專(zhuān)利名稱(chēng)：可調(diào)控的腫瘤活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤活疫苗，具體涉及一種其安全性和免疫效應(yīng)可調(diào)控的腫瘤活疫苗及其制備方法。
腫瘤疫苗(Cancer Vaccine)的提出已有100余年的歷史。通過(guò)體外制備各種形式的腫瘤疫苗注射到腫瘤患者體內(nèi)，能使機(jī)體T淋巴細(xì)胞致敏、活化，生成腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，專(zhuān)一性地結(jié)合并殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤疫苗種類(lèi)眾多，大致可分為基因修飾的疫苗；抗獨(dú)特型抗體疫苗；DNA疫苗和樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗等。目前，對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的研究成果最為引人注目。
樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是機(jī)體免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，高表達(dá)MHCI、MHCII類(lèi)分子、共刺激分子和粘附分子，能有效攝取、加工和提呈腫瘤抗原，激發(fā)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CTL對(duì)腫瘤的殺傷作用。因而DC在以細(xì)胞免疫為主的抗腫瘤反應(yīng)中有著舉足輕重的地位。迄今為止，DC疫苗已在惡性淋巴瘤、惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌等的實(shí)驗(yàn)研究和臨床I、II期試驗(yàn)中取得了結(jié)果。DC疫苗包括(1)、腫瘤抗原肽修飾或抗原基因轉(zhuǎn)染的DC；(2)、腫瘤細(xì)胞提取物致敏DC；(3)、腫瘤細(xì)胞總RNA沖擊DC；(4)、凋亡腫瘤細(xì)胞刺激DC；(5)、腫瘤細(xì)胞與DC的融合細(xì)胞疫苗等。其中融合疫苗可表達(dá)來(lái)源于DC和腫瘤細(xì)胞表面的全部標(biāo)志物，能顯著增強(qiáng)疫苗的免疫原性，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答，為當(dāng)今腫瘤免疫基因治療的一大熱點(diǎn)。
目前絕大多數(shù)腫瘤的特異性腫瘤抗原仍不明確，且針對(duì)單一抗原的治療往往效果不佳，因而將DC與腫瘤細(xì)胞融合作為疫苗，產(chǎn)生針對(duì)全部抗原的免疫反應(yīng)，為腫瘤的治療提供了一條捷徑。Gong等的研究表明，人卵巢癌與人DC融合細(xì)胞能表達(dá)CA-125抗原和源于DC的MHC-II分子、共刺激分子，有效地刺激T細(xì)胞增殖，引起并CTL腫瘤殺傷反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤消退。
自殺基因是來(lái)自某些病毒或細(xì)菌的基因，可編碼特定的酶，正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞缺乏這種基因。如果將自殺基因?qū)氚屑?xì)胞中，可使無(wú)毒性的前體藥物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物從而導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。常用的自殺基因系統(tǒng)有HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD雙自殺基因等。
各種腫瘤疫苗的實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，腫瘤疫苗在抗腫瘤方面有廣闊而良好的應(yīng)用前景。但攜帶腫瘤抗原的腫瘤疫苗回輸體內(nèi)后存在潛在的致瘤性問(wèn)題，也是始終是人們所關(guān)注的疫苗安全性問(wèn)題。既往的研究通常將疫苗在體外經(jīng)60Co照射或是絲裂霉素滅活處理，即以死疫苗回輸體內(nèi)，目的在于降低由疫苗引起腫瘤生長(zhǎng)的可能。這樣同時(shí)也降低了疫苗的抗原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫效應(yīng)較活瘤苗所形成的弱而短暫。腫瘤活疫苗能夠持久有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫效應(yīng)，這與安全性之間地矛盾就亟待解決。
