專(zhuān)利名稱：有效治療腫瘤和其它需要除去或破壞細(xì)胞的疾病的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用基于包含對(duì)應(yīng)于、相似或同源于神經(jīng)絲狀蛋白部分氨基酸序列的氨基酸序列的肽的化合物治療疾病的方法，這種疾病需要除去或破壞細(xì)胞因子，如良性或惡性腫瘤。方法包括但不限于肌肉內(nèi)、經(jīng)口、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、腫瘤內(nèi)、鼻內(nèi)、局部、透皮等施用化合物，或單獨(dú)或結(jié)合一種載體。
背景技術(shù)：
許多醫(yī)學(xué)治療和過(guò)程包括除去或破壞有害或不需要的組織。這種重要治療的例子包括手術(shù)除去癌性的生長(zhǎng)物、通過(guò)化療破壞轉(zhuǎn)移性腫瘤和減少腺(如前列腺)增生。其它例子包括除去不需要的面部毛發(fā)、疣皮下組織、淋巴組織或脂肪組織。
需要有效試劑能破壞從而便于除去或抑制有害或不需要細(xì)胞和組織的進(jìn)一步生長(zhǎng)，但有主要的局部效應(yīng)和最小或沒(méi)有全身毒性。神經(jīng)絲狀蛋白和它們相關(guān)分子是描述于2002年3月8日提交的題為“用神經(jīng)絲狀蛋白治療腫瘤和相關(guān)疾病的方法”的待審批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/092,934的一類(lèi)試劑，公布內(nèi)容全部納入本文供參考。含有與神經(jīng)絲狀蛋白的氨基酸序列部分對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的肽，AD7c-NTP也是這類(lèi)試劑。這些肽描述在2002年5月24日提交的題為“有效治療腫瘤和其它需要除去或破壞細(xì)胞的疾病的肽”的待審批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/153,334中，公布內(nèi)容全部納入本文供參考。
這里所揭示的是神經(jīng)絲狀蛋白的某些其它片段，這些片段可有效治療腫瘤和其它需要除去或破壞細(xì)胞的疾病。
癌是細(xì)胞內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制中的異常，導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。正常細(xì)胞構(gòu)成組織，當(dāng)這些細(xì)胞失去作為特定、受控制和協(xié)同單位的能力時(shí)，(去分化)缺陷導(dǎo)致細(xì)胞群中的混亂。當(dāng)它發(fā)生時(shí)，形成腫瘤。
組織的良性過(guò)度生長(zhǎng)是異常情況，其中需要從生物體除去細(xì)胞。良性腫瘤是不在全身轉(zhuǎn)移但確實(shí)引起疾病癥狀的細(xì)胞增殖。如果這種腫瘤位于器官如腦中難以到達(dá)的區(qū)域，它們可以是致命的。良性腫瘤存在于許多器官中，包括肺、腦皮膚、垂體、甲狀腺、腎上腺皮質(zhì)和腎上腺髓質(zhì)、卵巢、子宮、睪丸、結(jié)締組織、肌肉、腸、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、肝臟、膽囊、胰、前列腺、心和其它器官。
在癌癥治療中手術(shù)通常是第一步。手術(shù)的目的不同。有時(shí)它用于除去盡可能多的明顯腫瘤，或至少使它“除塊”(除去主要的腫瘤塊從而不太需要其它方法治療)。取決于癌種類(lèi)和位置，手術(shù)也可為病人提供一些癥狀緩解。例如，如果手術(shù)可除去大部分?jǐn)U散的腦腫瘤，顱內(nèi)的壓力會(huì)減少，使病人的癥狀改善。
不是所有的腫瘤都可以進(jìn)行手術(shù)。一些位于使它們不能完全除去的身體部分。這些例子可以是腦干中的腫瘤(控制呼吸的腦部分)或生長(zhǎng)在主要血管中和周?chē)哪[瘤。在這些情況中，由于與腫瘤去除相聯(lián)的高風(fēng)險(xiǎn)，手術(shù)的作用受限制。
在一些情況中，由于不必要，手術(shù)不用于除腫瘤塊。一個(gè)例子是何杰金淋巴瘤，這是一種很好響應(yīng)化療和放射治療結(jié)合的淋巴結(jié)癌。在何杰金淋巴瘤中，很少需要手術(shù)來(lái)獲得治愈，但手術(shù)幾乎主要用于確定診斷。
化療是癌治療的普遍形式。它包括使用遍及全身特異攻擊迅速分裂的細(xì)胞(如那些發(fā)現(xiàn)于腫瘤中的細(xì)胞)的藥物(通常通過(guò)口或注射給予)。這使化療有助于治療已轉(zhuǎn)移的癌以及有很高機(jī)會(huì)擴(kuò)散到血液和淋巴系統(tǒng)但未明顯超過(guò)原發(fā)性腫瘤的腫瘤?；熞部捎糜谔岣呔植磕[瘤對(duì)手術(shù)和放射的反應(yīng)。例如對(duì)于一些頭部和頸部的癌。
不幸的是，人體中正常迅速分裂的其它細(xì)胞(如胃和毛發(fā)的襯層(lining))也受到化療影響。由于這個(gè)原因，許多化療劑導(dǎo)致不良副作用的惡心、嘔吐、貧血、脫發(fā)或其它癥狀。這些副作用是暫時(shí)性的，醫(yī)生可提供藥物幫助減輕許多這些副作用。隨著我們的知識(shí)持續(xù)增長(zhǎng)，研究者設(shè)計(jì)了更新的化療劑，不僅更好地殺死癌細(xì)胞且對(duì)病人副作用更少。
化療以多種方式施用給病人。一些是藥丸，一些是靜脈內(nèi)或其它注射施用。就可注射的化療而言，病人到醫(yī)生辦公室或醫(yī)院接受治療。其它化療劑需要一天24小時(shí)連續(xù)灌輸?shù)窖髦?。?duì)于這些類(lèi)型的化療，進(jìn)行較小的手術(shù)過(guò)程以移植病人受損的小泵。泵然后緩慢施用藥物。在許多情況中，永久口置于病人靜脈以去除反復(fù)針刺的需要。
放射是另一種抗癌的常用武器。放射通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA來(lái)殺死癌。放射以兩種不同方式傳送。最普通的方法包括以高度精確方式使放射線束指向病人，集中于腫瘤。為此，病人躺在桌上且光束在他/她周?chē)苿?dòng)。這僅需要幾分鐘，但每天進(jìn)行連續(xù)數(shù)周(取決于腫瘤類(lèi)型)以獲得具體的總處方劑量。
有時(shí)使用稱為近程治療的另外放射方法，包括采用放射性小丸(“籽殼”)或電線并將它們移植到身體中的腫瘤區(qū)域。移植可以是暫時(shí)或永久性。就永久移植而言，籽殼中的放射在幾天或幾周中“衰變”從而病人不具放射性。就暫時(shí)移植而言，總放射劑量通常在天中傳遞且病人在此時(shí)間中必須留在醫(yī)院。對(duì)于兩種近程治療，放射一般傳遞給高度靶向區(qū)域以獲得對(duì)癌的局部控制(與治療整體相反，如化療劑量)。
一些高度選擇的病人可使用骨髓移植。通常進(jìn)行此過(guò)程是因?yàn)椴∪嘶季唢@著攻擊性的癌或因?yàn)樗麄兓汲Ｒ?guī)療法治療后復(fù)發(fā)的癌。骨髓移植是一種復(fù)雜的過(guò)程。有許多種類(lèi)且它們引起副作用和治愈的潛力不同。大多數(shù)移植在特殊中心進(jìn)行，在許多情況中它們的使用被認(rèn)為是研究性的。
有一些其它治療，盡管大部分仍在臨床試驗(yàn)中探索且尚未成為標(biāo)準(zhǔn)治療。例子包括使用免疫治療、單克隆抗體、抗血管生成因子和基因治療。
免疫治療設(shè)計(jì)了多種技術(shù)以促進(jìn)病人自身免疫系統(tǒng)抗癌，這與放射治療或化療完全不同。通常為達(dá)到目的，研究者用特別獲得的疫苗注射病人。
單克隆抗體這些是設(shè)計(jì)附著于癌性細(xì)胞(且不是正常細(xì)胞)的抗體，附著利用癌性和非癌性細(xì)胞間在抗原或/或其它特征中的差異?？贵w可單獨(dú)施用給病人，或與各種細(xì)胞毒性化合物結(jié)合或以放射性形式，這樣抗體優(yōu)先靶向癌性細(xì)胞，從而傳遞毒性試劑給所需細(xì)胞。
抗血管生成因子隨著癌細(xì)胞迅速分裂和腫瘤生長(zhǎng)，它們可長(zhǎng)得很快不再要血液供應(yīng)。為補(bǔ)償這點(diǎn)，一些腫瘤分泌有助于誘導(dǎo)血管在它們周?chē)L(zhǎng)的物質(zhì)，因此向癌細(xì)胞提供血管來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物。已設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)性治療以阻止腫瘤在血管中生長(zhǎng)。
基因治療癌是一系列突變的產(chǎn)物，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生和其過(guò)量的增生。治療癌可通過(guò)將控制或終止癌增生的基因引入癌細(xì)胞、開(kāi)啟細(xì)胞的程序性細(xì)胞機(jī)制以破壞細(xì)胞、提高細(xì)胞的免疫識(shí)別、或表達(dá)轉(zhuǎn)變成毒性代謝物或抑制腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞因子的前體藥物。
良性腫瘤和畸形也可通過(guò)多種方法治療，包括手術(shù)、放射治療、藥物治療、熱和電消融、冷凍療法和其它。盡管良性腫瘤不轉(zhuǎn)移，它們可長(zhǎng)得大且可復(fù)發(fā)。手術(shù)根除良性腫瘤有一般手術(shù)的所有困難和副作用，通常對(duì)于一些良性腫瘤必須反復(fù)進(jìn)行，如垂體腺瘤、腦膜瘤、前列腺增生和其它。
尚有包括不需要細(xì)胞因子的其它疾患，其中需要選擇性細(xì)胞去除。例如心臟病和中風(fēng)一般由動(dòng)脈粥樣硬化、纖維脂肪和修飾平滑肌成分的增殖損傷引起，增殖損傷使血管壁扭曲、腔縮小、血流收縮、傾向于病灶性血塊并最終導(dǎo)致阻塞和梗塞。治療動(dòng)脈粥樣硬化包括旁路移植；人工移植；用再通、刮除術(shù)、放射、激光或其它去除的血管成形術(shù)；通過(guò)脂質(zhì)減少抑制動(dòng)脈粥樣硬化的藥物療法；抗凝固治療；和飲食、鍛煉及生活方式的總體評(píng)估。需要一種方法用于除去動(dòng)脈粥樣硬化性損傷而無(wú)手術(shù)過(guò)程的風(fēng)險(xiǎn)和副作用。
其它需要選擇性細(xì)胞去除的不需要細(xì)胞因子例子包括病毒誘導(dǎo)的生長(zhǎng)如疣。另一個(gè)例子是炎癥情況中發(fā)現(xiàn)的肥大炎性群和肥大疤痕或瘢痕疙瘩。另外的例子發(fā)現(xiàn)于化妝品中例如除去不需要的毛發(fā)如面部毛發(fā)，或皺縮不需要的組織區(qū)域用于化妝目的如在面部皮膚和結(jié)締組織中或在四肢皮膚和結(jié)締組織中。
其它例子對(duì)于此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員是顯然的。在所有或大部分這些例子中，需要可除去或破壞不需要細(xì)胞因子的治療，無(wú)常規(guī)治療的風(fēng)險(xiǎn)和副作用，或需要更精確除去不需要的細(xì)胞因子。
神經(jīng)絲狀蛋白(NTP)是最近才鑒定的一個(gè)腦蛋白質(zhì)家族。此家族成員之一AD7c-NTP是41kD功能與神經(jīng)芽生有關(guān)的膜結(jié)合磷蛋白(de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999)；de la Monte SM和Wands JR，Journal of Alzheimer’s Disease，3345-353(2001))。編碼AD7c-NTP的基因和AD7c-NTP的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列已鑒定和描述(de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997))。除了41kD種類(lèi)外，其它種類(lèi)的神經(jīng)絲狀蛋白(約26kD、約21kD、約17kD和約15kD)也已鑒定并與神經(jīng)外胚層瘤、星形細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及缺氧、局部缺血或腦梗塞引起的損傷相關(guān)聯(lián)(Xu等，Cancer Research，533823-3829(1993)；de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，138(1-2)26-35(1996)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999))。
對(duì)神經(jīng)絲狀蛋白的種類(lèi)已有描述和權(quán)利要求，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634；5,948,888和5,830,670中所有關(guān)于“阿爾茨海默氏病的神經(jīng)絲狀蛋白基因表達(dá)和檢測(cè)”和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,071,705關(guān)于“檢測(cè)神經(jīng)疾病或功能不良的方法”。這些專(zhuān)利的披露內(nèi)容特別地全部納入本文供參考。如其中所述，NTP在細(xì)胞死亡期間上調(diào)和產(chǎn)生。因此，死亡和垂死的神經(jīng)細(xì)胞描述為過(guò)度產(chǎn)生NTP，因而它的存在表明神經(jīng)細(xì)胞死亡和阿爾茨海默氏病(AD)發(fā)作。
已將其它種類(lèi)的神經(jīng)絲狀蛋白鑒定為AD7c-NTP基因的其它產(chǎn)物(如描述于NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#XP_032307 PID g15928971的一種112個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì))或類(lèi)似于神經(jīng)絲狀蛋白(如描述于NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAH14951 PID g15928971的一種106個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，描述于NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#XP_039102 PID g18599339的另一種106個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)和描述于NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAH02534 PID g12803421的一種61個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì))。
與AD和NTP相連的神經(jīng)絲狀蛋白在AD的細(xì)胞死亡中上調(diào)。與對(duì)照相比AD7c-NTP mRNA在AD大腦中上調(diào)；AD中大腦和CSF中的AD7c-NTP蛋白水平高于對(duì)照；AD7c-NTP的免疫反應(yīng)性發(fā)現(xiàn)于AD和唐氏綜合癥大腦中的老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)、變性神經(jīng)元、神經(jīng)氈絲(neuropil thread)和營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)芽生中(Ozturk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86419-423(1989)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，86(3)1004-13(1990)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，113(2)152-64(1992)；de la Monte等，Ann.Neurol.，32(6)733-42(1992)；de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，138(1-2)26-35(1996)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999))。NTP定位于細(xì)胞內(nèi)、神經(jīng)氈內(nèi)的精細(xì)加工中，或AD和唐氏綜合癥大腦中的細(xì)胞外。de la Monte等，Ann.Neurol.，32(6)733-42(1992)。
在AD病人的CSF和尿中都發(fā)現(xiàn)AD7c-NTP蛋白水平升高(de la Monte和Wands，F(xiàn)ront Biosci 7989-96(2002)；de la Monte和Wands，Journal of Alzheimer’sDisease，3345-353(2001)；Munzar等，Alzheimer’s Reports 461-65(2001)；Kahle等，Neurology 541498-1504(2000)；Munzar等，Alzheimer’s Reports 3155-159(2000)；de la Monte等，Alzheimer’s Reports 2327-332(1999)；和de la Monte等，J Clin Invest 1003093-3104(1997)。
過(guò)度表達(dá)NTP也與阿爾茨海默氏病中的細(xì)胞死亡過(guò)程相聯(lián)系(de la Monte和Wands，J.Neuropathol Exp.Neurol.，60195-207(2001)；de la Monte和Wands，CellMol Life Sci 58844-49(2001)。也在唐氏綜合癥大腦組織中鑒定了AD7c-NTP(Wands等，國(guó)際專(zhuān)利出版號(hào)WO 90/06993；de la Monte等，J Neurol Sci 135118-25(1996)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999))。有一些證據(jù)表明過(guò)度表達(dá)NTP也可能與正常張力青光眼相關(guān)聯(lián)(Golubnitschaja-Labudova等，Curr Eye Res21867-76(2000))。
證明NTP是在體外神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤培養(yǎng)物以及體內(nèi)正常嚙齒動(dòng)物肌肉組織、皮下結(jié)締組織和真皮以及多種不同人和非人來(lái)源的腫瘤(包括乳腺癌、皮膚癌和乳頭狀瘤、結(jié)腸癌、腦膠質(zhì)瘤和嚙齒動(dòng)物模型中的其它腫瘤)中造成細(xì)胞死亡的一種有效試劑。參見(jiàn)2002年3月8日提交的待審批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/092,934；題為“用神經(jīng)絲狀蛋白治療腫瘤和相關(guān)疾病的方法”。
AD7c-NTP的某些肽序列(“AD7c-NTP肽”)也被證明是在體外膠質(zhì)瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中和/或在體內(nèi)正常的嚙齒動(dòng)物肌肉組織、皮下結(jié)締組織、真皮和其它組織中造成細(xì)胞死亡的有效試劑。參見(jiàn)2002年3月24日提交的題為“有效治療腫瘤和其它需要除去或破壞細(xì)胞的疾病的肽”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/153,334。
此描述中包括上述相關(guān)領(lǐng)域的描述、任何和所有本文所述公開(kāi)的文獻(xiàn)，包含任何和所有全部納入本文供參考的美國(guó)專(zhuān)利。上述相關(guān)領(lǐng)域的描述在任何方面不承認(rèn)包括待審批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的任何本文所述文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
此領(lǐng)域仍需要新的、毒性較弱的治療不需要的細(xì)胞因子的方法。本發(fā)明可滿足這些需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療不需要細(xì)胞增殖的肽組合物和方法，如良性或惡性腫瘤、腺(如前列腺)增生、不需要的面部毛發(fā)、疣和不需要的脂肪組織。這種方法包括施用治療有效量的NTP肽給需要的哺乳動(dòng)物，已知這種肽是造成細(xì)胞死亡的有效試劑。NTP肽的定義如下。
本發(fā)明的肽具有至少一段與神經(jīng)絲狀蛋白的氨基酸序列部分對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明的組合物包括這種肽和藥學(xué)上可接受的載體，或與載體等結(jié)合的肽，或被包囊在聚合的基體等中的肽。
本發(fā)明一部分包括發(fā)現(xiàn)AD7c-NTP中所含的肽序列，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)它是破壞或除去有害細(xì)胞或不需要的細(xì)胞的有效試劑，及其變體或同系物，它還在包括人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物在內(nèi)的其它生物的其它蛋白質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)。一旦發(fā)現(xiàn)了肽序列，此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員就可通過(guò)使用廣泛存在的公眾或商業(yè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)如國(guó)家生物技術(shù)信息蛋白質(zhì)中心數(shù)據(jù)庫(kù)(National Center Biotechnology Information′s Proteindatabase)和檢索程序如BLAST(局部序列比對(duì)基本檢索工具)找到這些蛋白質(zhì)。參見(jiàn)Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schffer，Jinghui Zhang，ZhengZhang，Webb Miller和David J.Lipman(1997)，“缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序(Gapped BLAST and PSI-BLASa new generation of proteindatabase search programs)”，Nucleic Acids Res.253389-3402。
