xué)公司獲得，使用本領(lǐng)域已知的方法加工和制備可溶性葡聚糖，比如使用Xia Y.等人在《免疫學(xué)》上所發(fā)表文章(1622281-2290(1999))以及Thornton B.P.等人在《免疫學(xué)》上所發(fā)表文章(1561235-1246(1996))所述的方法加工和制備可溶性葡聚糖。
小鼠和腫瘤模型正常的Balb/c和C57B1/6小鼠購自于Jackson實驗室或NCI-Frederick公司。缺乏C3的雜種小鼠(C3+/-)購自于Jackson實驗室，這些小鼠被用來建立繁殖種群，從該種群中衍生出缺乏C3的純種小鼠(C3+/-)以及它們的野生型(C3+/+)C57B1/6同胞。缺乏CR3(CD11b-/-)的C57B1/6小鼠(見Coxon A.和Rieu等人在《免疫》上發(fā)表的文章，5553-666，(1996)及其野生型(CD11b+/+)C57B1/6同胞仔的繁殖種群是從TanyaMayadas-Norton博士(波士頓Brigham婦女醫(yī)院和Harnard醫(yī)學(xué)校)獲得的。通過分別使用定量半徑免疫擴散法對血清C3進行分析以及使用免疫熒光染色法和流式細胞測定儀對血液中性粒細胞CD11b的表達進行分析來證實C3-/-和CR3-/-的表型及其同胞小鼠。
Blab/c乳腺癌被稱為Ptas64(或64PT)，這種癌細胞是從Wei-Zen Wei博士(底特律Karmonos癌癥中心和Wayne州立大學(xué))獲得的。該腫瘤細胞系表達小鼠乳房腫瘤病毒(鼠源性乳腺腫瘤病毒)膜抗原，使用11C1單克隆抗體可檢測到這種膜抗原。以前的研究表明，正常Blab/C小鼠血清中含有自然存在的抗體，這些抗體能與Ptas64發(fā)生反應(yīng)，這些抗體通過免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和C3來調(diào)理腫瘤細胞在體內(nèi)的生長；以前的研究還表明，靜脈注射11C1單克隆抗體可提高細胞表面對免疫球蛋白G和C3的吸收量(見Yan J.等人在《免疫學(xué)》上發(fā)表的文章，1633045-3052(1990))。在四組小鼠的乳腺脂肪墊內(nèi)，通過皮下注射方式植入1.0×106個腫瘤細胞，并使腫瘤細胞在小鼠體內(nèi)生長7～10天。當(dāng)使用測徑器測得腫瘤的平均長度和寬度達到3～4毫米時開始對小鼠進行治療。每隔2天對腫瘤的大小進行一次測量，當(dāng)腫瘤直徑達到15毫米時殺死小鼠。
高度表達膜GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的C57B1/6淋巴瘤EL-4由Nai-Kong V.Cheung博士提供。通過靜脈注射方式向正常的C57B1/6小鼠體內(nèi)植入3×105個EL-4細胞，從而使小鼠長出肝臟腫瘤(見Zhang H.等人在《癌癥研究》上發(fā)表的文章，582844-2849(1998))。在治療2星期后，取出接受治療小鼠的肝臟并對其進行稱重，然后與正常的未患腫瘤的小鼠肝臟進行比較。用患有腫瘤小鼠的肝臟重量減去正常小鼠的肝臟重量(1.0克)可以得出肝臟腫瘤的凈重量。使用C57B1/6淋巴瘤RMA-S進行類似的肝臟腫瘤模型實驗，淋巴瘤RMA-S同樣表達GD2神經(jīng)節(jié)苷脂，但在I型MHC(由匹斯堡癌癥研究院的Olivera J.Finn博士提供)聯(lián)合抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂(100微克，每隔2天靜脈注射一次)的14.G2a單克隆抗體的肽加載方面存在著缺陷。治療持續(xù)3個星期，然后對小鼠的存活期進行長期觀察。
