專利名稱：新組合物的應(yīng)用及方法
專利說明新組合物的應(yīng)用及方法 本發(fā)明涉及含水抗微生物防腐組合物用于消除或減少微生物污染的分離基質(zhì)中微生物含量的應(yīng)用以及生產(chǎn)這種消除或減少了微生物含量的分離基質(zhì)的方法。
如今許多實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)過程中用到分離基質(zhì)。這些系統(tǒng)可能對于所要吸附的組分或多或少有專一性。這樣的組分可能構(gòu)成所需要產(chǎn)品，或者可能構(gòu)成雜質(zhì)或其它不需要的物質(zhì)，其中不需要的物質(zhì)通過吸附到基質(zhì)上與所需要的成分分離。許多分離系統(tǒng)的共同特點(diǎn)是以聚合物質(zhì)為基礎(chǔ)的分離基質(zhì)，其中聚合物質(zhì)與水相容并在與水溶液(干凝膠)接觸時(shí)形成它們的活性結(jié)構(gòu)。這類基質(zhì)包括但不限于聚丙烯酰胺、纖維素、瓊脂糖及其它多糖。
然而，在有水的情況下這些基質(zhì)可能易感染微生物。當(dāng)高壓滅菌法、化學(xué)滅菌或放射不適用時(shí)，這些情況下微生物生長成為一個(gè)特別的問題。這可能歸因于基質(zhì)固有的敏感性或與基質(zhì)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接的配體由于滅菌操作失活或變化。一個(gè)例子是當(dāng)配體包括以蛋白或肽結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的識(shí)別部分時(shí)。然而，已知許多其它非蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對通常的滅菌技術(shù)也是敏感的。
在防止微生物生長特別重要的領(lǐng)域有許多應(yīng)用。一種這樣的應(yīng)用是以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的藥物或體內(nèi)診斷產(chǎn)品的純化。尤其是在分離基質(zhì)和最終產(chǎn)品都不能按照任何一種用于殺菌的標(biāo)準(zhǔn)方法適當(dāng)滅菌的情況下。一個(gè)這樣的例子是在分離過程中使用固定在基質(zhì)上的蛋白，如用于免疫球蛋白純化的固定化蛋白質(zhì)A、或用于純化各種與之相互作用的物質(zhì)的固定化的免疫球蛋白。另一個(gè)例子是通過利用以抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素包被的分離基質(zhì)獲取生物素?；牡奈镔|(zhì)。
即使在最終產(chǎn)品能夠經(jīng)受最后的成品滅菌的情況下，在制成品滅菌之前在加工和貯存過程中防止微生物不受控制的生長也是至關(guān)重要的。微生物污染的問題不局限于能生存的有機(jī)體的存在，而是包括這樣的有機(jī)體釋放的毒素、熱原或其它有害的產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。這類物系的一個(gè)例子是各種內(nèi)毒素。
要求防止微生物生長的分離基質(zhì)的另一個(gè)應(yīng)用是核酸類物質(zhì)的純化。這時(shí)，即使來源于污染微生物生長的微量DNA物質(zhì)也可能干擾分析方法、基因剪接、或遺傳設(shè)計(jì)物質(zhì)的克隆，尤其是在后者用于藥劑或醫(yī)療用具的生產(chǎn)時(shí)。因此，在許多應(yīng)用中防止分離基質(zhì)中微生物生長都至關(guān)緊要。類似的問題也可能在蛋白、肽或特定的碳水化合物分子的分離時(shí)由于微生物釋放類似性質(zhì)的雜質(zhì)而出現(xiàn)。
因此，需要一種用于大多數(shù)分離基質(zhì)的有效和足夠的處理，借此能夠減少或完全消除污染的微生物。若分離基質(zhì)打算裝在體內(nèi)、體旁或體外應(yīng)用的裝置中使用，而其中血液或其它體液通過所述裝置時(shí)有害物質(zhì)從中被除掉的情況下這是至關(guān)重要的。
用于處理人血漿的臨床體外吸附系統(tǒng)可用于在自身免疫疾病的治療中通過利用蛋白A除去免疫球蛋白(Bygren等，Lancet 1985，1295-1296)或防止移植器官的早期排斥(Palmer等，Lancet 1989，10-12)、和用于在高膽固醇血癥的治療中通過利用固定化的抗低密度脂蛋白抗體除去低密度脂蛋白(LDL)(duMoulin等，1990，Treatment ofSevere Hypercholesterolemia in the Prevention of Coronary HeartDisease，第170-174頁)。
已記載有利用固定化抗物種抗體的體外裝置、方法和這類裝置用于除去與腫瘤的免疫靶向有關(guān)的治療或造影的應(yīng)用(imaging)抗體(HenryCA，1991，第18卷，第565頁；Hofheinz D等，Proc.Am.Assoc.CancerRes.1987第28卷，第391頁；Lear JL，等，Radiology 1991，第179卷，第509-512頁；Johnson TK等，Antibody Immunoconj.Radiopharm.1991，第4卷，第509頁；Dienhart DG等，AntibodyImmunoconj.Radiopharm.1991，第7卷，第225頁；DeNardo GL等，J.Nucl.Med.1993，第34卷，第1020-1027頁；DeNardo GL等，J.Nucl.Med.1992b，第33卷，第863-864頁；DeNardo SJ等，J.Nucl.Med.1992a，第33卷，第862-863頁；US5,474,772；澳大利亞專利號638061和歐洲專利申請90914303.4)。
為了使血液清除更有效和能夠處理全血而不是血漿，將醫(yī)療劑(例如，運(yùn)載細(xì)胞殺傷劑的腫瘤專一的單克隆抗體或用于腫瘤定位的放射性核素)生物素?；⑼ㄟ^親合(例如，生物素結(jié)合的)柱純化。許多出版物提供了證實(shí)該技術(shù)用于純化生物素?；暮头派湫院怂貥?biāo)記的腫瘤專一的抗體既有效又實(shí)用的數(shù)據(jù)(Norrgren K等，AntibodyImmunoconj.Radiopharm.1991，第4卷，第54頁；Norrgren K等，J.Nucl.Med.1993，第34卷，第448-454頁；GarkavijM等，ActaOncologica 1996，第53卷，第309-312頁；Garkavij M等，J.Nucl.Med.1997，第38卷，第895-901頁)。歐洲專利申請92903 020.3描述了這類處理的應(yīng)用。
當(dāng)結(jié)合體外循環(huán)處理應(yīng)用時(shí)，必須保證分離基質(zhì)和與之接觸的裝置內(nèi)部完全無菌。也可在使用之前對體外裝置的基質(zhì)滅菌。此外，還可在良好的制造實(shí)踐條件下通過無菌處理制備裝置。
