專利名稱：穩(wěn)定的腺病毒配方的制作方法
發(fā)明描述本發(fā)明涉及，例如，通過向組合物中加入穩(wěn)定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇部分[PEG(還稱為聚環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu))，具有O-(CH2CH2O)z-H結(jié)構(gòu)，其中z為至少2]的非離子洗滌劑，例如Brij洗滌劑或聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20，而穩(wěn)定包含病毒，如空氣傳播病毒(例如腺病毒)的組合物，如藥物組合物的方法。在優(yōu)選的實施方案中，該非離子洗滌劑具有式I或式II或式III或式IV所示的結(jié)構(gòu)或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-HI其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其任選被一個或多個(例如1-3個)羧基、脲、鹵素(F、Cl、Br、I)、羥基、氨基或1-3個環(huán)取代，所述環(huán)可以是芳香(例如具有6-14個原子)或環(huán)烷基(例如具有3-12個C原子)，其還可以為雜環(huán)(例如具有4-14個C原子和1-3個N、S、O或P原子)，且其中所述環(huán)任選被一個或多個烷基(例如具有1-12個C原子)、羥基、氨基、鹵素(如上述)、硝基、硫氧基(sulfoxy)、羧基或脲(其中環(huán)基團(tuán)可以優(yōu)選為一、二或三環(huán))取代， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義，
其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100，其中X為5-15，優(yōu)選7-10，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′如上述的R。
在特別優(yōu)選的實施方案中，在式I中，R為(CH3)(CH2)Y-，其中Y為10-15；在最優(yōu)選的實施方案中，X為23而Y為12(Brij 35)，或者X為20而Y為12(Brij 58)；在式II中，R為CaH(2a+1)CO2-，其中a為10-70，而在最優(yōu)選的實施方案中，R＝C11H23CO2-(吐溫20)；在式III中，R為CH3，X為55，Y為29，而Z＝55(普朗尼克F68)，或者R為CH3，X為98，Y為67，而Z為98(普朗尼克F-127)；或者在式IV中，R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞苯基，而X為9-10(Triton X-100，NP40)，或者R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞環(huán)己基，而X為9-10(還原的Triton X-100)。
本發(fā)明的一個方面是用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的本發(fā)明的非離子洗滌劑，例如以上式I、II、III或IV的非離子洗滌劑，或者它們的組合；其中該腺病毒為表達(dá)轉(zhuǎn)基因，例如用于基因治療的治療基因的重組腺病毒；其中該非離子洗滌劑為Brij洗滌劑，如Brij 35或Brij 58，聚山梨醇酯(吐溫)洗滌劑，如聚山梨醇酯20、40、60或65，特別是聚山梨醇酯20，或者普朗尼克(pluronic)分子，如普朗尼克F127或F68，或類似Triton的分子，如Triton X-100、Triton X-114或NP-40，所述非離子洗滌劑的濃度為約臨界膠團(tuán)濃度(CMC)，例如約0.005％至約0.1％(vol/vol)，優(yōu)選約0.05％至約0.08％，更優(yōu)選約0.05％。
本發(fā)明的另一方面為包含由上述方法制備的穩(wěn)定的腺病毒組合物和至少一種藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明的另一方面為一種組合物，例如藥物組合物，其包含腺病毒和穩(wěn)定有效量的本發(fā)明的非離子洗滌劑，例如以上式I、II、III或IV的非離子洗滌劑，或者它們的組合，和任選的一種或多種鹽和/或賦形劑，且在藥物組合物的情況下，其包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體、鹽和/或賦形劑；其中腺病毒為表達(dá)轉(zhuǎn)基因，例如用于基因治療的治療基因的重組腺病毒；其中中性洗滌劑為Brij洗滌劑，如Brij35或Brij 58，聚山梨醇酯(吐溫)洗滌劑，如聚山梨醇酯20、40、60或65，特別是聚山梨醇酯20，普朗尼克分子，如普朗尼克F127或F68，或類似Triton的分子，如Triton X-100、Triton X-114或NP-40，所述非離子洗滌劑的濃度為約CMC，例如約0.005％至約0.1％(vol/vol)，優(yōu)選約0.05％至約0.08％，更優(yōu)選約0.05％。
另一方面為穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，其改進(jìn)之處是將穩(wěn)定有效量的本發(fā)明的非離子洗滌劑，例如式I、II、III或IV的非離子洗滌劑加到該組合物中。