本發(fā)明將自殺基因系統(tǒng)引入到腫瘤活疫苗，籍此來(lái)調(diào)控腫瘤活疫苗的安全性和免疫效應(yīng)。本發(fā)明以細(xì)胞因子誘導(dǎo)大鼠骨髓前體細(xì)胞獲得樹(shù)突狀細(xì)胞，并加以純化和擴(kuò)增；再與已轉(zhuǎn)導(dǎo)有自殺基因的腫瘤細(xì)胞融合制成活疫苗。所述疫苗在進(jìn)入體內(nèi)時(shí)為活疫苗，在完成活疫苗的作用后可接受自殺基因的控制而死亡，既可杜絕活疫苗在體內(nèi)持續(xù)生長(zhǎng)所導(dǎo)致的不良影響，又可象一般疫苗一樣細(xì)胞解體，從而徹底釋放免疫物質(zhì)。
所述的自殺基因系統(tǒng)是HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD雙自殺基因。
所述的腫瘤活疫苗包括樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，基因修飾的疫苗，DNA疫苗和抗獨(dú)特型抗體疫苗，優(yōu)選是婦科腫瘤活疫苗，最優(yōu)選是卵巢癌腫瘤活疫苗。
本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案和步驟進(jìn)行
(1)、樹(shù)突狀細(xì)胞分離、培養(yǎng)和生物免疫特性鑒定從大鼠骨髓前體細(xì)胞中分離樹(shù)突狀細(xì)胞，再體外以細(xì)胞因子誘導(dǎo)并擴(kuò)增樹(shù)突狀細(xì)胞；流式細(xì)胞儀和激光共聚焦進(jìn)行表型鑒定；采用本領(lǐng)域常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)其免疫功能，包括LDH釋放法檢測(cè)CTL活性、3H滲入法檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ。
(2)、以逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒為載體介導(dǎo)自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。
(3)、以PEG法將樹(shù)突狀細(xì)胞與轉(zhuǎn)導(dǎo)有自殺基因的腫瘤細(xì)胞相融合。
(4)、體外給予自殺基因的底物，控制活疫苗在體內(nèi)的存活狀態(tài)。
本發(fā)明從F344大鼠股骨骨髓中分離出單核細(xì)胞，再以GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)并大量擴(kuò)增出樹(shù)突狀細(xì)胞，每只大鼠可獲樹(shù)突狀細(xì)胞5～10×107×107；倒置顯微鏡下逐日觀察樹(shù)突狀細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；Gimsa染色、免疫組化和掃描、透射電鏡顯示典型樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)；熒光標(biāo)記抗體流式細(xì)胞儀作樹(shù)突狀細(xì)胞表型鑒定，結(jié)果顯示樹(shù)突狀細(xì)胞未成熟時(shí)表面抗原低表達(dá)，成熟時(shí)高表達(dá)MHC class II、共刺激分子和粘附分子?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)證實(shí)培養(yǎng)第6天的F344大鼠的樹(shù)突狀細(xì)胞能輕度刺激T細(xì)胞增殖；而培養(yǎng)第9天的樹(shù)突狀細(xì)胞促進(jìn)T細(xì)胞增生的能力大幅度提高，差異顯著。
本發(fā)明以本領(lǐng)域常規(guī)使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將自殺基因TK基因或腺病毒為載體將自殺基因CD轉(zhuǎn)導(dǎo)入F344大鼠卵巢癌細(xì)胞株NUTU-19，篩選出穩(wěn)定的陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆經(jīng)RT-PCR、WesternBlot、MTT法鑒定證實(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)有TK基因或CD基因，且能夠被HSV1-TK的底物GCV或Cd的底物5-FC高效地殺傷。
將培養(yǎng)至第8-10天的樹(shù)突狀細(xì)胞與NUTU-19用PEG法融合，經(jīng)流式細(xì)胞儀、激光共聚焦和熒光顯微鏡證實(shí)獲得雙陽(yáng)性的樹(shù)突狀細(xì)胞與腫瘤融合細(xì)胞。融合細(xì)胞經(jīng)RT-PCR、Western Blot、MTT法鑒定證實(shí)也轉(zhuǎn)導(dǎo)有TK基因或CD基因，且能夠被HSV1-TK的底物GCV或CD的底物5-FC高效地殺傷。以LDH釋放法檢測(cè)CTL活性、3H滲入法檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ，以此證實(shí)融合疫苗能有效提高免疫功能。
