專利名稱：誘導中胚層干細胞,es細胞,或無限增殖化的中胚層干細胞分化成神經(jīng)細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及誘導中胚層干細胞或ES細胞分化成神經(jīng)細胞的方法以及誘導無限增殖化的中胚層干細胞分化成神經(jīng)細胞的方法和這些方法的應用。
背景技術：
少突膠質(zhì)細胞(即少突神經(jīng)膠質(zhì))(Archer D.R.et al.，1994，Exp.Neurol.125268-77；Blakemore W.F.，和Crang A.J.，1988，Dev.Neurosci.101-11；Gumpel M.et al.1987，Ann.New York Acad.Sci.49571-85)或髓鞘形成細胞如Schwann細胞(Blakemore W.F.，1977，Nature 26668-9；Blakemore W.F.，和Crang A.J.，1988，Dev.Neurosci.101-11；Honmou O.et al.，1996，J.Neurosci.163199-208)或嗅覺ensheating細胞(Franklin R.L.et al.，1996，Glia 17217-24；Imaizumi T.et al.，1998，J.Neurosci.18(16)6176-6185；Kato T et al.，2000，Glia30209-218)的移植可以引發(fā)動物模型上的再髓鞘化和電生理功能的恢復(Utzschneider D.A.et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9153-7；HonmouO.et al.，1996，J.Neurosci.163199-208)。從患者或其他人制備這樣的細胞用于細胞治療是可能的。但是，因為必須從或者腦或者神經(jīng)獲得組織物，所以這種方法是相當有問題的。
起源于腦的神經(jīng)祖細胞或干細胞具有自我更新能力并能分化成神經(jīng)元和各個系的膠質(zhì)細胞(Gage F.H.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9211879-83；Lois C.and Alvarez-Buylla A.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.902074-7；Morshead C.M.et al.，1994，Neuron 131071-82；Reynolds B.A.，andWeiss S.，1992，Science 2551707-10)。當被移植入新生的小鼠腦內(nèi)，從胚胎組織獲得的人類神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞(Chalmers-Redman R.M.et al.，1997.Neurosci.761121-8；Moyer M.P.et al.，1997，Transplant.Proc.292040-1；Svendsen C.N.et al.，1997，Exp.Neurol.148135-46)，和使軸突包有髓鞘(Flax J.D.et al.，1998，Nat.Biotechnol.161033-9)。已經(jīng)有報道將源于成年人腦的神經(jīng)祖(干)細胞移植入脫髓鞘的嚙齒類脊髓后出現(xiàn)再髓鞘化和脈沖傳導的恢復(Akiyama Y.et al.，2001，Exp.Neurol.)。
這些研究激起強大的興趣，因為這意味著可能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的再生策略中應用上面提到的細胞(Akiyama Y.et al.，2001，Exp.Neurol.；Chalmers-Redman R.M.et al.，1997.Neurosci.761121-8；Moyer M.P.et al.，1997，Transplant.Proc.292040-1；Svendsen C.N.et al.，1997，Exp.Neurol.148135-46；Yandava B.D.et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.967029-34)。
本發(fā)明者們以前分離并培養(yǎng)了源于成年人腦的神經(jīng)干細胞，并且建立了一些細胞系。通過研究它們的功能，發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞具有多能性和自我更新能力(Akiyama Y.et al.，2001，Exp.Neurol.)。特別地，將源于成年人腦的神經(jīng)祖(干)細胞進行單細胞擴增以建立細胞系；然后將建立的細胞系用于體外克隆分析。結(jié)果證明細胞系具有多能性(即，分化成神經(jīng)元，星形膠質(zhì)(或星形膠質(zhì)細胞)，和少突膠質(zhì)(即，少突膠質(zhì)細胞))的能力和自我更新能力(即，增殖潛力)。因此，確認這些細胞具有神經(jīng)干細胞的特征。
在腦缺血模型大鼠或創(chuàng)傷模型大鼠上，這些細胞的移植真正達到非常滿意的移植物存活，遷移，和分化。而且，在脊髓脫髓鞘模型大鼠上，這些細胞的移植導致有功能的髓鞘的形成。因此，在脊髓脫髓鞘模型大鼠上的這種移植允許脫髓鞘的軸突再髓鞘化和神經(jīng)功能的重建。通過組織學的，電生理學的，和行為學的研究確認了使用這些細胞的這種移植治療的有效性。
從上面描述的發(fā)現(xiàn)判斷，將從患者大腦獲得的少量神經(jīng)組織分離并培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞移植給患者的脊髓損傷區(qū)將會是廣泛可應用的自體移植治療。
盡管這種收集不會導致神經(jīng)缺陷，但是，從大腦獲得含有神經(jīng)干細胞的組織是困難的。因此，從建立用于治療今天各種復雜疾病的方法的觀點看，建立用于自體移植的更安全更方便的方法是非常重要的。因此，本發(fā)明者們已經(jīng)開發(fā)了一種簡單的技術用于制備供體細胞，包括從骨髓細胞，臍血細胞，或胎肝細胞(專利申請第2001-160579)收集單核細胞成分或類似物；與前面需要收集神經(jīng)干細胞的背景方法相比，此技術是非常容易的。特別地，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)從骨髓細胞制備的單核細胞具有分化成神經(jīng)細胞的能力。而且，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)從單核細胞部分分離的含有中胚層干細胞的細胞部分，含有間質(zhì)細胞的細胞部分，和含有AC133-陽性細胞的細胞部分也具有分化成神經(jīng)細胞的能力。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以下這些情況進行本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供誘導中胚層干細胞或ES細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，該方法包括允許中胚層干細胞增殖以制備足夠數(shù)量的細胞，和有效地誘導該細胞分化成神經(jīng)干細胞或神經(jīng)細胞；通過該方法獲得的神經(jīng)細胞；治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的包含神經(jīng)細胞的組合物；和用該組合物治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。
本發(fā)明者們最近發(fā)現(xiàn)從骨髓液體或臍血中分離的單核細胞部分里，中胚層干細胞或ES細胞在體外能分化成神經(jīng)細胞。
特別地，發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)當將從骨髓液體或臍血中分離的單核細胞部分制備的中胚層干細胞或ES細胞在下述情況下懸浮培養(yǎng)時會分化成神經(jīng)干細胞5％CO2，37℃于培養(yǎng)基1中[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基礎培養(yǎng)基)/50％F-12/1％FSC；每日添加10ng/ml bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)和10ng/mlEGF(表皮生長因子)]或培養(yǎng)基2中[NPBM(神經(jīng)祖細胞基本培養(yǎng)基)/2％神經(jīng)存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生長因子)/0.2％慶大霉素-兩性霉素B/0.2％hFGF(人成纖維細胞生長因子)；每日添加10ng/mlbFGF和10ng/ml EGF]。
發(fā)明者們也發(fā)現(xiàn)，當將從骨髓液體或臍血中分離的單核細胞部分制備的中胚層干細胞或ES細胞在培養(yǎng)基1中(50％DMEM/50％F-12/1％FSC)或培養(yǎng)基2中[NPBM(神經(jīng)祖細胞基本培養(yǎng)基；Clonetics)/2％神經(jīng)存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生長因子)/0.2％慶大霉素-兩性霉素B/0.2％hFGF(人成纖維細胞生長因子)]培養(yǎng)時，中胚層干細胞或ES細胞會分化成神經(jīng)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞。
而且，發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，向上述培養(yǎng)基中加入缺血的腦提取物可以進一步促進中胚層干細胞或ES細胞向神經(jīng)細胞分化。
此外，用腦梗塞模型，癡呆模型，脊髓損傷模型和脫髓鞘模型評價用上述誘導分化方法獲得的神經(jīng)細胞的神經(jīng)再生潛力。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該細胞具有與從腦提取并培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞相同程度的再生潛力。
基于以上發(fā)現(xiàn)，可將通過上述誘導分化方法獲得的神經(jīng)細胞用于治療腦梗死，癡呆，脊髓損傷，脫髓鞘疾病，等等。此外，考慮本發(fā)明可應用于更為普通和廣泛的腦和/或神經(jīng)損害的神經(jīng)移植和/或再生治療。特別地，本發(fā)明可被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的缺血性腦和/或神經(jīng)損傷，外傷性腦和/或神經(jīng)損傷，腦神經(jīng)退化性疾病和代謝性神經(jīng)疾病的自體移植治療。