本發(fā)明的另一方面是穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的本發(fā)明的非離子洗滌劑，例如以上式I、II、III或IV的非離子洗滌劑，或者它們的組合。本發(fā)明的另一方面為一種組合物，例如藥物組合物，其包含空氣傳播病毒，本發(fā)明的非離子洗滌劑，例如以上式I、II、III或IV的非離子洗滌劑，或者它們的組合，和任選的一種或多種鹽或賦形劑。藥物組合物包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體、鹽和/或賦形劑。
“穩(wěn)定”，例如穩(wěn)定包含病毒的組合物在此意指與在除了不存在穩(wěn)定劑之外的相同條件下保存的樣品的損失量相比，在確定的時間內(nèi)抑制組合物中病毒可用(可測定)量和/或活性的損失。
由本發(fā)明的方法實現(xiàn)的典型的穩(wěn)定程度如實施例2和圖1-6所示。例如，如圖1所示，將在玻璃容器中于2-8℃下在不存在穩(wěn)定劑的情況下溫育的高度純化的腺病毒組合物在一個月后侵染性損失約2.5logs(230倍損失)；但在存在吐溫20時，該損失小于約0.5log(約3倍損失)。換句話說，在2-8℃下在吐溫20存在下1個月后回收的病毒活性比不存在吐溫20的情況下回收的活性大約80倍。圖1還表明，當(dāng)在塑料容器中進(jìn)行相同的實驗時，在存在吐溫20的情況下的相對活性降低為約40％。在圖2中，(通過HPLC)測定病毒濃度。圖2表明，在玻璃或塑料容器中，腺病毒組合物在于2-8℃和存在吐溫20的情況下一個月后不表現(xiàn)出可檢測的腺病毒濃度損失。相反，在玻璃容器中的病毒在此溫度下僅0.25個月后其濃度損失約1/3。
圖3和4表明，吐溫20穩(wěn)定在-70℃下溫育的腺病毒組合物。圖3表明，在玻璃或塑料容器中，當(dāng)病毒在-70℃下溫育時，沒有發(fā)生可檢測的侵染性損失。在1至12個月的溫育中的任何時間的病毒侵染性回收在存在吐溫20的情況下比不存在吐溫20的情況下高約0.5-0.8logs(高約3-4倍)。圖4顯示在(通過HPLC)測量病毒濃度時的類似發(fā)現(xiàn)。
圖5和6表明，吐溫20穩(wěn)定在-20℃下溫育的腺病毒組合物。圖5表明，在玻璃或塑料容器中，當(dāng)病毒在-20℃下溫育時，在存在吐溫20時溫育2.5個月后的病毒侵染性回收保持基本不變；但在不存在吐溫20的情況下，僅在1個月溫育之后侵染性即降低約0.6logs(約80％)。在圖6中，(通過HPLC)測量病毒濃度。圖6表明，在玻璃或塑料容器中，病毒濃度在-20℃下在存在吐溫20的情況下溫育達(dá)14個月后仍保持基本不變。當(dāng)不加入吐溫20時，病毒濃度降至這種測定法的檢測限之下。在玻璃管或塑料管中溫育時，病毒回收比在不存在吐溫20的情況下至少好約15倍。
本發(fā)明涉及用于穩(wěn)定包含病毒，例如腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入一定量的以上非離子洗滌劑，其中在給定的時間(例如至少5小時)內(nèi)在約2-8℃、室溫、37℃、-20℃或-70℃下，病毒量和/或活性的損失與不存在所述試劑時的損失相比小于約30％，例如0-30％，優(yōu)選小于約10％，更優(yōu)選小于約5％，最優(yōu)選小于約2％?？梢栽谥辽偌s5-24小時，優(yōu)選至少約1-30天，更優(yōu)選至少約1-12個月，最優(yōu)選至少約2-3年或更長時間內(nèi)用本發(fā)明的方法將病毒制劑穩(wěn)定至這種程度。在確定的時間之后，與初始量相比的殘余病毒量可以大于2％至例如100％，例如大于約2％、5％、10％、25％或75％。在最優(yōu)選的實施方案中，該量大于約90％(例如約95、98或99％)。
“活性”在此意指病毒的生存力和/或侵染性(感染單位、感染效價)。
不希望拘泥于理論，本發(fā)明的穩(wěn)定劑可以通過，例如抑制病毒的自身聚集和/或病毒結(jié)合(吸附)至它們所停留的容器表面或結(jié)合(吸附)至該組合物的其它組分而發(fā)揮功能。這種穩(wěn)定在不干擾病毒的結(jié)構(gòu)完整性(例如表面蛋白未變性)或它們的侵染性的情況下得以實現(xiàn)。
在優(yōu)選的實施方案中，與不存在穩(wěn)定試劑的情況下的腺病毒濃度和/或活性的降低相比，穩(wěn)定腺病毒組合物的試劑抑制在給定的時間內(nèi)，在特定的溫度下保存腺病毒期間所發(fā)生的可檢測的腺病毒濃度和/或活性損失。
本發(fā)明的方法的一個優(yōu)點是它在任何不同溫度下長時間地穩(wěn)定病毒。例如，這允許長期保存病毒制劑，特別是在高于冷凍溫度下保存病毒制劑，從而消除使用昂貴的冰箱和/或冷凍系統(tǒng)的需要。該方法用于，例如實驗?zāi)康?例如用于在HPLC分析之前穩(wěn)定玻璃或塑料自動進(jìn)樣瓶中的腺病毒制劑)；用于制備、保存和/或保藏藥物組合物；并用于確保作為基準(zhǔn)試劑，以及在采集用于診斷的臨床樣品中的病毒的侵染性保持。
本發(fā)明所包括的任何適宜的洗滌劑，例如以上式I、II、III或IV的洗滌劑，可以用于本發(fā)明的方法或組合物。例如，式I包括Brij 35(當(dāng)X為23，而Y為12時)、Brij 58(當(dāng)X為20，而Y為12時)和Brij 3J(當(dāng)X為23，而Y為11時)。例如，式II包括不同的聚山梨醇酯(聚氧乙烯20脫水山梨醇分子)，包括聚山梨醇酯20(聚氧乙烯20脫水山梨醇一月桂酸酯，吐溫20)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯20脫水山梨醇一棕櫚酸酯，吐溫40)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯20脫水山梨醇一硬脂酸酯，吐溫60)和聚山梨醇酯65。式III包括，例如不同的普朗尼克，包括普朗尼克127，此時X＝98，Y＝67而Z＝98，和普朗尼克F68，此時X＝55，Y＝29而Z＝55。例如，式IV包括不同的類似Triton的分子，例如當(dāng)X＝9-10而A＝亞環(huán)己基時，為還原的Triton X-100，而當(dāng)X＝9-10而A＝亞苯基時，為Triton X-100或NP-40。