此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員然后可以用這里描述的測(cè)定方法來(lái)篩選這些蛋白質(zhì)，以確定它們作為破壞或除去不需要或有害細(xì)胞的試劑的效力。發(fā)現(xiàn)一種或多種這類(lèi)有效試劑后，此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員然后可以確定那些試劑中包含與這里所述或2002年5月24日提交的題為“有效治療腫瘤和其它需要除去或破壞細(xì)胞的疾病的肽”的待審批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/153,334所述的AD7c-NTP肽序列同源或類(lèi)似的序列，所述試劑是用精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法合成的，并測(cè)試合成的試劑作為破壞或除去不需要或有害細(xì)胞的試劑的效力。此外，此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員還可使用被發(fā)現(xiàn)的任何此類(lèi)蛋白質(zhì)的氨基酸序列來(lái)確定與這里所述以及2002年5月24日提交的題為“有效治療腫瘤和其它需要除去或破壞細(xì)胞的疾病的肽”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/153,334所述的AD7c-NTP肽序列不類(lèi)似或不同源和周源或類(lèi)似的其它肽序列。然后可測(cè)試這些新合成的序列作為破壞或除去不需要或有害細(xì)胞的試劑的效力。
本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)(“細(xì)胞死亡肽”)可單獨(dú)或者結(jié)合載體或抗體施用。施用細(xì)胞死亡肽可肌肉內(nèi)、經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、腫瘤內(nèi)、病灶內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、局部、透皮、通過(guò)氣霧劑、灌輸、推注、移植裝置、緩釋系統(tǒng)等，或單獨(dú)或結(jié)合載體。另外，細(xì)胞死亡肽可由于遺傳改變或其它來(lái)體內(nèi)表達(dá)，這是通過(guò)施用表達(dá)肽的基因、通過(guò)施用誘導(dǎo)這類(lèi)生成的疫苗或通過(guò)引入體內(nèi)表達(dá)肽的細(xì)胞、細(xì)菌或病毒。
此外，細(xì)胞死亡肽可結(jié)合其它療法使用來(lái)治療良性或惡性腫瘤和其它不需要或有害的細(xì)胞生長(zhǎng)。上述一般描述和下列詳細(xì)描述是示范性和說(shuō)明性的，提供進(jìn)一步權(quán)利要求的發(fā)明的說(shuō)明。從下列發(fā)明的詳細(xì)描述中，其它目標(biāo)、優(yōu)點(diǎn)和新特征對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示AD7c-NTP基因的完整氨基酸序列和核酸序列以及該基因的AD7c-NTP蛋白產(chǎn)物(來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,888的序列120和121；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAC08737；PID g3002527)[SEQ ID NO.1]。
圖2顯示122個(gè)氨基酸的神經(jīng)絲狀蛋白的完整氨基酸序列(來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列40；NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAE25447 PID g10048540)[SEQ ID NO.2]。
圖3顯示122個(gè)氨基酸的神經(jīng)絲狀蛋白的完整氨基酸序列(NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#XP_032307 PID g15928971)[SEQ ID NO.3]。
圖4顯示106個(gè)氨基酸的神經(jīng)絲狀蛋白樣蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列(NCBIEntrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAH14951 PID g15928971)[SEQ ID NO.4]。
圖5顯示106個(gè)氨基酸的神經(jīng)絲狀蛋白樣蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列(NCBIEntrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#XP_039102 PID g18599339)[SEQ ID NO.5]。
圖6顯示98個(gè)氨基酸的神經(jīng)絲狀蛋白的完整氨基酸序列(來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列30；NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAE25445，PID g10048538)[SEQ ID NO.6]。
圖7顯示75個(gè)氨基酸的神經(jīng)絲狀蛋白的完整氨基酸序列(來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列48；NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAE25448，PID g10048541)[SEQ ID NO.7]。
圖8顯示68個(gè)氨基酸的神經(jīng)絲狀蛋白的完整氨基酸序列(來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列36；NCBI Entrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAE25446，PID g10048539)[SEQ ID NO.8]。
圖9顯示61個(gè)氨基酸的神經(jīng)絲狀蛋白樣蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列(NCBIEntrez-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)#AAH02534，PID g12803421)[SEQ ID NO.9]。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明除非另有說(shuō)明，這里使用的術(shù)語(yǔ)和詞組按如下定義。
術(shù)語(yǔ)“AD7c-NTP”是指約41kD蛋白質(zhì)和基因以及編碼它的核酸序列，描述在de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-104(1997)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634；5,948,888和5,830,670的序列120和121以及GenBank#AF010144中，其核酸和氨基酸序列示于圖1。術(shù)語(yǔ)“AD7c-NTP”也包括AD7c-NTP的生物活性片段、變體、衍生物、同源物和模擬物。
術(shù)語(yǔ)“NTP”或“神經(jīng)絲狀蛋白”指神經(jīng)絲狀蛋白和相關(guān)分子(包括胰絲狀蛋白)和編碼這些蛋白質(zhì)的核酸序列，且包括(但不限于)下列蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核酸序列(a)AD7c-NTP；(b)～42、～26、～21、～17、～14和～8kD種類(lèi)的神經(jīng)絲狀蛋白，描述見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,634；5,948,888；5,830,670和6,071,705和de la Monte等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55(10)1038-50(1996)，de la Monte等，J.Neurol.Sci.，138(1-2)26-35(1996)；de la Monte等，J.Neurol.Sci.，135(2)118-25(1996)；de la Monte等，J.Clin.Invest.，1003093-3104(1997)；de la Monte等，Alz.Rep.，2327-332(1999)；(c)由單克隆抗體#2特異性識(shí)別的蛋白質(zhì)保存于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，Manassas，Va.，登錄號(hào)HB-12546，或由單克隆抗體#5特異識(shí)別的蛋白質(zhì)保存于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，Manassas，Va.，登錄號(hào)HB-12545；(d)由AD7c-NTP基因編碼的蛋白質(zhì)；(e)122個(gè)氨基酸神經(jīng)絲狀蛋白，描述見(jiàn)來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列40，并在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25447，PIDg10048540中列出，氨基酸序列示于圖2；(f)NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#XP_032307，PID g14725132中列出的122個(gè)氨基酸神經(jīng)絲狀蛋白，氨基酸序列示于圖3；(g)NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAH14951 PID g1592897l中列出的106個(gè)氨基酸神經(jīng)絲狀蛋白，氨基酸序列示于圖4；(h)NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#XP_039102 PID g18599399中列出的106個(gè)氨基酸神經(jīng)絲狀蛋白，氨基酸序列示于圖5；(i)98個(gè)氨基酸神經(jīng)絲狀蛋白，描述見(jiàn)來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,88的序列30，并在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25445，PIDg10048538中列出，氨基酸序列示于圖6；(j)75個(gè)氨基酸神經(jīng)絲狀蛋白，描述見(jiàn)來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列48，并在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25448，PIDg10048541中列出，氨基酸序列示于圖7；(k)68個(gè)氨基酸神經(jīng)絲狀蛋白，描述見(jiàn)來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,670、5,948,634和5,948,888的序列36，并在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAE25446，PIDg10048539中列出，氨基酸序列示于圖8；(l)在NCBI Entrez-蛋白質(zhì)登錄號(hào)#AAH02534，PID g12803421中列出的61個(gè)氨基酸蛋白樣蛋白質(zhì)，氨基酸序列示于圖9；(m)胰絲狀蛋白；(n)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,071,705中描述的神經(jīng)胰絲狀蛋白(nPTP)；(o)由雜交瘤產(chǎn)生的抗體特異性識(shí)別的蛋白質(zhì)，雜交瘤為保存于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所的HB 9934、HB 9935和HB 9936。
術(shù)語(yǔ)“NTP肽”所指的肽包括對(duì)應(yīng)于NTP的至少部分氨基酸序列或NTP片段的氨基酸序列，除非另有說(shuō)明，還包括這些肽的同源物、衍生物、變體、融合蛋白和肽模擬物。術(shù)語(yǔ)“NTP肽”還包括(但不限于)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/092,934個(gè)10/153334中特別列出的肽。術(shù)語(yǔ)“NTP肽”優(yōu)選包括(但不限于)NTP的以下氨基酸序列a)NTP肽#1[SEQ ID NO.10]，與AD7c-NTP p227-245類(lèi)似，在p228之后插入了額外的苯丙氨酸殘基PGFFKLFSCPSLLSSWDYRRPro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO10A]CCCGGGTTCTTCAAGTTATTCTCCTGCCCCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCb)NTP肽#2[SEQ ID NO.11]，AD7c-NTP p114-132PELKQSTCLSLPKCWDYRRPro-Glu-Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO11A]CCTGAGCTCAAGCAGTCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGT
c)NTP肽#3[SEQ ID NO.12]，AD7c-NTP p326-344PPGLKRFSCLSLPSSWDYGPro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO12A]CCTCCCGGGCTCAAGCGATTCTCCTGTCTCAGCCTCCCAAGCAGCTGGGATTACGGGd)NTP肽#4[SEQ ID NO.13]，AD7c-NTP p332-345FSCLSLPSSWDYGHPhe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO13A]TTCTCCTGTCTCAGCCTCCCAAGCAGCTGGGATTACGGGCACe)NTP肽#5[SEQ ID NO.14]，AD7c-NTP p119-132STCLSLPKCWDYRRSer-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO14A]TCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTf)NTP肽#6[SEQ ID NO.15]，AD7c-NTP p232-245FSCPSLLSSWDYRRPhe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO15A]TTCTCCTGCCCCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCg)NTP太#7[SEQ ID NO.16]，AD7c-NTP p335-343LSLPSSWDYLeu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO16A]
CTCAGCCTCCCAAGCAGCTGGGATTACh)NTP肽#8[SEQ ID NO.17]，AD7c-NTP p122-132LSLPKCWDYRRLeu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO17A]CTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTi)NTP肽#9[SEQ ID NO.18]，AD7c-NTP p236-245SLLSSWDYRRSer-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO18A]AGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCj)NTP肽#10[SEQ ID NO.19]，AD7c-NTP p239-245在N末端具有額外的亮氨酸和脯氨酸殘基。
LPSSWDYRRLeu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO19A]CTCCCAGAGTAGCTGGGACTACAGGCGCk)NTP肽#11[SEQ ID NO.20]，AD7c-NTP p239-245SSWDYRRSer-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO20A]GAGTAGCTGGGACTACAGGCGCl)NTP肽#12[SEQ ID NO.21]，AD7c-NTP p239-243，p339-343SSWDYSer-Ser-Trp-Asp-Tyr相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO21A]
AGCAGCTGGGATTACm)NTP肽#13[SEQ ID NO.22]，AD7c-NTP p239-245+AD7c-NTP p139-144SSWDYRRFILFFLSer-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO22A]GAGTAGCTGGGACTACAGGCGCTTTATTTTATTTTTTTTAn)NTP肽#14[SEQ ID NO.23]，AD7c-NTP p241-245+AD7c-NTP p197-202WDYRRFIFNFLTrp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO23A]TGGGACTACAGGCGCTTTATTTTTAATTTTTTGo)NTP肽#15[SEQ ID NO.24]，AD7c-NTP p297-302FNFCLFPhe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO24A]TTTAATTTTTGTTTGTTTp)NTP肽#16[SEQ ID NO.25]，AD7c-NTP p197-202FIFNFLPhe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO25A]TTTATTTTTAATTTTTTGq)NTP肽#17[SEQ ID NO.26]，AD7c-NTP p31-43PASASPVAGITGMPro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO26A]CCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCTGGGATTACAGGCATG
r)NTP肽#18[SEQ ID NO.27]，AD7c-NTP p175-187PASASQVAGTKDMPro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO27A]CCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACCAAAGACATGs)NTP肽#19[SEQ ID NO.28]，AD7c-NTP p277-289PASASQSAGITGVPro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val相應(yīng)的核酸序列[SEQ ID NO28A]CCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTG并包括這些特別列出的NTP肽的同源物、衍生物、變體、片段、融合蛋白和肽模擬物以及它們相應(yīng)的核酸序列。
術(shù)語(yǔ)“片段”是指由NTP蛋白或NTP肽的氨基酸序列的連續(xù)亞序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)或多肽，包括天然產(chǎn)生的片段，如剪接變體和在體內(nèi)由分解蛋白活性天然產(chǎn)生的片段。這種片段可在氨基末端、羧基末端和/或中間(如自然剪接)截短。這種片段可以用或不用氨基末端甲硫氨酸制備。術(shù)語(yǔ)“片段”包括來(lái)自相同NTP蛋白或NTP肽的片段，可以相同或不同，共有或沒(méi)有毗連的氨基酸序列，直接或通過(guò)接頭連在一起。
術(shù)語(yǔ)“變體”指一種蛋白質(zhì)或多肽，其中與NTP蛋白或NTP肽的氨基酸序列相比存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入，包括天然產(chǎn)生的NTP蛋白或NTP肽的等位基因變體或者另路剪接變體。術(shù)語(yǔ)“變體”包括在肽序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸用類(lèi)似或同源氨基酸或不相似氨基酸的置換。氨基酸可在許多等級(jí)上分為類(lèi)似或同源氨基酸(Gunnar von Heijne，《分子生物學(xué)的序列分析》(SequenceAnalysis in Molecular Biology)，123-39頁(yè)Academic Press，紐約，NY 1987.)優(yōu)選的變體包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置的丙氨酸取代。其它優(yōu)選的取代包括對(duì)蛋白質(zhì)的整體凈電荷、極性或疏水性影響小或沒(méi)有影響的保守性取代。保守性取代列于下表2中。