而且，上面提及的誘導分化的方法可能利于闡明中胚層干細胞和ES細胞向神經(jīng)細胞分化的潛在機制。一旦指導此分化的基因被鑒定和分析，用該基因可以將足夠數(shù)量的中胚層干細胞和ES細胞有效轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細胞。因此，本發(fā)明顯示出建立促進神經(jīng)組織再生的“基因治療”方法的巨大希望。
而且，本發(fā)明者們成功開發(fā)了確保大量細胞穩(wěn)定增殖的神經(jīng)系統(tǒng)中誘導分化的方法。一般地，中胚層干細胞在神經(jīng)再生的醫(yī)學領域中是有用的；然而這些細胞的增殖程度在培養(yǎng)條件下受到限制。但是，按照本發(fā)明者們的研究，發(fā)現(xiàn)將含有無限增殖化基因如端粒酶作為插入物的病毒載體體外導入基質(zhì)細胞，導致宿主細胞的連續(xù)細胞增殖，甚至在細胞分裂周期之后，且保持與正常細胞相同形態(tài)的細胞有明顯延長的壽命。本發(fā)明者們注意到通過向細胞內(nèi)導入無限增殖化基因使中胚層干細胞無限增殖化，而使大量細胞可以穩(wěn)定增殖。而且，發(fā)明者們繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，可以在合適的培養(yǎng)條件下有效誘導經(jīng)細胞內(nèi)導入無限增殖化基因而無限增殖化的中胚層干細胞分化成神經(jīng)干細胞和神經(jīng)細胞。
特別地，發(fā)明者們成功誘導經(jīng)導入無限增殖化基因hTERT而無限增殖化的中胚層干細胞分化成脂肪細胞，成軟骨細胞，成骨細胞，等等。而且，發(fā)明者們誘導導入hTERT基因而無限增殖化的中胚層干細胞分化成含有高比例神經(jīng)干細胞的神經(jīng)細胞。本發(fā)明者們進一步揭示向脊髓中脫髓鞘區(qū)域移植這些細胞(中胚層干細胞本身；從中胚層干細胞分化的神經(jīng)干細胞；從中胚層干細胞分化的神經(jīng)干細胞再分化成的神經(jīng)細胞；和從中胚層干細胞分化來的神經(jīng)細胞)可使之修復。
此外，按照本發(fā)明上述方法，預期從其中導入無限增殖化基因的中胚層干細胞分化的神經(jīng)干細胞和神經(jīng)細胞在完成神經(jīng)再生上是非常有用的。
當細胞是通過導入癌基因等而無限增殖化時，細胞的特征也被轉(zhuǎn)化。相反，當細胞是通過如本發(fā)明導入無限增殖化基因而無限增殖化時，細胞保持其原有特征。此外，如果某處已經(jīng)導入無限增殖化基因，在細胞足量增殖后該基因可被去除。
如上所述，本發(fā)明者們開發(fā)出用于有效誘導中胚層干細胞分化成神經(jīng)細胞的新方法，并因此完成發(fā)明。
特別地，本發(fā)明涉及誘導中胚層干細胞或ES細胞分化成神經(jīng)細胞的方法；誘導中胚層干細胞有效分化成神經(jīng)細胞，包括神經(jīng)干細胞的方法，其包括中胚層干細胞的無限增殖化；通過該方法獲得的神經(jīng)細胞；包含神經(jīng)細胞的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組合物；和用該組合物治療神經(jīng)細胞疾病的方法。更具體地，本發(fā)明涉及[1]通過在基礎培養(yǎng)基中于33℃至38℃保溫誘導中胚層干細胞或ES細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，其中中胚層干細胞或ES細胞源于從脊椎動物收集的骨髓液體或臍血分離的單核細胞部分。
誘導中胚層干細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，其包括以下步驟(a)經(jīng)高表達或激活無限增殖化基因而提供無限增殖化中胚層干細胞；和(b)通過將中胚層干細胞在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)而誘導步驟(a)中無限增殖化中胚層干細胞分化成神經(jīng)細胞；[3]按照[2]的方法，其中通過將無限增殖化基因?qū)胫信邔痈杉毎篃o限增殖化基因被高度表達或激活；[4]按照[3]的方法，其中用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體向中胚層干細胞導入無限增殖化基因使其永生。
按照[4]的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是pBabe；[6]按照[2]至[5]任何一項的方法，其中神經(jīng)細胞的無限增殖化基因可以或已經(jīng)通過基因去除處理而去除；[7]按照[6]的方法，其中無限增殖化基因的基因去除處理通過將無限增殖化基因夾心于一對loxP序列或loxP-樣序列中，然后用重組酶處理；[8]按照[2]至[7]任何一項的方法，其中無限增殖化基因選自端粒酶基因，端粒酶衍生的基因，或調(diào)節(jié)端粒酶表達或活性的基因中的任何一種；[9]按照[2]至[8]任何一項的方法，其中中胚層干細胞源于骨髓液體，臍血，外周血，皮膚，皮膚的發(fā)根細胞，肌肉組織，ES細胞或ES細胞衍生的細胞；[10]按照[2]至[8]任何一項的方法，其中中胚層干細胞包含在從脊椎動物骨髓液體或臍血分離的單核細胞部分里；[11]按照[1]至[10]任何一項的方法，其中單核細胞部分的制備可通過將從脊椎動物收集的骨髓液體或臍血在溶液中進行密度梯度離心，2000rpm維持確保根據(jù)比重分離的足夠時間，然后回收比重范圍1.07g/ml至1.1g/ml的細胞部分；[12]按照[1]至[11]任何一項的方法，其中中胚層干細胞具有下列特征SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)；[13]按照[2]至[12]任何一項的方法，其中培養(yǎng)在33℃至38℃完成；[14]按照[1]至[13]任何一項的方法，其進一步包括向基礎培養(yǎng)基中添加bFGF，EGF，或缺血的腦提取物；[15]按照[1]至[14]任何一項的方法，其中神經(jīng)細胞選自神經(jīng)干細胞，神經(jīng)祖細胞，神經(jīng)元，或神經(jīng)膠質(zhì)細胞；[16]按照[1]至[15]任何一項的方法獲得的細胞；[17]治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組合物，其包括[16]的細胞；[18]按照[17]的組合物，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病和脫髓鞘疾病，腦卒中，腦腫瘤，高位腦機能障礙(higher braindysfunction)，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病，炎癥性疾病，感染性疾病和脊髓梗死；[19]治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其中包括給受體移植按照[16]的細胞或按照[17]的組合物；[20]按照[19]的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自包括下列者中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病和脫髓鞘疾病，腦卒中，腦腫瘤，高位腦機能障礙，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病，炎癥性疾病，感染性疾病或脊髓梗塞；和[21]按照[19]或[20]的方法，其中用來移植的細胞來源于受體。
首先，本發(fā)明提供通過在基礎培養(yǎng)基中于33℃至38℃保溫誘導中胚層干細胞或ES細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，其中中胚層干細胞或ES細胞源于從脊椎動物收集的骨髓液體或臍血分離的單核細胞部分。
本發(fā)明也提供用于有效誘導中胚層干細胞分化成神經(jīng)干細胞和神經(jīng)細胞的新方法，該方法包括向中胚層干細胞導入無限增殖化基因而制備大量中胚層干細胞的步驟。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過在中胚層干細胞中高表達或激活無限增殖化基因使中胚層干細胞永生，然后通過培養(yǎng)該細胞誘導中胚層干細胞分化成神經(jīng)細胞。
按照上面描述的本發(fā)明的方法，首先，通過高表達或激活無限增殖化基因(immortalization gene)(步驟(a))提供無限增殖化(immortalized)中胚層干細胞。
如這里使用的，短語“中胚層干細胞”指構(gòu)成胚胎學分類為中胚層類組織的細胞，包括血細胞?！爸信邔痈杉毎币仓缚梢宰晕覐椭?分裂和增殖)的具有與其起源細胞相同潛力的細胞，并且其具有分化成構(gòu)成中胚層組織的所有類型細胞的能力。中胚層干細胞表達細胞標志，例如，SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)，但是這類細胞不局限于這些標志。而且，所謂的間質(zhì)-相關干細胞也包括在本發(fā)明的中胚層干細胞內(nèi)。
短語“間質(zhì)-相關細胞”指間質(zhì)干細胞，間質(zhì)細胞，間質(zhì)前體細胞和源于間質(zhì)細胞的細胞。
短語“間質(zhì)干細胞”指可以從骨髓，外周血，皮膚，發(fā)根，肌肉組織，子宮內(nèi)膜，血液，臍血和各種組織的原代培養(yǎng)物獲得的干細胞。
短語“間質(zhì)細胞的前體細胞”指從間質(zhì)干細胞分化的細胞，并且處于向間質(zhì)細胞分化的過程中。
間質(zhì)細胞是通過間質(zhì)干細胞分化產(chǎn)生。不像干細胞，間質(zhì)細胞沒有多能性。但是，間質(zhì)細胞在有限的方向上具有分化潛力和增殖潛力。正常地，間質(zhì)細胞停滯在G0期，但是在刺激時可以進入G1期(分裂開始)。間質(zhì)細胞包括，例如基質(zhì)細胞和具有基質(zhì)細胞特點的細胞。間質(zhì)細胞存在于每種器官，包括例如，皮下組織，肺和肝，存在于間質(zhì)組織，例如骨，軟骨，脂肪，肌腱，骨骼肌和骨髓的基質(zhì)。
源自間質(zhì)細胞的細胞包括(1)心血管系統(tǒng)的細胞，例如內(nèi)皮細胞和心肌細胞，心血管系統(tǒng)細胞的前體細胞，和具有這些細胞特征的細胞；(2)骨，軟骨，肌腱和骨骼肌的任何細胞，骨，軟骨，肌腱和骨骼肌和脂肪組織任何細胞的前體細胞，和具有這些細胞特征的細胞；(3)神經(jīng)系統(tǒng)的細胞(神經(jīng)細胞)，它們的前體細胞和具有這些細胞特征的細胞；(4)內(nèi)分泌細胞，它們的前體細胞和具有這些細胞特征的細胞；(5)造血細胞，它們的前體細胞和具有這些細胞特征的細胞；和(6)肝細胞，它們的前體細胞和具有這些細胞特征的細胞。
