專利名稱：復(fù)合干擾素在治療sars疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及復(fù)合干擾素的用途，和一種用于治療SARS(重癥急性呼吸系統(tǒng)綜合癥)疾病的藥物組合物。
八十年代初，科學(xué)家比較了當(dāng)時(shí)已查明的13種α-干擾素的氨基酸序列及其相關(guān)功能之后，發(fā)現(xiàn)它們具有很多相同之處，說明它們的相似的生物活性與功能；同時(shí)它們又具有各自特異之處，這就決定了它們各自的作用專一性。綜合這些相同與相異之處，美國安進(jìn)(Amgen)公司設(shè)計(jì)出一種綜合各種天然干擾素優(yōu)點(diǎn)的全人工干擾素-復(fù)合干擾素(consensus interferon)(US00/5541293A，1996年7月15日，SEQ IDNO1)。復(fù)合干擾素具有天然干擾素?zé)o法匹配的優(yōu)點(diǎn)A.復(fù)合干擾素集中了各種天然干擾素的優(yōu)點(diǎn)，故而具有更強(qiáng)、更廣譜的抗病毒作用。例如，在治療丙型肝炎方面，干擾素α-2b的有效率略大于50％，但其中近三分之二的病人停藥后病情復(fù)發(fā)，因而其凈治愈率只有15-20％。與之呈鮮明對照的是，復(fù)合干擾素的總治愈率高達(dá)40％。B.對天然干擾素α-2b無法治療的病人，復(fù)合干擾素的治愈率達(dá)17％左右；而對干擾素α-2b治療后復(fù)發(fā)的病人，復(fù)合干擾素的治愈率高達(dá)50％。
安進(jìn)公司開發(fā)的復(fù)合干擾素于1997年獲美國FDA批準(zhǔn)上市，商品名Infergen，臨床上用于治療對干擾素α-2b治療無效的丙型肝炎。
中國四川省生物工程研究中心于2001年申請了“重組高效復(fù)合干擾素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制劑”的國際專利保護(hù)，并于2002年獲得批準(zhǔn)(WO 02/80958 A1)。
迄今為止的復(fù)合干擾素抗病毒活性的研究主要集中在乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒方面，而對抗其他病毒的活性評(píng)估未見文獻(xiàn)報(bào)道。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療SARS的藥物組合物。
我們在前期工作中，建立了一套復(fù)合干擾素高效表達(dá)、純化系統(tǒng)，能夠大量產(chǎn)生高純度、高活性的復(fù)合干擾素。
本發(fā)明研究了SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素抑制引起重癥急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(又稱非典型性肺炎)的冠狀病毒SARS-CoV病毒感染宿主的能力，為利用復(fù)合干擾素制備用于治療SARS-CoV病毒引起的非典型性肺炎提供一種新的方法。本發(fā)明分析了SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中抗SARS-CoV病毒的活性，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素能有效抑制SARS-CoV病毒的感染和復(fù)制。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SEQ IDNO1所示的復(fù)合干擾素能夠非常有效地抑制引起重癥急性呼吸系統(tǒng)綜合癥的冠狀病毒SARS-CoV病毒感染宿主細(xì)胞，抑制活性比干擾素α-2b高10倍以上。
本發(fā)明提供了一種SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素在制備治療SARS疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種用于治療SARS疾病的藥物組合物，它包括治療有效量的SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素和藥物載體。
實(shí)施例下面通過優(yōu)選實(shí)例對本發(fā)明做更詳細(xì)的描述。
SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素抗SARS-CoV病毒的活性測定1.病毒滴度測定SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素通過本領(lǐng)域公知的基因表達(dá)方法生產(chǎn)。SARS-CoV病毒原液經(jīng)10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋，取樣感染于96孔板培養(yǎng)的Vero E6細(xì)胞，每孔100微升，重復(fù)8孔，吸附2小時(shí)，棄病毒液，分別加入含2.5％胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，每孔100微升，平行做未感染陰性對照，37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)后，培養(yǎng)板于倒置顯微鏡下觀察并記錄病毒感染后出現(xiàn)的細(xì)胞病變(CPE)，記錄出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔數(shù)，按公知的Reed-Mcench法計(jì)算病毒滴度，以半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)表示。SARS-CoV病毒原液滴度的測定結(jié)果見表1。測試結(jié)果表明，高于50％組病變率為60，低于50％組病變率為7，高于50％組稀釋度對數(shù)值為6，經(jīng)計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)例中所用SARS-CoV病毒的TCID50為6.19。
