專利名稱：衍生自靈長類胚胎干細胞的內(nèi)皮細胞的制作方法
相關(guān)申請的相互參照本申請要求2001-11-02提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/335,332的優(yōu)先權(quán)。
關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)工作的聲明待定。
背景技術(shù)：
干細胞被定義為既能夠自行更新，又能夠分化成為一種或多種分化細胞類型的細胞。人胚胎干細胞就是從預(yù)先植入的人胚泡產(chǎn)生的這樣的一類干細胞。人胚胎干細胞是多能性細胞，可能還是全能性細胞，也就是說它們確實能夠分化成在成年人體中被證實的多種細胞類型，而且很可能分化成人體內(nèi)所有的細胞類型。
胚胎干細胞(ES細胞)也可衍生自除人以外的其他各種動物。例如，許多科學(xué)研究工作都是利用小鼠胚胎干細胞進行的。對于一種特定物種，ES細胞培養(yǎng)物的制備方法一旦制定之后，就有可能從多種途徑利用這種ES細胞以及據(jù)以制備的動物，來探索有關(guān)所研究的這種動物的遺傳方面的有價值的信息資料。例如，在過去的十年間，已經(jīng)有可能培養(yǎng)出小鼠ES細胞的培養(yǎng)物，其中每一種小鼠ES細胞培養(yǎng)物都有一個或多個特異性基因是被剔除的。已經(jīng)在各種小鼠胚胎細胞系中使用的有些技術(shù)，都能夠轉(zhuǎn)用于其他動物種，也有多種技術(shù)則不能。例如，能夠用于創(chuàng)立小鼠胚胎細胞培養(yǎng)物的幾種基礎(chǔ)技術(shù)，都不能完善地轉(zhuǎn)用于多種其他動物種。對于涉及人ES細胞的培養(yǎng)和使用的各種技術(shù)的開發(fā)，由于人類與小鼠之間在種系發(fā)生方面的距離，小鼠細胞可能并不是最良好的模型。然而，在有關(guān)人ES細胞的培養(yǎng)和技術(shù)科學(xué)發(fā)展過程中，初期的研究工作都是利用非人靈長類進行的，例如，利用獼猴。已經(jīng)證實，其他靈長類ES細胞培養(yǎng)物，對于能夠容易地轉(zhuǎn)用于人類細胞培養(yǎng)的各種系統(tǒng)，都是相當(dāng)可靠的模型。舉例來說，各種小鼠ES細胞培養(yǎng)物，對于維持非分化細胞的生長，要求采用白血病抑制因子(LIF)或其他gp130/STAT3發(fā)送信號途徑，而在人和獼猴的ES細胞培養(yǎng)物方面，對于非分化細胞的生長，則不需要LIF參與。在進行造血作用的研究之前，先利用獼猴的ES細胞，來驗證這一系統(tǒng)對于這項技術(shù)轉(zhuǎn)用于人ES細胞培養(yǎng)的可能性，進行臨床前期的調(diào)查研究。
干細胞的潛在誘人的用途之一就是對于人類組織的移植。在科學(xué)研究方面熱切期望能夠開發(fā)出各種指導(dǎo)干細胞分化成能夠移植入人體內(nèi)以替代或增強機體組織的各種專門的細胞系列，。為此，必須開發(fā)的第一批技術(shù)，就是指導(dǎo)干細胞定向分化成理想的專門的細胞系列。已經(jīng)提出的各種技術(shù)包括引導(dǎo)干細胞成為造血系、神經(jīng)系、心肌細胞系、胰腺系以及其他各種細胞系列。已經(jīng)證實，這類技術(shù)都各具特色，自成體系，互不相關(guān)，意味著對于每一個理想的新的細胞系列，都要求一套新的不同的技術(shù)。
在人體內(nèi)，內(nèi)皮細胞可構(gòu)成連接血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)和形成毛細血管網(wǎng)的一整套網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。內(nèi)皮細胞可支配營養(yǎng)物質(zhì)的流通、并且可引導(dǎo)產(chǎn)生形式多樣的生物學(xué)活性分子，以及對其作出種種反應(yīng)。已經(jīng)證實，人ES細胞能夠分化出多種子代細胞類型，包括內(nèi)皮細胞。這已經(jīng)不可能是象原先那樣指導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)皮細胞系列的可能導(dǎo)引不同的衍生細胞的人ES細胞。