本發(fā)明的間質(zhì)干細胞可以從源自下列物質(zhì)的細胞制備例如源自脊椎動物骨髓液體，臍血，外周血，皮膚，皮膚的發(fā)根細胞，肌肉組織，ES細胞或源自ES細胞的細胞。這種細胞的制備可以從皮膚，例如，按照Young等的方法(Young et al.，2001，Anat.Rec.264(1)51-62；Campagnli et al.，2001，Blood 98(8)2396-2402)；從肌肉，例如按照Asakura等的方法(Asakura A et al.，2001，Differentiation 68(4-5)245-253)；從脂肪組織，例如按照Zuk等的方法(Zuk PA et al.，Tissue Eng.7(2)211-228)；和從滑膜，例如按照De Bari等的方法(De Bari et al.，2001，Arthritis Rheum.44(8)1928-1942)。
在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選的脊椎動物包括哺乳動物(例如，小鼠，大鼠，兔，豬，狗，猴，人，等等)，但本發(fā)明不限于此。
本發(fā)明使用的骨髓液體的收集可以通過，例如，將脊椎動物(包括人)麻醉(局部麻醉或全身麻醉)，骨穿刺并用注射器抽吸細胞。合適的骨來源包括但不局限于例如股骨，胸骨和形成骨盆的髂骨。而且，在分娩時直接穿刺臍帶并用注射器抽取血液以收集和貯存臍血的方法已經(jīng)成為建立好的技術。
本發(fā)明的ES細胞可以通過本領域技術人員已知的方法制備(Doetschman TC et al.，1985，J.Embryol.Exp.Morphol.8727-45；Williams RLet al.，1988，Nature 336684-687)。按照本發(fā)明，按照上述方法制備的ES細胞在實施例中描述的條件下可以分化成神經(jīng)細胞。
按照本發(fā)明，中胚層干細胞的制備可以通過將從脊椎動物收集的骨髓液體或臍血在溶液中進行密度梯度離心，900g維持確保根據(jù)比重分離的足夠時間，然后回收比重范圍1.07g/ml至1.1g/ml的細胞部分。如這里使用的，短語“確保根據(jù)比重分離的足夠時間”指在密度梯度離心的溶液中根據(jù)細胞的比重足以使細胞達到位置的時間，一般約10-30分鐘。根據(jù)細胞來源動物的類型(例如人，大鼠，小鼠等等)不同，要收集的細胞的比重可以變化。密度梯度離心使用的溶液包括但不局限于Ficoll溶液和Percoll溶液。
具體例子如下。將從脊椎動物收集的骨髓液體(25ml)或臍血與等體積的PBS混合。將混合物在900g離心10分鐘。通過向細胞中加入PBS(細胞密度＝約4×107細胞/ml)去除其他血液成分以回收沉淀的細胞。然后，每份5ml細胞懸液置于Percoll溶液上(1.073g/ml)，并于900g離心30分鐘以提取單核細胞成分。為洗滌細胞，將提取的單核細胞成分與下列物質(zhì)混合例如，培養(yǎng)基1[DMEM(Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基-低糖)/10％FBS(胎牛血清)/1％抗生素-抗真菌溶液]，培養(yǎng)基2[MSCBM(間質(zhì)干細胞基礎培養(yǎng)基)/10％MCGS(間質(zhì)細胞生長添加物)/4mM L-谷氨酰胺/1％青霉素-鏈霉素]，或培養(yǎng)基3[DMEM(Sigma)/10％FBS(Gibco)/1％青霉素-鏈霉素/2mM L-谷氨酰胺(Gibco)]，然后于900g離心15分鐘或2000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。然后，棄掉離心后的上清并收集沉淀的細胞，培養(yǎng)于37℃，5％CO2的空氣中。
間質(zhì)干細胞的獲得也可以通過，例如，選擇具有上面提及的細胞表面標志的細胞，即SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)，和用抗體從上面提及的單核細胞部分選擇。選擇的方法沒有限制，而且這里包括使用磁珠或一般的細胞分選(FACS等)方法。
或者，按照本發(fā)明，可以從單核細胞部分(包括在培養(yǎng)液中者)制備中胚層干細胞。單核細胞部分的制備可以通過將從脊椎動物收集的骨髓液體或臍血在溶液中進行密度梯度離心，900g維持確保根據(jù)比重分離的足夠時間，然后回收比重范圍1.07g/ml至1.1g/ml的細胞部分。如這里使用的，短語“確保根據(jù)比重分離的足夠時間”指在密度梯度離心的溶液中根據(jù)細胞的比重足以使細胞達到位置的時間，一般約10-30分鐘。要回收的細胞部分的比重優(yōu)選在1.07g/ml至1.08g/ml范圍內(nèi)(例如，1.077g/ml)。密度梯度離心使用的溶液包括但不局限于Ficoll溶液和Percoll溶液。
具體的例子如下。首先，將從脊椎動物收集的骨髓液體(5-10μl)與溶液(2ml L-15和3ml的Ficoll)混合。然后，通過將混合物在900g離心15分鐘提取單核細胞部分(約1ml)。將單核細胞部分與培養(yǎng)液(2ml NPBM)混合并再于900g離心15分鐘以洗滌細胞。然后，棄去上清，收集沉淀的細胞。
也可以將本發(fā)明的單核細胞部分的培養(yǎng)液按照下述用于制備中胚層干細胞。這種含有單核細胞部分的培養(yǎng)液的制備可以通過，例如在上面提及的培養(yǎng)基1，培養(yǎng)基2，或培養(yǎng)基3中于37℃，5％CO2條件培養(yǎng)單核細胞部分的細胞，但本發(fā)明不限制特殊的培養(yǎng)條件。
本發(fā)明的神經(jīng)細胞的類型沒有限制，而且本發(fā)明包括神經(jīng)干細胞，神經(jīng)祖細胞，神經(jīng)元，和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。
如這里使用的，短語“細胞無限增殖化”指一種狀態(tài)，其中細胞甚至在一定次數(shù)的細胞分裂之后仍連續(xù)增殖，而正常時，細胞在一定次數(shù)分裂后停止增殖。因此，如這里使用的，短語“無限增殖化基因”指甚至在這樣的細胞分裂次數(shù)之后指導細胞繼續(xù)細胞分裂的基因。這種基因包括但不局限于端粒酶基因，源于端粒酶的基因，和調(diào)節(jié)端粒酶表達或活性的基因(例如，已經(jīng)報道m(xù)yc基因能增強端粒酶活性)。在本發(fā)明中，人端粒酶基因(hTERT)是尤其優(yōu)選的實施方案。
按照本發(fā)明，高表達或激活無限增殖化基因的方法包括但不局限于將無限增殖化基因?qū)胫信邔痈杉毎姆椒?。將無限增殖化基因?qū)胫信邔痈杉毎梢酝ㄟ^本領域已知的任何方法進行。典型的方法包括將無限增殖化基因插入質(zhì)粒載體然后將載體在磷酸鈣存在時轉(zhuǎn)化導入中胚層干細胞的方法；通過將基因連同如脂質(zhì)體的囊泡與細胞接觸而將無限增殖化基因?qū)胫信邔痈杉毎姆椒?；用電穿孔將無限增殖化基因?qū)胫信邔痈杉毎姆椒?；和將無限增殖化基因?qū)敫鞣N病毒載體然后將載體感染中胚層干細胞以達到基因轉(zhuǎn)移。使用病毒載體的方法包括用逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺病毒-相關病毒的方法；使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法包括用MoMLV病毒的方法，等等。在本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用pBabe載體。
按照上面描述的方法使中胚層干細胞無限增殖化的步驟對本發(fā)明不是必需的，而且用上面描述的方法等以前無限增殖化的中胚層干細胞可以用于下面描述的步驟(b)。
按照本發(fā)明的方法，在上面描述的步驟(a)之后，通過在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)無限增殖化中胚層干細胞使之分化成神經(jīng)細胞(步驟(b))。
在此步驟的優(yōu)選實施方案中，通過在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)無限增殖化中胚層干細胞使之分化成神經(jīng)干細胞。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將上面提到的中胚層干細胞或上面提到的ES細胞在基礎培養(yǎng)基中于33℃至38℃保溫。
對本發(fā)明使用的基礎培養(yǎng)基的類型沒有限制，只要是可以用于細胞培養(yǎng)的一般培養(yǎng)基即可。優(yōu)選的培養(yǎng)基包括DMEM(Dulbecco’s改良的基礎培養(yǎng)基)和NPBM(神經(jīng)祖細胞基礎培養(yǎng)基；Clonetics)。對上面提到的基礎培養(yǎng)基中可能含有的其他組份類型沒有限制，優(yōu)選的成分包括F-12，F(xiàn)CS和神經(jīng)存活因子(Clonetics)。在這類培養(yǎng)基中，例如，F(xiàn)-12和FCS的濃度分別是50％和1％。在這類培養(yǎng)基中CO2的濃度優(yōu)選是5％，但本發(fā)明不限于此。
而且，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，向上面提到的基礎培養(yǎng)基中添加bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)或EGF(表皮生長因子)。在這種情況下，可以加入一種或者兩者都加入。上面提到的bFGF或EGF的舉例濃度是1ng/ml至100ng/ml，優(yōu)選的濃度為10ng/ml。對添加的時間和方法沒有限制。優(yōu)選地，在將上面提到的中胚層干細胞在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)時每天加入試劑。當中胚層干細胞向神經(jīng)干細胞分化時，優(yōu)選向上面提到的基礎培養(yǎng)基中既加入bFGF又加入EGF。
按照本發(fā)明，向上面提到的基礎培養(yǎng)基或含有其它成分的基礎培養(yǎng)基中添加缺血的腦提取物可以促進上面提到的中胚層干細胞分化成上面提到的神經(jīng)細胞包括神經(jīng)干細胞。一般地，缺少這種缺血的腦組織提取物，分化成神經(jīng)干細胞要用一星期或更長時間。但是，當加入這種提取物，誘導可以僅在幾天完成，而且，分化效率大大改善。本發(fā)明也提供這種用于促進向神經(jīng)細胞包括神經(jīng)干細胞分化的誘導方法。