此外，為避免對所要處理的水溶液內(nèi)容物的有害影響，所選擇的方法-要么濕熱、放射，要么化學(xué)處理-不可與基質(zhì)和/或裝置產(chǎn)生任何化學(xué)反應(yīng)。這類化學(xué)反應(yīng)包括體外裝置中使用的材料的化學(xué)或結(jié)構(gòu)變化、斷鏈、交聯(lián)或機(jī)械性能的重大變化。
在用環(huán)氧乙烷或甲醛滅菌的情況下，由于滅菌劑對分離基質(zhì)和周圍的塑性材料的物理和化學(xué)吸附，這樣的參數(shù)如溶解度、滅菌劑的吸附及解吸附是至關(guān)重要的。因?yàn)樗鼈兊母叨拘?，在滅菌之后通常要求一段精確的脫氣時(shí)間。
如今，大多數(shù)現(xiàn)行的體外裝置應(yīng)用由瓊脂糖、硅膠、聚丙烯酸酯或聚乙烯醇制成的載體，所述載體通過蒸汽或乙基汞硫代水楊酸鈉(硫柳汞)滅菌。然而，迄今為止當(dāng)配體是蛋白質(zhì)和基質(zhì)處于濕的狀態(tài)或被水包圍時(shí)不能對分離基質(zhì)實(shí)施有效的滅菌。
EP 179420說明了一種用于體外循環(huán)處理的基質(zhì)的蒸汽滅菌方法，US 5,283,034描述了一種方法和組合物，該方法允許通過電離輻射對與偶聯(lián)生物活性基團(tuán)的表面進(jìn)行滅菌。
在體外系統(tǒng)中也曾使用過不同的防腐劑，如疊氮化物和硫柳汞。然而，使用這些物質(zhì)曾引起爭議，因?yàn)樗鼈兛赡芪接诓煌氖褂貌牧希蚨y以被沖洗掉。在這兩個(gè)例子中劇烈和長期毒性構(gòu)成另外的問題。就硫柳汞而論，過敏性危險(xiǎn)對于患者和健康專家都是事實(shí)。
其它有用的防腐劑不溶于水，有些防腐劑長期與配體或裝置內(nèi)使用的塑性材料相互作用。例如，苯甲醇使塑料易碎。這類防腐劑也難以沖洗掉，這是與差溶解性相關(guān)的性質(zhì)。
此外，防腐組合物必須既不與分離基質(zhì)又不與裝置反應(yīng)形成無用產(chǎn)物，例如有毒物質(zhì)。同樣重要的是防腐組合物不能減少用于分離的配體的結(jié)合效率。
在最終的體外裝置制成之前分離基質(zhì)和裝置往往在不同的場所生產(chǎn)以及貯藏和/或運(yùn)輸。這樣的處理要求長期的抗微生物作用，同時(shí)防腐組合物既不影響分離基質(zhì)也不影響用于貯存和運(yùn)輸?shù)娜萜?。而且，抗微生物防腐組合物應(yīng)便于從與裝填分離裝置的分離基質(zhì)中沖洗掉。這樣分離基質(zhì)能夠保持無菌，直到它被無菌包裝于最終的裝置中。
有效的滅菌或防腐在處理可再利用的分離基質(zhì)時(shí)同樣重要。尤其是在這種情況下更是如此當(dāng)這類基質(zhì)組成為處理血液、血漿或其它體液設(shè)計(jì)的可再利用的體外裝置的一部分時(shí)。
用于體外裝置中的載體或基質(zhì)通常是小球狀的聚合多孔材料，這種聚合多孔材料裝入裝置中，小球具有的大小足以提供當(dāng)被裝入裝置中時(shí)必需的小球間距的大小。載體還可以是微孔過濾的中空纖維或平片膜以便使壓降減到最小。
大多數(shù)分離系統(tǒng)應(yīng)用含有易生長微生物的蛋白質(zhì)或其它有機(jī)材料的將被處理的溶液以及分離基質(zhì)。將要處理的溶液可以滅菌例如通過過濾滅菌，或者作為體液供給。然而，分離基質(zhì)及其周圍的液體因?yàn)槿绻幚聿贿m當(dāng)被微生物污染就會(huì)出現(xiàn)問題。
用于分離基質(zhì)及其周圍液體的防腐組合物必須對細(xì)菌和真菌都有抑制或殺滅作用。而且，必須有組合物組分的毒理學(xué)數(shù)據(jù)。優(yōu)選地，它以前應(yīng)已經(jīng)在藥物制劑中使用過，且對于這類防腐劑必須滿足美國藥典和歐洲藥典的要求。
對羥苯甲酸酯屬于殺生物劑，它通過改變膜電位或電子傳遞從而影響細(xì)胞膜。它們對酵母菌和霉菌最有效。對羥苯甲酸酯是對羥基苯甲酸的酯。兩種最常見的酯是對羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯，它們在美國GRAS分級中被批準(zhǔn)用于食品中。對羥苯甲酸酯未作為抗微生物劑廣泛使用于其它應(yīng)用中。應(yīng)用主要包括食品工業(yè)和親代(parental)醫(yī)藥產(chǎn)品。
Prickett等(J.Pharm.Sci.，vol 50(4)，第316-320頁，1961)已經(jīng)研究過液體口服藥物制劑中的對羥苯甲酸酯的作用能被低濃度的丙二醇增強(qiáng)。他們發(fā)現(xiàn)丙二醇的這種對對羥苯甲酸酯的抗微生物活力的增強(qiáng)作用可被用來增加難以在防止微生物腐敗的制劑中的防腐作用和減輕對羥苯甲酸酯濃度，借此改善液體口服制劑的味道和消費(fèi)者的接受。
本發(fā)明的目的是消除如上所述的缺陷，因而本發(fā)明具有權(quán)利要求1和11中分別表征的特點(diǎn)。
因此，本發(fā)明描述了令人驚奇的發(fā)現(xiàn)一種含至少一種烷基對羥苯甲酸酯的含水組合物可被用來消除或減少基質(zhì)中微生物的含量，其中基質(zhì)裝在分離裝置中使用。這樣一種組合物可以例如用于分離醫(yī)藥產(chǎn)品的色譜和加工工業(yè)應(yīng)用的分離基質(zhì)中。它尤其適合于將用于體外循環(huán)處理裝置中的分離基質(zhì)的滅菌和/或貯藏。
在一種生產(chǎn)微生物含量消除或減少的分離基質(zhì)的方法中，該方法包括步驟 提供裝置或容器內(nèi)微生物污染了的分離基質(zhì)； 將含有至少一種烷基對羥苯甲酸酯的含水抗微生物防腐組合物加入到裝置或容器內(nèi)的分離基質(zhì)中； 讓該含水抗微生物防腐組合物在裝置或容器內(nèi)發(fā)揮其作用，直到每克防腐組合物中的菌落形成單位(CFU)充分減少；和 從裝置或容器中沖洗掉含水抗微生物防腐組合物。
優(yōu)選地，讓含水抗微生物防腐組合物發(fā)揮作用直到每克防腐組合物中菌落形成單位滿足美國藥典和/或歐洲藥典的試驗(yàn)規(guī)定(testprotocol)。
含水抗微生物防腐組合物可以按照GMP和ISO-9002/EN46002生產(chǎn)。優(yōu)選地，在所述組合物加入到分離基質(zhì)之前對其滅菌。例如適當(dāng)?shù)臏缇椒ㄓ姓羝瓦^濾滅菌。
分離基質(zhì)可以是任何通常用作固定基質(zhì)的支持材料。優(yōu)選地，分離基質(zhì)含多糖凝膠如瓊脂糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中固定化配體為蛋白質(zhì)，例如但不限于蛋白A或其它免疫球蛋白結(jié)合的蛋白或肽、或免疫球蛋白或半抗原結(jié)合的各種物質(zhì)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中固定化配體為生物素結(jié)合蛋白，例如但不限于，抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素及其衍生物。
合適的對羥苯甲酸酯為對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯。