表2保守性氨基酸取代堿性精氨酸賴氨酸組氨酸酸性谷氨酸天冬氨酸無(wú)電荷極性 谷氨酰胺天冬酰胺絲氨酸蘇氨酸酪氨酸非極性 苯丙氨酸色氨酸半胱氨酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸脯氨酸甲硫氨酸亮氨酸異亮氨酸表3列出氨基酸取代的另一種方案
表3原始?xì)埢〈彼? 甘氨酸；絲氨酸精氨酸 賴氨酸天冬酰胺谷氨酰胺；組氨酸天冬氨酸谷氨酸半胱氨酸絲氨酸谷氨酰胺天冬酰胺谷氨酸 天冬氨酸甘氨酸 丙氨酸；脯氨酸組氨酸 天冬酰胺；谷氨酰胺異亮氨酸亮氨酸；纈氨酸亮氨酸 異亮氨酸；纈氨酸賴氨酸 精氨酸；谷氨酰胺；谷氨酸甲硫氨酸亮氨酸；酪氨酸；異亮氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸；亮氨酸；酪氨酸絲氨酸 蘇氨酸蘇氨酸 絲氨酸色氨酸 酪氨酸酪氨酸 色氨酸；苯丙氨酸纈氨酸 異亮氨酸；亮氨酸其它變體可由保守性較小的氨基酸取代組成，如選擇的殘基更顯著不同在于它們對(duì)維持(a)取代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)的作用，例如片層或螺旋構(gòu)型，(b)靶位點(diǎn)分子的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈大小。預(yù)期通常對(duì)功能有更顯著作用的取代是(a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一種氨基酸取代或缺失或插入；(b)親水性殘基如絲氨酰或蘇氨酰取代(或被)疏水性殘基，如亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨?；虮滨?；(c)半胱氨酸殘基取代(或被)任何其它殘基；(d)具有正電性側(cè)鏈的殘基如賴氨酰、精氨?；蚪M氨酰取代(或被)具有負(fù)電荷的殘基如谷氨?；蛱於滨?；或(e)具有大側(cè)鏈的殘基如苯丙氨酸取代(或被)沒(méi)有這種側(cè)鏈的殘基如甘氨酸。其它變體包括設(shè)計(jì)為產(chǎn)生新的糖基化和/或磷酸化位點(diǎn)的，或設(shè)計(jì)為缺失現(xiàn)有糖基化和/或磷酸化位點(diǎn)的殘基。變體包括糖基化位點(diǎn)、蛋白酶裂解位點(diǎn)和/或半胱氨酸殘基上的至少一個(gè)氨基酸取代。變體還包括在接頭肽上NTP或NTP肽氨基酸序列之前或之后具有其它氨基酸殘基的NTP蛋白或NTP肽。例如，可將半胱氨酸殘基加在NTP肽的氨基和羧基末端以形成二硫鍵使NTP肽環(huán)化。術(shù)語(yǔ)“變體”還包括具有NTP肽的氨基酸序列的多肽，它在NTP肽的3′或5′末端側(cè)翼上有至少1個(gè)和多達(dá)25個(gè)或更多額外的氨基酸。
術(shù)語(yǔ)“衍生物”指化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)或多肽，它們通過(guò)天然過(guò)程如加工和其它翻譯后修飾而被化學(xué)修飾，也可通過(guò)化學(xué)修飾技術(shù)如加入一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子、糖、磷酸鹽和/或其它這種分子，其中這類(lèi)分子不是天然結(jié)合于野生型NTP蛋白或肽的分子。衍生物包括鹽。這種化學(xué)修飾描述可見(jiàn)基礎(chǔ)教材和更詳細(xì)的專(zhuān)論以及大量研究文獻(xiàn)中，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。將會(huì)理解的是，相同類(lèi)型的修飾可能以相同或不同程度存在于給定蛋白質(zhì)或多肽的一些位點(diǎn)上。同樣，給定蛋白質(zhì)或多肽可包含許多種類(lèi)的修飾。修飾可發(fā)生在蛋白質(zhì)或多肽的任何地方，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。修飾包括例如乙?；?、?；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)結(jié)合、血紅素部分的共價(jià)結(jié)合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)結(jié)合、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)結(jié)合、磷脂酰肌醇的共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；⒀趸?、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂質(zhì)結(jié)合、硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧基化、羥基化和ADP-核糖基化、硒基化(selenoylation)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸加入蛋白質(zhì)，如精氨?；头核鼗⒁?jiàn)例如《蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)》(Proteins-Structure And Molecular Properties)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，紐約(1993)和Wold，F(xiàn).，“翻譯后蛋白質(zhì)修飾觀點(diǎn)和前景”(Posttranslational Protein ModifcationPerspective andProspects)，《蛋白質(zhì)的翻譯后共價(jià)修飾》(Posttranslational Convalent Modification ofProteins)，1-12頁(yè)，B.C.Johnson編，Academic Press，紐約(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182626-646(1990)和Rattan等，“蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和衰老”(Posttranslational Modifcation and Aging)，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62(1992)。術(shù)語(yǔ)“衍生物”包括化學(xué)修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽變成分支狀或者有或沒(méi)有分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支狀和分支環(huán)狀蛋白質(zhì)或多肽可能由翻譯后的天然加工產(chǎn)生并也可完全由合成方法產(chǎn)生。
術(shù)語(yǔ)“同源物”指蛋白質(zhì)，其N(xiāo)TP蛋白、或NTP肽的氨基酸序列，根據(jù)常用于比較兩種多肽的氨基酸位置相似性的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定至少有60％相同。兩種蛋白質(zhì)之間的相似性或同一性程度可用已知方法計(jì)算，包括但不限于以下所描述的那些方法《計(jì)算分子生物學(xué)》(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.編，牛津大學(xué)出版社，紐約，1988；《生物計(jì)算信息學(xué)和基因組計(jì)劃》(BiocomputingInformatics and Genome Projiects)，Smith，D.W.編，Academic Press，紐約，1993；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》(Computer Analysis ofSequence Data)，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編，Humana Press，新澤西州，1994)；《分子生物學(xué)序列分析》(Sequence analysis in Molecular Biology)，von Heinje，G.，AcademicPress，紐約，1987)；《序列分析引物》(Sequence analysis Primery)，Gribskov，M.和Devereux，J.編，M Stockton Press，紐約，1991；Carillo H.和Lipman，D.，SIAM，J.Applied Math.，481073(1988)。設(shè)計(jì)了確定同一性的優(yōu)選方法來(lái)給出測(cè)試序列之間的最大匹配。在公眾可得到的計(jì)算機(jī)程序中纂確定同一性和相似性的方法。
用于確定兩種序列之間同一性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法，包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN和FASTA，Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)。BLASTX程序公眾可從NCBI和其它來(lái)源獲得(BLAST手冊(cè)，Altschul，S.等，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。例如采用計(jì)算機(jī)算法如GAP(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，University of Wisconsin，Madison，Wis.)，排列對(duì)比兩種待測(cè)定的蛋白質(zhì)或多肽的序列同一性百分比用于最佳匹配它們各自的氨基酸(“匹配范圍”通過(guò)算法確定)。
間隙開(kāi)放罰分(gap opening penalty)(計(jì)算為3x倍平均對(duì)角線；“平均對(duì)角線”是所用比較矩陣的對(duì)角線平均值；“對(duì)角線”是通過(guò)具體比較矩陣賦予各優(yōu)選氨基酸的評(píng)分或數(shù)值)和間隙延伸罰分(gap extension penalty)(通常是間隙開(kāi)放罰分的1/10倍)以及比較矩陣?yán)鏟AM250或BLOSUM62可與此算法結(jié)合使用。算法也可使用標(biāo)準(zhǔn)的比較矩陣(PAM250比較矩陣參見(jiàn)Dayhoff等，《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜集》(Atlas ofProtein Sequence and Structure)，第5卷，增補(bǔ)本3；BLOSUM62比較矩陣參見(jiàn)Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919)。然后用該算法計(jì)算同一性百分比。同源物與NTP或NTP肽相比，通常具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。
術(shù)語(yǔ)“肽模擬物”或“模擬物”指能模擬肽或蛋白質(zhì)的生物活性但在化學(xué)性質(zhì)上不再是肽的生物活性化合物，即它們不再含任何肽鍵(即氨基酸間的酰胺鍵)。這里術(shù)語(yǔ)肽模擬物用于更廣泛含義，包括性質(zhì)上不再完全是肽的分子如假肽、半肽和擬肽(peptoid)。此廣泛含義上的肽模擬物的例子(其中肽的一部分被缺乏肽鍵的結(jié)構(gòu)取代)在下面描述。無(wú)論完全是或部分是非肽，本發(fā)明的肽模擬物提供了反應(yīng)性化學(xué)組成成分的空間排列，肽模擬物所依據(jù)的這些組成成分非常類(lèi)似于NTP蛋白或肽中活性基團(tuán)的三維排列。由于這種相似的活性位點(diǎn)的幾何結(jié)構(gòu)，肽模擬物對(duì)生物系統(tǒng)的作用類(lèi)似于NTP肽的生物活性。
本發(fā)明的肽模擬物優(yōu)選在三維形狀和生物活性上基本上類(lèi)似于本文所述的NTP肽。結(jié)構(gòu)上修飾本領(lǐng)域已知的肽以產(chǎn)生肽模擬物的方法的例子包括倒置主鏈?zhǔn)中灾行漠a(chǎn)生D-氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，具體是在N-末端，使對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性提高而沒(méi)有不利地影響活性。在論文“含氚D-丙氨酸1-肽T結(jié)合”，Smith C.S.等，Drug Development Res.，15，371-379頁(yè)(1988)中描述了一個(gè)例子。第二種方法是改變穩(wěn)定性所需的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如N到C鏈間的二酰亞胺和內(nèi)酰胺(Ede等，Smith和Rivier編，《肽化學(xué)和生物學(xué)》(PeptidesChemistry and Biology)，Escom，Leiden，1991，268-270頁(yè))。例子見(jiàn)構(gòu)型限制的胸腺五肽樣化合物，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,457,489(1985)，Goldstein，G.等所公開(kāi)的那樣，其內(nèi)容全部納入本文供參考。第三種方法是用對(duì)蛋白水解有抗性的假肽鍵替換NTP肽中的肽鍵。
所述的一些假肽鍵一般不影響肽的結(jié)構(gòu)和生物活性。此方法的一個(gè)例子是取代逆轉(zhuǎn)化假肽鍵(“胸腺五肽的生物活性逆轉(zhuǎn)化同源物”)(Biologically activeretroinverso analogue ofthymopentin)，Sisto A等，Rivier，J.E.和Marshall，G.R.編，“肽、化學(xué)、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)”(Peptides，Chemistry，Structure and Biology)，Escom，Leiden，1990，722-773頁(yè))和Dalpozzo等(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41561-566，納入本文供參考)。根據(jù)此修飾，肽的氨基酸序列可能與上述NTP肽的序列相同，除了一個(gè)或多個(gè)肽鍵被逆轉(zhuǎn)化假肽鍵所取代。優(yōu)選大部分N-末端肽鍵被取代，由于這種取代是通過(guò)外肽酶作用于N-末端而賦予對(duì)蛋白水解的抗性。也可用其它類(lèi)似結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團(tuán)替代氨基酸的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行修飾。另一種已知可提高對(duì)酶裂解的穩(wěn)定性而生物活性沒(méi)有或很少損失的合適假肽鍵是還原型電子等排物(isostere)假肽鍵(Couder等(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41181-184，全部納入本文供參考)。
因此，這些肽的氨基酸序列可能與NTP肽的序列相同，除了一個(gè)或多個(gè)肽鍵被電子等排物假肽鍵替代外。本文所用術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”優(yōu)選指至少2種氨基酸的序列，優(yōu)選至少4種，更優(yōu)選至少5種。優(yōu)選大部分N-末端肽鍵被取代，由于這種取代是通過(guò)外肽酶作用于N-末端而賦予對(duì)蛋白水解的抗性。合成具有一個(gè)或多個(gè)還原型電子等排的假肽鍵的肽是本領(lǐng)域已知的(Couder等，上面所引用)。另一個(gè)例子包括導(dǎo)入酮亞甲基鍵或甲硫化物鍵來(lái)替代肽鍵。
NTP肽的擬肽衍生物代表了另一類(lèi)肽模擬物，擬肽保留了生物活性的重要結(jié)構(gòu)決定簇，但去除肽鍵，從而賦予對(duì)蛋白水解的抗性(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，899367-9371，全部納入本文供參考)。擬肽是N-取代的甘氨酸的寡聚物。已報(bào)道了一些N-烷基基團(tuán)，各對(duì)應(yīng)于天然氨基酸的側(cè)鏈(Simon等，1992，上面所引用)。NTP肽的一些或所有氨基酸用對(duì)應(yīng)于替代氨基酸的N-取代甘氨酸所替代。
術(shù)語(yǔ)“肽模擬物”或“模擬物”還包括反-D肽和下面定義的對(duì)映異構(gòu)體。術(shù)語(yǔ)“反-D肽”指與NTP肽的L-氨基酸序列相比，由反向順序排列的D-氨基酸組成的生物活性蛋白質(zhì)或肽。因此，L-氨基酸NTP肽的羧基末端殘基成為D-氨基酸肽的氨基末端。例如，NTP肽、SSWDY變成TdDdWdSdSd，其中Dd、Sd、Wd和Yd是分別對(duì)應(yīng)于L-氨基酸D、S、W和Y的D-氨基酸。
當(dāng)用在這里時(shí)，“對(duì)映異構(gòu)體”指一種生物活性蛋白質(zhì)或肽，其中NTP肽的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)L-氨基酸殘基被相應(yīng)的D-氨基酸殘基替代。
這里所描述的氨基酸和氨基酸殘基可參考下表提供的被接受的一個(gè)字母或三個(gè)字母的編碼。
表1氨基酸 一個(gè)字母符號(hào)三個(gè)字母符號(hào)丙氨酸 A Ala精氨酸 R Arg天冬酰胺N Asn天冬氨酸D Asp半胱氨酸C Cys谷氨酰胺Q Gln谷氨酸 E Glu甘氨酸 G Gly組氨酸 H His異亮氨酸I Ile亮氨酸 L Leu賴氨酸 K Lys甲硫氨酸M Met苯丙氨酸F Phe脯氨酸 P Pro絲氨酸 S Ser蘇氨酸 T Thr色氨酸 W Trp酪氨酸 Y Tyr纈氨酸 V Val本發(fā)明涉及含有如本發(fā)明以上定義的NTP肽的組合物。優(yōu)選的NTP肽與衍生自AD7c-NTP的NTP肽類(lèi)似或同源。然而，使用基于其它種類(lèi)NTP蛋白的部分或片段的NTP肽也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如，在許多人類(lèi)和非人蛋白質(zhì)(“相關(guān)蛋白質(zhì)”)中也發(fā)現(xiàn)了AD7c-NTP肽序列和類(lèi)似的變體和同源物。特別是，AD7c-NTP基因含有Alu-型序列，它與那些還在人類(lèi)和其它靈長(zhǎng)類(lèi)基因組的其它基因中發(fā)現(xiàn)的序列非常類(lèi)似。
因此，可以理解，一些(如果不是全部)相關(guān)蛋白質(zhì)也證明是造成細(xì)胞死亡的有效試劑，因?yàn)樗鼈兒须男蛄型次锘蚺cAD7c-NTP肽非常類(lèi)似的肽(“相關(guān)肽”)。同樣，此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以基于任何相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列來(lái)合成特定的相關(guān)肽，這些蛋白質(zhì)是造成細(xì)胞死亡的有效試劑，并測(cè)試它們作為造成細(xì)胞死亡試劑的效力。
衍生自相關(guān)蛋白質(zhì)(它們被發(fā)現(xiàn)是造成細(xì)胞死亡的有效試劑)的其它肽序列也是造成細(xì)胞死亡的有效試劑。此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可合成跨越所述蛋白質(zhì)的整個(gè)氨基酸序列的有效相關(guān)蛋白質(zhì)的片段，以便鑒定其它有效的肽序列。
本發(fā)明優(yōu)選的NTP肽包括已知含有與NTP肽序列相同、非常類(lèi)似或同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)和肽。
本發(fā)明的NTP肽及其片段、變體、衍生物、同源物和模擬物可用此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的方法制備，如重組DNA技術(shù)、蛋白質(zhì)合成和分離天然產(chǎn)生的NTP肽和其片段、變體、衍生物和同源物。
NTP肽可用熟知的重組DNA技術(shù)方法制備，如列于Sambrook等，(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)和/或Ausubel等，編，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Green Publishers Inc.及Wiley和Sons，N.Y.的方法。
可獲得編碼NTP肽的基因或cDNA，例如通過(guò)篩選基因組或cDNA文庫(kù)或通過(guò)PCR擴(kuò)增。用于篩選文庫(kù)的探針或引物可在其它已知基因或基因片段序列信息的基礎(chǔ)上產(chǎn)生，基因或基因片段來(lái)自相同或相關(guān)基因家族，如在其它NTP肽或NTP蛋白中發(fā)現(xiàn)的保守基序。此外，從一個(gè)種類(lèi)中鑒定了編碼NTP蛋白或NTP肽的基因，所有或部分基因可用作探針以從其它種類(lèi)中鑒定同源基因。探針或引物可用于從認(rèn)為表達(dá)NTP肽或NTP蛋白基因的多種組織來(lái)源中篩選cDNA文庫(kù)。通常，可使用高嚴(yán)緊性條件來(lái)最小化篩選獲得的假陽(yáng)性數(shù)量。