在優(yōu)選的實施方案中，特別是對于作為藥物組合物的組合物而言，該洗滌劑是已被批準(zhǔn)用于患者的洗滌劑，例如注射級洗滌劑，如可注射的吐溫20。
可以使用任何適宜的洗滌劑濃度，條件是它是穩(wěn)定有效量，即可以實現(xiàn)組合物中病毒的穩(wěn)定的量。一般地，洗滌劑存在的濃度為約CMC，例如約0.005％-0.1％vol/vol，優(yōu)選約0.05-0.08％，更優(yōu)選約0.05％。確定穩(wěn)定組合物中病毒需要多少洗滌劑的方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)方法。典型的測定病毒濃度或活性的方法在本文其它部分有述。
可以通過本發(fā)明的方法穩(wěn)定的病毒對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是清楚的。這些病毒可以是致病或非致病的。一般地，可以由本發(fā)明的方法穩(wěn)定的病毒是空氣傳播病毒。優(yōu)選的這些病毒例如為DNA或RNA病毒，如屬于以下科的病毒細(xì)小病毒(包括與腺有關(guān)的病毒)、腺病毒、皰疹病毒、痘病毒、乙型肝炎類病毒、微小核糖核酸病毒、杯狀病毒(Calcivirus)、星狀病毒、披膜病毒、黃熱病毒(flavivirus)、冠狀病毒、副粘病毒、彈狀病毒、蜷絲狀病毒、流感病毒、沙粒病毒、崩芽病毒、呼腸孤病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法穩(wěn)定的病毒是呼吸道感染中涉及的病毒，例如反轉(zhuǎn)錄病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法穩(wěn)定的病毒包括具有蛋白質(zhì)外衣和疏水表面的病毒。
最優(yōu)選腺病毒，例如鳥類或哺乳動物腺病毒，已鑒定的任何血清型包括腺病毒2和腺病毒5。在最優(yōu)選的實施方案中，使用重組病毒，例如適于基因治療的重組腺病毒。已描述了不同的病毒載體，包括適宜基因缺陷腺病毒(例如E1基因缺失腺病毒)，其適于基因治療應(yīng)用。任何不同的基因可以用作，例如標(biāo)記物或治療劑，并可以在適宜的調(diào)控序列的控制下克隆入這些載體中，然后在例如基因療法中導(dǎo)入患者中。適宜的載體和可以在其中表達(dá)的基因，以及制備這些構(gòu)建體和將它們用于體外或體內(nèi)基因療法的方法的選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)和已知的(例如參見Sambrook，J等人(1989).Molecular CloningA Laboratory Mamal.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。可以用于本發(fā)明的方法的基因包括，例如編碼多肽，如酶、激素、細(xì)胞因子(例如干擾素或白介素)、生長因子(例如FGF-1至FGF-23之任一種)等的基因。而且，可以表達(dá)標(biāo)記物基因，例如lacZ或綠熒光蛋白。當(dāng)然，可以通過本發(fā)明的方法制備(穩(wěn)定)任何以上病毒的突變體或變體形式，并可以制備這些病毒的重組體、雜合體、嵌合體等形式。本文的許多討論涉及腺病毒制劑。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，任何適宜的病毒均可以通過本文所述的方法穩(wěn)定，特別是空氣傳播病毒。確定特定的病毒是否可以被本發(fā)明的洗滌劑穩(wěn)定的方法是常規(guī)的。典型的測量病毒濃度或活性的測定法在本文其它部分有述。
本文所用的術(shù)語“穩(wěn)定腺病毒”指穩(wěn)定包含單一類型的腺病毒或多種類型的包含單一腺病毒顆粒和任何數(shù)目的顆粒的腺病毒的制劑。
任何適宜的病毒濃度均可以由本發(fā)明的方法穩(wěn)定。例如，腺病毒的濃度范圍可以為約1×108病毒顆粒/ml至約1×1013病毒顆粒/ml。具有不同純度的病毒可以由本發(fā)明的方法穩(wěn)定。例如，它們可以為中等純化的制劑至高度純化的制劑，如通過色譜法和膜分離步驟，例如超濾步驟制備的病毒。本發(fā)明特別適于穩(wěn)定高度純化的病毒制劑，例如接近均一的純度為約99.9％的制劑(例如其具有小于0.1％的蛋白質(zhì)污染物)。除非被穩(wěn)定，否則這些高度純化的制劑在保存期間快速損失侵染性。例如，已觀察到在室溫下保存16小時之后從玻璃自動進(jìn)樣瓶(例如RP-HPLC或SEC-HPLC)中的高度純化的腺病毒回收僅為約71％，在2小時后僅為約60％，其通過HPLC分析測量。不希望拘泥于理論，認(rèn)為該損失至少部分是由病毒顆粒吸附在自動進(jìn)樣瓶壁上導(dǎo)致的。
病毒可以通過任何不同的方案得到穩(wěn)定。例如，可以在融化之前、期間或之后將本發(fā)明的洗滌劑加入腺病毒的液體制劑中；或者可以將其加入冷凍腺病毒的容器中；或者可以將其加入液體制劑中，然后將該液體制劑凍干。