轉(zhuǎn)染了人類MUC1的RMA-S腫瘤細胞也由Finn博士提供，通過皮下植入方式在C57B1/6小鼠的乳房脂肪墊內(nèi)或脂肪墊附近植入1×106個RMA-S腫瘤細胞。在植入腫瘤細胞后8-10天，小鼠的體內(nèi)出現(xiàn)了3～4毫米的腫瘤，此時使用14.2a抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體或BCP8抗MUC1單克隆抗體在聯(lián)合使用β-葡聚糖或不聯(lián)合使用β-葡聚糖的情況下進行治療，治療持續(xù)2星期或3星期，然后按前面所述的過程測量腫瘤，當(dāng)腫瘤直徑達到15毫米時殺死小鼠。對沒有腫瘤的小鼠進行為期90～120天的生存期觀察。
由C57B1/6小鼠衍生出來的路易氏肺癌細胞(LL/2、CRL-1642)是從美國標準菌庫中獲得的。使該肺癌細胞轉(zhuǎn)染含有人類MUC1 CDNA的質(zhì)粒，該質(zhì)粒由Olivera Finn博士提供。LL/2細胞系均勻表達高表面強度的MUC1，通過對BCP8-異硫氰酸熒光素單克隆抗體染色的細胞進行熒光激活細胞分類而對LL/2細胞系進行選擇。通過使該細胞系兩次通過皮下方式經(jīng)過C57B1/6小鼠而對該細胞系進行進一步的選擇。被選用的腫瘤細胞系既在表面上高度表達MUC1，同時又能夠在植入5×105個腫瘤細胞的情況下在C57B1/6小鼠的皮下產(chǎn)生腫瘤。在植入腫瘤細胞7天后，當(dāng)腫瘤直徑達到1～2毫米時開始對患皮下腫瘤的小鼠進行治療。治療過程持續(xù)3個星期，其中每隔2天對腫瘤直徑進行一次測量，當(dāng)腫瘤直徑達到15毫米時殺死小鼠。對沒有腫瘤的小鼠做為期90天的長期生存觀察。
根據(jù)數(shù)據(jù)進行繪圖以及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析腫瘤治療的全部數(shù)據(jù)被輸入Prism3.0(加州圣選哥圖板軟件公司的軟件)，從而生成腫瘤退化或小鼠存活的圖形。然后在Prism3.0進行t檢驗，從而確定不同數(shù)據(jù)組的重要性。
結(jié)果口服酵母全β-葡聚糖顆粒所導(dǎo)致的腫瘤退化和存活情況改善與靜脈注射酵母β-葡聚糖的情況相似。正如在以上“材料和方法”一節(jié)中所述的，在Balb/c小鼠體內(nèi)植入Ptas64腫瘤細胞，植入7天后有腫瘤形成，此時通過單獨靜脈注射抗小鼠乳房腫瘤病毒單克隆抗體進行治療，或在同時靜脈注射可溶性酵母β-葡聚糖或口服全葡聚糖顆粒的條件下進行治療。優(yōu)選的全葡聚糖口服劑量約在200～400微克/天。圖14表明了平均值±標準偏差。
口服可溶性大麥β-葡聚糖或酵母β-葡聚糖顆粒所導(dǎo)致的腫瘤退化需要白細胞的CR3。正如在以上“材料和方法”一節(jié)中所述的，在野生型或缺乏CR3的C57B1/6小鼠的皮下植入RMA-S-MUC1腫瘤細胞，植入10天后有腫瘤形成，此時通過單獨靜脈注射抗GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的14.G2a單克隆抗體進行治療，或在同時口服酵母β-葡聚糖或口服大麥β-葡聚糖的條件下進行治療。在口服β-葡聚糖的當(dāng)天(共10天)，對某些小鼠組靜脈注射單克隆抗體，而其他小鼠組在靜脈注射單克隆抗體前3天口服β-葡聚糖。圖15表明了平均值±標準偏差。
可溶性大麥葡聚糖或顆粒型酵母β-葡聚糖療法要達到長期無腫瘤存活的效果需要白細胞的CR3。圖16表明了結(jié)果。這是圖15所示試驗的存活情況分析。