另一種制備編碼NTP蛋白或NTP肽的基因的方法采用化學(xué)合成，使用技術(shù)人員熟知的方法，如Engels等(Angew.Chem.Intl.Ed.，28716-734)描述的方法。這些方法尤其包括磷酸三酯、亞磷酰胺、H-膦酸酯方法用于核酸合成。這種化學(xué)合成的優(yōu)選方法是使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)的聚合物-支持的合成。一般，編碼NTP蛋白或NTP肽的DNA長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸?？捎眠@些方法將大于約100個(gè)核苷酸的核酸合成為幾個(gè)片段。然后片段可連接在一起形成全長(zhǎng)NTP蛋白或NTP肽。通常，編碼蛋白質(zhì)的氨基末端的DNA片段具有編碼甲硫氨酸的ATG。此甲硫氨酸可以或可不存在于NTP蛋白或NTP肽的成熟形式，這取決于宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是否設(shè)計(jì)成從該細(xì)胞中分泌。
編碼NTP蛋白或NTP肽的基因、cDNA或其片段可用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)插入合適表達(dá)或擴(kuò)增載體中。通常選擇在所用具體宿主細(xì)胞中有功能的載體(即載體與宿主細(xì)胞機(jī)制相容，從而可產(chǎn)生基因擴(kuò)增和/或基因表達(dá))。編碼NTP蛋白或NTP肽的基因、cDNA或其片段可在原核、酵母、昆蟲(chóng)(桿狀病毒系統(tǒng))和/或真核宿主細(xì)胞中擴(kuò)增/表達(dá)。宿主細(xì)胞的選擇部分取決于NTP蛋白或肽是否糖基化和/或磷酸化。如果這樣，優(yōu)選酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
通常，任何宿主細(xì)胞中所用的載體包含5’側(cè)翼序列(也稱為“啟動(dòng)子”)和其它調(diào)節(jié)元件以及增強(qiáng)子、復(fù)制元件的起點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止元件、含供體和受體剪接位點(diǎn)的完整內(nèi)含子序列、信號(hào)肽序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)元件、多腺苷酸化序列、多接頭區(qū)域用于插入編碼待表達(dá)多肽的核酸、可選擇的標(biāo)記元件。各個(gè)這些元件在下面討論。任選的是，載體可包含標(biāo)志序列，即位于NTP蛋白或NTP肽編碼序列的5’或3’末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸分子編碼PolyHis(如Hexa His)或其它標(biāo)志如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或存在可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)抗體的myc。此標(biāo)志常在表達(dá)多肽時(shí)融合到多肽，可作為從宿主細(xì)胞親和純化NTP蛋白或NTP肽的方法。例如可通過(guò)柱層析完成親和純化，柱層析使用抗體抗作為親和基質(zhì)的標(biāo)志。任選地，隨后通過(guò)多種方法如一些肽酶從純化的NTP蛋白或NTP肽中去除標(biāo)志。
人免疫球蛋白鉸鏈和Fc區(qū)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在NTP蛋白或NTP肽的N-或C-末端融合。隨后Fc融合蛋白可用A蛋白親和柱純化。已知Fc體內(nèi)表現(xiàn)出長(zhǎng)的藥物動(dòng)力學(xué)半衰期且發(fā)現(xiàn)融合Fc的蛋白質(zhì)體內(nèi)表現(xiàn)出的半衰期顯著大于未融合蛋白質(zhì)。同樣，融合Fc區(qū)使對(duì)一些分子的生物活性有用的分子二聚化/多聚化。
5’側(cè)翼序列可以是同源(即來(lái)自與宿主細(xì)胞相同的種類(lèi)和/或菌株)、異源(即來(lái)自與宿主細(xì)胞不同的種類(lèi)或菌株)、雜合(即來(lái)自超過(guò)一個(gè)來(lái)源的5’側(cè)翼序列組合)、合成，或可以是天然NTP蛋白或NTP肽基因5’側(cè)翼序列。同樣，5’側(cè)翼序列的來(lái)源可以是單細(xì)胞原核或真核生物、任何脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物、或任何植物，只要5’側(cè)翼序列有功能且可被宿主細(xì)胞機(jī)制活化。
本發(fā)明載體中有用的5’側(cè)翼序列可通過(guò)任何本領(lǐng)域中熟知的一些方法來(lái)獲得。通常，本文除了NTP蛋白或NTP肽基因側(cè)翼序列外的有用5’側(cè)翼序列在前面通過(guò)作圖和/或限制性內(nèi)切酶消化來(lái)鑒定，因此可用合適的限制性內(nèi)切酶從適當(dāng)組織來(lái)源中分離。在一些情況中，5′側(cè)翼序列的全核苷酸序列可以是已知的。這里可用上述核酸合成或克隆的方法合成5’側(cè)翼序列。
當(dāng)所有或僅部分5’側(cè)翼序列已知時(shí)，它可用PCR和/或篩選基因組文庫(kù)來(lái)獲得，篩選用合適的寡核苷酸和/或來(lái)自相同或另外種類(lèi)的5’側(cè)翼序列片段。
當(dāng)不知道5’側(cè)翼序列時(shí)，含5’側(cè)翼序列的DNA片段可從DNA的較大片斷中分離，DNA可包含例如編碼序列或甚至另外的基因。分離可通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化完成，用一種或多種仔細(xì)選擇的酶分離適當(dāng)DNA片段。消化后，所需片段可通過(guò)瓊脂糖凝膠純化、Qiagen柱或其它技術(shù)人員已知的方法來(lái)分離。選擇適當(dāng)酶以達(dá)到此目的對(duì)此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員是顯然的。
復(fù)制元件的起點(diǎn)通常是商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的原核表達(dá)載體的一部分，協(xié)助宿主細(xì)胞中的載體擴(kuò)增。在一些情況中，載體擴(kuò)增到一定拷貝數(shù)對(duì)最佳表達(dá)NTP蛋白或NTP肽是重要的。如果所選載體不包含復(fù)制位點(diǎn)的起點(diǎn)，可在已知序列基礎(chǔ)上化學(xué)合成起點(diǎn)并連接入載體。轉(zhuǎn)錄終止元件一般位于NTP蛋白或NTP/肽編碼序列的3’末端且用于終止NTP蛋白或NTP肽的轉(zhuǎn)錄。通常，原核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄終止元件是后面有多T序列的G-C豐富片段。元件可從文庫(kù)克隆或商業(yè)購(gòu)買(mǎi)作為載體部分，它也可用上述核酸合成方法容易地合成。
可選擇的標(biāo)記基因元件編碼宿主細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中存活和生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)。典型的選擇標(biāo)記基因元件編碼蛋白質(zhì)(a)賦予原核宿主細(xì)胞對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，如氨卡青霉素、四環(huán)素或卡那霉素，(b)細(xì)胞的互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺乏；或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基沒(méi)有的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記是卡那霉素抗性基因、氨卡青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因。
一般稱為SD序列(原核生物)或Kozak序列(真核核生物)的核糖體結(jié)合元件對(duì)mRNA翻譯起始通常是必需的。元件通常位于啟動(dòng)子3’端和待合成NTP蛋白或NTP肽編碼序列的5’端。SD序列不同但一般是多嘌呤(即有高A-G含量)。鑒定了許多SD序列，可用上述方法合成各序列并用于原核載體。
在需要NTP蛋白或NTP肽從宿主細(xì)胞分泌的情況中，可使用信號(hào)序列指導(dǎo)NTP蛋白或肽到宿主細(xì)胞外，NTP蛋白或肽在細(xì)胞外合成，且可缺失蛋白質(zhì)的羧基末端部分以防止膜錨定。通常，信號(hào)序列位于NTP蛋白/NTP肽基因或cDNA的編碼區(qū)域，或直接在NTP蛋白/NTP肽基因編碼區(qū)的5’末端。鑒定了許多信號(hào)序列，任何在所選宿主細(xì)胞中有功能的序列可與NTP蛋白/NTP肽基因或cDNA結(jié)合使用。因此信號(hào)序列可與NTP蛋白/NTP肽基因或cDNA同源或異源，且可與NTP蛋白/NTP肽基因或cDNA同源或異源。另外，信號(hào)序列可用上述方法化學(xué)合成。在大部分情況中，通過(guò)信號(hào)肽的存在從宿主細(xì)胞分泌多肽會(huì)導(dǎo)致氨基末端甲硫氨酸從多肽中去除。
在許多情況中，NTP蛋白/NTP肽基因或cDNA的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)載體中存在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子來(lái)增加；當(dāng)NTP蛋白或NTP肽在真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)尤其如此，具體是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。所用內(nèi)含子可以是NTP蛋白/NTP肽基因中天然產(chǎn)生的，具體是當(dāng)所用基因是全長(zhǎng)基因組序列或其片段時(shí)。當(dāng)內(nèi)含子不在基因中天然產(chǎn)生時(shí)(對(duì)于大部分cDNAs)，內(nèi)含子可獲得自另外來(lái)源。由于內(nèi)含子必須轉(zhuǎn)錄有效，內(nèi)含子相對(duì)側(cè)翼序列和NTP蛋白/NTP肽基因的位置一般是重要的。同樣，當(dāng)插入表達(dá)載體中的NTP蛋白/NTP肽基因是cDNA分子時(shí)，內(nèi)含子的優(yōu)選位置是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)3’端和多A轉(zhuǎn)錄終止序列5’端。對(duì)于NTP蛋白/NTP肽cDNA優(yōu)選的是，一個(gè)或幾個(gè)內(nèi)含子位于cDNA一側(cè)或另一側(cè)(即5’或3’)從而它不中斷此編碼序列。如果內(nèi)含子與其插入的宿主細(xì)胞相容，來(lái)自任何來(lái)源的任何內(nèi)含子可用于實(shí)踐本發(fā)明，來(lái)源包括任何病毒、原核和真核(植物或動(dòng)物)生物。同樣包括在本文中的是合成內(nèi)含子。任選地，在載體中可使用超過(guò)一個(gè)的內(nèi)含子。
當(dāng)上述一個(gè)或多個(gè)元件不存在于待使用的載體中時(shí)，它們可單獨(dú)獲得并連接入載體。用于獲得各元件的方法是技術(shù)人員熟知的，且可與上述方法相比較(即合成DNA、文庫(kù)篩選等)。
用于實(shí)踐本發(fā)明的最終載體可從起始載體構(gòu)建，如商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的載體。這種載體可以或可不包含一些包括在完整載體中的元件。如果沒(méi)有所需元件存在于起始載體中，各元件可單獨(dú)連接入載體，這是通過(guò)用合適的限制性內(nèi)切酶切割載體使元件的連接末端和載體末端對(duì)于連接是相容的。在一些情況中，必須使連接一起的末端成為“平端”以獲得滿意的連接。通過(guò)首先用Klenow DNA聚合酶或T4 DNA聚合酶在所有四種核苷酸存在時(shí)填補(bǔ)“粘端”來(lái)獲得平端。此過(guò)程在本領(lǐng)域熟知且被描述，例如Sambrook等，同上。另外，待插入載體的兩個(gè)或多個(gè)元件可首先連接一起(如果它們的位置彼此相鄰)且隨后連接入載體。
另一種構(gòu)建載體的方法在一種反應(yīng)混合物中同時(shí)進(jìn)行多種元件的所有連接。這里，由于不適當(dāng)?shù)倪B接或插入元件產(chǎn)生許多無(wú)義和無(wú)功能載體。然而可通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化來(lái)鑒定和選擇功能性載體。
實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選載體與細(xì)菌、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞相容。這種載體包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen Company，San Diego，Calif.)、pBSII(Stratagene Company，La Jolla，Calif.)、pET15b(Novagen，Madison，Wis.)、PGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，Calif.)、pETL(BlueBacII；Invitrogen)和pFastBacDual(Gibco/BRL，Grand Island，N.Y.)。
在載體構(gòu)建和編碼全長(zhǎng)或截短N(yùn)TP蛋白或NTP肽的核酸分子插入載體的適當(dāng)位點(diǎn)后，完整載體可插入合適的宿主細(xì)胞用于擴(kuò)增和/或多肽表達(dá)。宿主細(xì)胞可以是原核宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)或真核宿主細(xì)胞(如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或脊椎動(dòng)物細(xì)胞)。當(dāng)宿主細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)時(shí)，可合成NTP蛋白或NTP肽，NTP蛋白或NTP肽隨之從培養(yǎng)基收集(如果宿主細(xì)胞分泌它到培養(yǎng)基中)或直接來(lái)自生成它的宿主細(xì)胞(如果它不被分泌)。
收集后，NTP蛋白或NTP肽可用分子篩層析、親和層析等方法純化。選擇產(chǎn)生NTP蛋白或NTP肽的宿主細(xì)胞部分取決于NTP蛋白或NTP肽是否糖基化或磷酸化(其中真核宿主細(xì)胞優(yōu)選)、宿主細(xì)胞能折疊蛋白質(zhì)成其天然三級(jí)結(jié)構(gòu)(如二硫橋的適當(dāng)方向等)的方式從而通過(guò)具生物活性的NTP蛋白或NTP肽制備生物活性蛋白質(zhì)。合成后可用下面討論的合適化學(xué)條件折疊NTP蛋白或NTP肽。合適的細(xì)胞或細(xì)胞系包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、人胚胎腎(HEK)293或293T細(xì)胞或3T3細(xì)胞。選擇合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)物生成及純化的方法在本領(lǐng)域已知。其它合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括猴COS-1和COS-7細(xì)胞系及CV-1細(xì)胞系。更多示范性哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括靈長(zhǎng)類(lèi)細(xì)胞系和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系，含轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。正常二倍體細(xì)胞、獲得自初級(jí)組織體外培養(yǎng)的細(xì)胞株以及初級(jí)移植體也是合適的。候選細(xì)胞可以是選擇基因中的遺傳型缺陷或可包含顯性開(kāi)放選擇基因。其它合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括但不限于小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤N2A細(xì)胞、海拉細(xì)胞、小鼠L-929細(xì)胞、來(lái)自Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系。
與適合于本發(fā)明的宿主細(xì)胞同樣有用的是細(xì)菌細(xì)胞。例如，多種大腸桿菌菌株(如HB101、DH5α、DH10和MC1061)是生物技術(shù)領(lǐng)域中熟知的宿主細(xì)胞?？莶菅挎邨U菌(B.subtilis)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、其它芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、鏈霉菌屬(Streptomyces spp.)等的多種菌株可用于此方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多酵母細(xì)胞菌株也可作為表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞。
另外，需要時(shí)昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)可用于本發(fā)明的方法。這種系統(tǒng)已被描述，例如Kitts等(Biotechniques，14810-817)、Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.，4564-572)和Lucklow等(J.Virol.，674566-4579)。優(yōu)選的昆蟲(chóng)細(xì)胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。
插入(也稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)載體到所選宿主細(xì)胞中可用方法如氯化鈣、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染或DEAE-葡聚糖方法來(lái)完成。選擇的方法部分是待使用宿主細(xì)胞類(lèi)型的功能。這些方法和其它合適方法是技術(shù)人員熟知的并被列出，例如Sambrook等，同上。
含載體(即轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的)的宿主細(xì)胞可用技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基通常包含所有細(xì)胞生長(zhǎng)和存活必需的營(yíng)養(yǎng)物。培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞的合適培養(yǎng)基是例如Luria Broth(LB)和/或Terrific Broth(TB)。培養(yǎng)真核細(xì)胞的合適培養(yǎng)基是RPMI1640、MEM、DMEM，它們都添加有血清和/或培養(yǎng)特定細(xì)胞系所需的生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)昆蟲(chóng)的合適培養(yǎng)基是Grace培養(yǎng)基，添加有必需的yeastolate、乳白蛋白水解產(chǎn)物和/或胎牛血清。通常，抗生素或其它僅用于選擇性生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化合物作為添加物加入培養(yǎng)基。待使用化合物由轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的質(zhì)粒上存在的可選擇標(biāo)記元件決定。例如，當(dāng)可選擇標(biāo)記元件是卡那霉素抗性時(shí)，加入培養(yǎng)基的化合物是卡那霉素。
宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的NTP蛋白或NTP肽的量可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)估。這種方法包括但不限于蛋白質(zhì)印跡分析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、非變性凝膠電泳、HPLC分離、質(zhì)譜、免疫沉淀和/或活性試驗(yàn)如DNA結(jié)合凝膠移位試驗(yàn)。
如果NTP蛋白或NTP肽設(shè)計(jì)為從宿主細(xì)胞中分泌，大部分NTP蛋白或NTP肽可發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞培養(yǎng)基中。以此方法制備的蛋白質(zhì)通常不具有氨基末端甲硫氨酸，因?yàn)樗鼜募?xì)胞中分泌時(shí)被去除。然而如果NTP蛋白或NTP肽不從宿主細(xì)胞中分泌，它會(huì)存在于細(xì)胞質(zhì)和/或核中(真核宿主細(xì)胞)或在細(xì)胞溶質(zhì)中(革蘭氏陰性菌宿主細(xì)胞)，且可具有氨基末端甲硫氨酸。
就位于宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和/或核中的NTP蛋白或NTP肽而言，通常首先機(jī)械破碎宿主細(xì)胞或用去垢劑釋放胞內(nèi)成分到緩沖溶液中。然后NTP蛋白或NTP肽可從此溶液中分離。