發(fā)明概述簡言之，本發(fā)明開發(fā)了一種方法，該方法能夠引導(dǎo)干細胞培養(yǎng)物分化成內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物。所述方法包括，在原先已知含有內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)胚胎干細胞，此時該內(nèi)皮細胞便具有在培養(yǎng)過程中支持胚胎干細胞分化成內(nèi)皮細胞的能力。
簡言之，本發(fā)明還涉及衍生自胚胎干細胞的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物，它具有一般內(nèi)皮細胞所特有的形態(tài)學(xué)和細胞表面標記物，并且能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)組織的血管形成。
本發(fā)明的一個特色是，由于其步驟比較簡單，因而其實施相當(dāng)有效。其結(jié)果是，所形成的培養(yǎng)物中的內(nèi)皮細胞群相當(dāng)均一。
通過如下的說明再配合附圖
內(nèi)容，就更突現(xiàn)了本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和特色。
附圖簡述未提供。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及引導(dǎo)靈長類胚胎干細胞分化成內(nèi)皮細胞的方法，并涉及制造具有相當(dāng)純度的內(nèi)皮細胞群體的方法。該方法的基礎(chǔ)是將靈長類胚胎干細胞與一種指定的蛋白質(zhì)生長因子或者可誘導(dǎo)受處理細胞在形態(tài)學(xué)方面轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)皮細胞的其他因子一起培養(yǎng)。與指導(dǎo)胚胎干細胞分化成其他細胞系列的其他各種技術(shù)不同的是，采用本文所述的這種方法從胚胎干細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物，其外觀相當(dāng)均一，主要都是由具有血管形成能力的內(nèi)皮細胞所構(gòu)成。
本培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)是，在含有血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、基礎(chǔ)成纖維細胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)和表皮生長因子(EGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化的靈長類胚胎干(ES)細胞。這類因子都可從市售的稱為內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2，Clonetics/Bio Whittaker)的培養(yǎng)基中檢出。這種培養(yǎng)基是原先已知的，可在培養(yǎng)物內(nèi)維持內(nèi)皮細胞生長。但是原先并不知道，這種培養(yǎng)基竟可用于支持ES細胞分化成內(nèi)皮細胞?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，這類生長因子的組合已經(jīng)足以支持ES細胞分化成內(nèi)皮細胞。在培養(yǎng)基內(nèi)可能并不需要全部4種因子，至于可以免去哪一種因子，能夠容易地根據(jù)經(jīng)驗實驗方法來確定，而不至于偏離本發(fā)明的意圖。
本方法與可產(chǎn)生包括內(nèi)皮細胞在內(nèi)的異類混合物的現(xiàn)有技術(shù)的不同之處在于，從ES細胞轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞的細胞培養(yǎng)物相當(dāng)均一。曾嘗試過其他各種方法，但都未能成功實現(xiàn)這種轉(zhuǎn)化過程。例如采用佛波酯，與基質(zhì)細胞加血清一起培養(yǎng)，并從胚狀體分離內(nèi)皮細胞。這些努力都未能夠可復(fù)現(xiàn)地產(chǎn)生以內(nèi)皮細胞為主的培養(yǎng)物。相反，在此介紹的這種方法卻是簡單而有效的，其所獲得的細胞培養(yǎng)物中含有，在形態(tài)學(xué)方面具有類似內(nèi)皮細胞特征的細胞。