以NUTU-19腹腔接種和皮下接種F344大鼠均獲得類(lèi)似人卵巢癌的病程經(jīng)過(guò)，并經(jīng)病理證實(shí)為上皮性卵巢癌。將融合活疫苗以一周為間隔二次免疫F344大鼠，一周后皮下接種腫瘤細(xì)胞NUTU-19，觀察疫苗對(duì)抗腫瘤攻擊的保護(hù)性作用。實(shí)驗(yàn)組在接種腫瘤細(xì)胞后一周再腹腔給予自殺基因的底物，觀察腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠的腫瘤發(fā)生時(shí)間晚，腫瘤體積小，大鼠的生存期明顯延長(zhǎng)，證實(shí)本發(fā)明疫苗對(duì)抗腫瘤攻擊有保護(hù)性作用。
圖5是激光共聚焦顯示融合細(xì)胞為雙陽(yáng)性，圖6是樹(shù)突狀細(xì)胞Gimsa染色，圖7是熒光顯微鏡顯示融合細(xì)胞為雙陽(yáng)性。
復(fù)蘇逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞TK/VPC，傳代后，取攜帶有TK基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液與F344大鼠卵巢癌細(xì)胞株NUTU-19共孵育，3天后G418篩選，克隆形成后轉(zhuǎn)板、擴(kuò)增。陽(yáng)性克隆經(jīng)RT-PCR、WesternBlot、MTT法鑒定證實(shí)有TK基因整合，且能夠被HSV1-TK的底物GCV高效地殺傷。
將培養(yǎng)至第8-10天的樹(shù)突狀細(xì)胞與NUTU-19用PEG法融合。融合前NUTU-19經(jīng)的紅色熒光染料Dil染色，融合后的融合細(xì)胞在以綠色熒光FITC標(biāo)記的抗MHC class II抗體OX6標(biāo)記。融合細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀、激光共聚焦和熒光顯微鏡證實(shí)為雙陽(yáng)性細(xì)胞。融合細(xì)胞經(jīng)RT-PCR、Western Blot、MTT法鑒定證實(shí)有TK基因整合，且能夠被HSV1-TK的底物GCV高效地殺傷。以LDH釋放法檢測(cè)CTL活性、3H滲入法檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ，結(jié)果均提示融合疫苗能有效提高免疫功能。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共6組，每組6只分為融合活疫苗加GCV組、融合活疫苗、滅活的融合疫苗組、DC和NUTU-19分別注射組、空白對(duì)照組、GCV對(duì)照組。疫苗均從雙足墊皮下免疫F344大鼠，每周一次，共兩次。免疫后一周皮下接種腫瘤細(xì)胞NUTU-19，觀察疫苗對(duì)抗腫瘤攻擊的保護(hù)性作用。實(shí)驗(yàn)組與GCV對(duì)照組在接種腫瘤細(xì)胞后一周再腹腔給予HSV1-TK的底物GCV，繼續(xù)觀察腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠的腫瘤發(fā)生時(shí)間晚，腫瘤體積小，大鼠的生存期明顯延長(zhǎng)。
表1是樹(shù)突狀細(xì)胞促進(jìn)T細(xì)胞增生結(jié)果。表1DC∶Tc＝1∶10SamGroupSI(Xple Cpm(X±SD)(n) ±SD)2347.83±431.21±DC(第6天)123.76 0.23DC(第10天) 12 15976.67±1034.7*9.49±0.68**與6dDC相比，p＜0.01。
實(shí)施例2從F344大鼠股骨骨髓中分離出單核細(xì)胞，以雙蒸水溶解紅細(xì)胞，接種24孔板，每孔加mrGM-CSF、mrIL-4，隔天半量換液，培養(yǎng)8-10天，每只大鼠可獲樹(shù)突狀細(xì)胞5～10×107；倒置顯微鏡下觀察到典型的樹(shù)突狀細(xì)胞成集落生長(zhǎng)；Gimsa染色、免疫組化和掃描、透射電鏡顯示典型樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)。熒光標(biāo)記抗體流式細(xì)胞儀作樹(shù)突狀細(xì)胞表型鑒定，結(jié)果顯示樹(shù)突狀細(xì)胞未成熟時(shí)表面抗原低表達(dá)OX6(MHCclass II)為45.22％，B7-2為32.76％；成熟時(shí)高表達(dá)OX6為89.21％，B7-2為56.33％。以腺病毒為載體將自殺基因CD轉(zhuǎn)導(dǎo)入F344大鼠卵巢癌細(xì)胞株NUTU-19，篩選出陽(yáng)性克隆后轉(zhuǎn)板、擴(kuò)增?？寺〗?jīng)RT-PCR、Western Blot、MTT法鑒定證實(shí)有CD基因軟染成功，且能夠被CD的底物5-FC高效地殺傷。