從溶液中純化NTP蛋白或NTP肽可用多種技術(shù)完成。如果合成的蛋白質(zhì)含標(biāo)志如hexa Histidine NTP蛋白/hexa His)或其它小肽如FLAG(Sigma-Aldritch，St.Louis，MI)或在其羧基或氨基末端的鈣調(diào)蛋白-結(jié)合肽(Stratagene，LaJolla，CA)，它可以一步過(guò)程通過(guò)使溶液穿過(guò)親和柱來(lái)純化，其中柱基質(zhì)對(duì)標(biāo)志或直接對(duì)蛋白質(zhì)有高親和性(即特異識(shí)別NTP肽的單克隆抗體)。例如，多組氨酸以高親和性和對(duì)鎳、鋅及鈷的特異性結(jié)合；因而使用以鎳為基礎(chǔ)的親和樹(shù)脂(如用于Qiagene的QIAexpress system或Invitrogen的Xpress System)或以鈷為基礎(chǔ)的親和樹(shù)脂(如用于BD Biosciences-CLONTECH的Talon system)的固定金屬離子親和層析可用于純化NTP蛋白/pols His。(參見(jiàn)例如，Ausubel等，編，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，10.11.8章節(jié)，John Wiley&Sons，紐約)。
當(dāng)制備N(xiāo)TP蛋白或NTP肽而沒(méi)有附著標(biāo)志且沒(méi)有抗體時(shí)，可使用其它熟知的純化過(guò)程。這種過(guò)程包括但不限于離子交換層析、羥磷灰石層析、疏水作用層析、分子篩層析、HPLC、結(jié)合凝膠洗提的天然凝膠電泳以及制備型等電聚焦(Isoprime機(jī)器/技術(shù)，Hoefer Scientific)。
如果預(yù)期NTP蛋白或NTP肽主要發(fā)現(xiàn)于胞內(nèi)，胞內(nèi)物質(zhì)(包括革蘭氏陰性菌的包含體)可用技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從宿主細(xì)胞中提取。例如可裂解宿主細(xì)胞以釋放周質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)含物，這是通過(guò)弗氏壓碎器、勻漿化和/或超聲處理，接著離心。如果NTP蛋白或NTP肽形成細(xì)胞溶質(zhì)中的包含體，包含體通?？山Y(jié)合內(nèi)和/或外細(xì)胞膜，因此離心后主要在沉淀物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。然后沉淀物質(zhì)可在pH極端或用離液劑如去垢劑、胍、胍衍生物、尿素或尿素衍生物處理以釋放、斷裂和溶解包含體，處理是在還原劑存在時(shí)如處于堿性pH的二硫蘇糖醇或處于酸性pH的三羧乙基膦。然后處于目前可溶形式的NTP蛋白或NTP肽可用凝膠電泳、免疫沉淀等分析。如果需要分離NTP蛋白或NTP肽，可用標(biāo)準(zhǔn)方法完成分離，如下面和Marston等(Meth.Enz.，182264-275)列出的方法。
在一些情況中，NTP蛋白或NTP肽分離時(shí)可以沒(méi)有生物活性。再折疊或轉(zhuǎn)變多肽成其三級(jí)結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生二硫鍵的多種方法可用于恢復(fù)生物活性。這種方法包括使溶解的多肽暴露于通常高于7的pH且存在具體濃度的離液劑。離液劑的選擇非常類(lèi)似于用于包含體溶解的選擇，但通常濃度較低且未必是溶解所用的相同離液劑。在大部分情況中，再折疊/氧化溶液也包含還原劑或具體比例的還原劑加其氧化形式，以產(chǎn)生成具體氧化還原電勢(shì)使二硫化物改組形成蛋白質(zhì)的半胱氨酸橋。一些常用的氧化還原包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽(GSH)/二硫雙GSH(dithiobisGSH)、氯化銅、二硫蘇糖醇(DTT)/二噻烷DTT、2-巰基乙醇(bME)/二硫-b(ME)。在許多情況中，需要共溶劑提高再折疊和更多用于此目的普通試劑的效率，試劑包括甘油、不同分子量的聚乙二醇和精氨酸。
如果宿主細(xì)胞中不形成顯著程度的NTP蛋白或NTP肽包含體，細(xì)胞勻漿離心后NTP蛋白或NTP肽主要發(fā)現(xiàn)于上清液中，NTP蛋白或NTP肽可用如下列的方法從上清液中分離。
在優(yōu)選部分或完全分離NTP蛋白或NTP肽的情況中，可用技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法完成純化。這種方法包括但不限于電泳分離，接著電洗脫、多種層析(免疫親和、分子篩和/或離子交換)、和/或高壓液相層析。在一些情況中，優(yōu)選使用超過(guò)一種的這些方法來(lái)完全純化。
除了用重組DNA技術(shù)制備和純化NTP蛋白或NTP肽，NTP蛋白或NTP肽和它們的片段、變體、同源物和衍生物可用化學(xué)合成方法制備(如固相肽合成)，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)如描述于Merrifield等，(J.Am.Chem.Soc.，852149)、Houghten等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855132)、Stewart和Young(《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)，Pierce Chemical Co.，Rockford，III.)。這種多肽可在氨基末端有或沒(méi)有甲硫氨酸合成?；瘜W(xué)合成的NTP蛋白或NTP肽可用參考文獻(xiàn)所列方法氧化以形成二硫橋。預(yù)期NTP蛋白和NTP肽具有可與重組產(chǎn)生或純化自天然來(lái)源的NTP蛋白或NTP肽相比較的生物活性，因此可與重組或天然NTP蛋白質(zhì)或NTP肽交換使用。
化學(xué)修飾的NTP蛋白和NTP肽組合物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中NTP蛋白或NTP肽連接于聚合物。所選聚合物通常可溶于水從而它附著的蛋白質(zhì)不在水環(huán)境中沉淀，如生理環(huán)境。所選聚合物通常被修飾以具有單個(gè)反應(yīng)基團(tuán)如用于?；幕钚怎セ蛴糜谕榛娜?，從而可如本方法所提供的控制聚合程度。聚合物可以是任何分子量，可以是分支或未分支。包括在NTP蛋白/NTP肽聚合物范圍中的是聚合物的混合物。
在一些情況中，需要制備天然產(chǎn)生NTP蛋白或NTP肽的核酸和/或氨基酸變體。核酸變體可用定點(diǎn)誘變、PCR擴(kuò)增或其它合適方法產(chǎn)生，其中引物有所需點(diǎn)突變(誘變技術(shù)的描述參見(jiàn)Sambrook等，同上，Ausubel等，同上)。使用Engels等，同上，所述的化學(xué)合成方法也可用于制備這種變體。其它技術(shù)人員已知的方法也可使用。
優(yōu)選的核酸變體包含產(chǎn)生宿主細(xì)胞中密碼子優(yōu)先的核苷酸取代，宿主細(xì)胞待用于產(chǎn)生NTP蛋白或NTP肽。這種“密碼子最優(yōu)化”可通過(guò)計(jì)算機(jī)算法確定，算法結(jié)合密碼子頻率表如“Ecohigh.Cod”作為高度表達(dá)細(xì)菌基因的密碼子優(yōu)先，由University of Wisconsin包版本9.0，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，Madison，Wis提供。其它有用的密碼子頻率表包括“Celegans_high.cod”、“Celegans_low.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.cod”和“Yeast_high.cod”。其它優(yōu)選變體是編碼上述與野生型相比保守性氨基酸變化(如其中天然產(chǎn)生氨基酸側(cè)鏈的電荷或極性不被用不同氨基酸的取代所顯著改變)的變體、和/或設(shè)計(jì)為產(chǎn)生新的糖基化和/或磷酸化位點(diǎn)的變體、或設(shè)計(jì)為缺失現(xiàn)存糖基化和/或磷酸化位點(diǎn)的變體。
NTP蛋白、NTP肽、片斷、同源物、變體、衍生物和它的鹽類(lèi)可用此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的常規(guī)肽合成技術(shù)產(chǎn)生。這些技術(shù)包括化學(xué)偶聯(lián)方法(比較Wunch，E“有機(jī)化學(xué)方法”，第15卷，帶1+2，Synthese von Peptiden，thime Verlag，Stuttgart(1974)和Barrany，G.；Marrifield，R.B.“肽”(The Peptides)，E.Gross，J.Meienhofer編，第2卷，第1章，1-284頁(yè)，Academic Press(1980))、酶偶聯(lián)方法(比較Widmer，F(xiàn).Johansen，J.T.，Carlsverg Res.Commun.，第44卷，37-46頁(yè)(1979)和Kullmann，W.“酶肽合成”(Enzymatic Peptide Synthesis)，CRC Press Inc.BocaRaton，F(xiàn)la.(1987)和Widmer，F(xiàn).，Johansen，J.T.，“生物和醫(yī)學(xué)中的合成肽”(SyntheticPeptides in Biology and Medicines)，Alitalo，K.，Partanen，P.，Vatieri，A.編，79-86頁(yè)，Elsevier，Amsterdam(1985))、或化學(xué)和酶方法的組合，如果這對(duì)于加工設(shè)計(jì)和經(jīng)濟(jì)有優(yōu)勢(shì)。使用本文提供的指南和教授，本領(lǐng)域技術(shù)人員能改變NTP肽的肽序列以產(chǎn)生具有與原始或天然NTP蛋白或NTP肽相同或類(lèi)似生物活性的同源物。
使用給定NTP蛋白或NTP肽的模擬物而不是蛋白質(zhì)本身具有優(yōu)點(diǎn)。通常，與蛋白質(zhì)和肽相比，肽模擬物的生物利用度更高，有較長(zhǎng)的作用時(shí)間且生產(chǎn)成本低。
因此，上述NTP蛋白和NTP肽可用于開(kāi)發(fā)具類(lèi)似生物活性從而具類(lèi)似治療作用的小化學(xué)化合物?？墒褂媒M合化學(xué)技術(shù)和本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)開(kāi)發(fā)NTP蛋白和NTP肽的肽模擬物(參見(jiàn)例如《第20屆歐洲肽專(zhuān)題討論會(huì)記錄》(Proceedingsof the 20th European Peptide Symposium)，G.Jung，E.Bayer編，289-336頁(yè)，和其中的參考文獻(xiàn))。
結(jié)構(gòu)上修飾本領(lǐng)域已知的肽以產(chǎn)生肽模擬物的方法的例子包括倒置主鏈?zhǔn)中灾行漠a(chǎn)生D-氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，具體是在N-末端，導(dǎo)致對(duì)蛋白酶降解的穩(wěn)定性提高而沒(méi)有不利地影響活性。在論文“含氚D-丙氨酸1-肽T結(jié)合”，Smith C.S.等，DrugDevelopment Res.，15，371-379頁(yè)(1988)中給出了一個(gè)例子。
第二種方法是改變穩(wěn)定性所需的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如N到C鏈間的二酰亞胺和內(nèi)酰胺(Ede等，Smith和Rivier編，《肽化學(xué)和生物學(xué)》，Escom，Leiden，1991，268-270頁(yè))。例子見(jiàn)構(gòu)型限制的胸腺五肽樣化合物，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,457,489(1985)，Goldstein，G.等所公開(kāi)的那樣，其內(nèi)容全部納入本文供參考。
第三種方法是用對(duì)蛋白水解有抗性的假肽鍵替換NTP蛋白或NTP肽中的肽鍵。所述的一些假肽鍵一般不影響肽的結(jié)構(gòu)和生物活性。此方法的一個(gè)例子是取代逆轉(zhuǎn)化假肽鍵(“胸腺五肽的生物活性逆轉(zhuǎn)化同源物”，Sisto A等，Rivier，J.E.和Marshall，G.R.編，“肽、化學(xué)、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)”，Escom，Leiden，1990，722-773頁(yè))和Dalpozzo等(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41561-566，納入本文供參考)。根據(jù)此修飾，肽的氨基酸序列可能與上述NTP蛋白和NTP肽的序列相同，除了一個(gè)或多個(gè)肽鍵被逆轉(zhuǎn)化假肽鍵所取代。優(yōu)選大部分N-末端肽鍵被取代，由于這種取代是通過(guò)外肽酶作用于N-末端而賦予對(duì)蛋白水解的抗性。
合成具一個(gè)或多個(gè)還原型逆轉(zhuǎn)化假肽鍵的肽在本領(lǐng)域已知(Sisto(1990)和Dalpozzo等，(1993)，上面所引用)。因此肽鍵可用非肽鍵替代使肽模擬物獲得與原始肽相似的結(jié)構(gòu)，從而生物活性相似。也可用其它類(lèi)似結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團(tuán)替代氨基酸的化學(xué)基團(tuán)作進(jìn)一步修飾。另一種已知可提高對(duì)酶裂解的穩(wěn)定性而生物活性沒(méi)有或很少損失的合適假肽鍵是還原型電子等排物假肽鍵(Couder等(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41181-184，全部納入本文供參考)。因此，這些肽的氨基酸序列可能與NTP蛋白或NTP肽序列相同，除了一個(gè)或多個(gè)肽鍵被電子等排物假肽鍵替代外。優(yōu)選大部分N-末端肽鍵被取代，由于這種取代是通過(guò)外肽酶作用于N-末端而賦予對(duì)蛋白水解的抗性。合成具有一個(gè)或多個(gè)還原型電子等排假肽鍵的肽是本領(lǐng)域已知的(Couder等，上面所引用)。另一個(gè)例子包括導(dǎo)入酮亞甲基鍵或甲硫化物鍵來(lái)替代肽鍵。
NTP蛋白或NTP肽的擬肽衍生物代表了另一類(lèi)肽模擬物，擬肽保留了生物活性的重要結(jié)構(gòu)決定簇，但去除肽鍵，從而賦予對(duì)蛋白水解的抗性(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，899367-9371，全部納入本文供參考)。擬肽是N-取代的甘氨酸的寡聚物。已報(bào)道了一些N-烷基基團(tuán)，各對(duì)應(yīng)于天然氨基酸的側(cè)鏈(Simon等，1992，上面所引用)。NTP蛋白或NTP肽的一些或所有氨基酸用對(duì)應(yīng)于替代氨基酸的N-取代甘氨酸所替代。
可通過(guò)NMR譜、結(jié)晶學(xué)和/或計(jì)算機(jī)-輔助的制作分子模型確定原始NTP蛋白或NTP肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)協(xié)助開(kāi)發(fā)肽模擬物。這些技術(shù)幫助開(kāi)發(fā)具有比原始肽更高效力和/或更高生物利用率和/或更高穩(wěn)定性的新組合物(Dean(1994)，BioEssays，16683-687；Cohen和Shatzmiller(1993)，J.Mol.Graph.，11166-173；Wiley和Rich(1993)，Med.Res.Rev.，13327-384；Moore(1994)，TrendsPharmacol.Sci.，15124-129；Hruby(1993)，Biopolymers.，331073-1082；Bugg等(1993)Sci.Am.，26992-98，全部納入本文供參考)。
一旦一種潛在的肽模擬物化合物被鑒定，它可以用下面例子中概括的方法合成和分析以評(píng)估其活性。用上述方法獲得的肽模擬化合物在本發(fā)明范圍內(nèi)，化合物具有NTP蛋白或NTP肽的生物活性和類(lèi)似的三維結(jié)構(gòu)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，肽模擬物可從任何攜帶上述一種或多種修飾的NTP蛋白或NTP肽中產(chǎn)生。更顯然的是，本發(fā)明的肽模擬物除了作為治療化合物的效用，可進(jìn)一步用于開(kāi)發(fā)更有效的非肽化合物。
今天許多機(jī)構(gòu)都能夠合成這里描述的相關(guān)蛋白質(zhì)、相關(guān)肽和NTP肽。例如，有了一種NTP肽的序列，這些機(jī)構(gòu)就能合成肽并為合成的肽提供相應(yīng)的文件并證明肽的同一性。
本發(fā)明還包括使用NTP肽和它們相應(yīng)的核酸分子用于分析，以定性或定量測(cè)試哺乳動(dòng)物組織或體液樣品中NTP肽、NTP肽DNA或相應(yīng)RNA的存在。NTP肽和它們相應(yīng)的核酸分子可用于這些試驗(yàn)的準(zhǔn)備，無(wú)論NTP肽、或者編碼的NTP肽是否顯示生物活性。NTP肽核酸序列可作為有用的雜交探針源以定性或定量測(cè)試哺乳動(dòng)物組織或體液樣品中NTP肽DNA或相應(yīng)RNA的存在。
本身不具生物活性的NTP肽可用于制備識(shí)別和/或結(jié)合NTP肽的抗體。這種抗體可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備。因此，與NTP肽反應(yīng)的抗體以及短鏈抗體片段和其它這種抗體的反應(yīng)片段也在本發(fā)明范圍內(nèi)?？贵w可以是多克隆、單克隆、重組、嵌合、單鏈和/或雙特異性。通常，抗體或其片段是人來(lái)源或“人源化”，即制備以防止或?qū)⑹┯媒o病人時(shí)對(duì)抗體的免疫反應(yīng)減少到最低程度。優(yōu)選的抗體是人抗體，多克隆或單克隆。抗體片段可以是與本發(fā)明NTP肽反應(yīng)的任何片斷，如Fab、Fab等。本發(fā)明也提供了雜交瘤，它是通過(guò)呈遞任何NTP肽產(chǎn)生的作為所選哺乳動(dòng)物的抗原，接著用已知技術(shù)融合哺乳動(dòng)物的細(xì)胞(如脾細(xì)胞)和一些癌細(xì)胞以產(chǎn)生無(wú)限增殖化細(xì)胞系。產(chǎn)生這種細(xì)胞系和抗所有或部分NTP肽的抗體的方法也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
抗體可進(jìn)一步用于體內(nèi)和體外診斷或研究目的，如以標(biāo)記形式來(lái)檢測(cè)體液或細(xì)胞樣品中NTP肽的存在。
本發(fā)明也包括使用一種或多種NTP肽作為分析中的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，以定性或定量測(cè)試哺乳動(dòng)物組織或體液樣品中NTP肽、NTP肽DNA或相應(yīng)RNA的存在。
本發(fā)明涉及治療需要除去細(xì)胞的疾病的新方法，如良性或惡性腫瘤、腺(如前列腺)增生、不需要的面部毛發(fā)、疣和不需要的脂肪組織。這種方法包括施用治療有效量的NTP肽給需要的哺乳動(dòng)物。
疾病可以是例如肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢、皮膚、腎、竇、結(jié)腸、腸、胃、直腸、食道、血液、大腦和其覆蓋物、脊髓和其覆蓋物、肌肉、結(jié)締組織、腎上腺、副甲狀腺、甲狀腺、子宮、睪丸、垂體、生殖器、肝臟、膽囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴結(jié)和淋巴系統(tǒng)(如淋巴組織)及其它器官的腫瘤。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“惡性腫瘤”包括人類(lèi)癌、肉瘤和黑素瘤的所有形式，它們以低度分化、適度分化、高度分化的形式出現(xiàn)。
本發(fā)明滿足本領(lǐng)域治療的需要，可以除去良性腫瘤而風(fēng)險(xiǎn)較小且不良的手術(shù)副作用較少。具體需要在手術(shù)危險(xiǎn)區(qū)如體內(nèi)深位(例如腦、心臟、肺和其它)除去良性腫瘤的方法。
治療必須除去細(xì)胞的疾病的方法可與治療這些疾病的常規(guī)方法結(jié)合使用，如手術(shù)切除、化療和放射治療。NTP肽可在這些常規(guī)治療之前、期間或之后施用。
待治療的疾病也可以是組織增生、肥大或過(guò)度生長(zhǎng)，組織選自肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢、皮膚、腎、竇、結(jié)腸、腸、胃、直腸、食道、血液、大腦和其覆蓋物、脊髓和其覆蓋物、肌肉、結(jié)締組織、腎上腺、副甲狀腺、甲狀腺、子宮、睪丸、垂體、生殖器、肝臟、膽囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴結(jié)和淋巴系統(tǒng)。
另一種可用本發(fā)明方法治療的疾病包括但不限于病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)改變的組織，組織選自肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢、皮膚、腎、竇、結(jié)腸、腸、胃、直腸、食道、血液、大腦和其覆蓋物、脊髓和其覆蓋物、肌肉、結(jié)締組織、腎上腺、副甲狀腺、甲狀腺、子宮、睪丸、垂體、生殖器、肝臟、膽囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴結(jié)和淋巴系統(tǒng)。
待治療的疾病也可以是組織畸形或異常，組織選自肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢、皮膚、腎、竇、結(jié)腸、腸、胃、直腸、食道、血液、大腦和其覆蓋物、脊髓和其覆蓋物、肌肉、結(jié)締組織、腎上腺、副甲狀腺、甲狀腺、子宮、睪丸、垂體、生殖器、肝臟、膽囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴結(jié)和淋巴系統(tǒng)。
具體是，待治療的疾病可以是扁桃體肥大、前列腺增生銀屑病、濕疹、皮膚病或痔。待治療的疾病可以是血管病如動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)脈硬化，或者是血管病如靜脈曲張。待治療的疾病也可以是組織的整容修飾，如皮膚、眼、耳、鼻、喉、口、肌肉、結(jié)締組織、毛發(fā)或乳房組織。