對羥苯甲酸酯的總濃度及其相對分配對于抗微生物作用很重要。優(yōu)選地，組合物中各種烷基對羥苯甲酸酯的濃度隨著烷基數(shù)的增大(即碳原子數(shù)的增大)而降低。對羥苯甲酸甲酯的合適濃度在0.5和2g.l-1之間，對羥苯甲酸乙酯的合適濃度在0.01和0.5g.l-1之間，對羥苯甲酸丙酯的合適濃度在0.25和0.25g.l-1之間，且對羥基苯甲酸丁酯的合適濃度為至少0.002g.l-1。
然而，烷基對羥苯甲酸酯由于它們易于沉淀，難以維持溶解。因此，若含水抗微生物防腐組合物進(jìn)一步含增溶劑，其濃度足以在長期的貯存期間和/或在環(huán)境溫度(+4至+25℃)儲(chǔ)藏條件下維持至少一種烷基對羥苯甲酸酯溶解，那將是有利的。
增溶劑可以是高級醇或多元醇，例如甘油、聚乙二醇或丙二醇。優(yōu)選地，增溶劑為丙二醇。
當(dāng)使用丙二醇時(shí)，其濃度為不超過20g.l-1就已足夠了。
應(yīng)當(dāng)注意丙二醇將不僅助溶，有助于含水抗微生物防腐組合物的穩(wěn)定，而且它還增強(qiáng)其中對羥苯甲酸酯的抗微生物活性并且產(chǎn)生最大防腐效應(yīng)。不管是哪種具體的應(yīng)用，應(yīng)讓抗微生物的防腐組合物發(fā)揮其作用至少6小時(shí)，由此分離基質(zhì)中的微生物含量被消除或減少。
實(shí)施例 現(xiàn)在將通過以下的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)指出這些實(shí)施例決不能理解為是限制本發(fā)明的。
實(shí)施例1.防腐劑研究。
以如下所示貯液配制抗菌防腐組合物。
貯液 檸檬酸0.79mM 檸檬酸三鈉49.21mM 氯化鈉0.15M 水pH7.0±0.1 pH7.0對于生物相容性是理想的。
對下列防腐組合物進(jìn)行了研究。所試驗(yàn)的實(shí)際市售產(chǎn)品從NipaLaboratories Lmt，UK獲得，并在括號內(nèi)給出注冊商標(biāo)名稱。
防腐劑(1) 苯氧乙醇， 對羥基苯甲酸甲酯 對羥基苯甲酸丙酯，和 2-溴-2-硝基-1，3-丙二醇 的混合物； (0.3％Nipaguard BPX) 防腐劑(2) 對羥基苯甲酸甲酯，0.83g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.17g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.12g.l-1 的混合物； (0.1％Nipasept) 防腐劑(3) 對羥基苯甲酸甲酯，1.25g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.25g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.18g.l-1 的混合物； (0.15％Nipasept) 防腐劑(4)苯氧乙醇，5.0g.l-1， (0.5％Phenoxetol) 防腐劑(5) 對羥基苯甲酸甲酯，0.83g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.17g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.12g.l-1，和 苯氧乙醇，5.0g.l-1 的混合物； (0.1％Nipasept+0.5％Phenoxetol) 防腐劑(6) 對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1，和 對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1 的混合物； (0.08％NipaginM+0.02％Nipagin A) 防腐劑(7) 對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1，和 對羥基苯甲酸丁酯，0.005g.l-1 的混合物； (0.08％Nipagin M+0.02％Nipagin A+0.005％Nipabutyl) 防腐劑(8) 對羥基苯甲酸甲酯，0.70g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1，和 對羥基苯甲酸丁酯，0.005g.l-1 的混合物； (0.07％Nipagin M+0.02％Nipagin A+0.005％Nipabutyl) 防腐劑(9) 對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.15g.l-1，和 對羥基苯甲酸丁酯，0.005g.l-1 的混合物； (0.08％Nipagin M+0.15％Nipagin A+0.005％Nipabutyl) 防腐劑(10) 對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1，和 對羥基苯甲酸丁酯，0.04g.l-1 的混合物； (0.08％Nipagin M+0.02％Nipagin A+0.004％Nipabutyl) 通過使用以高壓滅菌法預(yù)先滅菌的貯液、滅過菌的工具和無菌操作來配制防腐劑(1)。其它防腐組合物以高壓滅菌法進(jìn)行滅菌。
微生物攻擊試驗(yàn) FP 1997-試驗(yàn)方案 將5份20g的各種防腐組合物轉(zhuǎn)移到無菌容器中并分別接種0.2ml以下詳述的試驗(yàn)生物體的培養(yǎng)物。將接種的樣品部分通過渦旋攪拌機(jī)混合并在室溫下儲(chǔ)存。然后進(jìn)行EP 1997的攻擊試驗(yàn)方案。
USP 23-試驗(yàn)方案 5份20g的各種防腐組合物接種0.1ml以下詳述的試驗(yàn)生物體的培養(yǎng)物，最初的柱水平以每g防腐組合物中菌落形成單位(CFU)表示。將接種的樣品部分通過渦旋攪拌機(jī)混合并在室溫下儲(chǔ)存。然后進(jìn)USP的攻擊試驗(yàn)方案。 最初的接種水平CFU每克 測試種類 EP 1997 USP XXIII 綠膿桿菌NCIMB 8626 1.1×106 5.6×106 大腸桿菌NCIB 8545 2.0×106 1.0×106 金黃色葡萄球菌NCTC 10788 4.3×106 2.2×106 白色念珠菌NCPF 3179 8.4×105 4.2×105 黑曲霉素IMI 149007 1.0×105 5.0×104 試驗(yàn)結(jié)果 給出每克防腐組合物中的菌落形成單位數(shù)(CFU)并與單獨(dú)的貯液(未防腐的)相比較。