本發(fā)明所制備的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物具有若干特征。這種細胞的形態(tài)學(xué)特征，類似長形至星形的內(nèi)皮細胞。相反，在另一類培養(yǎng)基上生長的ES細胞，則可形成含有各種細胞類型的異類細胞群，而沒有鮮明的內(nèi)皮細胞樣細胞。在基質(zhì)膠(TM)培養(yǎng)基中，內(nèi)皮細胞可迅速形成管狀結(jié)構(gòu)。這種內(nèi)皮細胞在有von Willebrand因子(vWF)存在時呈陽性反應(yīng)。并且具有高水平的荊豆(Ulex europaeus)凝集素1(UEA-1)的結(jié)合，并有整聯(lián)蛋白αvβ3以及表面抗原CD146的表達。這類細胞的另一個特征是，還可吸收乙?；兔芏戎鞍?LDL)。這類細胞不能表達在一般內(nèi)皮細胞表面并不經(jīng)常存在的兩種普通抗原CD31和VE-鈣粘著蛋白。這類內(nèi)皮細胞當(dāng)與腫瘤細胞一起轉(zhuǎn)移入SCID(重度聯(lián)合免疫缺缺損)小鼠體內(nèi)時，具有使所形成的腫瘤體有效地出現(xiàn)血管形成的能力。從而證實，這種細胞在體內(nèi)具有恢復(fù)和參與血管形成的雙重能力。這類細胞參與血管形成的能力特別突出，因為這種特征提供了這樣一種可能性，即，有可能將遺傳性質(zhì)改變了的內(nèi)皮細胞移植入要求血管形成的組織內(nèi)，使該變異的細胞在體內(nèi)的血管基質(zhì)中生存，從而表達插接入該細胞內(nèi)的基因。
與能夠從胚胎干細胞誘導(dǎo)形成的其他各種細胞類型不同的是，在此論述和鑒定的這種內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物，在其中產(chǎn)生的細胞系中的細胞相當(dāng)均一，即都是內(nèi)皮細胞。這種由ES細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物都是由具有均一形態(tài)的細胞所形成的，并且都表現(xiàn)出內(nèi)皮細胞的特征。然而，限于現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)技術(shù)，現(xiàn)在還不能肯定地認為，由ES細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物完全不含有其他各種細胞類型。只能認為由ES細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物主要是由內(nèi)皮細胞組成，并且是可用作對宿主實行體內(nèi)移植的內(nèi)皮細胞，以促進并參與組織的血管形成的一種實用的來源。利用對于內(nèi)皮細胞的特征施用的一種普通測試方法，即與凝集素荊豆凝集素1(UEA-1)相結(jié)合的能力，已發(fā)現(xiàn)在所產(chǎn)生的培養(yǎng)物中，與這種凝集素荊豆凝集素1相結(jié)合的，具有再現(xiàn)性的細胞在90％以上。在本方法的若干變化中，能夠與荊豆凝集素1結(jié)合的細胞百分率可能有所不同。但是，在此論述的本方法所制備的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物中，所培養(yǎng)的細胞至少有75％，更好是在90％以上，與凝集素荊豆凝集素1的結(jié)合能力呈陽性。
以下實施例都是選用獼猴進行的，用人ES細胞也能獲得同樣的過程和結(jié)果。利用衍生自ES細胞的人內(nèi)皮細胞，就為對人類患者開發(fā)組織移植提供了可能性。內(nèi)皮細胞的移植，對于需要血管形成的缺血組織是最為理想的。此外，對于需要改善血管形成的肌體部位，引入內(nèi)皮細胞可能都是有用的。由于ES細胞的前體細胞能夠以任何數(shù)量生長，這樣就有可能產(chǎn)生大量內(nèi)皮細胞以供臨床實驗或治療之用。