NTP肽的治療組合物在本發(fā)明范圍內(nèi)。這種組合物可包括治療有效量的NTP肽與藥學(xué)上可接受載體混合。載體物質(zhì)可以是用于注射的水，優(yōu)選添加溶液中常用的其它物質(zhì)以施用給哺乳動(dòng)物。通常，用于治療的NTP肽以組合物形式使用，組合物包括純化的NTP肽結(jié)合一個(gè)或多個(gè)生理上可接受載體、賦形劑或稀釋劑。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是適當(dāng)載體的范例。優(yōu)選地，產(chǎn)物用合適賦形劑(如蔗糖)制成凍干物。如果需要可包括其它標(biāo)準(zhǔn)載體、稀釋劑和賦形劑。組合物包括此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員已知的有合適pH值范圍的緩沖液，包含約pH7.0-8.5的Tris緩沖液、或約pH4.0-5.5的乙酸緩沖液，緩沖液可進(jìn)一步包括山梨醇或其合適的替代物。
用于靶向不需要的細(xì)胞因子的NTP肽共軛或連接或結(jié)合于抗體、抗體片段、抗體樣分子或?qū)μ禺愋阅[瘤標(biāo)記有高親和性的分子如細(xì)胞受體、信號(hào)肽或過(guò)度表達(dá)的酶，NTP肽的使用也在發(fā)明范圍內(nèi)?？贵w、抗體片段、抗體樣分子或?qū)μ禺愋阅[瘤標(biāo)記有高親和性的分子用于靶向NTP肽共軛物到特定細(xì)胞或組織靶。例如，有特殊表面抗原或表達(dá)抗原的腫瘤可由抗體、抗體片段、抗體樣結(jié)合分子靶向且腫瘤細(xì)胞可被NTP肽殺死。這種使用抗體靶的方法的優(yōu)點(diǎn)是降低劑量、增加結(jié)合和被靶細(xì)胞吸收的可能性、提高靶向和治療轉(zhuǎn)移性腫瘤和顯微大小的腫瘤的效率。
本發(fā)明也包括使用共軛或連接或結(jié)合于蛋白質(zhì)或其它分子的NTP肽以形成組合物，通過(guò)腫瘤-特異性或位點(diǎn)-特異性酶或蛋白酶或者通過(guò)靶向腫瘤或其它不需要的細(xì)胞的抗體共軛物在腫瘤或其它不需要的細(xì)胞位置或者附近裂解時(shí)，在腫瘤或其它不需要的細(xì)胞的位置或附近釋放NTP肽。
本發(fā)明也包括使用共軛或連接或結(jié)合于蛋白質(zhì)或其它分子的NTP肽以形成組合物，在待治療組織暴露于光(如激光療法或其它光動(dòng)力學(xué)或光活化療法)、其它形式電磁輻射時(shí)，組合物釋放NTP肽或NTP肽的一些生物活性片段，電磁輻射的其它形式如紅外線輻射、紫外線輻射、x射線或γ射線輻射、局部加熱、α或β輻射、超聲波發(fā)射或其它局部能量源。
NTP肽可單獨(dú)、一起或結(jié)合其它藥物組合物使用，如對(duì)于治療情況合適的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、抗生素、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、抗炎癥和/或化療劑。
本發(fā)明也包括NTP肽的組合物，組合物使用樹(shù)狀聚體、富勒烯和其它合成分子、聚合物及大分子，其中NTP肽和/或其相應(yīng)DNA分子本身或結(jié)合其它種類(lèi)分子如腫瘤特異性標(biāo)記來(lái)共軛、附著或納入分子、聚合物或大分子中。例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,714,166《生物活性和/或靶樹(shù)狀聚體共軛物》(Bioactive and/or TargetedDendrimer Conjugates)提供了制備和使用靶樹(shù)狀聚合物共軛物的方法，共軛物包括至少一個(gè)樹(shù)狀聚體和靶指示物以及至少一種與之結(jié)合的生物活性劑。
本發(fā)明也包括NTP肽和/或基因及藥物傳遞載體的治療組合物，載體如脂質(zhì)乳劑、膠束聚合物、聚合物微球、電活化聚合物、水凝膠和脂質(zhì)體。
使用轉(zhuǎn)移到不需要細(xì)胞的NTP肽或相關(guān)基因或基因同等物也在發(fā)明范圍內(nèi)。腫瘤內(nèi)過(guò)度表達(dá)NTP肽可用于誘導(dǎo)腫瘤中的細(xì)胞死亡并因而減少腫瘤細(xì)胞群?；蚧蚧蛲任镛D(zhuǎn)移NTP肽以治療不需要的細(xì)胞因子，其優(yōu)點(diǎn)是所需劑量更少、被傳遞到靶細(xì)胞因子的細(xì)胞后代上從而使治療頻率更低、以及總體治療更少。本發(fā)明也包括將編碼含NTP肽的融合蛋白的基因轉(zhuǎn)移到不需要的細(xì)胞或其鄰近細(xì)胞，表達(dá)基因及產(chǎn)生和/或分泌融合蛋白后，融合蛋白由天然酶或蛋白酶或者前體藥物分解以釋放NTP肽到不需要的細(xì)胞或附近。
使用克隆的重組NTP肽-抗體共軛物；克隆的重組NTP肽-抗體片段共軛物；克隆的重組NTP肽-抗體樣蛋白共軛物也包括在發(fā)明范圍內(nèi)?？寺〉腘TP肽結(jié)合靶共軛物(如抗體、抗體片段、抗體樣分子或者對(duì)癌特異性受體或其它腫瘤標(biāo)記有高親和性的分子)，除了制造和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)克隆的結(jié)合分子的優(yōu)點(diǎn)，此NTP肽的優(yōu)點(diǎn)是這種分子結(jié)合上述的靶向優(yōu)點(diǎn)。
口服施用的固體劑量形式包括但不限于膠囊、片劑、藥丸、粉末和顆粒。在這種固體劑量形式中，優(yōu)選活性化合物與至少一種下列物質(zhì)混合(a)一種或多種惰性賦形劑(或載體)，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣；(b)填充劑或膨脹劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(c)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠；(d)保濕劑，如甘油；(e)分裂劑，如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、褐藻酸、一些復(fù)合硅酸鹽和碳酸鈉；(f)溶液緩聚劑，如石蠟；(g)吸收加速劑，如季銨化合物；(h)潤(rùn)濕劑，如乙酰醇和甘油單硬脂酸鹽；(i)吸收劑，如瓷土和斑脫土；(j)滑潤(rùn)劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂酰硫酸鈉和它們的混合物。就膠囊、片劑、藥丸而言，劑量形式也可包括緩沖劑。
口服施用的液體劑量形式包括藥學(xué)上可接受乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除了活性化合物，液體劑量形式可包括本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑。乳化劑范例是乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油如棉子油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油，甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯或這些物質(zhì)的混合物等。
除了這種惰性稀釋劑，組合物也可包括佐劑，如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑和香味劑。
發(fā)明組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變以獲得治療有效量的NTP肽，NTP肽對(duì)獲得具體組合物和施用方法的理想治療反應(yīng)有效。因此選擇劑量水平取決于所需治療效果、施用途徑、所需治療的持續(xù)時(shí)間以及其它因素。
哺乳動(dòng)物包括人的有效量可在體表面積基礎(chǔ)上施用。用于不同大小、種類(lèi)的動(dòng)物和人的劑量間的相互關(guān)系(以體表的mg/M2為基礎(chǔ))描述于E.J.Freireich等，Cancer Chemother.Rep.，50(4)219(1966)。體表面積可從個(gè)體高度和重量大約確定(參見(jiàn)例如《科學(xué)表》(Scientific Tables)，Geigy Pharmaceuticals，Ardsley，N.Y.537-538頁(yè)(1970))。
施用給宿主的NTP肽的每天總劑量可以是單個(gè)或分開(kāi)的劑量。劑量單位組合物包含幾分之一的量可用于構(gòu)成每天劑量。然而要理解的是，任何具體病人的特定劑量水平取決于多種因素，包括體重、整體健康、性別、飲食、施用時(shí)間和途徑、施用藥物的效力、吸收和排泄的比例、結(jié)合其它藥物以及治療的具體疾病的嚴(yán)重性。
根據(jù)發(fā)明施用NTP肽組合物的方法包括但不限于肌肉內(nèi)、經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦心室內(nèi)、腫瘤內(nèi)、病灶內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、局部、透皮、通過(guò)氣霧劑、輸注、推射、移植裝置、緩釋系統(tǒng)等施用化合物。
另一種施用發(fā)明NTP肽組合物的方法是經(jīng)皮或透皮途徑。這種實(shí)施方案的一個(gè)例子是使用膜片。具體是，膜片可用NTP肽的精細(xì)懸浮液制備，例如二甲亞砜(DMSO)或DMSO與棉子油的混合物并接觸攜帶腫瘤的哺乳動(dòng)物皮膚，遠(yuǎn)離皮膚囊(pouch)內(nèi)腫瘤定位部位。有另外溶劑和固體支持物的其它介質(zhì)或其混合物也可同樣起作用。膜片可包含溶液或懸浮液形式的NTP肽化合物。然后膜片可應(yīng)用于病人皮膚，例如將它插入病人的皮膚囊，皮膚囊通過(guò)用縫針、夾子或其它夾持裝置將皮膚折疊和夾持一起來(lái)形成。應(yīng)確保囊與皮膚連續(xù)接觸而不受哺乳動(dòng)物干擾。除了使用皮膚囊，可使用任何保證牢固放置與皮膚接觸的膜片的裝置。例如，粘附繃帶可用來(lái)夾持膜片在皮膚上。
NTP肽可在緩釋制劑或制備中施用。緩釋制劑的合適例子包括以成形物質(zhì)形式的半透性聚合物基質(zhì)，如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)包括聚酯、水凝膠、聚交酯(美國(guó)3,773,919、EP58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman等，Biopolymers，22547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸鹽)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277和Langer等，Chem.Tech.，1298-105)、乙烯乙酸乙烯(Langer等，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。緩釋組合物也包括脂質(zhì)體，可由任何本領(lǐng)域已知的一些方法來(lái)制備(如Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688-3692；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949)。
另一種施用本發(fā)明NTP肽的方法是使NTP肽直接或間接灌注到待治療的腫瘤或其它組織。這種實(shí)施方案的一個(gè)例子是直接注射N(xiāo)TP肽到待治療的腫瘤或其它組織。治療可由單次注射、一段時(shí)間多次注射或幾小時(shí)、幾天或幾個(gè)月的一系列注射組成，待治療腫瘤或其它組織的消退或破壞通過(guò)活組織檢查、成像或其它監(jiān)控組織生長(zhǎng)的方法來(lái)監(jiān)控?？赏ㄟ^(guò)插入孔的裝置如鼻、口、耳、陰道、直腸或尿道注射到待治療的腫瘤或其它組織或穿過(guò)切口以到達(dá)體內(nèi)的腫瘤或組織，且注射可結(jié)合成像或光學(xué)系統(tǒng)如超聲波或纖維光鏡進(jìn)行以確定注射的合適位置。這種實(shí)施方案的另一個(gè)例子是使用可使NTP肽恒定灌注到組織的裝置。
又一種施用發(fā)明NTP肽的方法是結(jié)合手術(shù)或類(lèi)似用于物理切除、消融或者殺死或破壞腫瘤或其它組織或細(xì)胞因子的過(guò)程，它們需要或希望被除去或破壞，其中本發(fā)明的NTP肽施用給腫瘤或組織的周?chē)咏鼌^(qū)域，除去腫瘤或其它組織以破壞或阻止任何未被過(guò)程除去或破壞的腫瘤細(xì)胞或其它細(xì)胞因子的生長(zhǎng)。
另一種施用本發(fā)明NTP肽的方法是將裝置移植到待治療的腫瘤或其它組織中。這種實(shí)施方案的一個(gè)例子是將含NTP肽的薄片移植到待治療的腫瘤或其它組織中。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，薄片釋放治療劑量的NTP肽到組織中。另外或此外，組合物可局部施用，通過(guò)移植到膜、海綿或其它合適物質(zhì)的受影響區(qū)域，NTP肽被吸收到其中。使用移植裝置時(shí)，裝置可移植到任何合適的組織或器官，傳遞NTP肽可直接通過(guò)裝置，經(jīng)推注或經(jīng)連續(xù)施用或經(jīng)使用連續(xù)灌輸?shù)膶?dǎo)管。
另外一種施用方法是將一個(gè)或多個(gè)拷貝的NTP肽-編碼基因?qū)氚邢虻募?xì)胞，如果必要，誘導(dǎo)基因的拷貝開(kāi)始胞內(nèi)產(chǎn)生NTP肽。一種可應(yīng)用基因治療的方式是使用NTP肽-編碼基因(基因組DNA、cDNA和/或編碼NTP肽或片斷、變體、同源物或衍生物的合成DNA)，它可操作連接于組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子以形成“基因治療DNA構(gòu)建物”。如果啟動(dòng)子在構(gòu)建物插入的細(xì)胞或組織類(lèi)型中具有活性，它可與內(nèi)源性NTP肽-編碼基因同源或異源。如果需要，基因治療DNA構(gòu)建物的其它成分可任選地包括設(shè)計(jì)用于位點(diǎn)特異性整合的DNA分子(如用于同源重組的內(nèi)源性側(cè)翼序列)，組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或沉默子，能提供選擇性優(yōu)于親代細(xì)胞的DNA分子、用于標(biāo)記以鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA分子、陰性選擇系統(tǒng)、細(xì)胞特異結(jié)合劑(例如用于細(xì)胞靶向)細(xì)胞特異性內(nèi)在化因子、提高載體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子以及能使載體生產(chǎn)的因子。
體內(nèi)或活體外傳遞基因到細(xì)胞或組織的方法包括(但不限于)直接注射裸露DNA、彈道方法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(配體-DNA復(fù)合體)、電穿孔和磷酸鈣沉淀，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,970,154、WO 96/40958、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,679,559、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,676,954和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,593,875，公開(kāi)的內(nèi)容全部納入本文供參考。
NTP肽-編碼基因可通過(guò)移植一些細(xì)胞到病人來(lái)傳遞，細(xì)胞使用本文所述方法在活體外被遺傳工程改造以表達(dá)和分泌NTP肽或片段、變體、同源物或它的衍生物。這種細(xì)胞可以是動(dòng)物或人細(xì)胞，可獲得自病人自身組織或來(lái)自另外人或非人的來(lái)源。任選地細(xì)胞可以是無(wú)限增殖化或干可以是細(xì)胞。然而為減少免疫應(yīng)答的機(jī)會(huì)，優(yōu)選的是細(xì)胞被包囊以防止周?chē)M織滲透。包囊物質(zhì)一般是生物相容的半透性聚合封閉物或膜，使蛋白產(chǎn)物釋放但防止病人免疫系統(tǒng)或來(lái)自周?chē)M織的其它有害因素破壞細(xì)胞。用于膜包囊細(xì)胞的方法是技術(shù)人員所熟悉的，可制備包囊的細(xì)胞并移植到病人中而不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,892,538；5,001,472和5,106,627，它們公布的內(nèi)容全部納入本文供參考。包囊活細(xì)胞的系統(tǒng)描述于PCT WO 91/10425。制成多種其它持續(xù)或受控制傳遞方式的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如脂質(zhì)體載體、生物可侵蝕的顆?；蛑椋夹g(shù)描述于例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,653,975，公開(kāi)的內(nèi)容全部納入本文供參考。有或沒(méi)有包囊的細(xì)胞可移植到病人的適當(dāng)身體組織或器官。
提供以下例子以闡明本發(fā)明。然而應(yīng)理解的是發(fā)明不限于這些例子中所述的具體條件和細(xì)節(jié)。在說(shuō)明書(shū)中，任何和所有公眾可得到的文獻(xiàn)納入供參考，包括美國(guó)專(zhuān)利。
特別地，本發(fā)明特意包括待審批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/092,934用神經(jīng)絲狀蛋白治療腫瘤和相關(guān)疾病的方法中列出的實(shí)施例以供參考，它顯示完整的AD7c-NTP蛋白是在體外膠質(zhì)瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤以及體內(nèi)正常嚙齒動(dòng)物肌肉組織、皮下結(jié)締組織和真皮以及多種不同人和非人來(lái)源的腫瘤(包括乳腺癌、皮膚癌和乳頭狀瘤、結(jié)腸癌、腦膠質(zhì)瘤和嚙齒動(dòng)物模型中的其它腫瘤)中造成細(xì)胞死亡的一種有效試劑。本發(fā)明還特意包括待審批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/153,334有效治療腫瘤和其它需要除去或破壞細(xì)胞的疾病的肽中列出的實(shí)施例以供參考，它顯示NTP肽是在正常嚙齒動(dòng)物肌肉組織、皮下結(jié)締組織、真皮和其它組織體內(nèi)造成細(xì)胞死亡的有效試劑。
實(shí)施例1此例子的目的是確定NTP肽#7對(duì)注射部位組織的效果。
4只正常大鼠在皮膚和皮下注射，各有四個(gè)不同的病灶，在四肢骨骼肌注射，各有兩個(gè)不同的病灶，在100到400mL量鹽水中的NTP肽#7以0.1-1mg/mL濃度通過(guò)不銹鋼26量針從塑料注射器傳遞。
觀察動(dòng)物24小時(shí)且在24小時(shí)無(wú)痛殺死動(dòng)物。切除單獨(dú)的滲透病灶，固定在10％福爾馬林中，石蠟包埋，染色并用標(biāo)準(zhǔn)組織病理學(xué)方法檢測(cè)。
對(duì)照僅接受鹽水。
結(jié)果注射N(xiāo)TP肽#7在注射部位產(chǎn)生組織壞死。壞死在NTP肽#7注射部位的肌肉組織、皮下結(jié)締組織和真皮中明顯。壞死與注射區(qū)域相關(guān)且似乎不擴(kuò)散到離注射部分很遠(yuǎn)。
遠(yuǎn)離炎癥的輕度區(qū)域，對(duì)照沒(méi)有顯示出壞死或細(xì)胞損失。對(duì)照顯示出最小或沒(méi)有肌肉變化。對(duì)照注射在注射部位有輕度到最小的急性炎癥及來(lái)自針的病灶微出血。
實(shí)施例2此例子的目的是確定NTP肽#7對(duì)注射部位組織的效果。
用乙醚麻醉4只大鼠，并通過(guò)前列腺內(nèi)灌注給予NTP肽#7。注射液包括300μlNTP肽#7，其濃度為1mg/mL，溶于PBS pH7.4(1.0mg/kg)。對(duì)照僅注射PBS或不注射。72小時(shí)后無(wú)痛殺死動(dòng)物。切除前列腺，用10％緩沖的福爾馬林固定24小時(shí)，石蠟包埋，切片，并用H&E染色。對(duì)于每個(gè)動(dòng)物，將整個(gè)前列腺包埋并切片。用組織學(xué)技術(shù)檢測(cè)所有染色的切片。
結(jié)果用NTP肽#7處理的大鼠前列腺在注射部位出現(xiàn)組織壞死，并伴有腺上皮損失、變扁和萎縮。僅注射PBS的對(duì)照和未注射的對(duì)照之間沒(méi)有可辨別的差異。
實(shí)施例3此例子的目的是確定NTP肽#14對(duì)注射部位組織的效果。
如上述實(shí)施例1在皮膚和皮下注射大鼠，但它們注射的是NTP肽#14。
觀察動(dòng)物24小時(shí)且在24小時(shí)時(shí)無(wú)痛殺死動(dòng)物。切除組織，用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，染色并用標(biāo)準(zhǔn)組織病理學(xué)方法檢測(cè)。
對(duì)照與實(shí)施例1相同。
結(jié)果注射N(xiāo)TP肽#14在注射部位產(chǎn)生細(xì)胞死亡和組織壞死。與上述實(shí)施例1類(lèi)似，細(xì)胞死亡存在于NTP肽#14注射部位的肌肉組織、皮下結(jié)締組織和真皮中。
遠(yuǎn)離炎癥的輕度區(qū)域，對(duì)照顯示最低的壞死或細(xì)胞損失。對(duì)照注射在注射部位有輕度到最小的急性炎癥及偶爾來(lái)自針的病灶微出血。
實(shí)施例4此例子的目的是確定NTP肽#17對(duì)注射部位組織的效果。
如上述實(shí)施例2在前列腺注射正常大鼠，但它們注射的是NTP肽#17。72小時(shí)后無(wú)痛殺死動(dòng)物并如實(shí)施例2處理它們的前列腺。
結(jié)果如上述實(shí)施例2，72小時(shí)時(shí)，注射N(xiāo)TP肽#17在前列腺中產(chǎn)生明顯的細(xì)胞損失和萎縮。對(duì)照顯示最小變化或沒(méi)有變化，包括來(lái)自針頭的輕度局灶性炎。