2.SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素抗SARS-CoV病毒活性測定及與干擾素α-2b的比較Vero E6細(xì)胞常規(guī)傳代，取生長優(yōu)良的單層細(xì)胞1-2瓶，用胰酶消化、計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、每孔100微升。待細(xì)胞達(dá)80-90％單層時(shí)，棄培養(yǎng)上清，分別用10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋的復(fù)合干擾素、干擾素α-2b處理24小時(shí)，每種濃度重復(fù)8孔。
分別棄復(fù)合干擾素、干擾素α-2b上清液，用10-1、10-2、10-4、10-5稀釋的SARS-CoV病毒感染經(jīng)干擾素處理后的Vero E6細(xì)胞，平行做病毒感染陽性對照組，未感染陰性對照組，于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄細(xì)胞病變情況，培養(yǎng)72小時(shí)后用MTT法測定干擾素抑制效率。
與陰性對照(正常Vero E6細(xì)胞組)，陽性對照(SARS-CoV病毒感染組)細(xì)胞形態(tài)變化比較，綜合SARS-CoV病毒感染Vero E6細(xì)胞致細(xì)胞病變(CPE)的程度和MTT測定結(jié)果判定干擾素抑制病毒感染的IC50，結(jié)果見表2；用MTT法測定培養(yǎng)觀察72h后的各試驗(yàn)組細(xì)胞，定量評(píng)估干擾素對SARS-CoV病毒感染的抑制效率，結(jié)果見

圖1。
表2的結(jié)果顯示，復(fù)合干擾素、IFNα-2b兩種干擾素均能抑制SARS-CoV病毒感染宿主細(xì)胞，當(dāng)病毒感染滴度為10-1、10-2時(shí)，其IC50分別為10-5、10-4微克/微升，而降低病毒感染量(10-4、10-5)，其IC50也降低，呈量劑對應(yīng)關(guān)系，復(fù)合干擾素比干擾素α-2b的效率高10倍。圖1A、B的測定值與表2的觀察判斷結(jié)果基本吻合，復(fù)合干擾素、干擾素α-2b的抑制效率相差10倍以上。可見，復(fù)合干擾素較干擾素α-2b抑制SARS-CoV病毒感染的效果更佳。
表1SARS-CoV病毒TCID50的測定病毒稀釋度 出現(xiàn)CPE孔 未出現(xiàn)CPE孔 CEP累計(jì)孔數(shù) 無CPE累計(jì)孔數(shù) 測定孔總數(shù) CPE(％)10-38 029 02910010-48 021 02110010-57 113 1149310-65 364 10 6010-71 71 11 13710-80 80 19 190表2干擾素抑制SARS-CoV病毒感染細(xì)胞IC50的測定病毒滴度 復(fù)合干擾素IC50IFNα2bIC50陽性對照陰性對照(μg/μl) (μg/μl)10-110-410-4病變正常10-210-510-4病變正常10-410-510-5病變正常10-510-510-5病變正常
SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院微生物研究所<120>復(fù)合干擾素在治療SARS疾病中的用途<130>I030473<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>167<212>PRT<213>人工序列<400>1Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu1 5 10 15Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys20 25 30Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln35 40 45Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln50 55 60Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu65 70 75 80Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp85 90 95Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu100 105 110Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile115120 125Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val130 135 140Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln145150 155 160Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu16權(quán)利要求
1.SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素在制備治療SARS疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于治療SARS疾病的藥物組合物，它含有治療有效量的SEQID NO1所示的復(fù)合干擾素和藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素在制備治療SARS疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種用于治療SARS疾病的藥物組合物，它含有治療有效量的SEQ ID NO1所示的復(fù)合干擾素和藥物載體。
文檔編號(hào)A61K38/21GK1478545SQ03150139
公開日2004年3月3日 申請日期2003年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日
發(fā)明者高光俠, 唐宏 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所