EP 1997 防腐劑(1)測試種類之后的CFU每克 6小時(shí)1天2天綠膿桿菌 ＜10＜10＜10大腸桿菌 3.0×102＜10＜10金黃色葡萄球菌 7.2×105＜10＜10白色念珠菌 -＜10＜10黑曲霉素 -4.0×102＜10測試種類 之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10＜10＜10白色念珠菌＜10＜10＜10黑曲霉素＜10＜10＜10 防腐劑(2)測試種類 之后的CFU每克 6小時(shí)1天2天綠膿桿菌 5.0×1044.4×1041.2×104大腸桿菌 2.0×1061.5×1061.0×106金黃色葡萄球菌 2.1×1061.4×1061.0×106白色念珠菌 -8.8×1052.2×105黑曲霉素 -8.0×1047.7×104測試種類之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌3.2×1053.0×1051.0×105大腸桿菌7.3×1053.0×103＜10金黃色葡萄球菌1.4×1042.0×103＜10白色念珠菌7.1×1042.2×103＜10黑曲霉素3.0×1041.1×1039.0×102 防腐劑(3)測試種類之后的CFU每克6小時(shí)1天2天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌1.8×1058.0×103＜10金黃色葡萄球菌1.5×1068.0×102＜10白色念珠菌-1.6×1045.2×103黑曲霉素-2.0×1041.0×104測試種類之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10＜10＜10白色念珠菌＜10＜10＜10黑曲霉素＜10＜10＜10 防腐劑(4)測試種類 之后的CFU每克6小時(shí)1天2天綠膿桿菌7.0×1044.0×1045.4×103大腸桿菌3.8×1063.1×1065.0×105金黃色葡萄球菌3.6×1063.0×1061.5×106白色念珠菌-1.6×1054.6×104黑曲霉素-5.0×1045.0×104測試種類 之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌1.5×1065.4×1053.0×103金黃色葡萄球菌6.5×1052.6×1056.0×103白色念珠菌3.8×1043.2×1051.0×105黑曲霉素2.0×1041.0×1043.0×103 防腐劑(5)測試種類 之后的CFU每克 6小時(shí)1天2天綠膿桿菌 ＜10＜10＜10大腸桿菌 ＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌 5.12×1055.0×102＜10白色念珠菌 -8.0×1034.0×102黑曲霉素 -4.0×1047.0×103測試種類 之后的CFU每克7天 14天28天綠膿桿菌＜10 ＜10＜10大腸桿菌＜10 ＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10 ＜10＜10白色念珠菌＜10 ＜10＜10黑曲霉素＜10 ＜10＜10 防腐劑(6)測試種類 之后的CFU每克6小時(shí)1天2天綠膿桿菌1.0×1061.1×1049.0×103大腸桿菌2.4×1062.4×1069.6×105金黃色葡萄球菌3.6×1063.0×1061.9×106白色念珠菌-2.4×1051.8×105黑曲霉素-5.0×1044.0×104測試種類之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌3.2×1052.0×1069.0×105大腸桿菌3.3×1062.3×1051.7×105金黃色葡萄球菌2.0×1059.0×1032.0×103白色念珠菌1.4×1057.0×1047.0×103黑曲霉素6.0×1041.1×1043.0×104 防腐劑(7)測試種類 之后的CFU每克 6小時(shí) 1天2天綠膿桿菌 ＜10 ＜10＜10大腸桿菌 ＜10 ＜10＜10金黃色葡萄球菌 2.1×104 4.8×102＜10白色念珠菌 - ＜10＜10黑曲霉素 - 2.1×1053.0×103測試種類 之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10＜10＜10白色念珠菌＜10＜10＜10黑曲霉素＜10＜10＜10 未防腐測試種類 之后的CFU每克 6小時(shí)1天2天綠膿桿菌 4.9×1068.8×1066.7×106大腸桿菌 7.0×1061.1×1079.3×106金黃色葡萄球菌 6.1×1067.0×1066.5×106白色念珠菌 -1.5×1061.7×106黑曲霉素 -6.2×1054.1×105測試種類 之后的CFU每克7天 14天28天綠膿桿菌TNTC TNTCTNTC大腸桿菌TNTC TNTCTNTC金黃色葡萄球菌7.6×106 4.5×1065.2×106白色念珠菌1.0×106 2.8×1062.6×106黑曲霉素2.0×105 4.8×1053.1×105 USP 23 防腐劑(1)測試種類之后的CFU每克 7天 14天 21天 28天綠膿桿菌 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10大腸桿菌 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10金黃色葡萄球菌 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10白色念珠菌 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10黑曲霉素 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 防腐劑(2)測試種類 之后的CFU每克7天14天21天 28天綠膿桿菌9.1×1035.2×1037.1×103 ＜10大腸桿菌5.0×1059.2×1032.1×103 ＜10金黃色葡萄球菌7.1×1034.0×102＜10 ＜10白色念珠菌5.2×1043.0×103＜10 ＜10黑曲霉素1.0×103＜10＜10 ＜10 防腐劑(3)測試種類 之后的CFU每克7天 14天 21天 28天綠膿桿菌＜10 ＜10 ＜10 ＜10大腸桿菌＜10 ＜10 ＜10 ＜10金黃色葡萄球菌＜10 ＜10 ＜10 ＜10白色念珠菌＜10 ＜10 ＜10 ＜10黑曲霉素＜10 ＜10 ＜10 ＜10 防腐劑(4)測試種類 之后的CFU每克 7天14天21天28天綠膿桿菌 ＜10＜10＜10＜10大腸桿菌 6.0×1051.0×1058.0×1044.0×102金黃色葡萄球菌 3.1×1057.1×1044.5×1044.9×103白色念珠菌 1.0×1049.0×1033.0×103＜10黑曲霉素 6.0×1034.0×1031.0×103＜10 防腐劑(5)測試種類 之后的CFU每克7天 14天21天28天綠膿桿菌＜10 ＜10＜10＜10大腸桿菌＜10 ＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10 ＜10＜10＜10白色念珠菌＜10 ＜10＜10＜10黑曲霉素＜10 ＜10＜10＜10 防腐劑(6)測試種類之后的CFU每克7天14天21天28天綠膿桿菌8.2×1046.0×1043.0×1047.0×103大腸桿菌5.1×1043.3×1046.0×1041.2×104金黃色葡萄球菌9.0×1045.0×1044.1×1049.1×103白色念珠菌8.3×1046.3×1046.0×1042.9×103黑曲霉素4.0×1041.0×1047.0×1034.0×103 防腐劑(7)測試種類之后的CFU每克7天14天21天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10＜10＜10＜10白色念珠菌＜10＜10＜10＜10黑曲霉素＜10＜10＜10＜10 未防腐 測試種類 之后的CFU每克 7天 14天 21天 28天 綠膿桿菌 3.8×106 4.7×106 4.2×106 5.0×106 大腸桿菌 6.2×106 9.0×106 7.3×106 TNTC 金黃色葡萄珠菌 3.7×106 4.3×106 5.1×106 8.2×106 白色念珠菌 8.0×105 1.2×106 2.0×106 3.7×106 黑曲霉素 8.0×104 9.0×104 1.0×105 2.1×105 結(jié)論 EP 1997，A標(biāo)準(zhǔn)(目標(biāo))，要求細(xì)菌6小時(shí)減少至少log2、24小時(shí)減少至少log3，在7天以及此后沒有生物體再生，并且酵母菌/霉菌7天減少至少log2并在此后不再增殖。B標(biāo)準(zhǔn)(最低標(biāo)準(zhǔn))，要求細(xì)菌24小時(shí)減少了至少log1、7天減少了至少log3，14天以及此后不再增加，并且酵母菌/霉菌14天減少至少log1并在此后不再增加。