測量病毒量(質(zhì)量、濃度)的方法是慣常和常規(guī)的。對于腺病毒，例如，可以通過例如HPLC測定病毒顆粒的量(例如通過測定衣殼蛋白，如六位體的量)，或者可以通過顆粒計數(shù)測定來確定病毒顆粒的數(shù)目。這些測量檢測可用(可測定)病毒體(viral mass)的量，例如沒有吸附在其停留的容器的壁上的病毒的量。例如，參見實施例2，其例示使用RP-HPLC測量病毒濃度。通過測定和比較兩種或更多種不同衣殼組分的量，還可以確定病毒粒子是否完整。HPLC測量可以檢測可以影響例如病毒的免疫原性、生物分布(biodistribution)等的衣殼蛋白分子的變化(例如氧化、脫酰胺等)。
測定病毒活性(例如生存力和/或侵染性)的方法也是慣常和常規(guī)的。對于腺病毒，例如，可以用細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)、終點稀釋(EPD)、或者噬斑形成測定來測量感染顆粒的數(shù)目，或者可以使用FACS分析，例如與FITC標(biāo)記的抗.五位體(外殼蛋白)抗體綴合。例如，參見Mittereder等人(1996).J.Virology70，7498。這些測量檢測可用(可測定)病毒侵染性，例如沒有吸附到其它病毒粒子或它們停留的容器的壁上的傳染性病毒粒子的量。例如，參見實施例2，其例示使用終點稀釋來測量病毒侵染性。在表達(dá)轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒的情況下，腺病毒的活性與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)量有關(guān)，因此可以通過定量所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的量或活性來測量活性。
可以在任何不同的時間點測量病毒濃度或活性。例如，在將病毒組合物轉(zhuǎn)移到容器中之后，可能最初快速損失病毒濃度或活性(可能是病毒粘附到器壁上的結(jié)果)，然后在一段時間內(nèi)較慢損失。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在選擇進(jìn)行測定的適宜的時間，這取決于所研究的變量。
本發(fā)明還包括包含有效量的病毒，如腺病毒的藥物組合物?！坝行Я俊痹诖艘庵赣行У貙崿F(xiàn)治療效果的量。例如包含CF基因的重組腺病毒的有效量是在給予囊性纖維化病患者時有效地減少該疾病的癥狀的量。
本發(fā)明的藥物組合物含有任何不同的常規(guī)藥學(xué)可接受的載體。在優(yōu)選的實施方案中，該藥物組合物為液體形式，雖然它們也可以是固體(例如凍干)形式。本發(fā)明的藥物組合物包含無菌水(例如用于注射的USP級水)和任選的常規(guī)緩沖劑，例如PBS，其pH為約6.5-7.5，優(yōu)選為約7，其濃度為約0.1X-4X，或者Tris，其pH為約7-8，優(yōu)選約7.5，且其濃度為約0.05M-0.1M。也可以使用其它在中性pH下有效的緩沖液，如檸檬酸鹽緩沖液。本發(fā)明的組合物還任選包含鹽(例如MgCl2，其濃度為約1-5mM，優(yōu)選為約2mM)，和/或用于調(diào)節(jié)克分子滲透壓濃度/重量克分子滲透濃度的試劑，例如蔗糖，其濃度為約1-8％，優(yōu)選為約2％(±10％)(wt/vol)。
在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含約5×107-5×1011顆粒/ml的腺病毒，優(yōu)選重組腺病毒，約0.05％(vol/vol)的吐溫20，約2mM MgCl2和約2％(wt/vol)蔗糖，其在1X PBS中，其pH為約6.95。任選地，特別是在藥物組合物的形式時，本發(fā)明的組合物可以含有一種或多種其它常規(guī)的藥學(xué)可接受的賦形劑或穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的配方在任何不同的容器，例如玻璃或塑料容器，如由任何不同的塑料材料，如聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯制成的小瓶或注射器(例如包含硅樹脂內(nèi)涂層的Hypak注射器)，或者玻璃，如棕色或白色硼硅酸鹽HPLC小瓶中時是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的藥物組合物可以用于不同的治療應(yīng)用。例如，表達(dá)治療轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒可以用于基因療法，其中該轉(zhuǎn)基因取代缺陷基因，提供增強的免疫反應(yīng)等。


圖1例示吐溫20穩(wěn)定在2-8℃下，在玻璃或塑料容器中溫育的腺病毒組合物，其通過侵染性測定來測量。
圖2例示吐溫20穩(wěn)定在2-8℃下，在玻璃或塑料容器中溫育的腺病毒組合物，其通過HPLC來測量。
圖3例示吐溫20穩(wěn)定在-70℃下，在玻璃或塑料容器中溫育的腺病毒組合物，其通過侵染性測定來測量。
圖4例示吐溫20穩(wěn)定在-70℃下，在玻璃或塑料容器中溫育的腺病毒組合物，其通過HPLC來測量。
圖5例示吐溫20穩(wěn)定在-20℃下，在玻璃或塑料容器中溫育的腺病毒組合物，其通過侵染性測定來測量。
圖6例示吐溫20穩(wěn)定在-20℃下，在玻璃或塑料容器中溫育的腺病毒組合物，其通過HPLC測量。
不用進(jìn)一步的詳盡細(xì)節(jié)，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員利用前述的說明，可以充分地應(yīng)用本發(fā)明。因此，以下優(yōu)選的具體實施方案僅是例示性的，而不以任何方式對其余內(nèi)容進(jìn)行限制。