將培養(yǎng)至第8-10天的樹(shù)突狀細(xì)胞與轉(zhuǎn)到有CD的NUTU-19用PEG法融合。融合前NUTU-19經(jīng)的紅色熒光染料Dil染色，融合后的融合細(xì)胞在以綠色熒光FITC標(biāo)記的抗MHC class II抗體OX6標(biāo)記。融合細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀、激光共聚焦和熒光顯微鏡證實(shí)為雙陽(yáng)性細(xì)胞。融合細(xì)胞經(jīng)RT-PCR、Western Blot、MTT法鑒定證實(shí)也有CD基因整合，且能夠被CD的底物5-FC高效地殺傷。以LDH釋放法檢測(cè)CTL活性、3H滲入法檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ，結(jié)果均提示此融合疫苗能有效提高免疫功能。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共6組，每組6只分為融合活疫苗加GCV組、融合活疫苗、滅活的融合疫苗組、DC和NUTU-19分別注射組、空白對(duì)照組、GCV對(duì)照組。疫苗免疫F344大鼠，每周一次，共兩次。免疫后一周腹腔接種腫瘤細(xì)胞NUTU-19，觀察疫苗對(duì)抗腫瘤攻擊的保護(hù)性作用。
實(shí)驗(yàn)組與GCV對(duì)照組在接種腫瘤細(xì)胞后一周再腹腔給予HSV1-TK的底物GCV，繼續(xù)觀察腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠的生存期明顯延長(zhǎng)(P＜0.1)。
權(quán)利要求
1.可調(diào)控的腫瘤活疫苗，其特征是將自殺基因系統(tǒng)引入到腫瘤活疫苗，調(diào)控腫瘤活疫苗安全性和免疫效應(yīng)。
2.按權(quán)利要求1所述的可調(diào)控的腫瘤活疫苗，其特征是所述的自殺基因系統(tǒng)是HSV1-TK/GCV、CD/5-FC及TK/CD雙自殺基因。
3.按權(quán)利要求1所述的可調(diào)控的腫瘤活疫苗，其特征是所述的自殺基因系統(tǒng)是HSV1-TK/GCV自殺基因。
4.按權(quán)利要求1所述的可調(diào)控的腫瘤活疫苗，其特征是所述的自殺基因系統(tǒng)是CD/5-FC自殺基因。
5.按權(quán)利要求1所述的可調(diào)控的腫瘤活疫苗，其特征是所述的腫瘤活疫苗包括樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，基因修飾的疫苗，DNA疫苗和抗獨(dú)特型抗體疫苗。
6.按權(quán)利要求1所述的可調(diào)控的腫瘤活疫苗，其特征是所述的腫瘤活疫苗是婦科腫瘤活疫苗。
7.按權(quán)利要求1所述的可調(diào)控的腫瘤活疫苗，其特征是所述的腫瘤活疫苗是卵巢癌腫瘤活疫苗。
8.按權(quán)利要求1所述的調(diào)控腫瘤活疫苗的方法，其特征是通過(guò)下述技術(shù)方案和步驟進(jìn)行(1)、樹(shù)突狀細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和生物免疫特性鑒定；(2)、以逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒介導(dǎo)自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞；(3)、PEG法將樹(shù)突狀細(xì)胞與轉(zhuǎn)導(dǎo)有自殺基因的腫瘤細(xì)胞融合；(4)、體外給予自殺基因的底物，控制活疫苗體內(nèi)存活狀態(tài)。
9.按權(quán)利要求7所述的調(diào)控腫瘤活疫苗的方法，其特征是所述的自殺基因的底物，其中HSV1-TK的底物是GCV，CD的底物是5-FC。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種安全性和免疫效應(yīng)可調(diào)控的腫瘤活疫苗及其制備方法。本發(fā)明將自殺基因系統(tǒng)引入腫瘤活疫苗，所述疫苗在進(jìn)入體內(nèi)時(shí)為活疫苗，在完成活疫苗的作用后可接受自殺基因的控制而死亡，既杜絕活疫苗在體內(nèi)持續(xù)生長(zhǎng)所導(dǎo)致的不良影響，又可象一般疫苗細(xì)胞解體，徹底釋放免疫物質(zhì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤發(fā)生時(shí)間晚，體積小，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存期明顯延長(zhǎng)，證實(shí)本發(fā)明疫苗對(duì)抗腫瘤攻擊有保護(hù)性作用，能調(diào)控腫瘤活疫苗的安全性和免疫效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1476900SQ03141560
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者徐叢劍, 康玉 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院