制備本發(fā)明的缺血的腦提取物可以通過，例如，將脊椎動物缺血的腦碾碎裂解物離心。特別地，從全腦缺血動物模型(大鼠等)上切下全腦，從腦制備小塊并與NPBM(神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基)混合。將小塊在勻漿器內(nèi)機械碾碎。然后，將樣品在300g離心5分鐘或800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集所得上清，并將上清通過濾膜過濾以去除細胞碎片來制備缺血的腦提取物。但是，本發(fā)明不限于此方法。將用于全腦缺血動物模型的動物用戊巴比妥鈉(Nembutal)麻醉，然后用生理鹽水灌注動物。之后將用上面提到的方法制備的缺血腦提取物加入上面提到的基礎培養(yǎng)基或含有其它成分的基礎培養(yǎng)基。同樣，不限制添加的時間。
按照本發(fā)明，通過在上面描述的條件下培養(yǎng)，使上面提到的中胚層干細胞或上面提到的ES細胞分化成神經(jīng)細胞。所得的神經(jīng)細胞的具體例子包括神經(jīng)干細胞，神經(jīng)祖細胞，神經(jīng)元，和膠質(zhì)細胞。
本發(fā)明方法中使用的培養(yǎng)溫度在33℃至38℃之間，且優(yōu)選的溫度是37℃。
不限制培養(yǎng)條件的其它參數(shù)。細胞可以是懸浮狀態(tài)(神經(jīng)球狀態(tài))或粘附于培養(yǎng)容器。合適的培養(yǎng)容器包括例如，未包被的平皿等。
而且，通過去除無限增殖化基因，可以改進用本發(fā)明方法誘導分化的神經(jīng)細胞的安全性。在本發(fā)明中，可以用已建立的技術從細胞中去除導入的無限增殖化基因。特別地，無限增殖化基因可以經(jīng)例如Cre重組酶的重組酶處理而去除，例如，通過將無限增殖化基因置于一對loxP序列或loxP-樣序列之間。
按照本發(fā)明，也可以使中胚層干細胞直接分化成神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞(不轉(zhuǎn)變成神經(jīng)干細胞)，其通過將上面提到的中胚層干細胞培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基礎培養(yǎng)基)/50％F-12/1％FSC]或培養(yǎng)基2中[NPBM(神經(jīng)祖細胞基本培養(yǎng)基；Clonetics)/2％神經(jīng)存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生長因子)/0.2％慶大霉素-兩性霉素B/0.2％hFGF]并進一步培養(yǎng)大約幾天至約4周。因此，本發(fā)明也包括誘導中胚層干細胞直接分化成神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的方法。
本發(fā)明進一步提供用本發(fā)明上面提到的方法制備的細胞。本發(fā)明提供神經(jīng)細胞并且包括但不局限于神經(jīng)干細胞，神經(jīng)祖細胞，神經(jīng)元，和膠質(zhì)細胞。
本發(fā)明也提供用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組合物，該組合物包括用上面提到的方法制備的細胞。可以將本發(fā)明的細胞直接用于移植。但是，為改善治療效果，可以將細胞作為添加各種試劑的組合物或其中導入基因的組合物移植。
打算制備本發(fā)明的組合物時，例如，可以<1>加入改善本發(fā)明細胞增殖率或促進向神經(jīng)細胞分化的物質(zhì)，或?qū)胫笇н@些作用的基因；<2>在損傷的神經(jīng)組織中加入改善本發(fā)明細胞活力的物質(zhì)，或?qū)胫笇Т俗饔玫幕颍?amp;lt;3>加入抑制損傷神經(jīng)組織對本發(fā)明細胞的不良影響的物質(zhì)，或?qū)胫笇Т俗饔玫幕颍?amp;lt;4>加入延長供體細胞壽命的底物，或?qū)胫笇Т讼嗤饔玫幕颍?amp;lt;5>加入調(diào)節(jié)細胞周期的底物，或?qū)胫笇Т俗饔玫幕颍?amp;lt;6>加入用于抑制免疫反應的底物，或?qū)胫笇Т俗饔玫幕颍?amp;lt;7>加入激活能量代謝的底物，或?qū)胫笇Т俗饔玫幕颍?amp;lt;8>加入改善在宿主組織內(nèi)供體細胞遷移能力的底物，或?qū)胫笇Т俗饔玫幕颍?amp;lt;9>加入改善血流的底物，或?qū)胫笇Т俗饔?包括血管生成的誘導)的基因；和<10>加入對宿主腦和/或神經(jīng)有治療作用的底物(患有需治療的疾病包括，例如，腦腫瘤，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，腦卒中(包括腦梗塞，腦出血和蛛網(wǎng)膜下出血)，高位腦機能障礙包括癡呆，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病(包括頭部外傷，腦挫傷和脊髓損傷)，炎癥性疾病，感染性疾病等等)，或?qū)胫笇Т俗饔玫幕?。但是，本發(fā)明不限于這些例子。
為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的目的，可以將本發(fā)明的細胞和組合物移植給受體。需治療的疾病包括但不限于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，腦卒中(包括腦梗塞，腦出血和蛛網(wǎng)膜下出血)，腦腫瘤，高位腦機能障礙包括癡呆，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病(包括頭部外傷(head injury)，腦挫傷和脊髓損傷)，炎癥性疾病，感染性疾病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)和脊髓梗塞。
按照本發(fā)明，可以將源于受體的細胞作為供體細胞移植(自體移植治療)，該細胞例如從骨髓液，臍血，外周血，皮膚，肌肉組織，脂肪組織，滑膜和發(fā)根分離。由于低排斥風險和避免免疫抑制劑的使用，自體移植治療是優(yōu)選的。一旦自體移植治療困難，可以使用為醫(yī)療目的培養(yǎng)的其他人或動物的細胞。
本發(fā)明者也檢測細胞移植時間和治療效果的關系，并發(fā)現(xiàn)在超急性期(幾小時內(nèi))進行移植治療獲得最好的治療效果。僅次于超急性期進行治療，在急性期(幾天后)進行的治療可以獲得好的治療效果，在慢性期(幾周后)進行治療居于第三。因此，考慮在超急性期移植治療是優(yōu)選的。所以，提前收集并培養(yǎng)細胞，向細胞中導入基因，擴增細胞，誘導細胞分化和貯存細胞是非常有用的。特別地，優(yōu)選提前從受體收集細胞，按照本發(fā)明的方法向細胞導入無限增殖化基因，和通過培養(yǎng)為移植而適當儲存的細胞，誘導其分化成神經(jīng)細胞?？梢栽谙铝腥魏螤顟B(tài)貯存細胞?？紤]到要治療的疾病的類型，本領域的技術人員可以適當選擇細胞的合適狀態(tài)1.未經(jīng)任何處理的收集的細胞(粗提部分)；2.部分純化的細胞；3.純化的細胞并且然后經(jīng)培養(yǎng)擴增；4.純化的，無限增殖化的，和擴增的細胞；5.向神經(jīng)干細胞分化的細胞；和
6.向神經(jīng)細胞分化的細胞。
而且，在骨髓庫，臍血庫注冊的細胞等也可用于移植?？梢詫⑦@些細胞凍存。
此外，本發(fā)明顯示，當將中胚層干細胞(包括無限增殖化細胞)不經(jīng)任何進一步處理移植給受體時，中胚層干細胞向神經(jīng)組織遷移并分化成神經(jīng)細胞，導致功能恢復。相應地，向受體直接給予(移植)中胚層干細胞并誘導其體內(nèi)分化成神經(jīng)細胞的方法也包括在本發(fā)明中。不限制本方法中使用的給藥方法的類型。合適的給藥方法包括，例如，局部給藥，靜脈內(nèi)給藥，動脈內(nèi)給藥和腦脊髓內(nèi)給藥(例如，腰椎穿刺和腦室內(nèi)給藥)。
細胞移植給患者的完成可以通過，例如，注射器內(nèi)充滿待移植的懸于人工腦脊液，生理鹽水或類似物內(nèi)的細胞，手術暴露損傷的神經(jīng)組織，和直接用注射針向損傷區(qū)注射細胞。然后本發(fā)明的細胞由于高遷移性可以向神經(jīng)組織遷移。因此，可以將細胞移植入鄰近損傷區(qū)的部位。將細胞注射入腦脊液內(nèi)也是有效的。在這種情況下，可以用一般的腰椎穿刺注射細胞，并且是優(yōu)選的，因為患者只需局部麻醉且不必在病房手術。而且，動脈內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射也是有效的，并因此可以用與一般輸血相同的方法進行移植。與需要使用病房的那些移植方法相比，這些方法是優(yōu)選的。
此外，由于高遷移性，本發(fā)明的細胞可以用作基因的載體(載體)?？梢詫⑦@些細胞用作各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的載體，疾病例如，腦腫瘤，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，腦卒中(包括腦梗塞，腦出血和蛛網(wǎng)膜下出血)，高位腦機能障礙包括癡呆，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病(包括頭部損傷，腦挫傷和脊髓損傷)，炎癥性疾病，感染性疾病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)。


圖1顯示描述培養(yǎng)的中胚層干細胞的照片。細胞表達中胚層細胞標志SH3(A)，但是神經(jīng)干細胞標志巢蛋白(nestin)陰性(B)。在培養(yǎng)條件下誘導分化后，細胞形態(tài)變?yōu)樯窠?jīng)干細胞樣形態(tài)并且成為中胚層細胞標志SH3陰性(C)，和巢蛋白陽性(神經(jīng)干細胞標志)(D)。(A)和(B)中的標尺(scale bar)表示10μm，(C)和(D)中表示200μm。
圖2顯示描述從中胚層干細胞分化的神經(jīng)干細胞分化的照片，在培養(yǎng)條件下分化成神經(jīng)元(A，D)，分化成星形膠質(zhì)細胞(B，E)，和進一步誘導分化成少突膠質(zhì)細胞(C，F(xiàn))。細胞的免疫染色用NSE(神經(jīng)元特異的烯醇酶)(D)；GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)(E)；和GalC(半乳糖腦苷脂)(F)。標尺表示25μm。
圖3顯示描述移植的細胞使腦梗塞損傷的修復的照片。將供體細胞，即，從中胚層干細胞在培養(yǎng)條件下誘導分化的神經(jīng)干細胞，用LacZ基因(表達E.coliβ-半乳糖苷酶)遺傳標記。因此，當用底物X-gal處理時細胞被染成藍色。這可以追蹤宿主腦組織內(nèi)的供體細胞。用LacZ基因標記的供體細胞移植給大鼠腦梗塞模型(短暫大腦中動脈梗塞模型；腦梗塞發(fā)生在大腦基底神經(jīng)節(jié)，顳葉，海馬等等)，結(jié)果細胞進入受腦梗塞影響的大腦基底神經(jīng)節(jié)，顳葉，海馬等部位并修復組織。