已經(jīng)參考特別優(yōu)選的實(shí)施方案和例子描述了本發(fā)明。然而，精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，可對(duì)本發(fā)明作出多種改變而不背離發(fā)明的精神或范圍。
序列表<110>尼莫克斯股份有限公司(NYMOX CORPORATION)<120>有效治療腫瘤和其它需要除去或破壞細(xì)胞的疾病的肽<130>10107-45<140>PCT/CA02/01105<141>2002-07-19<150>US 60/306,161<151>2001-07-19<150>US 60/306,150<151>2001-07-19<150>US 60/331,477<151>2001-11-16<160>48<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>375<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys Asn Gly Ala Ile1 5 10 15Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala20 25 30Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met Cys Thr His Ala Arg35 40 45Leu Ile Leu Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met Glu Phe Leu His Val Gly50 55 60Gln Ala Gly Leu Glu Leu Pro Thr Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala65 70 75 80Ser Gln Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys Leu85 90 95Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val Ser Leu Met Cys Pro Ser Trp100 105 110Ser Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp115 120 125Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile Leu Phe Phe Leu130 135 140Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val Gln Trp Cys Asp145 150 155 160
His Ser Ser Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Ile Lys His Pro Pro Ala165 170 175Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met His His Tyr Thr Trp180 185 190Leu Ile Phe Ile Phe Ile Phe Asn Phe Leu Arg Gln Ser Leu Asn Ser195 200 205Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Arg Asn Leu Gly Ser Leu Gln Pro210 215 220Leu Pro Pro Gly Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser225 230 235 240Trp Asp Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe Phe Val Phe Leu245 250 255Val Glu Met Gly Phe Thr Met Phe Ala Arg Leu Ile Leu Ile Ser Gly260 265 270Pro Cys Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly275 280 285Val Ser His His Ala Arg Leu Ile Phe Asn Phe Cys Leu Phe Glu Met290 295 300Glu Ser His Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Pro Asn Leu Gly305 310 315 320Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser325 330 335Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro His Pro Ala Asn340 345 350Phe Cys Ile Phe Ile Arg Gly Gly Val Ser Pro Tyr Leu Ser Gly Trp355 360 365Ser Gln Thr Pro Asp Leu Arg370 375<210>2<211>122<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>對(duì)未知生物的描述未知NTP肽<400>2Met Met Val Cys Trp Asn Arg Phe Gly Lys Trp Val Tyr Phe Ile Ser1 5 10 15Ala Ile Phe Asn Phe Gly Pro Arg Tyr Leu Tyr His Gly Val Pro Phe20 25 30
Tyr Phe Leu Ile Leu Val Arg Ile Ile Ser Phe Leu Ile Gly Asp Met35 40 45Glu Asp Val Leu Leu Asn Cys Thr Leu Leu Lys Arg Ser Ser Arg Phe50 55 60Arg Phe Trp Gly Ala Leu Val Cys Ser Met Asp Ser Cys Arg Phe Ser65 70 75 80Arg Val Ala Val Thr Tyr Arg Phe Ile Thr Leu Leu Asn Ile Pro Ser85 90 95Pro Ala Val Trp Met Ala Arg Asn Thr Ile Asp Gln Gln Val Leu Ser100 105 110Arg Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Cys Leu115 120<210>3<211>112<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Met Ala Gln Ser Arg Leu Thr Ala Thr Ser Ala Ser Arg Val Gln Ala1 5 10 15Ile Leu Leu Ser Gln Pro Pro Lys Gln Leu Gly Leu Arg Ala Pro Ala20 25 30Asn Thr Pro Leu Ile Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Gly Phe His His35 40 45Ile Cys Gln Ala Gly Leu Lys Leu Leu Thr Ser Gly Asp Pro Pro Ala50 55 60Ser Ala Phe Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val Ser His Leu Thr Gln65 70 75 80Pro Ala Asn Leu Asp Lys Lys Ile Cys Ser Asn Gly Gly Ser Cys Tyr85 90 95Val Ala Gln Ala Gly Leu Lys Leu Leu Ala Ser Cys Asn Pro Ser Lys100 105 110<210>4<211>106<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Trp Thr Leu Lys Ser Ser Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Thr Cys1 5 10 15Ser Tyr Ala Phe Met Phe Ser Ser Leu Arg Gln Lys Thr Ser Glu Pro20 25 30
Gln Gly Lys Val Pro Cys Gly Glu His Phe Arg Ile Arg Gln Asn Leu35 40 45Pro Glu His Thr Gln Gly Trp Leu Gly Ser Lys Trp Leu Trp Leu Leu50 55 60Phe Ala Val Val Pro Phe Val Ile Leu Lys Cys Gln Arg Asp Ser Glu65 70 75 80Lys Asn Lys Val Arg Met Ala Pro Phe Phe Leu His His Ile Asp Ser85 90 95Ile Ser Gly Val Ser Gly Lys Arg Met Phe100 105<210>5<211>106<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Met Phe Phe Val Leu Tyr Arg Phe Cys Phe Cys Phe Phe Glu Thr Glu1 5 10 15Ser His Ser Leu Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Cys Glu Leu Gly Ser20 25 30Pro Gln Pro Leu Pro Ser Gly Phe Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser Leu35 40 45Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Ser His Glu Pro Pro His Pro Val Ile Cys50 55 60Ser Phe Leu Met Glu Lys Cys Leu Ile Leu Tyr Lys Pro Asn Gly Asp65 70 75 80Thr Ile Gly Pro Ile Leu Val Gln Gln Gly Lys Arg Gln Lys Leu Tyr85 90 95Ile Ser Ala Asp Leu Val His Leu Ile Ala100 105<210>6<211>98<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>對(duì)未知生物的描述未知NTP肽<400>6Glu Ala Tyr Tyr Thr Met Leu His Leu Pro Thr Thr Asn Arg Pro Lys1 5 10 15Ile Ala His Cys Ile Leu Phe Asn Gln Pro His Ser Pro Arg Ser Asn20 25 30
Ser His Ser His Pro Asn Pro Leu Lys Leu His Arg Arg Ser His Ser35 40 45His Asn Arg Pro Arg Ala Tyr Ile Leu Ile Thr Ile Leu Pro Ser Lys50 55 60Leu Lys Leu Arg Thr His Ser Gln Ser His His Asn Pro Leu Ser Arg65 70 75 80Thr Ser Asn Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Leu Met Thr Ser Ser Lys85 90 95Pro Arg<210>7<211>75<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>對(duì)未知生物的描述未知NTP肽<400>7Ser Ser Ser Leu Gly Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg His Glu Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Ala Leu Met Ile Asn Phe Arg Val Met Ala Cys Thr Phe20 25 30Lys Gln His Ile Glu Leu Arg Gln Lys Ile Ser Ile Val Pro Arg Lys35 40 45Leu Cys Cys Met Gly Pro Val Cys Pro Val Lys Ile Ala Leu Leu Thr50 55 60Ile Asn Gly His Cys Thr Trp Leu Pro Ala Ser65 70 75<210>8<211>68<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>對(duì)未知生物的描述未知NTP肽<400>8Met Phe Val Phe Cys Leu Ile Leu Asn Arg Glu Lys Ile Lys Gly Gly1 5 10 15Asn Ser Ser Phe Phe Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ser Phe Gln Asn Cys20 25 30Cys Gln Cys Phe Gln Cys Arg Thr Thr Glu Gly Tyr Ala Val Glu Cys35 40 45Phe Tyr Cys Leu Val Asp Lys Ala Ala Phe Glu Cys Trp Trp Phe Tyr
50 55 60Ser Phe Asp Thr65<210>9<211>61<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>9Met Glu Pro His Thr Val Ala Gln Ala Gly Val Pro Gln His Asp Leu1 5 10 15Gly Ser Leu Gln Ser Leu Leu Pro Arg Phe Lys Arg Phe Ser Cys Leu20 25 30Ile Leu Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Arg Asn Met Asn Thr Ala Leu Ile35 40 45Lys Arg Asn Arg Tyr Thr Pro Glu Thr Gly Arg Lys Ser50 55 60<210>10<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>10Pro Gly Phe Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser Trp1 5 10 15Asp Tyr Arg Arg20<210>11<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>11Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp1 5 10 15Tyr Arg Arg<210>12<211>19<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>12Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp1 5 10 15Asp Tyr Gly<210>13<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>13Phe Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His1 5 10<210>14<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>14Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg1 5 10<210>15<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>15Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg1 5 10<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽
<400>16Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr1 5<210>17<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>17Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg1 5 10<210>18<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>18Ser Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg1 5 10<210>19<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>19Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg1 5<210>20<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>20Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg1 5<210>21<211>5
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>21Ser Ser Trp Asp Tyr1 5<210>22<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>22Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg Phe Ile Leu Phe Phe Leu1 5 10<210>23<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>23Trp Asp Tyr Arg Arg Phe Ile Phe Asn Phe Leu1 5 10<210>24<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>24Phe Asn Phe Cys Leu Phe1 5<210>25<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>25
Phe Ile Phe Asn Phe Leu1 5<210>26<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>26Pro Ala Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met1 5 10<210>27<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>27Pro Ala Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met1 5 10<210>28<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的肽<400>28Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val1 5 10<210>29<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>29cccgggttct tcaagttatt ctcctgcccc agcctcctga gtagctggga ctacaggcgc 60<210>30<211>57<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>30cctgagctca agcagtccac ctgcctcagc ctcccaaagt gctgggatta caggcgt57<210>31<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>31cctcccgggc tcaagcgatt ctcctgtctc agcctcccaa gcagctggga ttacggg57<210>32<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>32ttctcctgtc tcagcctccc aagcagctgg gattacgggc ac42<210>33<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>33tccacctgcc tcagcctccc aaagtgctgg gattacaggc gt42<210>34<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>34ttctcctgcc ccagcctcct gagtagctgg gactacaggc gc42<210>35<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>35ctcagcctcc caagcagctg ggattac 27<210>36<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>36ctcagcctcc caaagtgctg ggattacagg cgt 33<210>37<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>37agcctcctga gtagctggga ctacaggcgc 30<210>38<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>38ctcccagagt agctgggact acaggcgc28<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>39gagtagctgg gactacaggc gc 22<210>40<211>15