在前述和以下實施例中，所有的溫度以攝氏度為單位不經(jīng)校對描述，且所有的份和百分比按重量計，除非另外指出。
實施例實施例1-測試不同試劑穩(wěn)定腺病毒組合物的能力腺病毒，例如5型腺病毒，在注射到RP-HPLC柱上時分解成它們的蛋白質(zhì)，且蛋白質(zhì)在用乙腈/TFA進(jìn)行梯度洗脫時分離。獲得特征性蛋白質(zhì)指紋圖譜，其用于腺病毒生產(chǎn)方案中的一些步驟的定量和純度分析。但是，除非被穩(wěn)定，已觀察到病毒蛋白峰的收率是可變的，并隨著樣品在自動進(jìn)樣管中保留的時間而降低。
為研究這種現(xiàn)象，將高度純化的腺病毒樣品在自動進(jìn)樣系統(tǒng)中保存數(shù)小時，然后將其注射到HPLC柱中。除非被穩(wěn)定，通過常規(guī)RP-HPLC或SEC-HPLC測定而測量的病毒蛋白峰的積分面積，(例如在六位體峰下)，在樣品于室溫或4℃下在自動進(jìn)樣系統(tǒng)中保存數(shù)小時時隨時間減少。例如，在室溫下保存1.6小時后回收僅為約70％，而在2小時后僅為約60％。證明損失至少部分是由于病毒結(jié)合到表面(自動進(jìn)樣管壁)上導(dǎo)致的；這種結(jié)合有時由病毒聚集體(與其它病毒結(jié)合的病毒)沉淀的介導(dǎo)。
加入幾種試劑，以力圖抵消這些吸附過程，并測試它們穩(wěn)定該組合物的能力。在自動進(jìn)樣管中將樣品溫育任何期望的時間，例如約1-20小時。如果需要的話，在期望的時間點，例如在測定期間的等距離時間點進(jìn)行測定。Plurmic、Brij 58和吐溫20是所測試的試劑。
用Brij 58和吐溫20進(jìn)行進(jìn)一步的實驗，以確定例如，改變HPLC保存小瓶的類型、保存溫度和洗滌劑濃度(范圍為0-0.1％，vol/vol)的效果。還評價了在存在洗滌劑的情況下冷凍的病毒樣品的作用。Brij58和吐溫20的最佳濃度各自為約0.05％(vol/vol)。在0.1％下，兩種洗滌劑似乎均導(dǎo)致病毒部分破壞。吐溫20允許冷凍病毒并且比Brij58更好地定量從HPLC小瓶中的回收。0.05％吐溫20的加入在融解病毒樣品之后在自動進(jìn)樣器中提供大于16小時的穩(wěn)定性。
實施例2-在不同條件下測試吐溫20在2-8℃、-20℃或-70℃下，在玻璃或塑料容器(例如小瓶或注射器)中培養(yǎng)腺病毒組合物達(dá)1個月(2-8℃)或14個月(-20℃和-70℃)。定期通過終點稀釋或通過RP HPLC分析測定等分試樣。典型實驗的結(jié)果如圖1-6所示，并在本文其他部分討論。在所有測試條件下，與不存在吐溫20的情況相比，在存在吐溫20的情況下溫育樣品時獲得更高的病毒穩(wěn)定性。
實施例3-在其它條件下測試吐溫20如實施例2所述進(jìn)行測試，但還測試其它參數(shù)，如吐溫20的最佳濃度，在室溫(約20-25℃)和37℃下溫育，溫育更長的時間(例如達(dá)約2-3年或更多年)。結(jié)果證實，在室溫和更長的溫育時間下，吐溫20有效地穩(wěn)定腺病毒組合物。
根據(jù)前面的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的必要特征，并且可以在不背離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍的情況下改變和修正本發(fā)明以使其適于不同的應(yīng)用和條件。
不用進(jìn)一步的詳盡細(xì)節(jié)，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員利用前述的說明，可以充分地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前述優(yōu)選的具體實施方案僅是例示性的，而不以任何方式對其余內(nèi)容進(jìn)行限制。
上述的所有申請、專利和出版物的全部內(nèi)容均引入本文作參考。
本發(fā)明的方面包括用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)部分的非離子洗滌劑；用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合
R-O(CH2CH2O)X-HI其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其任選被一個或多個羧基、脲、鹵素、羥基或胺，或者被1-3個環(huán)取代，所述環(huán)可以是芳香或環(huán)烷基，還可以為雜環(huán)，且該環(huán)可以任選被一個或多個烷基、羥基、胺、鹵素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′如上述的R；用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-HI其中X為4-30，而R為(CH3)(CH2)Y-，其中Y為10-15， 其中R為CaH(2a+1)CO2-，a為10-70，