實施例方法細胞培養(yǎng)將未分化的獼猴ES細胞(R366.4細胞系)按前述方法(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844-7848(1996))進行培養(yǎng)。簡言之，將R366.4細胞系與經(jīng)過照射的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)在含有DMEM、20％FBS(Hyclone，Ogden UT)、2mML-谷氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO)、0.1mM 2-巰基乙醇(Sigma)和1％MEM非必需氨基酸(Invitrogen)的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。未分化的細胞每日更換新鮮的培養(yǎng)基，并大約每5-7天傳代于新的MEF上。為促使內(nèi)皮細胞的分化，在接種24小時后除去ES細胞的培養(yǎng)基，更換含有EGM2、5％FBS、VEGF、bFGF、IGF-1、EGF和抗壞血酸的培養(yǎng)基(EGM2)(EGM2-MV Bullet Kit，Clonetics/Bio Whittaker，WalkersvilleMD)。ES細胞在EGM2培養(yǎng)基中分化29天，每3-5天更換一次培養(yǎng)基。分化的獼猴ES細胞用0.05％胰蛋白酶/0.53mM乙二胺四乙酸(EDTA)(GIBCO/BRL)分離5分鐘，離心，再重新放在裝有EGM2的10厘米組織培養(yǎng)皿中，其中不含經(jīng)過照射的MEF細胞。24小時后除去未附著的細胞，在附著的細胞中加入新鮮培養(yǎng)基。獼猴ES細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮細胞(RESDECs)可生長至融合，并在EGM2培養(yǎng)基中連續(xù)傳代和擴增。
人臍帶靜脈細胞(HUVECs)(Clonetics/Bio Whittaker)也可采用各種已知的方法在EGM2中生長和傳代。
在基質(zhì)膠(Matrigel)上形成管在24孔組織培養(yǎng)平板的每一個孔中加入0.2毫升基質(zhì)膠(Becton Dickinson)，置于37℃下至少30分鐘，使其凝固。形成凝膠后，在基質(zhì)膠頂端放入0.2毫升含有5×104-1×105RESDECs的細胞懸浮液，培養(yǎng)物在37℃/5％CO2下培養(yǎng)并在24、48和72小時觀察細胞重排成管形的毛細結(jié)構(gòu)。各項實驗都需重復(fù)進行3次，對于具有代表性的孔進行顯微攝影記錄。
VEGF和bFGF ELISARESDECs在不含VEGF或bFGF的EGM2內(nèi)培養(yǎng)3天。在EGM2內(nèi)補加10％剔除型血清置換物(GIBCO)以代替胎牛血清(FBS)，或補加10％FBS的DMEM。72小時后收集條件培養(yǎng)基(CM)并離心除去死細胞。用單一的EGM2作為陰性對照。通過比色計ELISA測定分析CM內(nèi)的VEGF或bFGF(R & D系統(tǒng)，Minneapolis，MN)。
流式細胞術(shù)用不含Ca2+和Mg2+的FBS洗滌RESDECs，并用0.05％胰蛋白酶/0.53mM乙二胺四乙酸處理5分鐘，將其從單層細胞層中分離出來。將分離的細胞離心，再用補加2％FBS和0.1％疊氮化鈉的含有PBS的FACS培養(yǎng)基洗滌處理。經(jīng)用80微米nitex過濾之后，分成若干等份稱量，再用以FACs培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度的同型對照物或抗原特異性抗體進行染色處理。采用抗原特異性原代抗體，繼以熒光標記的次級抗體(間接染色法)或熒光結(jié)合的抗原特異性抗體(直接染色)分析細胞表面的抗原表達情況。同型對照物分別采用相應(yīng)的未結(jié)合的小鼠和羊IgGs(都是Sigma)，以及FITC-結(jié)合的小鼠IgG(Pharmingen，San Diego，CA)。采用FITC標記的抗-羊IgG抗體(Sigma)來檢測未標記的抗原特異性抗flk-1抗體(Reasearch Diagnostics)。采用FITC標記的羊抗鼠IgG抗體(Caltag)來檢測未標記的抗VEGF受體1(Flt-1)和抗VEGF受體2(Flk-1)的抗體(兩者都是Sigma)。