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>40agcagctggg attac 15<210>41<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>41gagtagctgg gactacaggc gctttatttt atttttttta 40<210>42<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>42tgggactaca ggcgctttat ttttaatttt ttg 33<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>43tttaattttt gtttgttt 18<210>44<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>44tttattttta attttttg 18<210>45
<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>45cctgcctcag cctccccagt agctgggatt acaggcatg39<210>46<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>46cctgcctcag cctcccaagt agctgggacc aaagacatg39<210>47<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對(duì)人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>47cctgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtg39<210>48<211>1442<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(15)..(1139)<400>48tttttttttt tgag atg gag ttt tcg ctc ttg ttg ccc agg ctg gag tgc 50Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys1 5 10aat ggc gca atc tca gct cac cgc aac ctc cgc ctc ccg ggt tca agc 98Asn Gly Ala Ile Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser15 20 25gat tct cct gcc tca gcc tcc cca gta gct ggg att aca ggc atg tgc 146Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met Cys30 35 40acc cac gct cgg cta att ttg tat ttt ttt tta gta gag atg gag ttt 194Thr His Ala Arg Leu Ile Leu Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met Glu Phe
45 50 55 60ctc cat gtt ggt cag gct ggt ctc gaa ctc ccg acc tca gat gat ccc242Leu His Val Gly Gln Ala Gly Leu Glu Leu Pro Thr Ser Asp Asp Pro65 70 75tcc gtc tcg gcc tcc caa agt gct aga tac agg act ggc cac cat gcc290Ser Val Ser Ala Ser Gln Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala80 85 90cgg ctc tgc ctg gct aat ttt tgt ggt aga aac agg gtt tca ctg atg338Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val Ser Leu Met95 100 105tgc cca agc tgg tct cct gag ctc aag cag tcc acc tgc ctc agc ctc386Cys Pro Ser Trp Ser Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu110 115 120cca aag tgc tgg gat tac agg cgt gca gcc gtg cct ggc ctt ttt att434Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile125 130 135 140tta ttt ttt tta aga cac agg tgt ccc act ctt acc cag gat gaa gtg482Leu Phe Phe Leu Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val145 150 155cag tgg tgt gat cac agc tca ctg cag cct tca act cct gag atc aag530Gln Trp Cys Asp His Ser Ser Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Ile Lys160 165 170cat cct cct gcc tca gcc tcc caa gta gct ggg acc aaa gac atg cac578His Pro Pro Ala Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met His175 180 185cac tac acc tgg cta att ttt att ttt att ttt aat ttt ttg aga cag626His Tyr Thr Trp Leu Ile Phe Ile Phe Ile Phe Asn Phe Leu Arg Gln190 195 200agt ctc aac tct gtc acc cag gct gga gtg cag tgg cgc aat ctt ggc674Ser Leu Asn Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Arg Asn Leu Gly205 210 215 220tca ctg caa cct ctg cct ccc ggg ttc aag tta ttc tcc tgc ccc agc722Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser225 230 235ctc ctg agt agc tgg gac tac agg cgc cca cca cgc cta gct aat ttt770Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe240 245 250ttt gta ttt tta gta gag atg ggg ttc acc atg ttc gcc agg ttg atc818Phe Val Phe Leu Val Glu Met Gly Phe Thr Met Phe Ala Arg Leu Ile255 260 265ttg atc tct gga cct tgt gat ctg cct gcc tcg gcc tcc caa agt gct866Leu Ile Ser Gly Pro Cys Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala270 275 280ggg att aca ggc gtg agc cac cac gcc cgg ctt att ttt aat ttt tgt914
Gly Ile Thr Gly Val Ser His His Ala Arg Leu Ile Phe Asn Phe Cys285 290 295 300ttg ttt gaa atg gaa tct cac tct gtt acc cag gct gga gtg caa tgg962Leu Phe Glu Met Glu Ser His Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp305 310 315cca aat ctc ggc tca ctg caa cct ctg cct ccc ggg ctc aag cga ttc1010Pro Asn Leu Gly Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe320 325 330tcc tgt ctc agc ctc cca agc agc tgg gat tac ggg cac ctg cca cca1058Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro335 340 345cac ccc gct aat ttt tgt att ttc att aga ggc ggg gtt tca cca tat1106His Pro Ala Asn Phe Cys Ile Phe Ile Arg Gly Gly Val Ser Pro Tyr350 355 360ttg tca ggc tgg tct caa act cct gac ctc agg tgacccacct gcctcagcct 1159Leu Ser Gly Trp Ser Gln Thr Pro Asp Leu Arg365 370 375tccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc acctcaccca gccggctaat ttagataaaa 1219aaatatgtag caatgggggg tcttgctatg ttgcccaggc tggtctcaaa cttctggctt 1279catgcaatcc ttccaaatga gccacaacac ccagccagtc acatttttta aacagttaca 1339tctttatttt agtatactag aaagtaatac aataaacatg tcaaacctgc aaattcagta 1399gtaacagagt tcttttataa cttttaaaca aagctttaga gca144權(quán)利要求
1.一種肽，其特征在于，所述肽包括至少一種選自以下的肽a)以SEQ ID NO10中的氨基酸序列表述的肽(Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg)；b)以SEQ ID NO11中的氨基酸序列表述的肽(Pro-Glu-Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg)c)以SEQ ID NO12中的氨基酸序列表述的肽(Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly)d)以SEQ ID NO13中的氨基酸序列表述的肽(Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His)e)以SEQ ID NO14中的氨基酸序列表述的肽(Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg)f)以SEQ ID NO15中的氨基酸序列表述的肽(Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg)g)以SEQ ID NO16中的氨基酸序列表述的肽(Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly)h)以SEQ ID NO17中的氨基酸序列表述的肽(Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg)i)以SEQ ID NO18中的氨基酸序列表述的肽(Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg)j)以SEQ ID NO19中的氨基酸序列表述的肽(Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg)k)以SEQ ID NO20中的氨基酸序列表述的肽(Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg)l)以SEQ ID NO21中的氨基酸序列表述的肽(Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr)m)以SEQ ID NO22中的氨基酸序列表述的肽(Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu)n)以SEQ ID NO23中的氨基酸序列表述的肽(Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu)o)以SEQ ID NO24中的氨基酸序列表述的肽(Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe)p)以SEQ ID NO25中的氨基酸序列表述的肽(Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu)q)以SEQ ID NO26中的氨基酸序列表述的肽(Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met)r)以SEQ ID NO27中的氨基酸序列表述的肽(Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met)s)以SEQ ID NO28中的氨基酸序列表述的肽(Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val)。
2.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有一種或多種權(quán)利要求1所述肽和載體。
3.一種肽，其特征在于，所述肽含有權(quán)利要求1所述肽的同源物、衍生物、片段或變體。
4.一種肽，其特征在于，所述肽含有權(quán)利要求1所述肽的氨基酸序列的反-D順序的氨基酸。
5.一種肽，其特征在于，所述肽包括權(quán)利要求1所述的肽，所述肽3′或5′末端側(cè)翼由1到25個(gè)額外的氨基酸修飾。
6.一種肽，其特征在于，所述肽包括至少兩個(gè)權(quán)利要求1所述的肽。
7.一種肽，其特征在于，所述肽包括至少兩個(gè)權(quán)利要求1所述的肽的重復(fù)。
8.一種如權(quán)利要求1所述肽的模擬物。
9.一種肽，其特征在于，所述肽包括與抗體、抗體片段或抗體樣分子融合的如權(quán)利要求1所述的肽。
10.一種核酸，其特征在于，所述核酸編碼與權(quán)利要求1所述的肽相應(yīng)的氨基酸序列和其同源物、片段和變體。
11.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括一種或多種如權(quán)利要求10所述的核酸以及其藥學(xué)上可接受的載體。
12.一種治療患者疾病的方法，所述疾病需要除去或破壞細(xì)胞，其特征在于，所述方法包括給有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1所述的肽。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述給藥方法選自經(jīng)口、皮下、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、腫瘤內(nèi)、局部和透皮。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述治療在用選自手術(shù)切除、移植、嫁接、化療、免疫治療、疫苗接種、熱或電消融、冷凍療法和激光療法、基因治療和放射療法處理患者之前、期間或之后給予患者。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是組織的良性或惡性腫瘤，所述組織選自肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢、皮膚、腎、竇、結(jié)腸、腸、胃、直腸、食道、心、脾、唾液腺、血液、大腦和其覆蓋物、脊髓和其覆蓋物、肌肉、結(jié)締組織、腎上腺、副甲狀腺、甲狀腺、子宮、睪丸、垂體、生殖器、肝臟、膽囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴結(jié)和淋巴系統(tǒng)。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是組織增生、肥大或過(guò)度生長(zhǎng)，所述組織選自肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢、皮膚、腎、竇、結(jié)腸、腸、胃、直腸、食道、心、脾、唾液腺、血液、大腦和其覆蓋物、脊髓和其覆蓋物、肌肉、結(jié)締組織、腎上腺、副甲狀腺、甲狀腺、子宮、睪丸、垂體、生殖器、肝臟、膽囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴結(jié)和淋巴系統(tǒng)。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)改變的組織，所述組織選自肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢、皮膚、腎、竇、結(jié)腸、腸、胃、直腸、食道、心、脾、唾液腺、血液、大腦和其覆蓋物、脊髓和其覆蓋物、肌肉、結(jié)締組織、腎上腺、副甲狀腺、甲狀腺、子宮、睪丸、垂體、生殖器、肝臟、膽囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴結(jié)和淋巴系統(tǒng)。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是組織畸形，所述組織選自肺、乳房、胃、胰、前列腺、膀胱、骨、卵巢、皮膚、腎、竇、結(jié)腸、腸、胃、直腸、食道、心、脾、唾液腺、血液、大腦和其覆蓋物、脊髓和其覆蓋物、肌肉、結(jié)締組織、腎上腺、副甲狀腺、甲狀腺、子宮、睪丸、垂體、生殖器、肝臟、膽囊、眼、耳、鼻、喉、扁桃腺、口、淋巴結(jié)和淋巴系統(tǒng)。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述組織是淋巴組織。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是扁桃體肥大。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是前列腺增生。
22.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是銀屑病。
23.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是濕疹。
24.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是皮膚病。
25.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是對(duì)組織的整容修飾。
26.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述組織選自皮膚、眼、耳、鼻、喉、口、肌肉、結(jié)締組織、毛發(fā)和乳房。
27.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是血管病。
28.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是痔。
29.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病是靜脈曲張。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述血管病是動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)脈硬化。
31.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述疾病選自炎性疾病、自身免疫疾病、代謝疾病、遺傳疾病、創(chuàng)傷性疾病或身體損傷、營(yíng)養(yǎng)缺乏性疾病、傳染病、淀粉樣疾病、纖維變性病、貯積病、先天性畸形、酶缺乏性疾病、中毒、致醉、環(huán)境病、輻射病、內(nèi)分泌疾病、變性疾病和機(jī)械性疾病中的一種。
32.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述肽衍生自胰絲狀蛋白的氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述肽共軛、連接或結(jié)合于選自抗體、抗體片段和抗體樣結(jié)合分子的分子，其中所述分子結(jié)合腫瘤或其它靶的親和性高于結(jié)合其它細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述肽是部分單個(gè)新克隆的重組分子，所述重組分子由肽和選自抗體、抗體片段和抗體樣結(jié)合分子的分子組成，其中所述分子結(jié)合腫瘤或其它靶的親和性高于結(jié)合其它細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用含有肽或基于肽的化合物治療疾病的方法，所述肽含有一部分神經(jīng)絲狀蛋白的氨基酸序列，這種疾病需要除去或破壞患者的有害細(xì)胞或不需要的細(xì)胞，如良性或惡性腫瘤。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1649895SQ02816490
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2002年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月19日
發(fā)明者P·A·艾弗白克 申請(qǐng)人:尼莫克斯股份有限公司