其中R為CH3，X為55，Y為29，而Z為55(普朗尼克F68)，或者R為CH3，X為98，Y為67，而Z為98(普朗尼克F127)， 其中R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞苯基，而X為9-10(TritonX-100，NP-40)，或者R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞環(huán)己基，而X為9-10(還原的Triton X-100)，用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-HI其中R為(CH3)(CH2)Y-，而其中X為23，而Y為12(Brij 35)，或者X為20，而Y為12(Brij 58)， 其中R為R＝C11H23CO2-(吐溫20)；上述的方法，其中該洗滌劑為聚山梨醇酯20(吐溫20)，其中該腺病毒為重組腺病毒，其中該腺病毒為適于基因治療的重組腺病毒，其中該洗滌劑的濃度為0.005％-0.1％(vol/vol)，其中該洗滌劑的濃度為0.05-0.08％(vol/vol)，或者其中該洗滌劑的濃度為0.05％(vol/vol)；藥物組合物，其包含由本發(fā)明的方法制備的穩(wěn)定腺病毒組合物和至少一種藥學(xué)可接受的載體；藥物組合物，其包含a)腺病毒，b)穩(wěn)定有效量的本發(fā)明的非離子洗滌劑；和c)至少一種藥學(xué)可接受的載體；其中該腺病毒為重組腺病毒，其中該腺病毒為適于基因治療的重組腺病毒，其中該洗滌劑的濃度為0.005％-0.1％(vol/vol)，或0.05-0.08％(vol/vol)，或0.05％(vol/vol)；本發(fā)明的藥物組合物，其中該腺病毒為適于基因治療的重組腺病毒，該洗滌劑是濃度為0.05％(vol/vol)的吐溫20，而該藥學(xué)可接受的載體包含2mM MgCl2和2％蔗糖(wt/vol)，以及優(yōu)選的無菌水。
其它方面包括用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)部分的非離子洗滌劑；用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-HI其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其任選被一個或多個羧基、脲、鹵素、羥基或胺，或者被1-3個環(huán)取代，所述環(huán)可以是芳香或環(huán)烷基，還可以為雜環(huán)，且該環(huán)任選被一個或多個烷基、羥基、胺、鹵素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′如上述的R；
用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-HI其中X為4-30，而R為(CH3)(CH2)Y-，其中Y為10-15， 其中R為CaH(2a+1)CO2-，a為10-70， 其中R為CH3，X為55，Y為29，而Z為55(普朗尼克F68)，或者R為CH3，X為98，Y為67，而Z為98(普朗尼克F127)， 其中R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞苯基，而X為9-10(TritonX-100，NP-40)，或者R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞環(huán)己基，而X為9-10(還原的Triton X-100)；用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-HI其中R為(CH3)(CH2)Y-，而其中X為23，而Y為12(Brij 35)，或者X為20，而Y為12(Brij 58)， 其中R為R＝C11H23CO2-(吐溫20)；
上述的方法，其中該洗滌劑為聚山梨醇酯20(吐溫20)，或者0.005％-0.1％(vol/vol)；藥物組合物，其包含由本發(fā)明的方法制備的穩(wěn)定的空氣傳播病毒和至少一種藥學(xué)可接受的載體；包含空氣傳播病毒的藥物組合物，其包含a)所述病毒，b)穩(wěn)定有效量的本發(fā)明的非離子洗滌劑；和c)至少一種藥學(xué)可接受的載體；其中該洗滌劑的濃度為0.005％-0.1％(vol/vol)。
本發(fā)明的另一方面是用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，其改進(jìn)在于向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的本發(fā)明的非離子洗滌劑；包含空氣傳播病毒，或者優(yōu)選腺病毒，和穩(wěn)定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)部分的非離子洗滌劑的組合物；在其它優(yōu)選的方面，這種組合物包含式I-IV的非離子洗滌劑，或者關(guān)于本發(fā)明的其它組合物所述的其它次要方面。
權(quán)利要求
1.用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′為如上述的R。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述空氣傳播病毒為腺病毒。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該腺病毒為表達(dá)轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒。
4.權(quán)利要求1的方法，其中該非離子洗滌劑為Brij洗滌劑、聚山梨醇酯(吐溫)洗滌劑、普朗尼克分子或類似Triton的分子。
5.權(quán)利要求1的方法，其中濃度范圍為約0.005％至約0.1％(vol/vol)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中濃度范圍為約0.05％至約0.08％(vol/vol)。