USP 23要求14天細(xì)菌減少至少log3并在此后不再增加。14天以及此后酵母菌/霉菌應(yīng)顯示出不再增加。
總結(jié)-應(yīng)用上述標(biāo)準(zhǔn) 防腐系統(tǒng) EP 1997USP標(biāo)準(zhǔn)A(目標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)B(最小) 防腐劑(1)不通過通過通過 防腐劑(2)不通過不通過 防腐劑(3)不通過通過不通過 防腐劑(4)不通過不通過不通過 防腐劑(5)不通過通過通過 防腐劑(6)不通過不通過不通過 防腐劑(7)通過通過通過 未防腐不通過不通過不通過 試驗(yàn)結(jié)果表明對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1，對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1，和對羥基苯甲酸丁酯，0.005g.l-1的混合劑(防腐劑(7))將有效地保存貯液達(dá)到EP 1997的標(biāo)準(zhǔn)(A目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn))，對于親本制劑(parental preparations)，并且滿足USP 23標(biāo)準(zhǔn)。
EP 1997(B最低標(biāo)準(zhǔn))較不嚴(yán)格，這可由用防腐劑(3)和防腐劑(5)試驗(yàn)獲得的結(jié)果顯示。
同樣，USP 23的通過標(biāo)準(zhǔn)更不如EP 1997(親本)嚴(yán)格，這反映在用防腐劑(1)、防腐劑(2)，防腐劑(3)、防腐劑(5)和防腐劑(7)試驗(yàn)?zāi)塬@得有效的結(jié)果。
實(shí)施例2.穩(wěn)定性研究。
抗菌防腐組合物的貯液在2-8℃下儲(chǔ)存，貯存期限將高達(dá)1.5年。在微生物攻擊試驗(yàn)中將防腐組合物在4℃和-15℃下儲(chǔ)存以便測定防腐劑的穩(wěn)定性。
在儲(chǔ)存和最后從-15℃解凍后目測其穩(wěn)定性。防腐系統(tǒng)14天后的穩(wěn)定性4℃-15℃防腐劑(1)穩(wěn)定穩(wěn)定防腐劑(2)穩(wěn)定穩(wěn)定防腐劑(3)穩(wěn)定穩(wěn)定防腐劑(4)穩(wěn)定穩(wěn)定防腐劑(5)穩(wěn)定穩(wěn)定防腐劑(6)穩(wěn)定穩(wěn)定防腐劑(7)沉淀沉淀 對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1，對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1，和對羥基苯甲酸丁酯，0.005g.l-1的混合劑(防腐劑(7))雖然在微生物攻擊試驗(yàn)中是有效的，但在4℃和-15℃下不穩(wěn)定，這可由白色沉淀/晶體的沉淀顯示。
然后測定下列防腐劑系統(tǒng)的穩(wěn)定性。防腐系統(tǒng)14天后的穩(wěn)定性4℃-15℃防腐劑(8)穩(wěn)定穩(wěn)定防腐劑(9)穩(wěn)定穩(wěn)定防腐劑(10)穩(wěn)定穩(wěn)定 實(shí)施例3.增溶效果。
為了使微生物效果達(dá)到歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)A的同時(shí)獲得足夠的溶解度，將增溶劑加入到所選的對羥苯甲酸酯中。任何與水相容的物質(zhì)都可使用，條件是它被證實(shí)能藥用。優(yōu)選地，使用丙二醇增加溶解度。
因此，用不同濃度的對羥基苯甲酸的甲酯、乙酯和丙酯以及2或5％丙二醇的緩沖溶液進(jìn)行低溫穩(wěn)定性評估。
在上述的貯液中配制下列抗菌防腐組合物，除用pH6.0代替pH7.0以外。由于選擇pH6.0，就可能使用對羥苯甲酸酯的鈉鹽，其不能在酸性溶液中使用。
防腐劑(11) 對羥基苯甲酸甲酯，0.83g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.17g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.12g.l-1 的混合物； (0.10％Nipasept) 防腐劑(12) 對羥基苯甲酸甲酯，1.00g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.20g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.14g.l-1 的混合物； (0.12Nipasept) 防腐劑(13) 對羥基苯甲酸甲酯，1.16g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.24g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.17g.l-1 的混合物； (0.14％Nipasept) 防腐劑(14) 對羥基苯甲酸甲酯，1.33g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.27g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.19g.l-1 的混合物； (0.16％Nipasept) 防腐劑(15) 對羥基苯甲酸甲酯，1.49g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.31g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.22g.l-1 的混合物； (0.18％Nipasept) 防腐劑(16) 對羥基苯甲酸甲酯，1.66g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.34g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.24g.l-1 的混合物； (0.20％Nipasept) 防腐劑(17) 對羥基苯甲酸甲酯，0.83g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.17g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.12g.l-1，和 