口服可溶性大麥β-葡聚糖或酵母β-葡聚糖顆粒所導(dǎo)致的腫瘤退化需要血清的C3。正如在以上“材料和方法”一節(jié)中所述的，在野生型或缺乏CR3的C57B1/6小鼠的皮下植入LL/2-MUC1腫瘤細胞，植入7天后有腫瘤形成，此時通過單獨靜脈注射抗MUC1的BCP8單克隆抗體進行治療，或在同時口服酵母β-葡聚糖或口服大麥β-葡聚糖的條件下進行治療。圖17表明了平均值±標準偏差?？诜扇苄源篼溒暇厶腔蝾w粒型酵母β-葡聚糖療法要達到長期無腫瘤存活的效果需要血清的C3。圖18表明了結(jié)果。這是圖17所示試驗的存活情況分析。
口服的熒光素示蹤顆粒型酵母β-葡聚糖被巨噬細胞所吸收，這些巨噬細胞將遷移到脾、淋巴結(jié)和骨髓中。正如在以上“材料和方法”一節(jié)中所述的，使野生型或缺乏CR3的C57B1/6小鼠每天口服全葡聚糖顆粒-熒光素，然后對小鼠進行解剖，從而通過熒光顯微鏡分析含有全葡聚糖顆粒-熒光素的細胞在淋巴組織中的分布情況。結(jié)果表明的是口服全葡聚糖顆粒-熒光素3天后野生型小鼠的脾巨噬細胞。野生型或缺乏CR3小鼠的結(jié)果表明的是，在連續(xù)7天口服全葡聚糖顆粒-熒光素后通過吸收和洗滌從纖維結(jié)合素覆蓋的試驗盤中分離出來的骨髓巨噬細胞。野生型小鼠和缺乏CR3小鼠的骨髓細胞在含有全葡聚糖顆粒-熒光素的細胞比例或細胞大小和每個細胞所含全葡聚糖顆粒-熒光素的數(shù)量方面沒有明顯的差別。使用F4/80-Cy5對骨髓細胞進行的雙重染色證實，所有含有已降解全葡聚糖顆粒-熒光素的細胞都是巨噬細胞。在口服全葡聚糖顆粒-熒光素7～12天后，在野生型小鼠體內(nèi)觀察到了骨髓粒性白細胞，野生型小鼠出現(xiàn)了膜表面熒光染色；但缺乏CR3的小鼠沒有出現(xiàn)骨髓粒性白細胞。
有空白邊緣的粒性白細胞庫吸收可溶性β葡聚糖需要膜表面CR3。正如在以上“材料和方法”一節(jié)中所述的，10只野生型小鼠和10只缺乏CR3的C57B1/6小鼠每天口服全葡聚糖顆粒-熒光素，服用期為12天，然后使用巰基乙酸鹽對腹膜粒性白細胞進行誘導(dǎo)，并使用流式細胞測定儀進行表面熒光染色分析。在這一分析中，使用抗Gr-1-Cy5雙重染色法來鑒別力性白細胞。圖19表明了分析結(jié)果。
在另一實驗中，野生型小鼠和缺乏CR3的C57B1/6小鼠每天口服全葡聚糖顆粒，服用期為7天。使用巰基乙酸鹽對野生型小鼠和缺乏CR3的C57B1/6小鼠的腹膜粒性白細胞進行隔夜誘導(dǎo)，并對這些粒性白細胞在調(diào)節(jié)殺滅iC3b調(diào)理過的Ptas64乳腺腫瘤細胞的能力進行測試，其中經(jīng)iC3b調(diào)理過的Ptas64乳腺腫瘤細胞由鉻51進行示蹤。沒有口服全葡聚糖顆粒的小鼠作為對比組。結(jié)果表明，巰基乙酸鹽從口服全葡聚糖顆粒的野生型小鼠誘導(dǎo)的粒性白細胞能夠在體外調(diào)節(jié)對iC3b調(diào)理過的Ptas64乳腺腫瘤細胞的細胞毒性，但巰基乙酸鹽從缺乏CR3的C57B1/6小鼠誘導(dǎo)的粒性白細胞沒有這種調(diào)節(jié)能力。通過測定釋放出的鉻51數(shù)量來測試口服全葡聚糖顆粒12天后野生型小鼠和缺乏CR3小鼠的粒性白細胞對殺滅iC3b調(diào)理過的Ptas64乳腺腫瘤細胞的細胞毒性進行調(diào)節(jié)的能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到或有能力理解，在只不過是用常規(guī)實驗技術(shù)的情況下，就可以取得與本文所說明的具體實施方案相等同的結(jié)果。這些等同的結(jié)果被認為是在以下權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抑制或消滅腫瘤細胞的方法，該方法包括對需要治療的個體使用治療有效劑量的不溶性全葡聚糖顆粒以及至少一種可激活補體的抗腫瘤抗體，其中葡聚糖和抗體抑制或消滅腫瘤細胞。