圖4顯示移植的細胞使脊髓損傷區(qū)域修復的照片。用LacZ基因標記的供體細胞移植給大鼠脊髓損傷模型(在第一胸椎水平切斷脊髓的模型)，結(jié)果，供體細胞不僅向損傷區(qū)遷移，而且向腦(A)，頸髓(B)，腰髓(C)，和修復的組織遷移。圖(D)、(E)、(F)是分別與圖(A)、(B)、(C)相對應的高倍觀察。(A)-(C)中的標尺表示200μm，(D)-(E)中表示10μm。
圖5顯示移植的細胞使脊髓脫髓鞘區(qū)域修復的照片。(A)顯示將神經(jīng)干細胞移植入成熟大鼠脊髓脫髓鞘區(qū)域后再髓鞘化的照片。神經(jīng)干細胞已經(jīng)從來自成年人的人中胚層干細胞分化完成。(B)顯示用高倍觀察的再髓鞘化的軸突的照片。
圖6顯示從ES細胞分化的神經(jīng)干細胞的巢蛋白-陽性神經(jīng)球的照片。
圖7顯示用于向基質(zhì)細胞導入基因的載體結(jié)構(gòu)的圖解描述。
圖8顯示轉(zhuǎn)染基質(zhì)細胞的圖解描述。
圖9顯示基于中胚層干細胞(原代培養(yǎng))和導入hTERT而無限增殖化的中胚層干細胞細胞分裂產(chǎn)生的細胞數(shù)。
圖10顯示導入hTERT而無限增殖化的中胚層干細胞(A)和從無限增殖化的中胚層干細胞分化來的脂肪細胞(B油紅O-染色)的照片。
圖11顯示導入hTERT而無限增殖化的中胚層干細胞(A)和從無限增殖化的中胚層干細胞分化來的成軟骨細胞(BAlcian藍-染色)的照片。軟骨基質(zhì)中(冰凍切片)的軟骨素被染成藍色。
圖12顯示導入hTERT而無限增殖化的中胚層干細胞(A)和從無限增殖化的中胚層干細胞分化來的成骨細胞(Bvon Kossa-染色，礦物質(zhì)沉積)的照片。
圖13顯示從導入hTERT而無限增殖化的中胚層干細胞分化來的巢蛋白-陽性神經(jīng)干細胞的照片。標尺表示100μm。
圖14顯示從神經(jīng)干細胞分化來的NSE-陽性神經(jīng)元(A)和GFAP-陽性神經(jīng)膠質(zhì)細胞(B)，而該神經(jīng)干細胞是從導入hTERT而無限增殖化的中胚層干細胞分化來的。(A)中標尺表示20μm，(B)中表示10μm。
圖15顯示移植導入hTERT而無限增殖化的中胚層干細胞使脊髓脫髓鞘區(qū)域修復的照片。(A)顯示將導入hTERT基因的中胚層干細胞移植入成熟大鼠脊髓脫髓鞘區(qū)域后再髓鞘化的照片。(B)顯示用高倍觀察的再髓鞘化的軸突的照片。(A)中標尺表示250μm，(B)中表示10μm。
圖16顯示按照本發(fā)明的方法誘導各種細胞向神經(jīng)干細胞分化獲得的結(jié)果照片。在未處理的平皿中將各種細胞在神經(jīng)祖細胞基礎培養(yǎng)基中懸浮狀態(tài)保溫。48小時后觀察細胞。所有細胞在懸浮狀態(tài)是活的。僅MSC-hTERT，間質(zhì)-hTERT，和PDF顯示神經(jīng)球樣形態(tài)。
圖17顯示確認巢蛋白表達的RT-PCR測定結(jié)果照片，其中用本發(fā)明的方法在誘導向神經(jīng)干細胞分化的處理后，從各自的細胞制備總RNA用于RT-PCR。泳道A對應于DMEM-10％FBS/培養(yǎng)皿；B，NPBM/未處理的平皿/1天；C，NPBM/未處理的平皿/2天；D NPBM/未處理的平皿/5天。NPBM指神經(jīng)祖細胞基礎培養(yǎng)基。
圖18顯示確認從MSC分化的神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元的RT-PCR測定結(jié)果的照片。上圖顯示用GAPDH(GAPDH用作內(nèi)對照)標準化的結(jié)果；下圖顯示用神經(jīng)絲(NF)亞單位，NF-M標準化的結(jié)果。泳道1相應于DDW；泳道2，神經(jīng)干細胞；泳道3，MSC-hTERT；泳道4，間質(zhì)-hTERT；泳道5，PDF-hTERT；泳道6，MSC-hTERT BHA，DMSO；泳道7，間質(zhì)-hTERT BHA，DMSO；泳道8，PDF-hTERT BHA，DMSO；泳道9，MSC-hTERT NPBM(-)；泳道10，間質(zhì)-hTERT NPBM(-)；泳道11，PDF-hTERT NPBM(-)；泳道12，NSC NPBM(-)PDL/層粘連蛋白；泳道13，MSC-hTERT NPBM(-)PDL/層粘連蛋白；泳道14，間質(zhì)-hTERT NPBM(-)PDL/層粘連蛋白；和泳道15，PDF-hTERT NPBM(-)PDL/層粘連蛋白。
圖19顯示按照本發(fā)明方法誘導用載體導入的MSC-hTERT向神經(jīng)干細胞分化的結(jié)果的照片。在巢蛋白陽性細胞中載體表達EGFP。在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞。結(jié)果，顯示MSC-hTERT在向神經(jīng)干細胞分化前不表達EGFP，但是在誘導后強表達EGFP。
圖20顯示確認MSC-hTERT中巢蛋白表達的RT-PCR測定結(jié)果照片。泳道1，含有導入的巢蛋白增強子/啟動子EGFP的MSC-hTERT細胞；和泳道2，含有導入的巢蛋白增強子/啟動子EGFP并然后分化成神經(jīng)干細胞的MSC-hTERT細胞。
發(fā)明的最佳實施方案參考以下實施例詳細描述本發(fā)明，但是不應理解為本發(fā)明受此限制。
實施例1單核細胞部分和中胚層干細胞的制備(1)單核細胞部分和單核細胞部分的培養(yǎng)溶液將從小鼠(或人)收集的標本用含有3毫升Ficoll的L-15培養(yǎng)基(2毫升)稀釋，并于2,000rpm離心15分鐘。從單核細胞部分分離細胞，并懸于2毫升無血清培養(yǎng)基中(神經(jīng)祖細胞維持培養(yǎng)基(NPMM))。將懸液于2,000rpm離心15分鐘。棄上清并收集沉淀的細胞。將細胞重懸于NPMM中制備單核細胞部分。
進一步，單核細胞部分的培養(yǎng)溶液的制備通過在37℃，5％CO2條件下將單核細胞部分分別在下列培養(yǎng)基中保溫培養(yǎng)基1[DMEM(Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基-低糖)/10％FBS(胎牛血清)/1％抗生素抗霉菌溶液]，培養(yǎng)基2，和培養(yǎng)基3。
(2)中胚層干細胞使用抗體，從上面(1)描述的方法制備的單核細胞部分或單核細胞部分的培養(yǎng)溶液中挑選具有下列特征的細胞SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)。挑選通過使用磁珠或一般的細胞分類器(FACS等等)的方法進行。
實施例2中胚層干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導(1)中胚層干細胞向神經(jīng)干細胞分化的誘導首先，洗滌細胞并然后將培養(yǎng)基中的細胞用酶(試劑0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；室溫5分鐘)處理收集。加入等量培養(yǎng)基后，吹吸幾次使細胞分散成單個細胞。然后，將細胞于600rpm離心5分鐘。用吸管吸出沉淀的細胞。然后，在培養(yǎng)容器內(nèi)(未處理的聚苯乙烯平皿)中將細胞進一步培養(yǎng)在懸浮狀態(tài)，于37℃，5％CO2條件下，用新鮮的下列培養(yǎng)基培養(yǎng)基1[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基礎培養(yǎng)基)/50％F-12/1％FSC；每日添加10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和10ng/ml表皮生長因子(EGF)]或培養(yǎng)基2中[NPBM(神經(jīng)祖細胞基本培養(yǎng)基；Clonetics)/2％神經(jīng)存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生長因子)/0.2％慶大霉素-兩性霉素B/0.2％hFGF(人成纖維細胞生長因子)；每日添加10ng/ml bFGF和10ng/ml EGF]。
(2)中胚層干細胞向神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞分化的誘導在培養(yǎng)狀態(tài)將中胚層干細胞的培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基礎培養(yǎng)基)/50％F-12/1％FSC]或培養(yǎng)基2[NPBM(神經(jīng)祖細胞基本培養(yǎng)基；Clonetics)/2％神經(jīng)存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生長因子)/0.2％慶大霉素-兩性霉素B/0.2％hFGF]更換。培養(yǎng)約4周成功達到中胚層干細胞向神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的直接分化(不轉(zhuǎn)變成神經(jīng)干細胞)。
通過確認中胚層細胞標志SH2和SH3的消失(細胞起初是神經(jīng)干細胞標志巢蛋白陰性)和神經(jīng)干細胞標志巢蛋白的出現(xiàn)判斷用上面提到的方法(1)或(2)使中胚層干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導(圖1)。
此外，由于向神經(jīng)細胞分化，培養(yǎng)的中胚層干細胞形態(tài)改變。特別地，分散的細胞形成神經(jīng)球(圖1)。而且，確認這些神經(jīng)干細胞分化成神經(jīng)元(NSE陽性)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(GFAP陽性)(圖2)。
實施例3用缺血的腦提取物促進中胚層干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導在中胚層干細胞的培養(yǎng)期間，發(fā)現(xiàn)加入缺血的腦提取物使中胚層干細胞更高效率地向神經(jīng)干細胞分化，該提取物從暴露于缺血應激的腦制備。發(fā)現(xiàn)該方法僅用幾天的培養(yǎng)就確保中胚層干細胞高效地向神經(jīng)干細胞分化。
(1)缺血的腦提取物的制備首先，將大鼠用戊巴比妥鈉深麻醉并從前腹壁切開心前區(qū)以暴露心臟和升主動脈。切開心尖并將插管從左心室插入升主動脈。然后，在心臟的右心耳作切口，并用生理鹽水從插管灌注3分鐘使足夠的血液流出。灌注后，將大鼠保持4-5小時并用作全腦缺血模型。接下來，從上面提到的全腦缺血模型大鼠上切下大腦和中腦并用雕刻刀切成約1-2mm的小塊。將制備的小塊與NPMM混合并在勻漿器內(nèi)機械碾碎以制備懸液。然后，將懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，于800rpm離心5分鐘，收集所得上清。用0.22μm膜的濾器去除細胞成分并將過濾物用作缺血的腦提取物。