采用大鼠抗小鼠IgG-FITC結(jié)合的次級抗體(Caltag)來檢測未經(jīng)標記的P1H12抗體(小鼠IgG1，由明尼蘇達大學(xué)的Robert Hebbel博士提供)。對于該細胞還可采用生物素化的VEGF試劑盒(R & D系統(tǒng))檢測VEGF受體的表達情況，以及其與荊豆凝集素1(UEA-1)相結(jié)合的能力(Vector labs)。采用的直接抗體有HLA-A、B、C-FITC(Pharmingen)和αVβ3/clLM609-FITC(Chemicon)。采用人體臍帶靜脈細胞(HUVEC)(Clionetics)作為陽性對照。進行分析的細胞不必固定在FACScan或FACs Calibur(Becton Dickinson)，使用碘化丙錠來排除死亡的細胞。用CellQuest軟件(Becton Dickinson)進行數(shù)據(jù)分析。
免疫染色在無血清EGM2中用稀釋的diIAcLDL(Molecular Probes)分析乙?；疞DL受體。細胞用含有diIAcLDL的EGM2洗滌2次并培養(yǎng)過夜。在細胞洗滌之后，用熒光顯微鏡(UV，若丹明濾片)進行觀察。采用HUVECs作為陽性對照。
用羊抗兔IgG-FITC次級抗體(Sigma)檢測von Willebrand因子蛋白(vWF)(DAKO)的表達情況。細胞用von Willebrand因子蛋白固定，并在室溫下培養(yǎng)1小時，洗滌，再在次級抗體中培養(yǎng)30分鐘。洗滌后用熒光顯微鏡觀察細胞(UV，F(xiàn)ITC濾片)。仍然選用HUVECs作為陽性對照。
基質(zhì)膠栓(Plug)在一項實驗中，對于SCID小鼠(Balb/Scid，Harlan Sprague Dawley)經(jīng)皮下注射含有5×105-1×106RESDECs的0.5毫升基質(zhì)膠(Becton Dickinson)。在第2項實驗中在固化的基質(zhì)膠中植入一塊含有RESDECs的紗布。分別經(jīng)14、21、35和42小時后取出該基質(zhì)膠栓。在取出和固地該批栓之前數(shù)分鐘，，經(jīng)靜脈內(nèi)注射高分子量的FITC-葡聚糖，以觀察血管生成狀態(tài)。同時還制備標準的蘇木紫-伊紅(H/E)染色的載玻片。
體內(nèi)研究采用胰蛋白酶處理收集附著的RESDECs，與小鼠乳腺癌C755細胞系相混合。在2次分別進行的實驗中，各對一組Balb/c-SCID小鼠經(jīng)皮下注入，或者是1×106C755腫瘤細胞系，或者是1×106RESDECs，或者是1×106的腫瘤細胞和1×106RESDECs的混合物。自開始生長之日起，每隔3-5天用卡鉗對腫瘤進行測量。大約在移植之后3周處死全部小鼠，以對于生長的腫瘤進行組織化學(xué)分析。在僅施用RESDECs的小鼠中腫瘤無法生長。
腫瘤的免疫組織化學(xué)染色在第一項實驗中，將腫瘤在10％的福爾馬林中分離并固定以備制作石蠟切片。為制備冷凍切片須將腫瘤固定在2％多聚甲醛中。全部切片都固定在FisherSuperfrost載玻片上。采用標準ABC技術(shù)(VetaStain Elite ABC kit，Vector labs)處理各切片使其表達HLA-I級A、B、C(W6/32抗體，IgG2a)和CD31(IgG1)(Novacatra，Vector)。以小鼠的IgG1(Sigma)和IgG2a(Southern Biotechnology)作為同型對照。采用DAB底物(Vector)來觀察過氧化物酶的活性，各份切片都采用蘇木紫進行復(fù)染處理。
結(jié)果從獼猴的ES細胞衍生內(nèi)皮細胞獼猴的ES細胞置于如材料和方法一節(jié)所述的含有VEGF、bFGF、EGF和IGF的EGM2培養(yǎng)基中生長。大約5-10天后，這些ES細胞可變成類似長形或星形的內(nèi)皮細胞的均一形態(tài)。相反，在單純補加FBS的培養(yǎng)基中生長的ES細胞則可分化成為無明顯內(nèi)皮細胞外觀的其他異類細胞群。該類可能的內(nèi)皮細胞可連續(xù)傳代轉(zhuǎn)種，大約可擴增至20個細胞群。在內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長可維持其均一的外觀。