2.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中的抗體是通過直接使用單克隆抗體或多克隆抗體而引入的，或者是個體通過癌癥疫苗所產(chǎn)生的。
3.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中的抗體選自曲妥單抗、美羅華、西妥昔單抗以及這些單抗的組合物。
4.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中全葡聚糖顆粒和抗體形成協(xié)同療效。
5.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中全葡聚糖顆粒通過口服方式進行給藥。
6.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中全葡聚糖顆粒通過注射方式進行給藥。
7.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中全葡聚糖顆粒由酵母衍生出來。
8.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中全葡聚糖顆粒由植物或真菌衍生出來。
9.如權(quán)利要求8中所述的方法，其中的植物是大麥。
10.如權(quán)利要求8中所述的方法，其中的真菌是蘑菇。
11.全葡聚糖顆粒和能夠激活補體的抗體制造用于治療贅生細胞的藥物的應(yīng)用，其中全葡聚糖顆粒和激活補體抗體的聯(lián)合使用將阻礙贅生細胞的生長。
12.一種治療贅生細胞的方法，該方法包括對所述細胞使用有效劑量的全葡聚糖顆粒以及可激活補體的抗體，其中的抗體對贅生細胞具有特異性。
13.如權(quán)利要求12中所述的方法，其中葡聚糖和激活補體抗體的聯(lián)合使用將阻礙贅生細胞的生長。
14.如權(quán)利要求12中所述的方法，其中葡聚糖和激活補體抗體的聯(lián)合使用將阻止贅生細胞的生長。
15.如權(quán)利要求12中所述的方法，其中葡聚糖和激活補體抗體的聯(lián)合使用將延長贅生細胞宿主的存活期。
16.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中激活補體的抗體包裹住腫瘤細胞，并通過iC3b在腫瘤細胞上的沉積而激活補體。
17.如權(quán)利要求16中所述的方法，其中全葡聚糖顆粒被巨噬細胞所吸收和降解，降解后形成的片段與骨髓中的中性粒細胞相結(jié)合，并通過趨化性而遷移到抗體覆蓋的腫瘤細胞上并與腫瘤細胞相結(jié)合，其中腫瘤細胞上的補體已經(jīng)通過iC3b在腫瘤細胞上的沉積所激活。
18.一種抑制或消滅腫瘤細胞的方法，該方法包括對需要治療的個體使用有效劑量的不溶性全葡聚糖顆粒，其中全葡聚糖顆粒被巨噬細胞所吸收和降解，降解后形成的片段與骨髓中的中性粒細胞相結(jié)合，并通過趨化性而遷移到抗體覆蓋的腫瘤細胞上并與腫瘤細胞相結(jié)合，其中腫瘤細胞上的補體已經(jīng)通過iC3b在腫瘤細胞上的沉積而被天然存在的能夠激活補體的抗體所激活。
全文摘要
本文涉及使用全葡聚糖顆粒和可激活補體的抗體治療癌癥的方法。全葡聚糖顆粒通過與C3補體蛋白受體CR3相結(jié)合而加強先天免疫系統(tǒng)殺滅腫瘤的活性。這種結(jié)合可增強先天免疫系統(tǒng)的細胞毒性，并刺激活性細胞因子的釋放。
文檔編號A61K39/395GK1697659SQ03824895
公開日2005年11月16日 申請日期2003年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月4日
發(fā)明者加里·R·奧斯羅夫, 戈登·D·羅斯 申請人:生物聚合物工程有限公司, 路易斯維爾大學(xué)研究基金會