專利名稱：南瓜蛋白的抗腫瘤活性及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化學領域，特別是涉及到生物化學中一種核糖體失活蛋白的抗腫瘤活性及其應用。
背景技術：
在本文中，抗腫瘤蛋白被定義為至少具有下列活性之一的蛋白質抑制人腫瘤細胞株活性，抑制鼠腫瘤細胞株活性?；钚园ㄒ欢ǚ秶霓卓剐Ч?，例如部分抑制或致死。該蛋白是寡聚的或是單肽鏈的蛋白質。
從高等植物中提取的核糖體失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein，簡稱RIP)，RIP是一類能使真核生物細胞的核糖體失活，從而抑制細胞內蛋白質合成的細胞毒素，其作用機制是具有RNA N-糖苷酶或叫多核苷酸·腺苷糖苷酶[EC3.2.2.22]活性。根據(jù)其分子結構，可以分為3類，類型1 RIP是具RNA N-糖苷酶活性的單肽鏈蛋白，例如，來自葫蘆科植物瓜蔞塊根的天花粉蛋白(Trichosanthin，簡稱TCS)，苦瓜種子的α，β-苦瓜子蛋白(α，β-Momorcharin，簡稱α，β-MOM)和西葫蘆瓜瓢的西葫蘆蛋白(Pepocin，簡稱PEP)。類型2 RIP是雙肽鏈蛋白，例如，來自大戟科植物蓖麻毒素(Ricin)和豆科植物相思樹種子的相思子毒素(Abrin)，它是由一條具有RNA N-糖苷酶活性的A鏈和一條具凝集素活性的B鏈通過二硫鍵連接而成的。類型3 RIP是一類茉莉酮誘導的蛋白(jasmonate-induced protein)，它是由具有RNA N-糖苷酶功能的N端結構域和一個未知功能的C端結構域組成，例如來自大麥的JIP60。從葫蘆科植物中分離出來的類型1 RIP，例如天花粉蛋白、苦瓜子蛋白、絲瓜蛋白、白瀉根蛋白等，均具有抗腫瘤抗病毒活性，特別是抗艾滋病毒活性。關于類型1 RIP和類型2 RIP已有很多的專利和文獻報道。
中國專利99102290.4提供了從南瓜中分離出的類型1 RIP——南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公開了它的制備方法。SDS-PAGE顯示它的分子量為27kDa，等電點pI＞9，具有強烈抑制細胞內核糖體蛋白質合成的活性。南瓜蛋白已長出可供X-射線衍射用的單晶，晶體結構分析結果指出，南瓜蛋白與天花粉蛋白具有結構同源性[Chen et al.Acta Cryst.D56 2000，665-666；Shi etalChinese J.struct.chem.2003，22(2)，165-168]。
本發(fā)明是基于上述現(xiàn)有技術基礎，證實了南瓜蛋白和天花粉蛋白一樣具有RNA N-糖苷酶活性和抗腫瘤活性，提供了其應用的實驗基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供南瓜蛋白的抗腫瘤活性及其應用，實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案如下采用溫和的分離純化方法，包括鹽溶液抽提、DEAE-纖維素過濾、CM-纖維素或SP-瓊脂糖等強或弱的陽離子凝膠介質二次離子交換層析分離，可以從南瓜果肉中分離到南瓜蛋白，SDS-PAGE檢測分子量為27kDa，園二色譜檢測其二級結構為α-螺旋，β-折疊，無序結構分別為30.8％，41.7％.27.4％，與天花粉蛋白相似。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以用作引產(chǎn)藥物原料用于治療滋養(yǎng)層細胞有關的腫瘤、惡性腫瘤疾病，如絨癌等，也可以作為天花粉蛋白的替代藥物原料，用于克服反復使用產(chǎn)生的免疫反應。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以用作抗病毒，特別是抗艾滋病毒的藥物原料，也可作為天花粉蛋白治療艾滋病的替代藥物原料，用于克服反復使用產(chǎn)生的免疫反應。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以用作抗腫瘤藥物原料，也可以作為天花粉蛋白治療腫瘤的替代藥物原料。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以作為N-糖苷酶用于分子生物學和免疫學研究。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以作為免疫毒素的毒素材料或融合蛋白的毒素材料，用于治療腫瘤和病毒性疾病，特別是艾滋病。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下積極效果(1)南瓜蛋白的二級結構與天花粉蛋白相類似；(2)南瓜蛋白具有RNA N-糖苷酶活性；(3)南瓜蛋白對人白血病細胞株K562有較強的細胞毒作用。半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.3×10-7mol/L。


現(xiàn)在對附圖作圖面說明圖1.顯示南瓜蛋白抗腫瘤活性，1、2為天花粉蛋白，3、4為南瓜蛋白，1、3為樣品不經(jīng)苯胺處理，2、4經(jīng)苯胺處理后可見450個核苷酸特征片斷；圖2.顯示南瓜蛋白圓二色性圖譜；圖3.顯示南瓜蛋白抗腫瘤活性；▲為南瓜蛋白，●為天花粉蛋白。
具體實施例方式
下面結合附圖通過實施例來進一步描述本發(fā)明實施例1.本發(fā)明的南瓜蛋白，按張祖?zhèn)鞯鹊姆椒?生物化學與生物物理學報2000，32(5)495-498)測定其對大鼠肝核糖體RNA N-糖苷酶活性，并與天花粉蛋白比較，見圖1，表明南瓜蛋白和天花粉蛋白一樣具有RNA N-糖苷酶活性。
實施例2.本發(fā)明的南瓜蛋白，在日本Jasco-810型圓二色譜儀上測定，見圖2，按最小二乘擬合法計算出它的二級結構含量與天花粉蛋白相類似

①見陳世芝等，生物物理學報1989，5(2)188-250實施例3.本發(fā)明的南瓜蛋白，按謝捷明等的方法(單克隆抗體通訊1995，11(1)39-42)測定其對人白血病細胞株K562有較強的細胞毒性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.3×10-7mol/L，見圖3。人白血病細胞株K562在含有15％滅活小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液內，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，用培養(yǎng)液將細胞濃度調整為5×105/ml，分別加入不同濃度的南瓜蛋白和天花粉蛋白，每孔100μl，3個復孔。陰性對照孔加入生理鹽水，陽性對照孔加入細胞液，培養(yǎng)72h后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)3-4h，離心去上清液，每孔加100μl DMSO振蕩溶解后，用酶標儀測定各孔A550值。
權利要求
1.一種南瓜蛋白的抗腫瘤活性，其特征在于，該蛋白的二級結構與天花粉蛋白相似；它具有RNA N-糖苷酶的活性；它具有抗腫瘤活性。
2.一種權利要求1的南瓜蛋白的應用，其特征在于，該蛋白作為制備治療白血病藥物的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化學領域，特別是涉及到生物化學中一種核糖體失活蛋白的抗腫瘤活性及其應用。從南瓜果肉中分離出一種核糖體失活蛋白——南瓜蛋白，該蛋白顯示了RNA N－糖苷酶活性和抗腫瘤活性。該蛋白具有作為制備治療白血病藥物的商業(yè)應用前景。
文檔編號A61P35/00GK1603340SQ0314338
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權日2003年9月29日
發(fā)明者陳明晃, 謝捷明, 葉曉明, 石小莉 申請人:中國科學院福建物質結構研究所