對于這類內(nèi)皮細胞特征的初步測試，可將細胞放置在以基質(zhì)膠為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中，這類細胞可迅速形成管形毛細結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)與HUVECs或其他內(nèi)皮細胞群在以基質(zhì)膠為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中所形成的管形結(jié)構(gòu)相類似。據(jù)細胞遺傳學(xué)研究表明，所有這類細胞都具有正常獼猴的40 XY染色體組型。此項細胞遺傳學(xué)研究結(jié)果十分重要，證實了這種細胞并不是經(jīng)過長期培養(yǎng)之后變異而成的，也決不可能是潛在污染的供未分化的ES細胞生長用的小鼠胚胎成纖維細胞所產(chǎn)生。
獼猴ES細胞產(chǎn)生的細胞的電子圖象展示了典型的內(nèi)皮細胞特征。其中包括，多處密集的圓形或短桿形Weibel-Palade小體、細胞之間緊密連接、有若干細胞內(nèi)/細胞外空泡。
免疫表型測定然后，據(jù)對于這類獼猴產(chǎn)生的內(nèi)皮樣細胞進行免疫組織化學(xué)染色處理表明，這類細胞中存在著von Willebrand因子(vWF)、這類細胞具有快速吸收乙?；疞DL的能力、并具備與凝集素荊豆凝集素-1(UEA-1)相結(jié)合的能力。據(jù)流式細胞計數(shù)研究證實了，其中有高水平的荊豆凝集素-1的結(jié)合，以及可由P1H12抗體識別的整聯(lián)蛋白αvβ3和表面抗原CD146的表達。根據(jù)這類結(jié)果，我們就將其稱之為獼猴胚胎干細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮細胞(RESDECs)。令人不解的是，抗VEGF受體flk-1和flt-1并不會與這類RESDECs相結(jié)合，即使與HUVECs的結(jié)合，也相當(dāng)微弱。然而，據(jù)采用生物素化的VEGF以及鏈式抗生物素蛋白-FITC進行的試驗表明了其與RESDEC(和HUVEC)相結(jié)合的情況。用一種抗VEGF的抗體進行的阻斷處理，表明這種結(jié)合具有特異性。上述這類結(jié)果提示，一方面，抗人的flk-1和flt-1的抗體并不會與獼猴產(chǎn)生的細胞發(fā)生交叉反應(yīng)；另一方面，這類細胞卻可表達一種不同的VEGF受體。據(jù)RT-PCR研究表明，在RESDEC中有flk-1 mRNA的表達，這提示了各種抗體可能并無交叉反應(yīng)。當(dāng)然，這很可能是，從這種mRNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，并未能完全在稀薄表面表達出來。
RESDECs與HUVECs的不同之處在于，其中缺乏CD31和VE-鈣粘著蛋白的表達。這是可在內(nèi)皮細胞表面發(fā)現(xiàn)的2種普通的表面抗原，但是并不均一。RT-PCR研究驗證了，并不存在可表達該2種基因的mRNA。然而，有些對于小鼠ES細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮細胞進行的研究也表明，在某些內(nèi)皮細胞群內(nèi)，也缺乏CD31和VE-鈣粘著蛋白。盡管CD31和VE-鈣粘著蛋白可以作為內(nèi)皮細胞的陽性標記物，但是缺乏這種表達，也并不足以排除其為內(nèi)皮細胞。
從RESDEC細胞的血管形成首先利用基質(zhì)膠栓試驗法評定了RESDEC在體內(nèi)的功能。先將RESDEC包入懸掛在固化的基質(zhì)膠層中的紗布內(nèi)。然后，將該批基質(zhì)膠栓分別經(jīng)皮下植入一組重度聯(lián)合免疫缺缺損(SCID)小鼠。大約經(jīng)過28天后，再對小鼠經(jīng)靜脈內(nèi)注射FITC-葡聚糖溶液，并去出栓進行成象處理。從而證實了，在含有RESDEC的紗布周圍形成強力的血管定位分布，這就是內(nèi)皮細胞所特有的一種趨化性現(xiàn)象。從這種血管形成作用的表現(xiàn)來看，其中很可能就是小鼠對于RESDECs所產(chǎn)生的各種因子發(fā)生反應(yīng)的血管形成的一個方面。確實，其后對于RESDECs的上清液進行的ELISA分析表明，這類細胞中果然有大量的VEGF的產(chǎn)生。不過，由內(nèi)皮細胞經(jīng)?？僧a(chǎn)生的另一種血管生成蛋白質(zhì)bFGF，在RESDECs上清液中，卻未能測出。