(2)培養(yǎng)的中胚層干細胞向神經(jīng)干細胞分化的誘導將MSCs進一步在100-mm未包被的平皿上(IWAKI)用條件培養(yǎng)基(3類本文其他處描述的)于37℃，5％CO2中培養(yǎng)直至90％匯合。然后，用Pasteur吸管吸出培養(yǎng)液并將細胞用Dulbecco’s PBS洗滌3次。向平皿中加入含有0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS 2毫升，于37℃保溫2-5分鐘直至細胞分開。向平皿中加入2毫升條件培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的反應。用Pasteur吸管將上清和分開的細胞轉(zhuǎn)移入離心管中，吹吸幾次，然后于1000rpm離心5分鐘。棄上清，將細胞在NPMM中重懸。將細胞置于37℃預溫的培養(yǎng)基(50％NPMM和50％缺血腦提取物)中，然后于37℃，5％CO2條件在100-mm未包被的平皿上(IWAKI)懸浮狀態(tài)培養(yǎng)，每日添加10ng/mlbFGF和10ng/mlEGF。
實施例4神經(jīng)再生潛力的評價評價用上面描述的誘導分化的方法獲得的神經(jīng)細胞的神經(jīng)再生潛力使用腦梗塞模型(圖3)，癡呆模型(圖3)，脊髓損傷模型(圖4)和脫髓鞘模型(圖5)。結(jié)果，接受評價的細胞具有和從腦提取并和培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞相當?shù)脑偕鷿摿Α?br> 實施例5ES細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導將小鼠ES細胞在100-mm明膠包被的平皿上(IWAKI)用20毫升條件培養(yǎng)基(DMEM，10％FCS，100μM 2-巰基乙醇，1000單位/mlESGRO(CHEMICON))于37℃，5％CO2中連續(xù)培養(yǎng)直至90％匯合。然后，用Pasteur吸管吸出培養(yǎng)基并將細胞用PBS洗滌3次。向平皿中加入含有0.25％胰蛋白酶和0.03％EDTA的PBS 2毫升，于37℃保溫2-5分鐘直至細胞分開。加入400μl FCS終止胰蛋白酶的反應。用Pasteur吸管將上清和分開的細胞轉(zhuǎn)移入離心管中，吹吸幾次，然后于1000rpm離心5分鐘。棄上清，將細胞在NPMM中重懸。將細胞置于37℃預溫的培養(yǎng)基(50％NPMM和50％缺血腦提取物)中，然后于37℃，5％CO2條件在100-mm未包被的平皿上(IWAKI)懸浮狀態(tài)培養(yǎng)，每日添加10ng/ml bFGF和10ng/mlEGF。
實施例6向細胞內(nèi)導入hTERT基因下面描述通過向細胞內(nèi)導入hTERT基因使基質(zhì)細胞無限增殖化的方法1.原代基質(zhì)細胞的收集從健康成年男性髂骨獲得的10ml骨髓液體分離單核細胞。過夜培養(yǎng)后粘附于瓶底的細胞用做基質(zhì)細胞。
2.將編碼人端粒酶催化亞基(hTERT)的基因?qū)牖|(zhì)細胞。hTERT的序列，例如Science 277955-959所發(fā)表。Ras基因和SV40 T基因都是已知的和細胞腫瘤發(fā)生有關的基因，也將其導入基質(zhì)細胞。
3.用作基因?qū)牖|(zhì)細胞的載體pBABE-hygro-hTERT(Robert A.Weinberg博士惠贈；圖7)通過將hTERT克隆入pBABE-hygro構(gòu)建，其中hTERT EcoRV-SalI片段如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514723-14728所描述的用PCR從pCI-Neo-hTERT-HA獲得。載體pBABE-puro-rasV12(Scott WLowe博士惠贈)的制備按照Cell，88593-602，1997描述的方法。載體pMFG-tsT-IRES-neo的制備通過將IRES-neo的BamHI片段(通過消化pRx-hCD25-ires-neo獲得(Human gene therapy 91983-1993，1998))克隆入MFG-tsT(通過將pZIPtsU19片段(R.McKay博士惠贈)插入MFG載體制備(Lab.Invest.781467-1468，1998))。
4.產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞的制備和用該細胞的病毒感染按照“ExperimentalMedicine，SupplementThe Protocal Series-Experimental Methods forGeneDelivery & Expression Analysis(Eds.，I.Saito and S.Sugano；Yodosha)(pp.58-62)”描述的方法進行。
特別地，通過下面描述的方法用BOSC23包裝(packaging)細胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908392-8396，1993)制備ψCRIP包裝細胞Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908392-8396，1993)。
4-1.產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細胞的制備i)轉(zhuǎn)染前18-24小時將BOSC23細胞以密度5.5×106細胞/平皿種于10cm平皿中。
ii)向15μg DNA(逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)中輕輕加入800μlOPTI-MEM(Gibco/BRL)并攪拌混合物制備溶液A。
iii)在無菌試管中放入750μl OPTI-MEM，向其中加入50μlLIPOFECTAMINE(2mg/ml Gibco/BRL)并輕輕振搖混合物以制備溶液B。
iv)將溶液B輕輕混入溶液A并然后在室溫放置30-45分鐘制備溶液C。
v)將BOSC23細胞用37℃預溫的無抗生素，無FBS培養(yǎng)基洗滌一次。
vi)將溶液C(1.6ml)輕輕加入BOSC23細胞。
vii)再向混合物中加入2.4 ml OPTI-MEM。
viii)將所得混合物在5％CO2條件下保溫5小時。
ix)加入含有20％胎牛血清的DMEM 4ml并將混合物保溫過夜。
x)將培養(yǎng)基換成用37℃預溫的含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，同時將ψCRIP包裝細胞以密度1-2×106細胞/平皿種于10cm平皿中。
xi)24小時后，將BOSC23細胞的培養(yǎng)基通過0.45μm或0.20μm的注射器濾器過濾。同時，以終濃度8μg/ml加入polybrene(Hexadimethrine Bromide，SIGMA H-9268)。
xii)4-24小時培養(yǎng)后，加入5ml培養(yǎng)基并將細胞繼續(xù)保溫過夜。
xiii)最后，用藥物篩選制備產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的ψCRIP細胞。
然后，將上面提到的三種載體分別在產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞(ψCRIP/P131)中擴增。將基質(zhì)細胞如下轉(zhuǎn)染(圖8)。
首先，轉(zhuǎn)染前1天，將基質(zhì)細胞以密度5×104細胞/10cm平皿再次接種，并將產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的ψCRIP/P131的培養(yǎng)基由含10％牛血清的DMEM換成含12.5％滅活的馬血清，12.5％滅活的胎牛血清，2-巰基乙醇，和氫化可的松(hydrocortisone)的α-MEM培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當天，將培養(yǎng)上清通過0.20μm的濾器過濾并以終濃度8μg/ml加入1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)。接著，將上清中產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染基質(zhì)細胞。4小時后，用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)上清并繼續(xù)培養(yǎng)2天。然后進行藥物篩選，分別是對pBABE-hygro-hTERT用100μg/ml潮霉素5天；對pBABE-puro-rasV12用1μg/ml嘌呤霉素5天；對pMFG-tsT-IRES-neo用1mg/ml G4185天。
用3類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以下列組合完成感染(1)對照；(2)單獨pBABE-hygro-hTERT；(3)單獨pMFG-tsT-IRES-neo；(4)單獨pBABE-puro-rasV12；(5)兩種載體pMFG-tsT-IRES-neo和pBABE-hygro-hTERT；(6)兩種載體pBABE-puro-rasV12和pBABE-hygro-hTERT；(7)兩種載體pMFG-tsT-IRES-neo和pBABE-puro-rasV12；(8)三種載體pBABE-puro-rasV12，pMFG-tsT-IRES-neo和pBABE-hygro-hTERT。
發(fā)明者保存有這些病毒和載體，而且在獲得此申請的專利后可以進行這樣的公開利用。
實施例7間質(zhì)干細胞的分化潛力間質(zhì)干細胞，其具有分化成骨，軟骨，肌肉，等等的能力和自我更新能力，檢測其分化潛力和支持血液干細胞的能力。
在健康成年人進行髂骨穿刺。接著，通過密度離心收集單核細胞并在含10％滅活的胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)過夜。從第2天開始培養(yǎng)粘附的細胞。2周后，將用T-E(胰蛋白酶-EDTA)收集的細胞保存為冰凍的原代間質(zhì)干細胞。然后，同實施例1導入hTERT基因。然后對比原代間質(zhì)干細胞和通過導入hTERT基因無限增殖化的間質(zhì)干細胞的生長曲線。結(jié)果如圖9所示。如圖9所示，42天后(代數(shù)，17(PD＝17))原代間質(zhì)干細胞的細胞分裂停止(臨界(crisis))。另一方面，無限增殖化的間質(zhì)干細胞保持最初的細胞分裂速率并可以傳代至270天之后(代數(shù)，54(PD＝54))。因此，推測已經(jīng)建立穩(wěn)定的細胞系。