7.用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇部分的非離子洗滌劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述空氣傳播病毒為腺病毒。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述非離子洗滌劑具有式I或式II或式III或式IV所示的結(jié)構(gòu)或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′為如上述的R。
10.權(quán)利要求9的方法，其中R被一個或多個羧基、脲、鹵素、羥基、氨基或1-3個環(huán)取代，所述環(huán)可以為芳香或環(huán)烷基或者還可以為雜環(huán)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述1-3個環(huán)被一個或多個烷基、羥基、氨基、鹵素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代。
12.權(quán)利要求9的方法，其中，在式I中，R為(CH3)(CH2)Y-，其中Y為10-15；在式II中，R為CaH(2a+1)CO2-，其中a為10-70；在式III中，R為CH3，X為55，Y為29，而Z＝55，或者R為CH3，X為98，Y為67，而Z為98；或者在式IV中，R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞苯基，而X為9-10，或者R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞環(huán)己基，而X為9-10。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在式I中，R為(CH3)(CH2)Y-，X為23，而Y為12，或者R為(CH3)(CH2)Y-，X為20，而Y為12。
14.權(quán)利要求12的方法，其中在式II中，R為C11H23CO2-。
15.用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)部分的非離子洗滌劑。
16.用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′為如上述的R。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述烷基被一個或多個羧基、脲、鹵素、羥基或胺，或者被1-3個環(huán)取代，所述環(huán)可以是芳香或環(huán)烷基或者還可以是雜環(huán)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述1-3個環(huán)可以被一個或多個烷基、羥基、胺、鹵素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代。
19.用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為(CH3)(CH2)Y-，其中Y為10-15， 其中R為CaH(2a+1)CO2-，a為10-70， 其中R為CH3，X為55，Y為29，而Z為55，或者R為CH3，X為98，Y為67，而Z為98， 其中R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞苯基，而X為9-10，或者R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞環(huán)己基，而X為9-10。
20.用于穩(wěn)定包含腺病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中R為(CH3)(CH2)Y-，而其中X為23，而Y為12，或者X為20，而Y為12， 其中R為R＝C11H23CO2-。
21.用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′為如上述的R，濃度范圍為約0.005％至約0.1％(vol/vol)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述烷基被一個或多個羧基、脲、鹵素、羥基或胺，或者被1-3個環(huán)取代，所述環(huán)可以是芳香或環(huán)烷基或者還可以是雜環(huán)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述1-3個環(huán)可以被一個或多個烷基、羥基、胺、鹵素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代。
24.用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為(CH3)(CH2)Y-，其中Y為10-15， 其中R為CaH(2a+1)CO2-，a為10-70， 其中R為CH3，X為55，Y為29，而Z為55，或者R為CH3，X為98，Y為67，而Z為98， 其中R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞苯基，而X為9-10，或者R′為(CH3)3C-CH2C(CH3)2-，A為亞環(huán)己基，而X為9-10。
25.用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中R為(CH3)(CH2)Y-，而其中X為23，而Y為12，或者X為20，而Y為12， 其中R為R＝C11H23CO2-。