為證實由RESDECs所產(chǎn)生的新血管，分別將均勻懸浮的0.5-1.0×106細胞的基質(zhì)膠栓經(jīng)皮下植入SCID小鼠。再對小鼠注射FITC-葡聚糖，然后取出栓進行成象處理。此時，可見到有較大的血管結(jié)構(gòu)，其后對于栓進行的組織學(xué)檢驗表明，這種RESDECs能夠促使血管形成。
然后，選用另外一批SCID小鼠來驗證RESDECs對于在體內(nèi)積極參與腫瘤內(nèi)血管形成方面的作用。其方法是，將小鼠乳腺癌細胞系C755細胞，單獨或與等量的RESDECs一起，經(jīng)皮下注射。按定期間隔測量腫瘤的生長情況，其中與RESDECs一起注射時，腫瘤的生長顯著加快。值得注意的是，用量為106的RESDECs單獨注射時并未能引起任何可測量的腫瘤的生長。證明這種細胞并沒有直接的腫瘤發(fā)生作用。這類腫瘤受到帶有抗人特異性抗體(可與獼猴細胞發(fā)生交叉反應(yīng)，而小鼠細胞則不然)的腫瘤高度的血管和免疫組織化學(xué)染色，顯然表明是RESDECs內(nèi)的內(nèi)皮細胞層所起的作用。在有RESDECs一起注射的腫瘤內(nèi)，采用抗MHC-I級抗體或抗vonWillebrand因子(vWF)抗體染色時，大量內(nèi)皮細胞都呈陽性反應(yīng)，在單獨由C755細胞系產(chǎn)生的腫瘤中的內(nèi)皮細胞，對于這類抗原則都呈陰性反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種引導(dǎo)靈長類胚胎干細胞分化成內(nèi)皮細胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)在含有血管內(nèi)皮細胞生長因子、基礎(chǔ)成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子和表皮生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎干細胞的培養(yǎng)物；以及(b)傳代培養(yǎng)具有內(nèi)皮細胞形態(tài)的細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靈長類細胞是獼猴細胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靈長類細胞是人類細胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用于將胚胎干細胞培養(yǎng)成內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)基中還含有哺乳動物的血清。
5.一種衍生自靈長類胚胎干細胞的細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)物主要含有具有下列特征的內(nèi)皮細胞具有長形至星形的均一的形態(tài)、對于vonWillebrand因子的存在呈陽性、吸收乙酰化LDL的能力呈陽性、以及在植入哺乳動物體內(nèi)時，具有促進和參與血管形成的能力。
6.一種衍生自靈長類胚胎干細胞的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)物中90％以上的細胞結(jié)合荊豆凝集素1(UEA-1)這種凝集素的能力呈陽性。
全文摘要
描述了誘導(dǎo)靈長類胚胎干細胞使其分化成相對均一的內(nèi)皮細胞群的方法。這種ES衍生的內(nèi)皮細胞具有內(nèi)皮細胞一樣的形態(tài)學(xué)以及細胞表面標記特征。在移植如體內(nèi)組織時，這種ES衍生的內(nèi)皮細胞也能夠誘導(dǎo)和參與血管形成(或稱血管形成)。
文檔編號A61K35/12GK1582331SQ02821970
公開日2005年2月16日 申請日期2002年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月2日
發(fā)明者D·S·科夫曼, R·劉易斯, R·奧爾巴齊 申請人:威斯康星校友研究基金會