接下來，檢測制備的間質(zhì)干細胞多潛能性。
(1)首先，(用1μM地塞米松(dexamethasone)，60μM indomethacin，0.5μM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和5μg/ml胰島素誘導向脂肪細胞的分化。培養(yǎng)約一周后，將細胞用油紅O染色(圖10；脂滴染成紅色)。
(2)然后，用1μM地塞米松，50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸鹽，6.25μg/ml胰島素，6.25μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5.35μg/ml硒酸，1.25mg/ml亞油酸和10ng/mlTGF-β誘導向軟骨分化。培養(yǎng)2-3周后，將細胞用Alcian藍染色。軟骨基質(zhì)(冰凍切片)中的軟骨素被染成藍色(圖11)。
(3)而且，用1μM地塞米松，50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸鹽和10mM β-磷酸甘油誘導骨分化。培養(yǎng)2-3周后，將細胞進行von Kossa染色(礦物質(zhì)的沉積)。結(jié)果如圖12所示。
實施例8中胚層干細胞向神經(jīng)細胞分化的誘導(1)中胚層干細胞向神經(jīng)干細胞的分化將上面實施例中通過導入hTERT基因無限增殖化的中胚層干細胞(MSC)用作下面實驗中的間質(zhì)干細胞。
首先，將永生細胞洗滌，然后用酶處理(試劑0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；室溫5分鐘)收集培養(yǎng)基中的細胞。加入等量的培養(yǎng)基并吹吸幾次使細胞分散成單個。然后將懸液于900g離心5分鐘。用吸管吸取沉淀的細胞。然后，在培養(yǎng)容器內(nèi)(未處理的聚苯乙烯平皿)中將細胞進一步培養(yǎng)在懸浮狀態(tài)，于37℃，5％CO2條件下，用新鮮的下列培養(yǎng)基培養(yǎng)基1[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基礎培養(yǎng)基)/50％F-12/1％FSC；每日添加10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和10ng/ml表皮生長因子(EGF)]或培養(yǎng)基2中[NPBM(神經(jīng)祖細胞基本培養(yǎng)基；Clonetics)/2％神經(jīng)存活因子(Clonetics)/10ng/ml hEGF(人表皮生長因子)/0.2％慶大霉素-兩性霉素B/10ng/ml hFGF(人成纖維細胞生長因子)；每日添加10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和10ng/ml表皮生長因子(EGF)]。
用這種方法使中胚層干細胞向神經(jīng)干細胞的分化用中胚層干細胞標志SH2和SH3(細胞最初是神經(jīng)干細胞標志巢蛋白陰性)的消失和神經(jīng)干細胞標志巢蛋白的出現(xiàn)(細胞變成此標志陽性)來評估(圖13)。
此外，分化成神經(jīng)干細胞時培養(yǎng)的中胚層干細胞形態(tài)學發(fā)生變化。特別地，分散的細胞形成神經(jīng)球(圖7)。此外，發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元(NSE陽性)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(GFAP陽性)分化(圖14)。
(2)中胚層干細胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化[1]將上面培養(yǎng)中胚層干細胞的培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基礎培養(yǎng)基)/50％F-12/1％FSC]或培養(yǎng)基2[NPBM(神經(jīng)祖細胞基本培養(yǎng)基；Clonetics)/2％神經(jīng)存活因子(Clonetics)/10ng/ml hEGF(人表皮生長因子)/0.2％慶大霉素-兩性霉素B/10ng/mlhFGF]，培養(yǎng)約4周。結(jié)果，成功誘導中胚層干細胞直接分化成神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞(不經(jīng)過神經(jīng)干細胞的轉(zhuǎn)變)。
(3)中胚層干細胞向神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的分化[2]也可以用下面方法誘導中胚層干細胞向神經(jīng)元的分化。按照以前報道完成神經(jīng)的誘導(Journal of Neuroscience Research 61364-370，2000)。首先，調(diào)節(jié)MSC KYhTERT的細胞密度。特別地，將細胞在10-cm平皿中預培養(yǎng)直至70-80％匯合，吸棄上清，用5ml PBS洗滌，加入1ml胰蛋白酶/EDTA收集細胞。在210g離心10分鐘使細胞沉淀，然后以2×104細胞/ml密度用含10％胎牛血清的DMEM重懸細胞。按照2ml等份將溶液置于6孔板的每個孔中(4×104細胞)。24小時后，棄掉含10％胎牛血清的DMEM，并將培養(yǎng)基換成含1mM 2-ME和10％胎牛血清的DMEM 2ml(預誘導)。再過24小時，棄去血清并用下列三類培養(yǎng)基完成神經(jīng)的誘導(1)含1mM 2-ME的DMEM 2ml；(2)含10mM 2-ME的DMEM 2ml；和(3)含200μM丁醇改性的hydroxyanisole(BHA，Sigma)和2％二甲基亞砜(DMSO，NACALAI)。用上面的培養(yǎng)基誘導24小時后觀察細胞的形態(tài)。
結(jié)果，用(1)的培養(yǎng)基，有扁平胞質(zhì)的MSC KY hTERT的細胞質(zhì)退化并顯示與相鄰細胞接觸的具有雙極或多極形態(tài)的形態(tài)學。與用(1)的培養(yǎng)基獲得的結(jié)果相比，用(2)或(3)的培養(yǎng)基觀察到更多的細胞展現(xiàn)出幾乎相同的形態(tài)。這些形態(tài)學的改變與以前報道中描述的相似。進一步用神經(jīng)標志的免疫染色分析細胞。將3類抗體的溶液，即，抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP；Cappel)抗體，髓磷脂堿性蛋白(MBP；Chemicon)抗體；和神經(jīng)元特異的烯醇酶抗體(NSE；ARP)分別稀釋50，200，200倍用于實驗。進一步，用Vectastain EliteABC試劑盒(VECTOR laboratories)和DAB底物試劑盒作底物完成免疫染色。將細胞用2％多聚甲醛固定細胞并用0.3％過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化物酶。如上描述的完成神經(jīng)的誘導并在誘導后24小時進行免疫染色。
實施例9神經(jīng)再生潛力的評價用上述誘導分化方法獲得的神經(jīng)細胞的神經(jīng)再生潛力用腦梗塞模型，癡呆模型，脊髓損傷模型和脫髓鞘模型來評價。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該細胞具有與從腦提取并培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞相同的再生潛力(圖15)。
實施例10神經(jīng)球樣細胞的向神經(jīng)細胞分化按照上面實施例的方法將hTERT基因?qū)胫信邔痈杉毎归g質(zhì)干細胞無限增殖化(MSC-hTERT)。進一步，將hTERT基因同樣導入基質(zhì)細胞(基質(zhì)-hTERT)，PDF細胞，Hella細胞和HepG2細胞。然后，將每種細胞分別懸于神經(jīng)祖細胞基礎培養(yǎng)基中并在未處理的平皿中培養(yǎng)。48小時后，觀察細胞的形態(tài)。MSC-hTERT，基質(zhì)-hTERT和PDF細胞顯示球樣形態(tài)(圖16)。
而且，按照本發(fā)明的方法(即，在未處理的平皿中于神經(jīng)祖細胞基礎培養(yǎng)基里懸浮培養(yǎng)1，2，或5天)將上面提到的各種細胞誘導分化成神經(jīng)干細胞后，從細胞制備總RNA并用RT-PCR檢測巢蛋白的表達。
將僅培養(yǎng)在含10％FBS的DMEM中的細胞用作對照。判定用這種方法誘導的中胚層干細胞向干細胞的分化如實施例8所描述，是通過確認細胞變成神經(jīng)干細胞標志巢蛋白陽性。
結(jié)果，在培養(yǎng)2或5天的MSC-hTERT，MSC，基質(zhì)-hTERT和PDF細胞的泳道檢測到巢蛋白的表達(圖17)。
實施例11向神經(jīng)元的分化和神經(jīng)球的形成將實施例10中使用的各種細胞以5×104細胞/孔密度用含10％FBS的DMEM種于6孔板上。過夜培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基換成含10％FBS和1mMβ-ME的DMEM，繼續(xù)將細胞培養(yǎng)過夜。然后，將培養(yǎng)基換成含2％DMSO/200μM叔丁對甲氧酚(butylated hydroxyanisole)(BHA)的DMEM進行誘導。4天后，收集細胞并提取RT-PCR用的總RNA。
進一步，將上面提到的各種細胞以5×105細胞/10-cm密度種于含有NPBM(FGF(20ng/ml)和EGF(20ng/ml))培養(yǎng)基的未包被平皿上以形成神經(jīng)球。4天后，收集細胞并用NPBM(FGF，EGF(-))以1×105細胞/孔密度種板(用多聚-D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的6孔板)。10天后，收集細胞并提取RT-PCR用的總RNA。
為使樣品間cDNA濃度差異標準化，用同樣方法分析甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為標準化的內(nèi)對照。
結(jié)果，觀察到從MSC-hTERT分化的神經(jīng)元(圖18中泳道6；BHA和DMSO)和從MSC-hTERT經(jīng)神經(jīng)干細胞分化的神經(jīng)元(圖18中泳道13；NPBM(-)PDL/層粘連蛋白)強表達NF-M。