26.用于穩(wěn)定包含空氣傳播病毒的組合物以減少病毒量或活性的損失的方法，所述方法包括向該組合物中加入穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′為如上述的R，其中在給定的時間內(nèi)，在約2-8℃、室溫、37℃、-20℃或-70℃下，病毒量或活性的損失與不存在所述非離子洗滌劑時的損失相比小于約30％。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述損失小于約10％。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述損失小于約5％。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述損失小于約2％。
30.藥物組合物，其包含空氣傳播病毒和穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合，以及至少一種藥學(xué)可接受的載體、鹽或賦形劑R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′為如上述的R。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述空氣傳播病毒為腺病毒。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中該非離子洗滌劑為Brij洗滌劑、聚山梨醇酯(吐溫)洗滌劑、普朗尼克分子或類似Triton的分子。
33.權(quán)利要求30的組合物，其中該非離子洗滌劑存在的濃度范圍為約0.005％至約0.1％(vol/vol)。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中該濃度范圍為約0.05％至約0.08％(vol/vol)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中該濃度為約0.05％(vol/vol)。
36.藥物組合物，其包含腺病毒、濃度為約0.05％(vol/vol)的吐溫20和包含2mM MgCl2、2％蔗糖(wt/vol)和水的藥學(xué)可接受的載體。
37.藥物組合物，其包含a)腺病毒，b)穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′為如上述的R；和c)至少一種藥學(xué)可接受的載體。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中該腺病毒為重組腺病毒。
39.權(quán)利要求37的組合物，其中該腺病毒為適于基因治療的重組腺病毒。
40.權(quán)利要求37的組合物，其中該洗滌劑存在的濃度范圍為0.005％-0.1％(vol/vol)。
41.權(quán)利要求15的方法，其中所述洗滌劑存在的濃度范圍為0.005％-0.1％(vol/vol)。
42.權(quán)利要求15的方法，其中該腺病毒為重組腺病毒。
43.權(quán)利要求42的方法，其中該重組腺病毒適于基因治療。
44.藥物組合物，其包含由權(quán)利要求1的方法制備的穩(wěn)定腺病毒組合物和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
45.藥物組合物，其包含由權(quán)利要求1的方法制備的穩(wěn)定腺病毒組合物和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
46.權(quán)利要求25的方法，其中該洗滌劑為聚山梨醇酯20(吐溫20)。
47.權(quán)利要求7的方法，其中該洗滌劑的濃度為0.005％-0.1％(vol/vol)。
48.藥物組合物，其包含a)空氣傳播病毒，b)穩(wěn)定有效量的式I或式II或式III或式IV的非離子洗滌劑或它們的組合R-O(CH2CH2O)X-H I其中X為4-30，而R為10-70個碳原子的直鏈或支鏈烷基， 其中R為具有10-70個碳的-CO2R′，而W+X+Y+Z＝20，其中R′如以上關(guān)于R定義， 其中R如上述，而X為5-100，Y為25-75，而Z為50-100， 其中X為5-15，環(huán)A為亞苯基或亞環(huán)己基，而R′為如上述的R；和c)至少一種藥學(xué)可接受的載體。
49.權(quán)利要求48的組合物，其中該洗滌劑的濃度為0.005％-0.1％(vol/vol)。
50.權(quán)利要求1的方法，其中所述烷基被一個或多個羧基、脲、鹵素、羥基或胺，或者被1-3個環(huán)取代，所述環(huán)可以是芳香或環(huán)烷基或者還可以是雜環(huán)。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述1-3個環(huán)可以被一個或多個烷基、羥基、胺、鹵素、硝基、硫氧基、羧基或脲取代。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過向組合物中加入包含烷基部分和聚乙二醇(PEG)的非離子洗滌劑而穩(wěn)定包含空氣傳播病毒，特別是腺病毒，更特別是重組腺病毒的組合物的方法。本發(fā)明還公開了包含這些洗滌劑的適于基因療法的腺病毒，特別是重組腺病毒的藥物和其它組合物。
文檔編號A61K48/00GK1617745SQ03802342
公開日2005年5月18日 申請日期2003年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月18日
發(fā)明者艾爾諾·蓬戈爾, 伊麗莎白·萊姆貝格 申請人:舍林股份公司