丙二醇，20g.l-1 的混合物； (0.10％Nipasept+2％丙二醇) 防腐劑(18) 對羥基苯甲酸甲酯，1.00g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.20g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.14g.l-1，和 丙二醇，20g.l-1 的混合物； (0.12％Nipasept+2％丙二醇) 防腐劑(19) 對羥基苯甲酸甲酯，1.16g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.24g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.17g.l-1，和 丙二醇，20g.l-1 的混合物； (0.14％Nipasept) 防腐劑(20) 對羥基苯甲酸甲酯，1.33g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.27g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.19g.l-1，和 丙二醇，20g.l-1 的混合物； (0.16％Nipasept+2％丙二醇) 防腐劑(21) 對羥基苯甲酸甲酯，1.49g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.31g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.22g.l-1，和 丙二醇，20g.l-1 的混合物； (0.18％Nipasept) 防腐劑(22) 對羥基苯甲酸甲酯，1.66g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.34g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.24g.l-1，和 丙二醇，20g.l-1 的混合物； (0.20％Nipasept+2％丙二醇) 防腐劑(23) 對羥基苯甲酸甲酯，0.83g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.17g.l-1，和 對羥基苯甲酸丙酯，0.12g.l-1； 丙二醇，50g.l-1 的混合物； (0.10％Nipasept+5％丙二醇) 防腐劑(24) 對羥基苯甲酸甲酯，1.00g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.20g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.14g.l-1，和 丙二醇，50g.l-1 的混合物； (0.12％Nipasept+5％丙二醇) 防腐劑(25) 對羥基苯甲酸甲酯，1.16g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.24g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.17g.l-1，和 的混合物 (0.14％Nipasept) 防腐劑(26) 對羥基苯甲酸甲酯，1.33g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.27g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.19g.l-1，和 丙二醇，50g.l-1 的混合物； (0.16％Nipasept+5％丙二醇) 防腐劑(27) 對羥基苯甲酸甲酯，1.49g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.31g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.22g.l-1，和 丙二醇，50g.l-1 的混合物； (0.18％Nipasept+5％丙二醇) 防腐劑(28) 對羥基苯甲酸甲酯，1.66g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.34g.l-1， 對羥基苯甲酸丙酯，0.24g.l-1，和 丙二醇，50g.l-1 的混合物； (0.20％Nipasept+5％丙二醇) 防腐劑(29) 對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1，和 對羥基苯甲酸丁酯，0.005g.l-1 的混合物； (0.08％Nipagin M+0.02％Nipagin A +0.005％Nipabutyl) 防腐劑(30) 對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1， 對羥基苯甲酸丁酯，0.005g.l-1；和 丙二醇，20g.l-1 的混合物； (0.08％Nipagin M+0.02％Nipagin A +0.005％Nipabutyl+2％丙二醇) 防腐劑(31) 對羥基苯甲酸甲酯，0.80g.l-1， 對羥基苯甲酸乙酯，0.02g.l-1， 對羥基苯甲酸丁酯，0.005g.l-1，和 丙二醇，50g.l-1 的混合物； (0.08％Nipagin M+0.02％Nipagin A +0.005％Nipabutyl+5％丙二醇) 通過高壓滅菌法對這些防腐組合物滅菌，在4℃下儲(chǔ)存14天，然后評價(jià)可見的白色沉降晶體形式的沉淀。
試驗(yàn)結(jié)果 沉淀 防腐劑(11)(+) 防腐劑(12)(+) 防腐劑(13)+ 防腐劑(14)+ 防腐劑(15)+ 防腐劑(16)++ 防腐劑(17)- 防腐劑(18)- 防腐劑(19)- 防腐劑(20)- 防腐劑(21)(+) 防腐劑(22)(+) 防腐劑(23)- 防腐劑(24)- 防腐劑(25)- 防腐劑(26)- 防腐劑(27)(+) 防腐劑(28)(+) 防腐劑(29)- 防腐劑(30)- 防腐劑(31)- 結(jié)果表明試驗(yàn)的防腐組合物防腐劑(29)似乎正好在低貯存溫度下的溶解度的邊緣，因?yàn)槠溆嗟脑囼?yàn)防腐組合物在沒有加入增溶劑丙二醇時(shí)在低貯存溫度下沒有一個(gè)是穩(wěn)定的。
當(dāng)對羥苯甲酸酯的濃度增加到一定的程度，進(jìn)一步添加增溶劑不會(huì)提高溶解度(cf.防腐劑(21)和防腐劑(27))。
微生物攻擊試驗(yàn) 通過進(jìn)一步研究防腐組合物防腐劑(18)、防腐劑(19)、防腐劑(20)和防腐劑(30)來估計(jì)最低的有效防腐劑濃度。
將5份20g的各種溶液轉(zhuǎn)移到無菌容器中并分別接種0.2ml以下詳述的試驗(yàn)生物的培養(yǎng)物。將接種的樣品部分通過渦旋攪拌機(jī)混合并在室溫下儲(chǔ)存。然后進(jìn)行EP 1997的攻擊試驗(yàn)方案。