實施例12巢蛋白的表達當宿主變成巢蛋白陽性時，向MSC-hTERT導入表達EGFP的載體制備細胞系。體外誘導向神經(jīng)干細胞的分化，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)巢蛋白陽性的MSC-hTERT細胞發(fā)射綠色熒光(圖19)。
而且，也用RT-PCR證實巢蛋白的表達(圖20)。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供誘導中胚層干細胞或ES細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，一種新方法其包括擴增中胚層干細胞獲得大量細胞和有效誘導細胞分化成神經(jīng)干細胞，神經(jīng)細胞；用該方法獲得的神經(jīng)細胞；包含神經(jīng)細胞的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組合物；和用該組合物治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。
當在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的人中胚層干細胞的擴增受到某種程度限制時，可以非常穩(wěn)定地大規(guī)模擴增已經(jīng)導入hTERT基因的本發(fā)明的中胚層干細胞。而且，不象導入原癌基因等修飾的細胞，本發(fā)明的細胞未出現(xiàn)細胞特征的可見變化。因此，在不丟失細胞原始特性的情況下可以完成細胞的無限增殖化。此外，細胞充分擴增后可以去除hTERT基因。
本發(fā)明的方法對各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療是有用的，這些疾病例如中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，腦卒中(包括腦梗塞，腦出血和蛛網(wǎng)膜下出血)，腦腫瘤，高位腦機能障礙包括癡呆，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病(包括腦損傷，腦挫傷和脊髓損傷)，炎癥性疾病，感染性疾病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)和脊髓梗塞。此外，打算將本發(fā)明用于更普通的和彌散的腦和/或神經(jīng)損傷的神經(jīng)移植和/或再生治療。特別地，可以將本發(fā)明用于下列疾病的自體移植治療中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，腦卒中(包括腦梗塞，腦出血和蛛網(wǎng)膜下出血)，腦腫瘤，高位腦機能障礙包括癡呆，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病(包括腦損傷，腦挫傷和脊髓損傷)，炎癥性疾病，感染性疾病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)和脊髓梗塞。
而且，本發(fā)明的誘導分化方法提供理解中胚層干細胞向神經(jīng)細胞分化潛在機制的可能。一旦指導這種分化的基因被鑒定和分析，就可以用這種基因?qū)⒆懔康闹信邔痈杉毎行У剞D(zhuǎn)化成神經(jīng)細胞。因此，非常期望本發(fā)明使促進神經(jīng)組織再生的“基因治療”成為可能。
此外，本發(fā)明的方法可應用于藥物開發(fā)的功能試驗，毒性試驗，和cDNA克隆。通常，在開發(fā)作用于神經(jīng)的治療性藥物中的評價系統(tǒng)需要大量神經(jīng)元，如用于功能試驗和毒性試驗的評價系統(tǒng)，或者用于對修飾人神經(jīng)細胞功能的新cDNA的研究的評價系統(tǒng)。以前，提供足量的人神經(jīng)元是非常困難的。而且，這里的無限增殖化細胞系可以相當簡單地從小鼠細胞等獲得。然而，多數(shù)地，人的神經(jīng)元和源自非人類動物種屬的細胞具有很大差異(種屬特異性)，而且用動物細胞或動物個體獲得的實驗結(jié)果經(jīng)常難于替代人類細胞的而應用于人。使用本發(fā)明的細胞和方法，可以容易地大規(guī)模制備足量的人類神經(jīng)細胞來完成所有實驗。而且，可以制備這種細胞來保留原始的人神經(jīng)元的特點和功能。因此，考慮到藥物開發(fā)的功能試驗，毒性試驗和cDNA克隆的方法，和以前常常受到量的限制的方法，按照本發(fā)明，可以完成明顯的技術革新。
例如，當化合物(藥物)的功能試驗和毒性試驗已經(jīng)通過將化合物給予實驗動物如大鼠來進行時，許多實驗結(jié)果不能對應于人。因此，本領域中希望使用人類標本檢測。在所有的人類細胞中，神經(jīng)細胞是難于得到的。因此，當可以獲得足量的人類神經(jīng)細胞時，用人類神經(jīng)細胞的可以容易地進行功能試驗和毒性試驗。因此，這種細胞在藥物開發(fā)中是非常有用的。通過用本發(fā)明的無限增殖化的人MSC獲得大量細胞，并按照本發(fā)明的方法使制備的細胞向神經(jīng)細胞分化就可以制備大量的人神經(jīng)細胞。
本發(fā)明提供使中胚層細胞分化成神經(jīng)細胞的技術。進一步，通過克隆可以鑒定分化中表達水平改變的基因，調(diào)節(jié)生長/增殖的基因。此外，盡管需要大量細胞完成這種研究，由于可以按照本發(fā)明的方法制備大量的無限增殖化的人MSC的事實，本發(fā)明具有例如方便的完成基因克隆的價值。
權利要求
1.通過在基礎培養(yǎng)基中于33℃至38℃保溫誘導中胚層干細胞或ES細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，其中中胚層干細胞或ES細胞源于從脊椎動物收集的骨髓液體或臍血分離的單核細胞部分。
2.誘導中胚層干細胞分化成神經(jīng)細胞的方法，其包括以下步驟(a)經(jīng)高表達或激活無限增殖化基因而提供無限增殖化中胚層干細胞；和(b)通過將中胚層干細胞在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)而誘導步驟(a)中無限增殖化中胚層干細胞分化成神經(jīng)細胞。
3.按照權利要求2的方法，其中通過將無限增殖化基因?qū)胫信邔痈杉毎篃o限增殖化基因被高度表達或激活。
4.按照權利要求3的方法，其中用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體向中胚層干細胞中導入無限增殖化基因使其永生。
5.按照權利要求4的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是pBabe。
6.按照權利要求2至5中任何一項的方法，其中神經(jīng)細胞的無限增殖化基因可以或已經(jīng)通過基因去除處理而去除。
7.按照權利要求6的方法，其中無限增殖化基因的基因去除處理通過將無限增殖化基因夾心于一對loxP序列或loxP-樣序列中，然后用重組酶處理。
8.按照權利要求2至7中任何一項的方法，其中無限增殖化基因選自端粒酶基因，端粒酶衍生的基因，或調(diào)節(jié)端粒酶表達或活性的基因中的任何一種。
9.按照權利要求2至8中任何一項的方法，其中中胚層干細胞源于骨髓液體，臍血，外周血，皮膚，皮膚的發(fā)根細胞，肌肉組織，ES細胞或ES細胞衍生的細胞。
10.按照權利要求2至8中任何一項的方法，其中中胚層干細胞包含在從脊椎動物骨髓液體或臍血分離的單核細胞部分里。
11.按照權利要求1至10中任何一項的方法，其中單核細胞部分的制備可通過將從脊椎動物收集的骨髓液體或臍血在溶液中進行密度梯度離心，2000rpm維持確保根據(jù)比重分離的足夠時間，然后回收比重范圍1.07g/ml至1.1g/ml的細胞部分。
12.按照權利要求1至11中任何一項的方法，其中中胚層干細胞具有下列特征SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)。
13.按照權利要求2至12中任何一項的方法，其中培養(yǎng)在33℃至38℃完成。
14.按照權利要求1至13中任何一項的方法，其進一步包括向基礎培養(yǎng)基中添加bFGF，EGF，或缺血的腦提取物。
15.按照權利要求1至14中任何一項的方法，其中神經(jīng)細胞選自包括神經(jīng)干細胞，神經(jīng)祖細胞，神經(jīng)元，和膠質(zhì)細胞。
16.按照權利要求1至15任何一個的方法獲得的細胞。
17.治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組合物，其包括按照權利要求16的細胞。
18.按照權利要求17的組合物，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病和脫髓鞘疾病，腦卒中，腦腫瘤，高位腦機能障礙，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病，炎癥性疾病，感染性疾病或脊髓梗塞。
19.一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其中包括給受體移植按照權利要求16的細胞或按照權利要求17的組合物。
20.按照權利要求19的方法，其中神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病和脫髓鞘疾病，腦卒中，腦腫瘤，高位腦機能障礙，精神疾病，癲癇，創(chuàng)傷性神經(jīng)疾病，炎癥性疾病，感染性疾病或脊髓梗塞。
21.按照權利要求19或20的方法，其中用來移植的細胞來源于受體。
全文摘要
發(fā)現(xiàn)將從骨髓液體或臍血分離的單核細胞部分制備的中胚層干細胞或ES細胞培養(yǎng)在液體基礎培養(yǎng)基中時向神經(jīng)干細胞，神經(jīng)細胞，或神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。此外，通過向上面提到的液體基礎培養(yǎng)基中加入缺血腦提取物促進中胚層干細胞或ES細胞向神經(jīng)細胞分化。而且，在腦梗塞模型，癡呆模型，脊髓損傷模型和脫髓鞘模型上，發(fā)現(xiàn)用上面描述的誘導分化方法獲得的神經(jīng)細胞具有神經(jīng)再生潛力。此外，按照本發(fā)明，通過使中胚層干細胞無限增殖化可以將其分化成神經(jīng)系統(tǒng)細胞，而無限增殖化通過在中胚層干細胞中高表達或激活無限增殖化基因并在適當條件下培養(yǎng)該細胞。本發(fā)明的方法在神經(jīng)再生的醫(yī)學領域中是非常有用的。
文檔編號A61P25/00GK1610738SQ02826599
公開日2005年4月27日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權日2001年10月30日
發(fā)明者本望修, 濱田洋文 申請人:株式會社雷諾再生醫(yī)學研究所