試驗(yàn)生物最初的接種物含量 初始接種物水平 每克的菌落數(shù) 綠膿桿菌NCIMB 86265.3×106 大腸桿菌NCIB 8545 1.2×107 金黃色葡萄球菌 NCTC 107888.2×106 白色念珠菌 NCPF 3179 1.3×106 黑曲霉 IMI 1490075.8×105 試驗(yàn)結(jié)果 EP 1997 防腐劑(18)測試種類 之后的CFU每克6小時(shí)1天2天綠膿桿菌1.0×103＜10＜10大腸桿菌4.6×103＜10＜10金黃色葡萄球菌6.0×104＜10＜10白色念珠菌2.1×1064.21×105 8.0×104黑曲霉素2.0×1055.0×1041.0×104測試種類 之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10＜10＜10白色念珠菌9.0×103＜10＜10黑曲霉素＜10＜10＜10 防腐劑(19)測試種類 之后的CFU每克 6小時(shí)1天2天綠膿桿菌 ＜10＜10＜10大腸桿菌 ＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌 5.0×104＜10＜10白色念珠菌 6.8×1051.9×1057.5×104黑曲霉素 1.5×1053.0×1047.0×103測試種類 之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10＜10＜10白色念珠菌2.1×103＜10＜10黑曲霉素＜10＜10＜10 防腐劑(20)測試種類 之后的CFU每克6小時(shí)1天2天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌6.0×103＜10＜10白色念珠菌8.4×1052.8×1055.1×104黑曲霉素1.0×1051.3×1046.2×103測試種類之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌＜10＜10＜10白色念珠菌＜10＜10＜10黑曲霉素＜10＜10＜10 防腐劑(30)測試種類 之后的CFU每克6小時(shí)1天2天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌8.0×1045.0×102＜10金黃色葡萄球菌3.0×104＜10＜10白色念珠菌8.4×1052.0×1055.3×104黑曲霉素8.0×1045.0×102＜10測試種類 之后的CFU每克7天14天28天綠膿桿菌＜10＜10＜10大腸桿菌＜10＜10＜10金黃色葡萄球菌3.0×103＜10＜10白色念珠菌＜10＜10＜10黑曲霉素＜10＜10＜10 EP 1997，A標(biāo)準(zhǔn)(目標(biāo))，要求細(xì)菌6小時(shí)減少至少log2、24小時(shí)減少至少log3，7天以及此后沒有生物再生，并且酵母菌/霉菌7天減少至少log2并在此后不再增加。B標(biāo)準(zhǔn)(最低標(biāo)準(zhǔn))，要求細(xì)菌24小時(shí)減少了至少log1、7天減少了至少log 3，14天以及此后不再增加，并且酵母菌/霉菌14天減少至少log1并在此后不再增加。
總結(jié)-應(yīng)用上述標(biāo)準(zhǔn)防腐系統(tǒng) EP1997標(biāo)準(zhǔn)A(目標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)B(最低)防腐劑(18)通過通過防腐劑(19)通過通過防腐劑(20)通過通過防腐劑(30)通過通過 試驗(yàn)結(jié)果表明這些抗菌防腐組合物能有效保存貯液達(dá)到EP 1997 A(目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn))的標(biāo)準(zhǔn)。
最低的對羥苯甲酸酯的總濃度是抗微生物組合物防腐劑(21)，在此濃度下4℃時(shí)出現(xiàn)沉淀。為了在50％的溶解度4℃獲得安全范圍，優(yōu)選組合物防腐劑(18)。
實(shí)施例4.安全性評價(jià) 毒理學(xué)數(shù)據(jù) 毒理學(xué)數(shù)據(jù)總結(jié)如下(從科學(xué)文獻(xiàn)摘要)。
對羥基苯甲酸甲酯試驗(yàn)結(jié)果急性的口服LD50(小鼠)＞8000mg/kg腹膜內(nèi)注射LD50(小鼠)960mg/kg重復(fù)的口服劑量(大鼠)-96周900-1200mg/kg/天沒有觀察到毒性的征候或主要器官的組織變化重復(fù)的口服劑量(人)在攝取2000mg/天30天后沒有明顯的毒性作用皮膚刺激(人)在丙二醇中的5％溶液無刺激(50人志愿受試者5天覆蓋接觸)眼刺激(人)含0.1-0.3％對羥基苯甲酸甲酯的溶液產(chǎn)生刺激和燒灼感的癥狀，1分鐘內(nèi)消失皮膚過敏性(人)在健康的受試者中沒有證據(jù)表明皮膚過敏性光敏作用(人)沒有證據(jù)表明光敏作用致癌性沒有證據(jù)表明有致癌性Ames試驗(yàn)沒有證據(jù)表明有致突變性 對羥基苯甲酸乙酯試驗(yàn)結(jié)果急性的口服LD50(大鼠)＞4300mg/kg重復(fù)的口服劑量(大鼠)-25周含2％對羥基苯甲酸乙酯的飲食沒有觀察到毒性的征候。觀察到生長速度降低。皮膚刺激(人)在丙二醇中的7％溶液無刺激(50人志愿受試者5天覆蓋接觸)眼睛刺激(兔)純對羥基苯甲酸乙酯產(chǎn)生輕微的刺激皮膚過敏性(人)在健康的受試者中沒有證據(jù)表明皮膚過敏性光敏作用(人)沒有證據(jù)表明有光敏作用致癌性沒有證據(jù)表明有致癌性Ames試驗(yàn)沒有證據(jù)表明有致突變性 對羥基苯甲酸丙酯試驗(yàn)結(jié)果急性的口服LD50(小鼠)＞8000mg/kg腹膜內(nèi)注射LD50(小鼠)640mg/kg重復(fù)的口服劑量(大鼠)-96周900-1200mg/kg/天沒有觀察到毒性的征候或主要器官的組織變化重復(fù)的口服劑量(人)在攝取150mg/天4-7天后在28名患者中沒有明顯的毒性作用皮膚刺激(人)在丙二醇中的12％溶液無刺激(50人志愿受試者5天覆蓋接觸)眼刺激(人)在60名患者中含0.01％對羥基苯甲酸丙酯的溶液15分鐘的接觸時(shí)間沒有產(chǎn)生刺激癥狀皮膚過敏性(人)在非健康的受試者中沒有證據(jù)表明皮膚過敏性光敏作用(人)沒有證據(jù)表明光敏作用致癌性沒有證據(jù)表明有致癌性Ames試驗(yàn)沒有證據(jù)表明有致突變性 丙二醇 根據(jù)″chemical resistance chart，1996 Nalgene Labwarecatalogue″，濃丙二醇在20℃下持續(xù)與聚碳酸酯接觸30天后幾乎不引起損害，在50℃下持續(xù)接觸7天后會(huì)有一些影響。根據(jù)同一耐化學(xué)性圖表，濃丙二醇在20℃和50℃下與聚乙烯(過濾材料)接觸30后不產(chǎn)生有害影響。因此，丙二醇的優(yōu)選濃度(2％)對硬質(zhì)塑料沒有任何影響。
最低的對羥苯甲酸酯的總濃度是抗微生物組合物防腐劑(21)，在此濃度下4℃時(shí)出現(xiàn)沉淀。為了在50％的溶解度4℃下獲得安全范圍，優(yōu)選組合物防腐劑(18)。
實(shí)施例5.洗去性質(zhì)。
在安全性評價(jià)中假定按最壞的條件整個(gè)裝置容積都充滿含水抗微生物防腐組合物。
約180ml的裝置被填充活性多糖凝膠的分離基質(zhì)(蛋白質(zhì)抗生物素蛋白已經(jīng)固定于多糖凝膠上)和組合物防腐劑(18)。
將該裝置插入用于體外循環(huán)處理的裝置內(nèi)并在臨床應(yīng)用之前用900ml Ringer-醋酸溶液(Pharmacia，Inc)沖洗。然后分析沖冼之后防腐劑(18)的組分的殘余濃度。存在的最高濃度低于檢測限 對羥基苯甲酸甲酯＜0.010g.l-1 對羥基苯甲酸乙酯＜0.010g.l-1 對羥基苯甲酸丙酯＜0.010g.l-1 丙二醇 0.005g.l-1 假定裝置容積為210ml，殘存成分將等于 對羥基苯甲酸甲酯＜2.1mg 對羥基苯甲酸乙酯＜2.1mg 對羥基苯甲酸丙酯＜2.1mg 丙二醇 ＜1.1mg 這些量相當(dāng)于下面的對50kg人的最大靜脈注射劑量 對羥基苯甲酸甲酯0.042mg/kg 對羥基苯甲酸乙酯＜0.042mg/kg 對羥基苯甲酸丙酯＜0.042mg/kg 丙二醇 ＜0.022mg/kg 在對羥苯甲酸酯的急性中毒劑量和裝置中的殘余量之間的安全余量足夠大而不致認(rèn)為對患者有害。動(dòng)物研究和長期應(yīng)用和對藥物的體驗(yàn)，表明關(guān)于慢性毒性作用沒有明顯的危險(xiǎn)。
關(guān)于急性和慢性毒理，丙二醇的安全余量也都是足夠大。源自裝置的丙二醇的最大殘余量比一些藥物的給藥劑量低得多。如此小劑量的丙二醇的給藥臨床經(jīng)驗(yàn)表明給藥不會(huì)有害。
在這些應(yīng)用中使用本發(fā)明抗菌防腐組合物的其它優(yōu)點(diǎn)有256nm處的專一紫外線吸收(E1％256＝9.5)，這使得能夠進(jìn)行沖冼操作的連續(xù)監(jiān)測。
權(quán)利要求
1.含水抗微生物防腐組合物用于消除或減少污染了微生物的分離基質(zhì)中的微生物含量的應(yīng)用，其中分離基質(zhì)要裝在分離裝置中使用，其中所述組合物含有至少一種烷基對羥苯甲酸酯。
2.如權(quán)利要求1中的應(yīng)用，其中至少一種烷基對羥苯甲酸酯為對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯或?qū)αu基苯甲酸丁酯。
3.如權(quán)利要求1或2中的應(yīng)用，其中所述的至少一種烷基對羥苯甲酸酯的濃度隨烷基數(shù)的增大而降低。
4.如權(quán)利要求2或3中的應(yīng)用，其中對羥基苯甲酸甲酯的濃度在0.5和2g.l-1之間。
5.如權(quán)利要求2或3中的應(yīng)用，其中對羥基苯甲酸乙酯的濃度在0.01和0.5g.l-1之間。
6.如權(quán)利要求2或3中的應(yīng)用，其中對羥基苯甲酸丙酯的濃度在0.25和0.25g.l-1之間。
7.如權(quán)利要求2或3中的應(yīng)用，其中對羥基苯甲酸丁酯的濃度為至少0.002g.l-1。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述含水抗微生物防腐組合物進(jìn)一步含有增溶劑，其濃度足以維持所述至少一種烷基對羥苯甲酸酯溶解。
9.如權(quán)利要求8中的應(yīng)用，其中所述增溶劑為丙二醇。
10.如權(quán)利要求9中的應(yīng)用，其中所述丙二醇的濃度為不超過20g.l-1。
11.一種生產(chǎn)具有消除的或減少的微生物含量的分離基質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟
提供在裝置或容器中的被微生物污染的所述分離基質(zhì)；
向在所述裝置或容器內(nèi)的所述分離基質(zhì)中加入含水抗微生物防腐組合物，其中所述抗微生物防腐組合物含至少一種烷基對羥苯甲酸酯；
讓所述的含水抗微生物防腐組合物在所述裝置或容器內(nèi)發(fā)揮作用直到每克防腐組合物的菌落形成單位數(shù)(CFU)充分減少；和
從所述裝置或容器中沖冼掉所述的含水抗微生物防腐組合物。
12.如權(quán)利要求11中的所述方法，其中至少一種烷基對羥苯甲酸酯為對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯或?qū)αu基苯甲酸丁酯。
13.如權(quán)利要求11或12中的方法，其中所述的至少一種烷基對羥苯甲酸酯的濃度隨烷基數(shù)的增大而降低。
14.如權(quán)利要求12或13中的方法，其中對羥苯甲酸甲酯的濃度在0.5和2g.l-1之間。
15.如權(quán)利要求12或13中的方法，其中對羥基苯甲酸乙酯的濃度在0.01和0.5g.l-1之間。
16.如權(quán)利要求12或13中的方法，其中對羥基苯甲酸丙酯的濃度在0.25和0.25g.l-1之間。
17.如權(quán)利要求12或13中的方法，其中對羥基苯甲酸丁酯的濃度為至少0.002g.l-1。
18.權(quán)利要求11-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的含水抗微生物防腐組合物進(jìn)一步含有增溶劑，其濃度足以維持所述至少一種烷基對羥苯甲酸酯溶解。
19.如權(quán)利要求18中的方法，其中所述增溶劑為丙二醇。
20.如權(quán)利要求9的方法，其中所述丙二醇的濃度為不超過20g.l-1。
21.權(quán)利要求11-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中在將含水抗微生物防腐組合物加入所述分離基質(zhì)中之前對所述含水抗微生物防腐組合物滅菌。
22.如權(quán)利要求21的方法，其中所述的含水抗微生物防腐組合物通過蒸汽或過濾滅菌的方式滅菌。
23.權(quán)利要求11-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中讓含水抗微生物防腐組合物發(fā)揮其作用至少6小時(shí)。
24.權(quán)利要求11-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中讓含水抗微生物防腐組合物發(fā)揮其作用直到滿足美國藥典和/或歐洲藥典的試驗(yàn)規(guī)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及在含水抗微生物防腐組合物中使用至少一種烷基對羥苯甲酸酯用于消除或減少微生物污染的分離基質(zhì)中的微生物含量，其中分離基質(zhì)裝在分離裝置中使用，分離基質(zhì)被微生物污染。此外，上述組合物用于生產(chǎn)微生物含量消除或減少的分離基質(zhì)的方法中，所述方法包括提供所述的分離基質(zhì)，其中分離基質(zhì)裝在所述裝置或容器內(nèi)且被微生物污染；將含有至少一種烷基對羥苯甲酸酯的含水抗微生物防腐組合物加入到在所述裝置或容器內(nèi)的上述分離基質(zhì)中；讓所述的含水抗微生物防腐組合物在所述裝置或容器內(nèi)發(fā)揮其作用直到每克防腐組合物中的菌落數(shù)(CFU)充分降低；從上述裝置或容器中沖冼掉含水抗微生物防腐組合物。
文檔編號A61L2/07GK1678354SQ03821068
公開日2005年10月5日 申請日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月5日
發(fā)明者B·E·B·桑德伯格, R·尼森, C·汝德巴克 申請人:米特拉醫(yī)療股份公司